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È necessario un sistema in vitro affidabile in grado di riprodurre accuratamente l'ambiente fisiologico del cuore per i test antidroga.La disponibilità limitata di sistemi di coltura del tessuto cardiaco umano ha portato a interpretazioni imprecise degli effetti dei farmaci cardiaci.Qui, abbiamo sviluppato un modello di coltura del tessuto cardiaco (CTCM) che stimola elettromeccanicamente le fette di cuore e subisce un allungamento fisiologico durante le fasi sistolica e diastolica del ciclo cardiaco.Dopo 12 giorni di coltura, questo approccio ha parzialmente migliorato la vitalità delle sezioni cardiache, ma non ha preservato completamente la loro integrità strutturale.Pertanto, dopo lo screening di piccole molecole, abbiamo scoperto che l'aggiunta di 100 nM di triiodotironina (T3) e 1 μM di desametasone (Dex) al nostro mezzo ha mantenuto la microstruttura delle sezioni per 12 giorni.In combinazione con il trattamento T3/Dex, il sistema CTCM ha mantenuto i profili trascrizionali, la vitalità, l'attività metabolica e l'integrità strutturale allo stesso livello del tessuto cardiaco fresco per 12 giorni.Inoltre, l'eccessivo allungamento del tessuto cardiaco in coltura induce la segnalazione cardiaca ipertrofica, fornendo prove della capacità del CTCM di imitare le condizioni ipertrofiche indotte dall'allungamento cardiaco.In conclusione, CTCM può modellare la fisiologia e la fisiopatologia del cuore in coltura per lunghi periodi di tempo, consentendo uno screening farmacologico affidabile.
Prima della ricerca clinica, sono necessari sistemi in vitro affidabili in grado di riprodurre accuratamente l'ambiente fisiologico del cuore umano.Tali sistemi dovrebbero imitare l'allungamento meccanico, la frequenza cardiaca e le proprietà elettrofisiologiche alterate.I modelli animali sono comunemente usati come piattaforma di screening per la fisiologia cardiaca con un'affidabilità limitata nel riflettere gli effetti dei farmaci nel cuore umano1,2.In definitiva, l'Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) è un modello altamente sensibile e specifico per vari interventi terapeutici e farmacologici, che riproduce fedelmente la fisiologia e la fisiopatologia del cuore umano3.L'assenza di un tale sistema limita la scoperta di nuovi trattamenti per l'insufficienza cardiaca4,5 e ha portato alla cardiotossicità dei farmaci come motivo principale per l'uscita dal mercato6.
Negli ultimi dieci anni, otto farmaci non cardiovascolari sono stati ritirati dall'uso clinico perché causano un prolungamento dell'intervallo QT che porta ad aritmie ventricolari e morte improvvisa7.Pertanto, vi è una crescente necessità di strategie di screening preclinico affidabili per valutare l'efficacia e la tossicità cardiovascolare.Il recente utilizzo di cardiomiociti derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPS-CM) nello screening dei farmaci e nei test di tossicità fornisce una soluzione parziale a questo problema.Tuttavia, la natura immatura di hiPS-CM e la mancanza di complessità multicellulare del tessuto cardiaco sono i principali limiti di questo metodo.Studi recenti hanno dimostrato che questa limitazione può essere in parte superata utilizzando l'hiPS-CM precoce per formare idrogel di tessuto cardiaco poco dopo l'inizio delle contrazioni spontanee e aumentando gradualmente la stimolazione elettrica nel tempo.Tuttavia, questi microtessuti hiPS-CM mancano delle proprietà elettrofisiologiche e contrattili mature del miocardio adulto.Inoltre, il tessuto cardiaco umano ha una struttura più complessa, costituita da una miscela eterogenea di diversi tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali, neuroni e fibroblasti stromali, interconnessi da gruppi specifici di proteine ​​della matrice extracellulare.Questa eterogeneità delle popolazioni non cardiomiocitarie11,12,13 nel cuore dei mammiferi adulti è un ostacolo importante alla modellazione del tessuto cardiaco utilizzando i singoli tipi di cellule.Queste principali limitazioni sottolineano l'importanza di sviluppare metodi per coltivare tessuto miocardico intatto in condizioni fisiologiche e patologiche.
