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Il lupino angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) è una leguminosa utilizzata per la produzione alimentare e per il miglioramento del suolo.L'espansione globale della NLL come coltura ha attratto molti funghi patogeni, tra cui l'antracnosi del lupino, che causa la devastante malattia dell'antracnosi.Due alleli, Lanr1 e AnMan, che conferiscono una maggiore resistenza, sono stati utilizzati nell'allevamento NLL, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti.In questo studio, i marcatori Lanr1 e AnMan sono stati utilizzati per lo screening di campioni NLL europei.I test del vaccino in un ambiente controllato hanno confermato l'efficacia di entrambi i donatori resistenti.Il profilo di espressione genica differenziale è stato eseguito su linee resistenti e suscettibili rappresentative.La resistenza all'antracnosi è stata associata alla sovraespressione dei termini di ontologia genica "GO: 0006952 Defense Response", "GO: 0055114 Redox Process" e "GO: 0015979 Photosynthesis".Inoltre, la linea Lanr1(83A:476) ha mostrato una significativa riprogrammazione del trascrittoma rapidamente dopo l'inoculazione, mentre le altre linee hanno mostrato un ritardo in questa risposta di circa 42 ore.Le risposte di difesa sono associate ai geni TIR-NBS, CC-NBS-LRR e NBS-LRR, 10 proteine ​​coinvolte nella patogenesi, proteine ​​di trasferimento dei lipidi, endoglucano-1,3-β-glucosidasi, proteine ​​della parete cellulare ricche di glicina e geni dal percorso reattivo dell'ossigeno.Le prime risposte a 83A:476, inclusa un'attenta soppressione dei geni associati alla fotosintesi, hanno coinciso con una protezione efficace durante la fase di crescita vegetativa della biologia fungina, suggerendo che un effettore innesca l'immunità.La reazione di Mandeloop è rallentata, così come la resistenza orizzontale complessiva.
Il lupino a foglia stretta (NLL, Lupinus angustifolius L.) è un cereale ad alto contenuto proteico originario della regione del Mediterraneo occidentale1,2.Attualmente è coltivato come coltura alimentare per animali e umani.È anche considerato concime verde nei sistemi di rotazione delle colture a causa della fissazione dell'azoto da parte di batteri simbiotici che fissano l'azoto e del miglioramento generale della struttura del suolo.NLL ha subito un rapido processo di addomesticamento nel secolo scorso ed è ancora sotto forte pressione riproduttiva3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Con la diffusa coltivazione di NLL, il susseguirsi di funghi patogeni ha sviluppato nuove nicchie agricole e causato nuove malattie che distruggono i raccolti. Il più notevole per i coltivatori e gli allevatori di lupini è stata la comparsa di antracnosi, causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Il più notevole per i coltivatori e gli allevatori di lupini è stata la comparsa di antracnosi, causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Non è possibile utilizzare una soluzione antibatterica per i termosifoni e i selettori di liquido antideflagrante, che si adattano perfettamente a рибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. La cosa più importante per i coltivatori e gli allevatori di lupino è stata la comparsa dell'antracnosi causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Ha gedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Haired。1 Non è possibile utilizzare la batteria per il riscaldamento e la selezione di lamine per l'antrace, ma anche per evitare problemi грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. La cosa più sorprendente per gli allevatori e gli allevatori di lupino è l'emergenza dell'antracnosi causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Le prime segnalazioni della malattia provenivano dal Brasile e dagli Stati Uniti, con sintomi tipici che comparvero rispettivamente nel 1912 e nel 1929.Tuttavia, dopo circa 30 anni, l'agente patogeno è stato designato come Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo di Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .e H.Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。e H. Schlenk, .La fenotipizzazione preliminare della malattia eseguita a metà del XX secolo ha mostrato una certa resistenza nelle accessioni di NLL e di lupino giallo (L. luteus L.), ma tutte le accessioni di lupino bianco (L. albus L.) testate erano altamente suscettibili15,16.Gli studi hanno dimostrato che lo sviluppo di antracnosi è associato ad un aumento delle precipitazioni (umidità dell'aria) e della temperatura (nell'intervallo 12-28°C), portando a una violazione della resistenza a temperature più elevate17, 18. Infatti, il tempo necessario per la germinazione dei conidi e l'inizio della malattia era quattro volte più breve a 24°C (4 ore) che a 12°C (16 ore) in condizioni di elevata umidità19.Pertanto, il riscaldamento globale in corso ha portato alla diffusione dell'antracnosi.Tuttavia, la malattia è stata osservata in Francia (1982) e in Ucraina (1983) come presagio di una minaccia imminente, ma all'epoca fu apparentemente ignorata dall'industria del lupino20,21.Pochi anni dopo, questa devastante malattia si diffuse in tutto il mondo e colpì anche i maggiori paesi produttori di lupino come Australia, Polonia e Germania22,23,24.A seguito di un'epidemia di antracnosi a metà degli anni '90, un ampio screening ha portato all'identificazione di diversi donatori resistenti nei campioni di NLL19.La resistenza NLL all'antracnosi è controllata da due alleli dominanti separati trovati in diverse fonti di germoplasma: Lanr1 nella cultivar Tanjil e Wonga e AnMan nella cultivar.Mandalay 25, 26. Questi alleli completano i marcatori molecolari che supportano la selezione del germoplasma resistente nei programmi di riproduzione25,26,27,28,29,30.La linea riproduttiva resistente 83A:476 portatrice dell'allele Lanr1 è stata incrociata con la linea selvatica suscettibile P27255 per ottenere una segregazione della popolazione RIL per la resistenza all'antracnosi, che ha reso possibile assegnare il locus Lanr1 al cromosoma NLL-1131, 32, 33. lo stesso cromosoma (NLL-11), ma in posizioni diverse29,34,35.Tuttavia, a causa del numero ridotto di RIL e della grande distanza genetica tra marcatori e alleli corrispondenti, non è possibile trarre conclusioni affidabili sui loro geni sottostanti.D'altra parte, l'uso della genetica inversa nei lupini è difficile a causa del loro bassissimo potenziale di rigenerazione, che rende ingombrante la manipolazione genetica37.
Lo sviluppo del germoplasma addomesticato che porta l'allele desiderato nello stato omozigote, come 83A:476 (Lanr1) e Mandelup (AnMan), ha aperto la porta allo studio della resistenza all'antracnosi di fronte alla presenza di opposte combinazioni di alleli nelle popolazioni selvatiche.Possibilità di meccanismi molecolari.Confronta le risposte di difesa generate da genotipi specifici.Questo studio ha valutato la risposta precoce del trascrittoma della NLL alla vaccinazione con C. lupini.Innanzitutto, un pannello di germoplasma NLL europeo contenente 215 linee è stato sottoposto a screening utilizzando marcatori molecolari che contrassegnano gli alleli Lanr1 e AnMan.La fenotipizzazione dell'antracnosi è stata quindi eseguita su 50 linee NLL, precedentemente selezionate per marcatori molecolari, in condizioni controllate.Sulla base di questi esperimenti, sono state selezionate quattro linee diverse per resistenza all'antracnosi e composizione allelica Lanr1/AnMan per la profilazione dell'espressione genica della difesa differenziale utilizzando due approcci complementari: sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento e quantificazione della PCR in tempo reale.