Le sezioni sottili coltivate (300 µm) del cuore umano hanno dimostrato di essere un modello promettente di miocardio umano intatto.Questo metodo fornisce l'accesso a un sistema multicellulare 3D completo simile al tessuto cardiaco umano.Tuttavia, fino al 2019, l'uso di sezioni cardiache in coltura era limitato dalla breve sopravvivenza della coltura (24 ore).Ciò è dovuto a una serie di fattori tra cui la mancanza di allungamento fisico-meccanico, l'interfaccia aria-liquido e l'uso di mezzi semplici che non supportano le esigenze del tessuto cardiaco.Nel 2019, diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che l'incorporazione di fattori meccanici nei sistemi di coltura del tessuto cardiaco può prolungare la durata della coltura, migliorare l'espressione cardiaca e imitare la patologia cardiaca.Due eleganti studi 17 e 18 mostrano che il carico meccanico uniassiale ha un effetto positivo sul fenotipo cardiaco durante la coltura.Tuttavia, questi studi non hanno utilizzato il carico fisico-meccanico tridimensionale dinamico del ciclo cardiaco, poiché le sezioni cardiache sono state caricate con forze di trazione isometriche 17 o carico auxotonico lineare 18 .Questi metodi di allungamento dei tessuti hanno portato alla soppressione di molti geni cardiaci o alla sovraespressione di geni associati a risposte di allungamento anomale.In particolare, Pitoulis et al.19 hanno sviluppato un bagno dinamico di coltura di fette di cuore per la ricostruzione del ciclo cardiaco utilizzando il feedback del trasduttore di forza e le unità di tensione.Sebbene questo sistema consenta una modellazione del ciclo cardiaco in vitro più accurata, la complessità e la bassa produttività del metodo limitano l'applicazione di questo sistema.Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un sistema di coltura semplificato utilizzando la stimolazione elettrica e un mezzo ottimizzato per mantenere la vitalità di sezioni di tessuto cardiaco suino e umano fino a 6 giorni20,21.
Nell'attuale manoscritto, descriviamo un modello di coltura del tessuto cardiaco (CTCM) utilizzando sezioni del cuore suino che incorpora segnali umorali per ricapitolare la fisiologia cardiaca tridimensionale e la distensione fisiopatologica durante il ciclo cardiaco.Questo CTCM può aumentare l'accuratezza della previsione preclinica dei farmaci a un livello mai raggiunto prima, fornendo un sistema cardiaco a rendimento medio economico che imita la fisiologia/patofisiologia del cuore dei mammiferi per i test preclinici sui farmaci.
I segnali meccanici emodinamici svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della funzione dei cardiomiociti in vitro 22,23,24.Nell'attuale manoscritto, abbiamo sviluppato un CTCM (Figura 1a) che può imitare l'ambiente cardiaco adulto inducendo la stimolazione sia elettrica che meccanica a frequenze fisiologiche (1,2 Hz, 72 battiti al minuto).Per evitare un eccessivo allungamento del tessuto durante la diastole, è stato utilizzato un dispositivo di stampa 3D per aumentare le dimensioni del tessuto del 25% (Fig. 1b).La stimolazione elettrica indotta dal sistema C-PACE è stata programmata per iniziare 100 ms prima della sistole utilizzando un sistema di acquisizione dati per riprodurre completamente il ciclo cardiaco.Il sistema di coltura tissutale utilizza un attuatore pneumatico programmabile (LB Engineering, Germania) per espandere ciclicamente una membrana di silicone flessibile per provocare l'espansione delle fette di cuore nella camera superiore.Il sistema è stato collegato ad una linea d'aria esterna attraverso un trasduttore di pressione, che ha permesso di regolare con precisione la pressione (± 1 mmHg) e il tempo (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Fissare la sezione di tessuto all'anello di supporto da 7 mm, mostrato in blu, all'interno della camera di coltura del dispositivo.La camera di coltura è separata dalla camera d'aria da una sottile membrana flessibile in silicone.Posizionare una guarnizione tra ciascuna camera per evitare perdite.Il coperchio del dispositivo contiene elettrodi di grafite che forniscono stimolazione elettrica.b Rappresentazione schematica del dispositivo per tessuti grandi, dell'anello guida e dell'anello di supporto.Le sezioni di tessuto (marrone) vengono posizionate sul dispositivo sovradimensionato con l'anello guida posizionato nella scanalatura sul bordo esterno del dispositivo.Utilizzando la guida, posizionare con cura l'anello di supporto rivestito con adesivo acrilico tissutale sopra la sezione di tessuto cardiaco.c Grafico che mostra il tempo di stimolazione elettrica in funzione della pressione della camera d'aria controllata da un attuatore pneumatico programmabile (PPD).Un dispositivo di acquisizione dati è stato utilizzato per sincronizzare la stimolazione elettrica mediante sensori di pressione.Quando la pressione nella camera di coltura raggiunge la soglia impostata, viene inviato un segnale a impulsi al C-PACE-EM per attivare la stimolazione elettrica.d Immagine di quattro CTCM posizionati su uno scaffale dell'incubatore.Quattro dispositivi sono collegati a un PPD tramite un circuito pneumatico e i sensori di pressione sono inseriti nella valvola emostatica per monitorare la pressione nel circuito pneumatico.Ogni dispositivo contiene sei sezioni di tessuto.
Utilizzando un singolo attuatore pneumatico, siamo stati in grado di controllare 4 dispositivi CTCM, ognuno dei quali poteva contenere 6 sezioni di tessuto (Fig. 1d).In CTCM, la pressione dell'aria nella camera d'aria viene convertita in pressione sincrona nella camera del fluido e induce l'espansione fisiologica della fetta di cuore (Figura 2a e Film supplementare 1).Valutazione dell'allungamento tissutale a 80 mm Hg.Arte.ha mostrato lo stiramento delle sezioni di tessuto del 25% (Fig. 2b).È stato dimostrato che questo allungamento percentuale corrisponde a una lunghezza fisiologica del sarcomero di 2,2–2,3 µm per la normale contrattilità della sezione cardiaca17,19,25.Il movimento dei tessuti è stato valutato utilizzando le impostazioni personalizzate della fotocamera (Figura supplementare 1).L'ampiezza e la velocità del movimento del tessuto (Fig. 2c, d) corrispondevano all'allungamento durante il ciclo cardiaco e al tempo durante la sistole e la diastole (Fig. 2b).L'allungamento e la velocità del tessuto cardiaco durante la contrazione e il rilassamento sono rimasti costanti per 12 giorni in coltura (Fig. 2f).Per valutare l'effetto della stimolazione elettrica sulla contrattilità durante la coltura, abbiamo sviluppato un metodo per determinare la deformità attiva utilizzando un algoritmo di ombreggiatura (Figura 2a, b supplementare) e siamo stati in grado di distinguere tra deformità con e senza stimolazione elettrica.La stessa sezione del cuore (Fig. 2f).Nella regione mobile del taglio (R6-9), la tensione durante la stimolazione elettrica era superiore del 20% rispetto all'assenza di stimolazione elettrica, il che indica il contributo della stimolazione elettrica alla funzione contrattile.
Tracce rappresentative della pressione della camera d'aria, della pressione della camera del fluido e delle misurazioni del movimento del tessuto confermano che la pressione della camera cambia la pressione della camera del fluido, provocando un movimento corrispondente della fetta di tessuto.b Tracce rappresentative dell'allungamento percentuale (blu) delle sezioni di tessuto corrispondenti all'allungamento percentuale (arancione).c Il movimento misurato della fetta cardiaca è coerente con la velocità di movimento misurata.(d) Traiettorie rappresentative del movimento ciclico (linea blu) e della velocità (linea tratteggiata arancione) in una fetta del cuore.e Quantificazione del tempo di ciclo (n = 19 fette per gruppo, da diversi maiali), tempo di contrazione (n = 19 fette per gruppo), tempo di rilassamento (n = 19 fette per gruppo, da diversi maiali), movimento dei tessuti (n = 25).fette)/gruppo di suini diversi), velocità sistolica di picco (n = 24(D0), 25(D12) fette/gruppo di suini diversi) e tasso di rilassamento massimo (n=24(D0), 25(D12) fette/gruppo di suini diversi).Il test t di Student a due code non ha mostrato differenze significative in nessun parametro.f Tracce di analisi della deformazione rappresentativa di sezioni di tessuto con stimolazione elettrica (rossa) e senza (blu), dieci aree regionali di sezioni di tessuto della stessa sezione.I pannelli inferiori mostrano la quantificazione della differenza percentuale di deformazione nelle sezioni di tessuto con e senza stimolazione elettrica in dieci aree di diverse sezioni. (n = 8 fette/gruppo di maiali diversi, viene eseguito il test t di Student a due code; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 fette/gruppo di maiali diversi, viene eseguito il test t di Student a due code; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-criterio Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sezioni/gruppo di suini diversi, t-test di Student a due code; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sezioni/gruppo, da suini diversi, t-test di Student a due code; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Nel nostro precedente sistema di coltura di fette di cuore biomimetico statico [20, 21], abbiamo mantenuto la vitalità, la funzione e l'integrità strutturale delle fette di cuore per 6 giorni applicando la stimolazione elettrica e ottimizzando la composizione del mezzo.Tuttavia, dopo 10 giorni, queste cifre sono diminuite drasticamente.Faremo riferimento a sezioni coltivate nel nostro precedente sistema di coltura biomimetica statica 20, 21 condizioni di controllo (Ctrl) e utilizzeremo il nostro mezzo precedentemente ottimizzato come condizioni MC e coltura sotto stimolazione meccanica ed elettrica simultanea (CTCM).chiamato .Innanzitutto, abbiamo determinato che la stimolazione meccanica senza stimolazione elettrica era insufficiente per mantenere la vitalità dei tessuti per 6 giorni (Figura 3a, b supplementare).