Lo screening di un set di germoplasma NLL (N = 215) con marcatori Lanr1 (Anseq3 e Anseq4) e AnMan (Anseq4) e AnMan (AnManM1) ha mostrato che solo una linea (95726, vicino a Salamanca-b) amplifica l'allele "resistenza" per tutti i marcatori, mentre "Presenza di alleli 'suscettibili'" ha trovato la proporzione di tutti i marcatori in 158 (~73,5 %) righe.Tredici linee hanno prodotto due alleli "resistenti" del marcatore Lanr1 e 8 linee hanno prodotto alleli "resistenti" di Lanr1.marcatore.L'allele "resistenza" del marcatore AnMan (Tabella Supplementare S1).Due linee erano eterozigoti per il marcatore Anseq3 e una eterozigote per il marcatore AnManM1.42 linee (19,5%) portavano fasi opposte degli alleli Anseq3 e Anseq4, indicando un'alta frequenza di ricombinazione tra questi due loci.I fenotipi di antracnosi in condizioni controllate (Tabella Supplementare S2) hanno rivelato variabilità nella resistenza dei genotipi testati, che si rifletteva nella gravità dell'antracnosi.Le differenze nei punteggi medi variavano da 1,8 (moderatamente resistente) a 6,9 (sensibile) e le differenze di peso delle piante variavano da 0,62 (sensibile) a 4,45 g (resistente). C'era una correlazione significativa tra i valori osservati in due repliche dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P <0,0001) nonché tra questi due parametri (-0,59 e -0,77, P <0,0001). C'era una correlazione significativa tra i valori osservati in due repliche dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P <0,0001) così come tra questi due parametri (-0,59 e -0,77, P <0,0001). Выявлена ​​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяж ести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001 ) 0,0001). È stata trovata una correlazione significativa tra i valori osservati in due ripetizioni dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P <0,0001), nonché tra questi due parametri (- 0,59 e -0,77, P <0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0.51，P = 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0.5 1 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和– 0.59和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболе вания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. C'era una correlazione significativa tra i valori osservati in duplicato (punteggio di gravità della malattia 0,51, P = 0,00017 e peso della pianta 0,61, P <0,0001) e tra questi due parametri (-0,59 e -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).I sintomi tipici osservati nelle piante suscettibili includono l'attorcigliamento e la torsione dello stelo che ricorda una struttura ad "arco di pastore", seguita da lesioni ovali con sporozoiti arancioni/rosa (Figura 1 supplementare).Le accessioni australiane che portano i geni Lanr1 (83A:476 e Tanjil) e AnMan (Mandelup) sono moderatamente resistenti, 0,0331 e 0,0036).Alcune linee che portano anche alleli Lanr1 e/o AnMan “resistenti” mostrano i sintomi della malattia.
È interessante notare che alcune linee NLL prive di qualsiasi allele marcatore "resistente" hanno rivelato un alto livello di resistenza all'antracnosi (comparabile o superiore rispetto ai genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P <0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P <0,0001 per punteggio e 0,001 per peso della pianta) e Popolazione B-549/79b (valore P <0,0001 per punteggio e non -significativo per il peso). È interessante notare che alcune linee NLL prive di qualsiasi allele marcatore "resistente" hanno rivelato un alto livello di resistenza all'antracnosi (comparabile o superiore rispetto ai genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P <0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P <0,0001 per punteggio e 0,001 per peso della pianta) e Popolazione B-549/79b (valore P <0,0001 per punteggio e non -significativo per il peso). Interessante, che non è una linea NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий урове Non ci sono problemi con l'antrace (consigliato o con un sacco di soldi, come per la generazione di Lanr1 e AnMan), come Boregine (con P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) e популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). È interessante notare che diverse linee NLL prive di qualsiasi allele marcatore "resistente" hanno mostrato un alto livello di resistenza all'antracnosi (paragonabile o superiore a quello dei genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P <0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P <0,0001 per la valutazione e 0,001 per il peso della pianta) e popolazione B-549/79b (valore P <0,0001 per la valutazione) e non significativo per il peso).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 È interessante notare che alcuni sistemi NLL che non hanno marcatori "antigenici" mostrano un'elevata resistenza orizzontale (equivalente ai geni Lanr1 o AnMan o superiore), come Boregine (entrambi i parametri P <0,0001), Bojar (valore P <0,0001, peso della pianta 0,001) e ceppo B-549/79b (valore P <0,0001, peso non significativo). Interessante, che nekotorыe line NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни усто йчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), come Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) e популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). È interessante notare che alcune linee NLL prive di alleli marcatori di "resistenza" hanno mostrato alti livelli di resistenza all'antracnosi (paragonabili o superiori ai genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P per entrambi i parametri <0,0001), Bojar (valore P <0,0001, peso della pianta 0,001) e popolazione B-549/79b (valore P <0,0001, peso non significativo ).Questo fenomeno suggerisce la possibilità di una nuova fonte genetica di resistenza, spiegando la mancanza osservata di correlazione tra genotipi marcatori e fenotipi della malattia (valori P da ~0,42 a ~0,98).Pertanto, il test di Kolmogorov-Smirnov ha mostrato che i dati sulla resistenza all'antracnosi erano distribuiti approssimativamente normalmente per punteggi (valori P 0,25 e 0,11) e massa vegetale (valori P 0,47 e 0,55), suggerendo di ipotizzare che siano coinvolti più alleli rispetto a Lanr1 e AnMan.
Sulla base dei risultati dello screening della resistenza all'antracnosi, sono state selezionate 4 linee per l'analisi del trascrittoma: 83A:476, Boregine, Mandelup e Population 22660. Queste linee sono state testate nuovamente per la resistenza all'antrace negli esperimenti di inoculazione mediante sequenziamento dell'RNA, a condizione che fossero le stesse del test precedente.I valori del punteggio erano i seguenti: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) e popolazione 22660 (6,11 ± 1,29).
Il protocollo Illumina NovaSeq 6000 ha raggiunto una media di 40,5 coppie di Mread per campione (da 29,7 a 54,4 Mread) (Tabella supplementare S3).I punteggi di allineamento nella sequenza di riferimento variavano dal 75,5% all'88,6%.La correlazione media dei dati di conteggio delle letture tra varianti sperimentali tra repliche biologiche variava da 0,812 a 0,997 (media 0,959). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno rivelato alcuna espressione e gli altri 4785 geni sono stati espressi a un livello trascurabile (media di base <5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno rivelato alcuna espressione e gli altri 4785 geni sono stati espressi a un livello trascurabile (media di base <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незна чительном уровне (базовое среднее <5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno mostrato alcuna espressione e i restanti 4785 geni sono stati espressi a un livello trascurabile (media di base <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5 ）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную эксп рессию (базовое среднее значение <5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non erano espressi e i restanti 4785 geni avevano un'espressione trascurabile (media di base <5).Pertanto, il numero di geni considerati espressi (media base ≥ 5) durante l'esperimento era 27.468 (78, 1%) (Tabella Supplementare S4).