È interessante notare che, con l'introduzione della stimolazione fisiomeccanica ed elettrica mediante STCM, la vitalità delle sezioni cardiache di 12 giorni è rimasta la stessa delle sezioni cardiache fresche in condizioni di SM, ma non in condizioni Ctrl, come mostrato dall'analisi MTT (Fig. 1).3a).Ciò suggerisce che la stimolazione meccanica e la simulazione del ciclo cardiaco possono mantenere vitali le sezioni di tessuto per il doppio del tempo riportato nel nostro precedente sistema di coltura statica.Tuttavia, la valutazione dell'integrità strutturale delle sezioni di tessuto mediante immunoetichettatura della troponina cardiaca T e della connessina 43 ha mostrato che l'espressione della connessina 43 era significativamente più alta nei tessuti MC il giorno 12 rispetto ai controlli lo stesso giorno.Tuttavia, l'espressione uniforme della connessina 43 e la formazione del disco Z non sono state completamente mantenute (figura 3b).Utilizziamo un framework di intelligenza artificiale (AI) per quantificare l'integrità strutturale dei tessuti26, una pipeline di deep learning basata su immagini basata sulla colorazione di troponina-T e connessina43 per quantificare automaticamente l'integrità strutturale e la fluorescenza delle fette di cuore in termini di forza della localizzazione.Questo metodo utilizza una rete neurale convoluzionale (CNN) e un framework di apprendimento profondo per quantificare in modo affidabile l'integrità strutturale del tessuto cardiaco in modo automatizzato e imparziale, come descritto nel riferimento.26. Il tessuto MC ha mostrato una migliore somiglianza strutturale rispetto al giorno 0 rispetto alle sezioni di controllo statico.Inoltre, la colorazione tricromica di Masson ha rivelato una percentuale significativamente inferiore di fibrosi in condizioni di SM rispetto alle condizioni di controllo al giorno 12 della coltura (Fig. 3c).Sebbene il CTCM abbia aumentato la vitalità delle sezioni di tessuto cardiaco al giorno 12 a un livello simile a quello del tessuto cardiaco fresco, non ha migliorato significativamente l'integrità strutturale delle sezioni cardiache.
un grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità MTT di fettine di cuore fresco (D0) o coltura di fettine di cuore per 12 giorni in coltura statica (D12 Ctrl) o in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fettine/gruppo di suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e ** p < 0 .01 rispetto a D12 Ctrl). un grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità MTT di fette di cuore fresco (D0) o coltura di fette di cuore per 12 giorni in coltura statica (D12 Ctrl) o in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) fette/gruppo di suini diversi, viene eseguito il test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl).l'istogramma mostra la quantificazione della vitalità delle sezioni di cuore fresco MTT (D0) o della coltura di sezioni cardiache per 12 giorni in coltura statica (D12 controllo) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 controllo).), 12 (D12 MC) sezioni/gruppo di diversi suini, viene eseguito un test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001 по сравнению с D0 e **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养1 2 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ct rl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D 12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)istogramma che mostra la quantificazione della vitalità MTT in sezioni di cuore fresco (D0) o sezioni di cuore coltivate per 12 giorni in coltura statica (D12 controllo) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 controllo)), 12 (D12 MC) sezioni/gruppo di diversi suini, test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 rispetto a D0, **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), connessina 43 (rossa) e DAPI (blu) in sezioni cardiache appena isolate (D0) o sezioni cardiache coltivate in condizioni statiche (Ctrl) o condizioni CTCM (MC) per 12 giorni) di immagini rappresentative di immunofluorescenza (scala vuota = 100 µm). Quantificazione dell'intelligenza artificiale dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuna da un maiale diverso, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p <0,0001 rispetto a D0 e ****p <0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Quantificazione dell'intelligenza artificiale dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuna da suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p <0,0001 rispetto a D0 e ****p <0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Количествен riesco a груп о р рзз с виней, проводия однофактор scart Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppi di suini diversi, test ANOVA unidirezionale eseguito; #### p <0,0001 vs. con D0 e ****p <0,0001 rispetto a D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuna di maiale diverso, test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0. 