Dal primo punto temporale, tutte le linee NLL hanno risposto all'inoculazione di C. lupini (ceppo Col-08) riprogrammando il trascrittoma (Tabella 1), tuttavia, sono state osservate differenze significative tra le linee.Pertanto, la linea di resistenza 83A:476 (che trasporta il gene Lanr1) ha mostrato una significativa riprogrammazione del trascrittoma al primo punto temporale (6 hpi) con un aumento di 31-69 volte del numero di geni up e down isolati rispetto ad altri punti temporali in questo punto temporale.Inoltre, questo picco è stato di breve durata, poiché l'espressione di pochi geni è rimasta significativamente alterata al secondo punto temporale (12 hpi).È interessante notare che Boregine, che ha anche mostrato un alto livello di resistenza nel test dell'innesto, non ha subito una riprogrammazione trascrizionale così massiccia durante l'esperimento.Tuttavia, il numero di geni differenzialmente espressi (DEG) era lo stesso per Boregine e 83A:476 a 12 HPI.Sia Mandelup che la popolazione 22660 hanno mostrato picchi DEG nell'ultimo punto temporale (48 l/s), indicando un ritardo relativo nelle risposte di difesa.
Poiché 83A: 476 ha subito una massiccia riprogrammazione del trascrittoma in risposta a C. lupini a 6 HPI rispetto a tutte le altre linee, circa il 91% dei DEG osservati in questo momento erano specifici del lignaggio (Fig. 1).Tuttavia, c'era una certa sovrapposizione nelle prime risposte tra le linee di studio, poiché il 68,5%, 50,9% e 52,6% DEG in Boregine, Mandelup e la popolazione 22660, rispettivamente, si sovrapponevano a quelli trovati in 83A:476 in determinati momenti.Tuttavia, questi DEG rappresentavano solo una piccola frazione (0,97-1,70%) di tutti i DEG attualmente rilevati utilizzando 83A:476.Inoltre, 11 DEG di tutte le linee erano coerenti in questo momento (Tabelle Supplementari S4-S6), compresi i componenti comuni delle risposte di difesa delle piante: proteina di trasferimento dei lipidi (TanjilG_32225), enzima endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), due proteine ​​​​inducibili dallo stress come SAM22 (TanjilG_31528 e TanjilG_3153 1), proteina di base del lattice (TanjilG_32352) e due proteine ​​della parete cellulare strutturale ricche di glicina (TanjilG_19701 e TanjilG_19702).C'era anche una sovrapposizione relativamente elevata nelle risposte del trascrittoma tra 83A:476 e Boregine a 24 HPI (totale 16-38% DEG) e tra Mandelup e Popolazione 22660 a 48 HPI (totale 14-20% DEG).
Diagramma di Venn che mostra il numero di geni differenzialmente espressi (DEG) nelle linee di lupino a foglia stretta (NLL) inoculate con Colletotrichum lupini (ceppo Col-08 ottenuto dai campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, 1999).Le linee NLL analizzate sono state: 83A:476 (resistente, portatore dell'allele Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatore dell'allele AnMan) e popolazione 22660 (molto suscettibile).L'abbreviazione hpi sta per ore dopo la vaccinazione.I valori zero sono stati rimossi per semplificare il grafico.
L'insieme di geni sovraespressi a 6 hpi è stato analizzato per la presenza di domini del gene R canonico (Tabella Supplementare S7).Questo studio ha rivelato l'induzione del trascrittoma dei classici geni di resistenza alle malattie con domini NBS-LRR solo a 83A:476.Questo set consisteva in un gene TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinque geni CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 e tanjilg_16162) e quattro NBS-LR, Tanjilg_16162) e quattro NBS-LRRE (tanji lg_16162) così come Quattro NBS-Lrr (tanjilg_16162) e Quattro NBS-LRR (TANJILG_16162).Tutti questi geni hanno domini canonici disposti in sequenze conservate.Oltre ai geni del dominio NBS-LRR, diverse chinasi RLL sono state attivate a 6 hpi, vale a dire una in Boregine (TanjilG_19877), due in Mandelup (TanjilG_07141 e TanjilG_19877) e nella popolazione 22660 (TanjilG_09014 e TanjilG_10361) e due in 83A 27:47 6.
I geni con espressione significativamente alterata in risposta all'inoculazione con C. lupini (ceppo Col-08) sono stati sottoposti all'analisi di arricchimento di Gene Ontology (GO) (Tabella Supplementare S8). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato era "GO: 0006952 risposta di difesa" che appariva in 6 combinazioni su 16 (tempo × linea) con un alto significato (valore P <0, 001) (Fig. 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato era "GO: 0006952 risposta di difesa" che appariva in 6 combinazioni su 16 (tempo × linea) con un alto significato (valore P <0, 001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», которы й появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (ris. 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato era "GO: 0006952 risposta di difesa", che appariva in 6 combinazioni su 16 (tempo × lignaggio) con un alto significato (valore P <0, 001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Il termine del processo biologico più rappresentativo è "GO: 0006952 risposta di difesa", che appare in 6 delle 16 (时间×线) combinazioni, con un alto significato (valore P <0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato era "GO: 0006952 Defense Response", che appariva in 6 combinazioni su 16 (tempo × linea) con un alto significato (valore P <0, 001) (Fig. 2).Questo termine era sovrarappresentato in due punti temporali in 83A: 476 e Boregine (6 e 24 hpi) e in un punto temporale in Mandelup e Population 22660 (12 e 6 hpi, rispettivamente).Questo è un risultato atteso, che evidenzia la risposta antimicotica delle linee resistenti.Inoltre, 83A:476 ha risposto a C. lupini inducendo rapidamente geni correlati al burst ossidativo rappresentato dal termine "GO:0055114 processo redox", che indica una risposta di difesa specifica, mentre Boregine ha rivelato risposte di difesa specifiche, correlate al termine "GO".:0006950 Risposta allo stress”.Popolazione 22660 ha attivato la risposta di resistenza orizzontale che coinvolge metaboliti secondari, evidenziando l'eccessivo numero di termini “GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis” e “GO:0006722 Process of triterpene metabolic” (entrambi i termini appartengono allo stesso set di geni), tenendo conto dei risultati dell'analisi di arricchimento del termine GO, la stabilità della reazione di Mandelup era tra Boregine e Popolazione 22660. Inoltre, la reazione iniziale 83A: 476 (6 hpi) e la reazione ritardata Mandelup e Population 22660 includono il termine GO:0015979 'fotosintesi' e altri processi biologici correlati.
I termini di ontologia genica del bioprocesso selezionati nell'annotazione dei geni differenzialmente espressi durante le risposte del trascrittoma del lupino a foglia stretta (NLL) inoculato con lupino di antrace (ceppo Col-08 ottenuto dai campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, nel 1999) sono notevolmente esagerati.Le linee NLL analizzate erano: 83A:476 (resistente, portatore dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatore dell'allele omozigote AnMan) e popolazione 22660 (suscettibile).
Poiché questo studio mirava a identificare i geni che contribuiscono alla resistenza all'antracnosi, i geni assegnati ai termini GO "GO: 0006952 Defensive responses" e "GO: 0055114 Redox processs" sono stati analizzati con cut-off poiché la linea di base significa ≥ 30 con almeno una linea.× punto nel tempo che combina valori statisticamente significativi di log2 (fold change).Il numero di geni che soddisfacevano questi criteri era 65 per GO:0006952 e 524 per GO:0055114.