0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuna di maiali diversi, test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0. 0001 与D12 Ctrl 相比）. Intelletto istantaneo per la combinazione di tasti di scelta rapida (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) сре зов/группу каждой из разных свиней, односторонний test ANOVA;####p <0,0001 vs. Intelligenza artificiale per quantificare l'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppo ciascuna di suini diversi, test ANOVA unidirezionale; ####p<0,0001 vs .D0 Per confronto ****p <0,0001 rispetto a D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) per le fette di cuore colorate con la macchia tricromica di Masson (Scala nuda = 500 µm) (n = 10 fette/gruppo ciascuna da maiale diverso, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p <0,0001 rispetto a D0 e ***p <0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) per le fette di cuore macchiate con la macchia tricromica di Masson (Scala nuda = 500 µm) (n = 10 fette/gruppo ciascuna da suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p <0,0001 rispetto a D0 e ***p <0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителе м Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 in corrispondenza di D0 e ***p < 0,001 in corrispondenza di D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) delle sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (scala non rivestita = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo di suini diversi, test ANOVA unidirezionale eseguito; #### p <0,0001 rispetto a D0 e ***p <0,001 rispetto a D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪, 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，*** p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) e количественный ANALYZ (SPRAва) срезов сердца, окрашенных трихромным красителе м Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофактор ного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 per la risoluzione con D0, ***p < 0,001 per la risoluzione con D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) delle sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (vuoto = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo, ciascuna di un maiale diverso, testate mediante analisi della varianza unidirezionale; ### # p <0,0001 rispetto a D0, ***p <0,001 rispetto a D12 Ctrl).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Abbiamo ipotizzato che aggiungendo piccole molecole al mezzo di coltura, l'integrità dei cardiomiociti potrebbe essere migliorata e lo sviluppo della fibrosi ridotto durante la coltura CTCM.Abbiamo quindi eseguito lo screening per piccole molecole utilizzando le nostre colture di controllo statico20,21 a causa del numero ridotto di fattori di confusione.Per questa schermata sono stati scelti desametasone (Dex), triiodotironina (T3) e SB431542 (SB).Queste piccole molecole sono state precedentemente utilizzate nelle colture hiPSC-CM per indurre la maturazione dei cardiomiociti aumentando la lunghezza del sarcomero, i tubuli T e la velocità di conduzione.Inoltre, è noto che sia Dex (un glucocorticoide) che SB sopprimono l'infiammazione29,30.Pertanto, abbiamo testato se l'inclusione di una o una combinazione di queste piccole molecole migliorerebbe l'integrità strutturale delle sezioni cardiache.Per lo screening iniziale, la dose di ciascun composto è stata selezionata in base alle concentrazioni comunemente utilizzate nei modelli di coltura cellulare (1 μM Dex27, 100 nM T327 e 2,5 μM SB31).Dopo 12 giorni di coltura, la combinazione di T3 e Dex ha prodotto un'integrità strutturale ottimale dei cardiomiociti e un rimodellamento fibroso minimo (Figure supplementari 4 e 5).Inoltre, l'uso del doppio o del doppio di queste concentrazioni di T3 e Dex ha prodotto effetti deleteri rispetto alle concentrazioni normali (Figura 6a, b supplementare).
Dopo lo screening iniziale, abbiamo eseguito un confronto testa a testa di 4 condizioni di coltura (Figura 4a): Ctrl: sezioni cardiache coltivate nella nostra coltura statica precedentemente descritta utilizzando il nostro mezzo ottimizzato;20.21 TD: mercoledì T3 e Ctrl hanno aggiunto Dex;MC: sezioni di cuore coltivate in CTCM utilizzando il nostro terreno precedentemente ottimizzato;e MT: CTCM con T3 e Dex aggiunti al mezzo.Dopo 12 giorni di coltivazione, la vitalità dei tessuti MS e MT è rimasta la stessa dei tessuti freschi valutati mediante test MTT (Fig. 4b).È interessante notare che l'aggiunta di T3 e Dex alle colture transwell (TD) non ha comportato un miglioramento significativo della vitalità rispetto alle condizioni Ctrl, indicando un ruolo importante della stimolazione meccanica nel mantenere la vitalità delle sezioni cardiache.
un diagramma di progettazione sperimentale che illustra le quattro condizioni di coltura utilizzate per valutare gli effetti della stimolazione meccanica e dell'integrazione di T3/Dex su terreno per 12 giorni. b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fette/gruppo di suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p < 0,0001, ### p < 0 .001 rispetto a D0 e **p < 0.01 rispetto a D12 Ctrl). b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fette/gruppo di suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p < 0,0001, ### p < 0 .001 rispetto a D0 e **p < 0.01 rispetto a D12 ctrl). b Il tasso di cambio di frequenza è di circa 12 giorni dopo la durata di 4 mesi. овиях культивирования (CONTROLLO, TD, MC E MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 1 2 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA;####p < 0,0001, ###p < 0,001 per сравнению с D0 e **p < 0,01 in corrispondenza di D12 Ctrl). b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità a 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) sezioni/gruppo di diversi suini, test ANOVA unidirezionale; #### p < 0,0001, ### p < 0,0 01 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，####p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (controllo, TD, MC e MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 п о сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Istogramma che mostra tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) confrontate con sezioni di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), da diversi suini 12 (D12 MC) sezioni/gruppo, test ANOVA unidirezionale; 12). c Il grafico a barre mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 6 fette/gruppo di suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ###p <0,001, rispetto a D0 e ***p <0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Il grafico a barre mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 6 fette/gruppo di suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ###p <0,001, rispetto a D0 e ***p <0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усло виях культивирования (Controllo, TD, MC e MT) per le vincite delle vincite (D0) (n = 6 срезов/группу от разных сви ней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c L'istogramma mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 6 sezioni/gruppo di suini diversi, test ANOVA unidirezionale eseguito; ###p <0,001 rispetto a D0 e ***p <0,001 rispetto a D12 Ctrl). C 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 与 新鲜 心脏 切片 (d0) 相比 ， 培养 后 12 天 的 葡萄糖 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 不同 猪 ， ， 单向 执行 anova 测试 ### P <0.001 与 与 ， ， ， 相比 ， ， ， 相比 相比 ， 组 组 组 ， ， 不同 猪 ， ， ， 单向 执行 Anova 测试 ； ### P <0.001 2 ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (controllo, TD, MC e MT) по сравнению со со свежими сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разны х свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (controllo). c Istogramma che mostra la quantificazione del flusso di glucosio a 12 giorni dopo la coltura per tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 6 sezioni/gruppo, da suini diversi, sono stati eseguiti test ANOVA unilaterali, ###p <0,001 rispetto a D0, ***p <0,001 rispetto a D12 (controllo).d Tracciati di analisi della deformazione di tessuti freschi (blu), giorno 12 MC (verde) e giorno 12 MT (rosso) in dieci punti di sezione di tessuto regionale (n = 4 sezioni/gruppo, test ANOVA unidirezionale; non vi era alcuna differenza significativa tra i gruppi).e Grafico del vulcano che mostra i geni espressi in modo differenziato nelle sezioni di cuore fresco (D0) rispetto alle sezioni di cuore coltivate in condizioni statiche (Ctrl) o in condizioni MT (MT) per 10-12 giorni.f Heatmap dei geni del sarcomero per le sezioni cardiache coltivate in ciascuna delle condizioni di coltura.Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
La dipendenza metabolica dal passaggio dall'ossidazione degli acidi grassi alla glicolisi è un segno distintivo della dedifferenziazione dei cardiomiociti.I cardiomiociti immaturi utilizzano principalmente il glucosio per la produzione di ATP e hanno mitocondri ipoplastici con poche creste5,32.Le analisi sull'utilizzo del glucosio hanno mostrato che in condizioni MC e MT, l'utilizzo del glucosio era simile a quello nei tessuti del giorno 0 (Figura 4c).Tuttavia, i campioni Ctrl hanno mostrato un aumento significativo dell'utilizzo del glucosio rispetto al tessuto fresco.Ciò indica che la combinazione di CTCM e T3/Dex migliora la vitalità dei tessuti e preserva il fenotipo metabolico delle sezioni cardiache coltivate di 12 giorni.Inoltre, l'analisi del ceppo ha mostrato che i livelli di ceppo sono rimasti gli stessi del tessuto cardiaco fresco per 12 giorni in condizioni di MT e MS (Fig. 4d).