83A:476 ha rivelato due picchi DEG annotati con il termine GO:0006952, il primo a 6 geni per pollice (64 geni, regolazione in alto e in basso) e il secondo a 24 geni per pollice (15 geni, solo regolazione in alto).Boregine ha anche dimostrato che GO:0006952 ha raggiunto il picco nello stesso punto temporale, ma con meno DEG (11 e 8) e attivazione preferenziale.Mandeloop ha mostrato due picchi di GO:0006952 a 12 e 48 HPI, entrambi portatori di 12 geni (il primo con geni attivanti e il secondo con solo geni soppressivi), mentre la popolazione 22660 a 6 HPI (13 geni) ha avuto una maggiore predominanza del picco di aumento.regolamento.Va notato che il 96,4% di GO:0006952 DEG in questi picchi ha avuto lo stesso tipo di risposta (su o giù), indicando una significativa sovrapposizione nelle risposte di difesa nonostante le differenze nel numero di geni coinvolti.Il più grande gruppo di sequenze correlate al termine GO:0006952 codifica per la proteina 22 del messaggio associata allo stress da fame (simile a SAM22), che appartiene al clade proteico della proteina associata alla patogenesi di classe 10 (PR-10) e al lattice proteico centrale.proteina simile (tipo MLP)) (Fig. 3).I due gruppi differivano nella natura dell'espressione e nella direzione della risposta.I geni che codificano per le proteine ​​simili a SAM22 hanno mostrato un'induzione consistente e significativa nei primi momenti (6 o 12 hpi) e generalmente non rispondevano alla fine dell'esperimento (48 hpi), mentre le proteine ​​simili a MLP hanno mostrato coordinazione a 6 hpi.hpi.83A:476 e Mandelup a 48 hp/in, quasi tutti gli altri dati non rispondevano.Inoltre, le differenze nei profili di espressione dei geni proteici simili a SAM22 hanno seguito la variabilità osservata nella resistenza all'antracnosi, poiché le linee più resistenti avevano più punti temporali che inducevano in modo significativo questi geni rispetto ai geni più sensibili.Un altro gene PR-10 simile a LlR18A/B ha mostrato un modello di espressione molto simile al gene della proteina simile a SAM22.
Sono stati identificati i componenti principali del termine del processo biologico "GO: 0006952 Defense Response" e i modelli di espressione dei geni candidati degli alleli Lanr1 e AnMan.La scala Log2 rappresenta i valori log2 (cambiamento di piega) tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenute da campi di lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) e piante di controllo (sham-inoculate) nello stesso punto temporale.Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portante l'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portante l'allele omozigote AnMan) e Popolazione 22660 (suscettibile).
Inoltre, sono stati valutati i profili di espressione dei geni candidati RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) e AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3).Il gene TanjilG_05042 ha mostrato una risposta (attivazione) significativa a 83A:476 solo al primo punto temporale (6 hpi), mentre TanjilG_12861 era significativo in Mandeloop solo a due punti temporali: 6 hpi (regolazione ridotta) e 24 hpi (6 hpi).Con.).regolabile)).
I geni più sovraespressi nel termine GO:0055114 "processo redox" erano geni che codificano per le proteine ​​del citocromo P450 e perossidasi (Fig. 4).Per i campioni isolati da 83A:476 a 6 HPI, sono stati generalmente osservati valori massimi o minimi di log2 (fold change) (per l'86,6% dei geni) tra piante inoculate e controllo, evidenziando l'elevata risposta di questo genotipo al sesso inoculante.83A:476 mostrava il GO più significativo: 0055114 DEG a 6 hpi (503 geni), mentre il resto delle linee a 48 hpi (Boregine, 31 geni; Mandelup, 85 geni; e Popolazione 22660, 78 geni)).Nella maggior parte dei geni della famiglia GO:0055114 sono stati osservati due tipi di risposta alla vaccinazione (attivazione e inibizione).È interessante notare che fino al 97,6% dei DEG identificati per il termine GO: 0055114 in Mandelupe a 48 hp. Queste osservazioni suggeriscono che, nonostante la scala significativamente più piccola (cioè il numero di geni redox mutati, 85 contro 503), il modello delle risposte ritardate del trascrittoma del mandeloup all'antracnosi è simile alla risposta precoce di 83A:476.In Boregine e Popolazione 22660, questa convergenza è inferiore rispettivamente al 51,6% e al 75,6%.
Sono stati rivelati i modelli di espressione dei componenti principali del termine del processo biologico "GO:0055114 Redox process".La scala Log2 rappresenta i valori log2 (cambiamento di piega) tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenute da campi di lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) e piante di controllo (sham-inoculate) nello stesso punto temporale.Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portante l'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portante l'allele omozigote AnMan) e Popolazione 22660 (suscettibile).
83A:476 Le risposte trascrittomiche all'inoculazione con C. lupini (ceppo Col-08) includevano anche il silenziamento coordinato dei geni attribuiti al termine GO:0015979 "fotosintesi" e altri processi biologici correlati (FIG. 5).Questo set GO:0015979 DEG conteneva 105 geni che erano significativamente repressi a 6 hpi a 83A:476.In questo sottoinsieme, 37 geni sono stati anche sottoregolati in Mandelup a 48 HPI e 35 nello stesso momento nella popolazione 22660, inclusi 19 DEG comuni a entrambi i genotipi.Nessun DEG correlato al termine GO: 0015979 è stato attivato in modo significativo in qualsiasi combinazione (linea x tempo).
Sono stati rivelati i modelli di espressione dei componenti principali del termine del processo biologico "GO:0015979 fotosintesi".La scala Log2 rappresenta i valori log2 (cambiamento di piega) tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenute da campi di lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) e piante di controllo (sham-inoculate) nello stesso punto temporale.Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portante l'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portante l'allele omozigote AnMan) e Popolazione 22660 (suscettibile).
Sulla base dei risultati dell'analisi dell'espressione differenziale e presumibilmente coinvolto nelle risposte di difesa contro i funghi patogeni, questo insieme di sette geni è stato selezionato per la quantificazione dei profili di espressione mediante PCR in tempo reale (Tabella Supplementare S9).
Il gene proteico putativo TanjilG_10657 è stato significativamente indotto in tutte le linee e punti temporali studiati rispetto alle piante di controllo (mimiche) (Tabelle Supplementari S10, S11).Inoltre, il profilo di espressione di TanjilG_10657 ha mostrato una tendenza crescente nel corso dell'esperimento per tutte le linee.La popolazione 22660 ha mostrato la massima sensibilità di TanjilG_10657 all'inoculazione con attivazione di 114 volte e il livello di espressione relativo più alto (4, 4 ± 0, 4) a 24 HPI (Fig. 6a).Anche il gene della proteina PR10 LlR18A TanjilG_27015 ha mostrato l'attivazione su tutte le linee e punti temporali, con significatività statistica nella maggior parte dei punti dati (Fig. 6b).Simile a TanjilG_10657, il più alto livello di espressione relativa di TanjilG_27015 è stato osservato nella popolazione inoculata di 22660 a 24 HPI (19,5 ± 2,4).Il gene dell'endochitinasi acida TanjilG_04706 è stato significativamente sovraregolato in tutte le linee e in tutti i punti temporali ad eccezione di Boregine 6 hpi (Fig. 6c).È stato fortemente indotto al primo punto temporale (6 HPI) a 83A:476 (di 10,5 volte) e moderatamente aumentato in altre linee (di 6,6-7,5 volte).Durante l'esperimento, l'espressione di TanjilG_04706 è rimasta a livelli simili in 83A:476 e Boregine, mentre in Mandelup e Population 22660 è aumentata significativamente, raggiungendo valori relativamente elevati (rispettivamente 5,9 ± 1,5 e 6,2 ± 1,5).Il gene simile all'endoglucano-1,3-β-glucosidasi TanjilG_23384 ha mostrato un'elevata attivazione nei primi due punti temporali (6 e 12 hpi) in tutte le linee tranne la popolazione 22660 (Fig. 6d).I più alti livelli di espressione relativa di TanjilG_23384 sono stati osservati al secondo punto temporale (12 hpi) in Mandelup (2,7 ± 0,3) e 83A:476 (1,5 ± 0,1).A 24 HPI, l'espressione di TanjilG_23384 era relativamente bassa in tutte le linee studiate (da 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Profili di espressione di geni selezionati (ag) rivelati mediante PCR quantitativa.I numeri 6, 12 e 24 rappresentano le ore dopo la vaccinazione.I geni LanDExH7 e LanTUB6 sono stati utilizzati per la normalizzazione e LanTUB6 è stato utilizzato per la calibrazione inter-serie.Le barre di errore rappresentano la deviazione standard basata su tre repliche biologiche, ciascuna delle quali è la media di tre repliche tecniche. La significatività statistica delle differenze nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 dal campo di lupino a Wierzenica, Polonia) e le piante di controllo (fintamente inoculate) sono contrassegnate sopra i punti dati (* valore P <0,05, ** valore P ≤ 0,01, *** valore P ≤ 0,001). La significatività statistica delle differenze nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 dal campo di lupino a Wierzenica, Polonia) e le piante di controllo (fintamente inoculate) sono contrassegnate sopra i punti dati (* valore P <0,05, ** valore P ≤ 0,01, *** valore P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, шtammm Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Differenze statisticamente significative nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 da un campo di lupino a Wierzhenice, Polonia) e le piante di controllo (sham-inoculate) sono annotate sopra i punti dati (* valore P <0,05, ** valore P ≤ 0,01, *** valore P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, шtammm Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данн ых (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Differenze statisticamente significative nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenute dai campi di lupino a Verzhenice, in Polonia, nel 1999) e le piante di controllo (sham-inoculate) sono annotate sopra i punti dati (* valore P <0,05, ** valore P ≤ 0,01, *** valore P ≤ 0,001).Le linee NLL analizzate erano: 83A:476 (resistente, portatore dell'allele omozigote Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, portatore dell'allele omozigote AnMan), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto) e popolazione 22660 (suscettibile).
Il gene candidato TanjilG_05042 nel locus Lanr1 ha mostrato un pattern di espressione marcatamente diverso dai profili ottenuti dagli studi RNA-seq (Fig. 6e).Un'attivazione significativa di questo gene è stata osservata in Mandelup e nella popolazione 22660 (rispettivamente fino a 39,7 e 11,7 volte), con livelli di espressione relativamente elevati (rispettivamente fino a 1,4 ± 0,14 e 7,2 ± 1,3).83A:476 ha anche rivelato una sovraregolazione del gene TanjilG_05042 (fino a 3,8 volte), tuttavia, i livelli di espressione relativi raggiunti (0,044 ± 0,002) erano più di 30 volte inferiori a quelli osservati in Mandelup e nella popolazione 22660.analizzato mediante qPCR ha mostrato differenze significative nei livelli di espressione tra i genotipi nelle varianti mock-vaccinate (controllo), raggiungendo una differenza di 58 volte tra le popolazioni 22660 e 83A: 476, nonché tra le popolazioni 22660 e 22660. È stata raggiunta una differenza doppia tra Boregine e Mandalup.
Il gene candidato nel locus AnMan, TanjilG_12861, è stato attivato in risposta alla vaccinazione in 83A: 476 e Mandelup, era neutro nella popolazione 22660 ed è stato sottoregolato in Boregine (Fig. 6f).L'espressione relativa del gene TanjilG_12861 era la più alta nell'83A inoculato: 476 (0,14 ± 0,01).Il gene della proteina da shock termico di classe I da 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 ha mostrato livelli di espressione relativi inferiori in tutti i ceppi e punti temporali studiati (Fig. 6g).Il valore più alto è stato osservato a 24 HPI nella popolazione 22660 (0,14 ± 0,02, un aumento di otto volte in risposta alla vaccinazione).
Il confronto dei profili di espressione genica (Fig. 7) ha rivelato un'alta correlazione tra TanjilG_10657 e altri quattro geni: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) e TanjilG_04706 (r = 0,79).Tali risultati possono indicare la co-regolazione di questi geni durante le risposte di difesa.I geni TanjilG_12861 e TanjilG_23384 hanno mostrato profili di espressione diversi con valori del coefficiente di correlazione di Pearson inferiori (rispettivamente da 0,08 a 0,43 e da -0,19 a 0,28) rispetto ad altri geni.
Le correlazioni tra i profili di espressione genica sono state rilevate mediante PCR quantitativa.Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portante l'allele omozigote Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, portante l'allele omozigote AnMan), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto) e Popolazione 22660 (suscettibile).Sono stati calcolati tre punti temporali (6, 12 e 24 ore dopo l'inoculazione), comprese le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenute dai campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, nel 1999) e quelle di controllo (inoculate fittizie).La scala mostra il valore del coefficiente di correlazione di Pearson.
Sulla base dei dati ottenuti a 6 cavalli per pollice, WGCNA è stato eseguito su 9981 DEG identificato confrontando piante inoculate e di controllo per concentrarsi sulle prime risposte di difesa (Tabella Supplementare S12).Sono stati trovati ventidue moduli genici (cluster) con profili di espressione correlati (positivi o negativi) tra genotipi e varianti sperimentali. In media, i livelli di espressione genica erano discendenti nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo). In media, i livelli di espressione genica erano discendenti nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo). Nel corso degli ultimi 100 anni i genitori sono stati trovati in 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in varie varianti, однако, эта тен денция была сильнее у контрольных растений). In media, i livelli di espressione genica sono diminuiti nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> popolazione 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在 在 植物中 更）。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Nel corso degli ultimi 100 anni i genitori sono stati individuati in 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in base alle varianti della tendenza ия была сильнее у контрольных растений). In media, i livelli di espressione genica sono diminuiti nella serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (tuttavia, in entrambe le varianti, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo).La vaccinazione ha provocato una sovraregolazione dell'espressione genica, specialmente nei moduli 18, 19, 14, 6 e 1 (in ordine decrescente di effetto), regolazione negativa (ad esempio moduli 9 e 20) o con effetti neutri (ad esempio moduli 11, 22, 8 e 13).L'analisi dell'arricchimento del termine GO (Tabella supplementare S13) ha rivelato "GO: 0006952 Risposte protettive" per il modulo inoculato (18) con la massima attivazione, inclusi i geni analizzati da qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015), così come molti moduli di fotosintesi più soppressi di Inoculate (9).Il concentratore del modulo 18 (Fig. 8) è stato identificato come il gene TanjilG_26536 che codifica per la proteina LlR18B simile a PR-10 e il concentratore del modulo 9 è stato identificato come il gene TanjilG_28955 che codifica per la proteina PsbQ del fotosistema II.Un gene candidato per la resistenza all'antracnosi Lanr1, TanjilG_05042, è stato trovato nel modulo 22 (Fig. 9) ed è associato ai termini "GO: 0044260 Processi metabolici macromolecolari cellulari" e "GO: 0006355 Regolazione trascrizionale, DNA templating" che trasportano l'hub TanjilG_01212.il gene codifica per il fattore di trascrizione dello stress termico A-4a (HSFA4a).
Analisi di rete ponderata della coespressione genica di moduli con termini di processo biologico sovrarappresentati "GO: 0006952 Defense responses".La legatura è stata semplificata per evidenziare i quattro geni analizzati da qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015).