Per analizzare l'impatto complessivo di CTCM e T3/Dex sul panorama trascrizionale globale del tessuto cardiaco, abbiamo eseguito RNAseq su fette cardiache da tutte e quattro le diverse condizioni di coltura (dati supplementari 1).È interessante notare che le sezioni MT hanno mostrato un'elevata somiglianza trascrizionale con il tessuto cardiaco fresco, con solo 16 espressi in modo differenziato su 13.642 geni.Tuttavia, come abbiamo mostrato in precedenza, le sezioni Ctrl mostravano 1229 geni espressi in modo differenziato dopo 10-12 giorni di coltura (Fig. 4e).Questi dati sono stati confermati da qRT-PCR dei geni del cuore e dei fibroblasti (Figura 7a-c supplementare).È interessante notare che le sezioni Ctrl hanno mostrato una sottoregolazione dei geni cardiaci e del ciclo cellulare e l'attivazione di programmi genici infiammatori.Questi dati suggeriscono che la dedifferenziazione, che normalmente si verifica dopo una coltura a lungo termine, è completamente attenuata in condizioni MT (Figura 8a, b supplementare).Un attento studio dei geni del sarcomero ha mostrato che solo in condizioni MT i geni che codificano il sarcomero (Fig. 4f) e il canale ionico (Figura 9 supplementare) sono conservati, proteggendoli dalla soppressione in condizioni Ctrl, TD e MC.Questi dati dimostrano che con una combinazione di stimolazione meccanica e umorale (T3/Dex), il trascrittoma della fetta di cuore può rimanere simile alle fette di cuore fresco dopo 12 giorni di coltura.
Questi risultati trascrizionali sono supportati dal fatto che l'integrità strutturale dei cardiomiociti nelle sezioni cardiache è meglio conservata in condizioni MT per 12 giorni, come mostrato dalla connessina 43 intatta e localizzata (Fig. 5a).Inoltre, la fibrosi nelle sezioni cardiache in condizioni MT era significativamente ridotta rispetto a Ctrl e simile alle sezioni cardiache fresche (Fig. 5b).Questi dati dimostrano che la combinazione di stimolazione meccanica e trattamento con T3/Dex preserva efficacemente la struttura cardiaca nelle sezioni cardiache in coltura.
a Immagini rappresentative di immunofluorescenza di troponina-T (verde), connessina 43 (rossa) e DAPI (blu) in sezioni cardiache appena isolate (D0) o coltivate per 12 giorni in tutte e quattro le condizioni di coltura della sezione cardiaca (barra della scala = 100 µm).). Quantificazione dell'intelligenza artificiale dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fette/gruppo di suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p <0,0001 rispetto a D0 e *p <0,05, o ****p <0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Quantificazione dell'intelligenza artificiale dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo di suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p <0,0001 rispetto a D0 e *p <0,05 o ****p <0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани serдца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 T D, D12 MC e D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 e *p < 0,05 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco utilizzando l'intelligenza artificiale (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo di suini diversi, test ANOVA unidirezionale eseguito; #### p <0,0001 rispetto a D0 e *p <0,05 o ****p <0,0001 rispetto a D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比） 。Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco utilizzando l'intelligenza artificiale in diversi suini (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo) con un test ANOVA unidirezionale;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05 o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione per le fette di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (barra della scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fette/gruppo di diversi maiali, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p <0,0001 rispetto a D0 e *** p <0,001 o **** p <0. 0001 rispetto a D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione per le fette di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (barra della scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fette/gruppo di diversi maiali, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p <0,0001 rispetto a D0 e *** p <0,001 o **** p <0. 0001 rispetto a D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов SERдца, окрашенных трихромным красителем Массона (мас штабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione delle sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (barra della scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni/gruppo di suini diversi, eseguita ANOVA unidirezionale; 12 CTRL). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或**** p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов SERдца, окрашенных трихромом Массона (масштабная LIN ейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по срав нению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione delle sezioni cardiache colorate con tricromia di Masson (barra della scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni di diversi suini/gruppo, un metodo ANOVA; ####p <0,0001 rispetto a D0, ***p <0,001 o ****p <0,0001 rispetto a D12 C trl).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Infine, la capacità del CTCM di imitare l'ipertrofia cardiaca è stata valutata aumentando l'allungamento del tessuto cardiaco.In CTCM, la pressione massima della camera d'aria è aumentata da 80 mmHg a 80 mmHg.Arte.(allungamento normale) fino a 140 mmHg N° art.(figura 6a).Ciò corrisponde a un aumento del 32% dell'allungamento (Fig. 6b), che era stato precedentemente mostrato come l'allungamento percentuale corrispondente richiesto affinché le sezioni cardiache raggiungessero una lunghezza del sarcomero simile a quella osservata nell'ipertrofia.L'allungamento e la velocità del tessuto cardiaco durante la contrazione e il rilassamento sono rimasti costanti durante i sei giorni di coltura (Fig. 6c).Il tessuto cardiaco da condizioni MT è stato sottoposto a condizioni di stiramento normale (MT (Normal)) o overstretch (MT (OS)) per sei giorni.Già dopo quattro giorni di coltura, il biomarcatore ipertrofico NT-ProBNP era significativamente elevato nel mezzo in condizioni MT (OS) rispetto alle condizioni MT (normali) (Fig. 7a).Inoltre, dopo sei giorni di coltura, la dimensione delle cellule in MT (OS) (Fig. 7b) è aumentata significativamente rispetto alle sezioni del cuore MT (normale).Inoltre, la traslocazione nucleare NFATC4 era significativamente aumentata nei tessuti sovraccarichi (Fig. 7c).Questi risultati mostrano il progressivo sviluppo del rimodellamento patologico dopo l'iperdistensione e supportano il concetto che il dispositivo CTCM può essere utilizzato come piattaforma per studiare la segnalazione dell'ipertrofia cardiaca indotta dallo stiramento.