Analisi di rete ponderata della coespressione genica di un modulo con un termine di processo biologico sovrarappresentato "GO: 0006355: regolazione trascrizionale, templating del DNA" e che trasporta un gene candidato per la resistenza all'antracnosi Lanr1 TanjilG_05042.La legatura è stata semplificata per isolare il gene TanjilG_05042 e il gene centrale TanjilG_01212.
Lo screening della resistenza all'antracnosi raccolto in Australia ha mostrato che la maggior parte delle cultivar rilasciate per la prima volta erano suscettibili;Kalya, Coromup e Mandelup sono stati descritti come moderatamente resistenti, mentre Wonga, Tanjil e 83A:476 sono stati descritti come altamente resistenti26,27,31.aveva lo stesso allele di resistenza, designato Lanr1, e Coromup e Mandelup avevano un allele diverso, designato AnMan10, 26, 39, mentre Kalya trasmetteva un allele diverso., Lanr2.Lo screening per la resistenza all'antracnosi in Germania ha portato all'identificazione di una linea resistente Bo7212 con un allele candidato diverso da Lanr1, denominato LanrBo36.
Il nostro studio ha rivelato una frequenza molto bassa (circa il 6%) dell'allele Lanr1 nel germoplasma testato.Questa osservazione è coerente con i risultati dello screening del germoplasma dell'Europa orientale utilizzando i marcatori Anseq3 e Anseq4, che hanno mostrato che l'allele Lanr1 è presente solo in due linee bielorusse.Ciò suggerisce che l'allele Lanr1 non è ancora ampiamente utilizzato dai programmi di allevamento locali, a differenza dell'Australia, dove è uno degli alleli chiave per l'allevamento assistito da marcatori.Ciò potrebbe essere dovuto al livello inferiore di resistenza fornito dall'allele Lanr1 nelle condizioni di campo europee rispetto al rapporto australiano.Inoltre, studi sull'antracnosi in aree ad alta piovosità in Australia hanno dimostrato che le risposte di resistenza mediate dall'allele Lanr1 potrebbero non essere efficaci in condizioni meteorologiche che favoriscono la crescita e il rapido sviluppo del patogeno19,42.Infatti, nel presente studio, alcuni sintomi di antracnosi sono stati osservati anche nei genotipi portatori dell'allele Lanr1, suggerendo che la resistenza può scomparire in condizioni ottimali per lo sviluppo di C. lupini.Inoltre, sono possibili interpretazioni false positive della presenza di marcatori Anseq3 e Anseq4, che sono circa 1 cM dal locus Lanr1 28,30,43.
Il nostro studio ha dimostrato che 83A:476, che porta l'allele Lanr1, ha risposto all'inoculazione di C. lupini con una riprogrammazione del trascrittoma su larga scala al primo punto temporale analizzato (6 hpi), mentre in Mandelup, che porta l'allele AnMan, sono state osservate risposte trascrittomiche molto più tardi.(da 24 a 48 CV).Queste variazioni temporali nelle risposte di difesa sono associate a differenze nei sintomi della malattia, evidenziando l'importanza del riconoscimento precoce del patogeno per una risposta efficace alla resistenza.Per infettare il tessuto vegetale, le spore di antrace devono attraversare diversi stadi di sviluppo sulla superficie dell'ospite, tra cui la germinazione, la divisione cellulare e la formazione di un appressorio.Un'appendice è una struttura infettiva che si attacca alla superficie dell'ospite e facilita la penetrazione nei tessuti dell'ospite.Pertanto, le spore di C. gloeosporioides nell'estratto di pisello hanno mostrato la prima divisione del nucleo dopo 75-90 minuti di incubazione, la formazione di un tubo germinativo dopo 90-120 minuti e la soppressione dopo 4 ore45.Mango C. gloeosporioides ha mostrato più del 40% di germinazione conidiale dopo 3 ore di incubazione e circa il 20% di formazione di appressori dopo 4 ore.Il gene CAP20 associato alla virulenza di C. gloeosporioides ha mostrato attività trascrizionale nei conidi che formano epifiti dopo 3,5 ore di incubazione nella cera superficiale dell'avocado con alte concentrazioni di proteina CAP20 dopo 4 ore e 46 minuti.Allo stesso modo, l'attività dei geni della biosintesi della melanina in C. trifolii è stata indotta durante un'incubazione di 2 ore seguita dalla formazione di un appressorio dopo 1 ora.Studi sui tessuti fogliari hanno dimostrato che le fragole inoculate con C. acutatum hanno una prima soppressione a 8 hpi, mentre i pomodori inoculati con C. coccodes hanno una prima soppressione a 4 hpi48,49.ampiamente coerente con la scala temporale di Colletotrichum spp.processo infettivo.Le risposte di difesa rapida a 83A: 476 suggeriscono il coinvolgimento di geni di resistenza delle piante e di immunità innescata da effettori (ETI) in questa linea, mentre le risposte ritardate di Mandelup supportano l'ipotesi 50 dell'immunità innescata da schemi molecolari micro-associati (MTI). Prime risposte a 83A: 476 e Mandelup.Anche la parziale sovrapposizione tra geni sovraregolati o sottoregolati nella risposta ritardata supporta questo concetto, poiché l'ETI è spesso considerata una risposta MTI accelerata e potenziata che culmina nella morte cellulare programmata nel sito di infezione, nota come shock anafilattico51,52.
La maggior parte dei geni attribuiti al termine sovrarappresentato Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" sono gli 11 omologhi della proteina 22 del messaggio di digiuno indotto dallo stress (simile a SAM22) e i sette principali latex protein-like (MLP).-like proteine ​​31, 34, 43 e 423 hanno mostrato somiglianza di sequenza.I geni simili a SAM22 hanno mostrato un'attivazione significativa che è durata più a lungo, mostrando livelli aumentati di resistenza all'antracnosi (83A: 476 e Boregine).Tuttavia, i geni simili a MLP erano sottoregolati solo nelle linee che portavano l'allele di resistenza candidato (83A:476/Lanr1 a 6 hpi e Mandelup/AnMan a 24 hpi).Va notato che tutti gli omologhi simili a SAM22 identificati provengono da un cluster genico che copre circa 105 kb, mentre i geni simili a MLP provengono da regioni separate del genoma.L'attivazione coordinata di tali geni simili a SAM22 è stata trovata anche nel nostro precedente studio sulla resistenza NLL all'inoculazione di Diaporthetoxica, suggerendo che sono coinvolti nelle componenti orizzontali della risposta di difesa.Questa conclusione è supportata anche da segnalazioni di una risposta positiva di geni simili a SAM22 a lesioni o trattamenti con acido salicilico, induttori fungini o perossido di idrogeno.
È stato dimostrato che i geni simili a MLP rispondono a vari stress abiotici e biotici, comprese le infezioni fungine batteriche, virali e patogene in molte specie di piante55.Le direzioni di risposta a determinate interazioni tra piante e agenti patogeni variavano da un forte aumento (ad esempio, durante l'infestazione del cotone con Verticillium dahliae) a una significativa diminuzione (ad esempio, dopo l'infezione del melo con Alternaria spp.)56,57.Una significativa sottoregolazione del gene 423 simile a MLP è stata osservata durante le difese dell'avocado contro l'infezione da F. niger e durante l'infezione del melo Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola e Alternaria alternata sono patotipi del melo58,59.Inoltre, i calli di mela che sovraesprimevano il gene 423 simile a MLP avevano un'espressione inferiore dei geni associati alla resistenza ed erano più suscettibili alle infezioni fungine59.A seguito di Fusarium oxysporum f, il gene 423 simile a MLP è stato soppresso anche nel germoplasma del fagiolo comune resistente.cn.Infezione del fagiolo 60.
Altri membri della famiglia PR-10 identificati nel nostro studio RNA-seq erano i geni LlR18A e LlR18B in risposta alla sovraregolazione, nonché il gene sovraregolato (1 gene) o sottoregolato (3 geni) per la proteina di trasferimento dei lipidi DIR1..Inoltre, WGCNA evidenzia il gene LlR18B come hub in questo modulo, che è altamente suscettibile alla vaccinazione e porta diversi geni di risposta protettiva.I geni LlR18A e LlR18B sono stati indotti nelle foglie di lupino giallo in risposta a batteri patogeni, così come negli steli NLL dopo l'inoculazione di D.toxica, mentre l'omologo di questi geni nel riso, RSOsPR10, è stato rapidamente indotto da un'infezione fungina presumibilmente coinvolta nella via di segnalazione dell'acido jasmonico53,61,62. resistenza (SAR).Con lo sviluppo di reazioni protettive, la proteina DIR1 viene trasportata dal focolaio dell'infezione attraverso il floema per indurre SAR in organi distanti.È interessante notare che il gene TanjilG_02313 DIR1 è stato significativamente indotto al primo punto temporale nelle linee 84A: 476 e Popolazione 22660, ma la resistenza all'antracnosi si è sviluppata con successo solo nella linea 84A: 476.Ciò potrebbe indicare una subfunzionalizzazione del gene DIR1 in NLL, poiché i restanti tre omologhi hanno risposto all'inoculazione solo nella linea 83A:476 a 6 hpi e questa risposta era diretta verso il basso.
Nel nostro studio, i componenti più comuni corrispondenti al processo biologico chiamato "GO:0055114 processo Redox" erano la proteina del citocromo P450, la perossidasi, l'acido linoleico 9S-/13S-lipossigenasi e l'acido 1-amminociclopropano-1-carbossilico ossidasi.Inoltre, il nostro WGCNA definisce l'omologo HSFA4a come un hub che trasporta moduli come il candidato del gene di resistenza Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a è un componente della regolazione redox-dipendente della trascrizione nucleare nelle piante.
Le proteine ​​del citocromo P450 sono ossidoreduttasi che catalizzano le reazioni di idrossilazione NADPH e/o O2-dipendenti nel metabolismo primario e secondario, compreso il metabolismo degli xenobiotici, così come gli ormoni, gli acidi grassi, gli steroli, i componenti della parete cellulare, i biopolimeri e la biosintesi dei composti protettivi. un gran numero di omologhi alterati (37) e differenze nei modelli di risposta tra geni specifici, che riflettono una revisione al rialzo..Usare solo i dati RNA-seq per chiarire la presunta funzione biologica dei geni NLL in una superfamiglia proteica così grande sarebbe altamente speculativo.Tuttavia, vale la pena notare che alcuni geni del citocromo P450 sono associati a una maggiore resistenza a funghi o batteri patogeni, incluso un contributo alle reazioni allergiche69,70,71.
Le perossidasi di classe III sono enzimi vegetali multifunzionali coinvolti in un'ampia gamma di processi metabolici durante la crescita e lo sviluppo delle piante, nonché in risposta a stress ambientali come salinità, siccità, elevata intensità luminosa e attacco di agenti patogeni72.Le perossidasi sono coinvolte nell'interazione di diverse specie vegetali con Anthracis, tra cui Stylosanthes humilis e C. gloeosporioides, Lens culinaris e C. truncatum, Phaseolus vulgaris e C. lindemuthianum, Cucumis sativus e C. lagenarium73,74,75,76.La risposta è molto rapida, talvolta anche a 4 HPI, prima che il fungo penetri nel tessuto vegetale73.Il gene della perossidasi ha anche risposto all'inoculazione di D.toxica NLL.Oltre alle loro funzioni tipiche per regolare lo scoppio ossidativo o eliminare lo stress ossidativo, le perossidasi possono interferire con la crescita dei patogeni creando barriere fisiche basate sul rinforzo della parete cellulare durante la lignificazione, subunità o reticolazione di composti specifici.Questa funzione può essere attribuita in silico al gene TanjilG_03329 che codifica per una presunta perossidasi anionica formante lignina che è stata significativamente sovraregolata nel nostro studio nella linea resistente 83A:476 a 6 HPI, ma non in altri ceppi e punti temporali che non hanno risposto.
La 9S-/13S-lipossigenasi dell'acido linoleico è il primo passo nella via ossidativa della biosintesi dei lipidi78.I prodotti di questo percorso hanno molteplici funzioni nella difesa delle piante, incluso il rafforzamento della parete cellulare attraverso la formazione di depositi di callosio e pectina e la regolazione dello stress ossidativo attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno79,80,81,82,83.Nel presente studio, l'espressione dell'acido linoleico 9S-/13S-lipossigenasi è stata alterata in tutti i ceppi, ma nella popolazione suscettibile 22660, la sovraregolazione ha prevalso in diversi momenti, mentre nei ceppi portatori di Lanr1 resistente e dell'allele AnMan, sottolinea la diversificazione dello strato di ossilipina nelle reazioni protettive dell'antrace tra questi genotipi.
L'omologo 1-aminociclopropano-1-carbossilato ossidasi (ACO) era significativamente sovraregolato (9 geni) o sottoregolato (2 geni) quando inoculato con lupino.Con due eccezioni, tutte queste risposte si sono verificate a 6 hp.in 83A:476.La reazione enzimatica mediata dalle proteine ​​ACO è la fase che limita la velocità nella produzione di etilene ed è quindi altamente regolata84.L'etilene è un ormone vegetale che svolge una varietà di ruoli nella regolazione dello sviluppo delle piante e nella risposta a condizioni di stress abiotico e biotico.L'induzione della trascrizione ACO e l'attivazione della via di segnalazione dell'etilene sono coinvolte nell'aumento della resistenza del riso al fungo emibiotrofico oryzae oryzae regolando la produzione di specie reattive dell'ossigeno e fitoalessine.Un processo di infezione fogliare molto simile trovato tra M. oryzae e C. lupini88,89, sullo sfondo di una significativa sovraregolazione degli omologhi ACO nella linea 83A:476 riportata in questo studio, sposta la possibilità di conferire resistenza a NLL antracnosi Etilene un passaggio centrale di segnalazione nei percorsi molecolari .
Nel presente studio, la soppressione su larga scala di molti geni associati alla fotosintesi è stata osservata a 6 hpi in 83A:476 ea 48 hpi in Mandeloop e nella popolazione 22660.L'estensione e la progressione di questi cambiamenti è proporzionale al livello.In questo esperimento è stata osservata resistenza all'antracnosi.Recentemente, è stata segnalata una forte e precoce repressione delle trascrizioni correlate alla fotosintesi in diversi modelli di interazioni pianta-patogeno, inclusi batteri e funghi patogeni.La fretta (da 2 HPI in alcune interazioni) e la soppressione globale dei geni associati alla fotosintesi in risposta all'infezione possono innescare l'immunità delle piante basata sul dispiegamento di specie reattive dell'ossigeno e sulla loro interazione con la via dell'acido salicilico per mediare le reazioni allergiche 90,94.
In conclusione, i meccanismi di risposta di difesa proposti per il lignaggio più resistente (83A:476) includono il riconoscimento rapido del patogeno da parte del gene R (presumibilmente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) e la segnalazione dell'acido salicilico e dell'etilene mediata dalla risposta allergica, seguita dall'istituzione di SAR a lungo raggio.l'azione è supportata dalla proteina DIR-1.Va notato che il periodo biotrofico per l'infezione da C. lupini è molto breve (circa 2 giorni), seguito dalla crescita necrotica95.La transizione tra queste fasi può essere associata alla necrosi e all'espressione di proteine ​​​​inducibili dall'etilene che agiscono come trigger per reazioni di ipersensibilità nelle piante ospiti.Pertanto, la finestra temporale per il successo della cattura di C. lupini allo stadio biotrofico è molto stretta.La riprogrammazione dei geni associati all'ossidoriduzione e alla fotosintesi osservata in 83A:476 a 6 hpi è coerente con la progressione delle ife fungine e preannuncia lo sviluppo di una risposta protettiva di successo nella fase biotrofica.Le risposte trascrittomiche di Mandelup e della popolazione 22660 potrebbero essere troppo ritardate per catturare il fungo prima di passare alla crescita necrotica, tuttavia, Mandelup potrebbe essere più efficace della popolazione 22660 perché la regolazione relativamente rapida della proteina PR-10 promuove la resistenza orizzontale.
L'ETI, guidato dal gene canonico R, sembra essere un meccanismo comune per la resistenza dei fagioli all'antracnosi.Pertanto, nel legume modello Medicago truncatula, la resistenza all'antracnosi è conferita dal gene RCT1, un membro della classe del gene R della pianta TIR-NBS-LRR97.Questo gene conferisce anche una resistenza all'antracnosi ad ampio spettro nell'erba medica quando viene trasferita a piante sensibili.Nel fagiolo comune (P. vulgaris), fino ad oggi sono stati identificati più di due dozzine di geni di resistenza all'antracnosi.Alcuni di questi geni si trovano in regioni prive di geni R canonici, tuttavia molti altri si trovano ai bordi dei cromosomi che trasportano il cluster genico NBS-LRR, incluso TIR-NBS-LRRs99.Lo studio SSR su tutto il genoma ha anche confermato l'associazione del gene NBS-LRR con la resistenza all'antracnosi nel fagiolo comune.Il gene canonico R è stato trovato anche nella regione genomica che trasporta il principale locus di resistenza all'antracnosi nel lupino bianco 101.
Il nostro lavoro mostra che una reazione di resistenza immediata, attivata in una fase precoce dell'infezione della pianta (preferibilmente non oltre 12 hpi), protegge efficacemente il lupino a foglia stretta dall'antracnosi causata dal fungo patogeno Collelotrichum lupini.Utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento, abbiamo dimostrato profili di espressione differenziale dei geni di resistenza all'antracnosi nelle piante NLL mediate dai geni di resistenza Lanr1 e AnMan.Una difesa di successo comporta un'attenta progettazione dei geni per le proteine ​​coinvolte nell'ossidoriduzione, nella fotosintesi e nella patogenesi entro poche ore dal primo contatto della pianta con un agente patogeno.Simili reazioni protettive, ma ritardate nel tempo, sono molto meno efficaci nel proteggere le piante dalle malattie.La resistenza all'antrace mediata dal gene Lanr1 assomiglia alla tipica risposta rapida del gene R (immunità innescata dall'effettore), mentre il gene AnMan molto probabilmente fornisce una risposta orizzontale (immunità innescata da un modello molecolare associato al microbo), fornendo un livello moderato di sostenibilità.
Le 215 linee NLL utilizzate per lo screening dei marcatori di antracnosi erano costituite da 74 cultivar, 60 linee ottenute per incrocio o riproduzione, 5 mutanti e 76 germoplasmi selvatici o originali.Le linee provenivano da 17 paesi, principalmente da Polonia (58), Spagna (47), Germania (27), Australia (26), Russia (19), Bielorussia (7), Italia (5) e altre linee.da 10 paesi.Il set include anche linee resistenti di riferimento: 83A:476, Tanjil, Wonga che porta l'allele Lanr1 e Mandelup che porta l'allele AnMan.Le linee sono state ottenute dal database delle risorse genetiche del lupino europeo gestito da Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (tabella supplementare S1).
Le piante sono state coltivate in condizioni controllate (fotoperiodo 16 ore, temperatura 25°C durante il giorno e 18°C ​​durante la notte).Sono state analizzate due repliche biologiche.Il DNA è stato isolato da foglie di tre settimane utilizzando il kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Germania) secondo il protocollo.La qualità e la concentrazione del DNA isolato è stata valutata mediante metodi spettrofotometrici (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Il marcatore AnManM1 che segna il gene di resistenza all'antracnosi AnMan (derivato dalla cv. Mandelup) ei marcatori Anseq3 e Anseq4 che fiancheggiano il gene Lanr1 (derivato dalla cv. Tanjil) sono stati analizzati 11,26,28.Gli omozigoti per l'allele resistente sono stati valutati come "1", suscettibili - come "0" e eterozigoti - come 0,5.
Sulla base dei risultati dello screening per i marcatori AnManM1, AnSeq3 e AnSeq4 e della disponibilità di semi per gli esperimenti finali di follow-up, sono state selezionate 50 linee NLL per la fenotipizzazione della resistenza all'antracnosi.L'analisi è stata eseguita in duplicato in una serra controllata da computer con un fotoperiodo di 14 ore con un intervallo di temperatura di 22°C durante il giorno e 19°C durante la notte.I semi vengono grattati (tagliando il rivestimento del seme sul lato opposto dell'embrione con una lama affilata) prima della semina per evitare la dormienza del seme a causa del rivestimento del seme troppo duro e per garantire una germinazione uniforme.Le piante sono state coltivate in vasi (11 × 11 × 21 cm) con terreno sterile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsavia, Polonia).L'inoculazione è stata effettuata con il ceppo Colletotrichum lupini Col-08, coltivato nel 1999 dagli steli di piante di lupino a foglia stretta coltivate in un campo a Verzhenitsa, Grande Polonia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Ottieni un'area.Gli isolati sono stati coltivati ​​in terreno SNA a 20°C sotto luce nera per 21 giorni per indurre la sporulazione.Quattro settimane dopo la semina, quando le piante avevano raggiunto lo stadio di 4-6 foglie, è stata effettuata l'inoculazione mediante irrorazione con una sospensione di conidi alla concentrazione di 0,5 x 106 conidi per ml.Dopo l'inoculazione le piante sono state mantenute al buio per 24 ore ad un'umidità di circa il 98% ed una temperatura di 25°C per facilitare la germinazione dei conidi ed il processo di infezione.Le piante sono state quindi coltivate in un fotoperiodo di 14 ore a 22°C giorno/19°C notte e 70% di umidità.Il punteggio della malattia è stato effettuato 22 giorni dopo l'inoculazione e variava da 0 (immune) a 9 (molto suscettibile) a seconda della presenza o assenza di lesioni necrotiche su steli e foglie.Inoltre, dopo il punteggio, è stato misurato il peso delle piante.Le relazioni tra i genotipi dei marcatori e i fenotipi della malattia sono state calcolate come correlazioni punto due sequenze (assenza di marcatori eterozigoti nell'insieme di linee per l'analisi del fenotipo di resistenza all'antracnosi).