Tracce rappresentative della pressione della camera d'aria, della pressione della camera del fluido e delle misurazioni del movimento del tessuto confermano che la pressione della camera cambia la pressione della camera del fluido, provocando un movimento corrispondente della fetta di tessuto.b Curve rappresentative della percentuale di allungamento e della velocità di allungamento per sezioni di tessuto normalmente allungate (arancione) e eccessivamente allungate (blu).c Grafico a barre che mostra il tempo di ciclo (n = 19 strati per gruppo, di suini diversi), il tempo di contrazione (n = 18-19 strati per gruppo, di suini diversi), il tempo di rilassamento (n = 19 strati per gruppo, di suini diversi), l'ampiezza del movimento dei tessuti (n = 14 strati/gruppo, di suini diversi), la velocità sistolica massima (n = 14 strati/gruppo, di suini diversi) e il tasso di rilassamento massimo (n = 14 (D0). 15 (D6) ) sezioni/gruppi) di suini diversi), il test t di Student a due code non ha mostrato differenze significative in alcun parametro, indicando che questi parametri sono rimasti costanti durante 6 giorni di coltura con sovratensione.Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
a Quantificazione del grafico a barre della concentrazione di NT-ProBNP nei terreni di coltura da fette di cuore coltivate in condizioni di allungamento normale MT (Norm) o overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fette/gruppo di diversi suini, viene eseguita l'ANOVA a due vie; ** p <0,01 rispetto all'allungamento normale). una quantificazione del grafico a barre della concentrazione di NT-ProBNP nei terreni di coltura da fette di cuore coltivate in condizioni di allungamento normale MT (Norm) o overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fette/gruppo di diversi suini, viene eseguita l'ANOVA a due vie; ** p <0,01 rispetto allo stiramento normale).Istogramma quantitativo della concentrazione di NT-ProBNP nel terreno di coltura da fette di cuore coltivate in condizioni di normale allungamento MT (norma) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4).MTOS) fette/gruppo di suini diversi, viene eseguita l'analisi a due fattori della varianza;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 rispetto all'allungamento normale). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01 ）。 a Quantificazione della concentrazione di NT-ProBNP in fettine di cuore coltivate in condizioni di allungamento normale (Norm) o overstretch (OS) MT (n = 4 (D2 MTOS, D4 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) da diversi 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **rispetto allo stretching normale, p<0,01).istogramma Quantificazione delle concentrazioni di NT-ProBNP in fette di cuore coltivate in condizioni di allungamento MT normale (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTOS) fette/gruppo da suini diversi, analisi della varianza a due vie;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 rispetto all'allungamento normale). b Immagini rappresentative per fette di cuore colorate con troponina-T e WGA (a sinistra) e quantificazione delle dimensioni delle cellule (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 diverse fette di diversi maiali, Viene eseguito il t-test Student a due code; **** p <0,0001 rispetto al tratto normale). b Immagini rappresentative per fette di cuore colorate con troponina-T e WGA (a sinistra) e quantificazione delle dimensioni delle cellule (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 diverse fette di diversi maiali, Viene eseguito il t-test di Student a due code; **** p <0,0001 rispetto al normale allungamento). b Репрезентативные изображения срезов SERдца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определен ия размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х востовой t-criterio Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Immagini rappresentative di sezioni cardiache colorate con troponina-T e AZP (a sinistra) e quantificazione delle dimensioni delle cellule (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 diverse sezioni di diversi maiali, è stato eseguito il test t di Student a due code; ****p <0,0001 rispetto al ceppo normale). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS） ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Immagini rappresentative di fette di cuore colorate con calcareina-T e WGA (sinistra) e dimensione cellulare (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 da 10 diverse fette (D6 MTNorm)) Cellule/组，两方法有尾学生t test；rispetto allo stiramento normale，****p <0,0001). b Репрезентативные изображения срезов SERдца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка разм ера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) di 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 rispetto alla frequenza normale). b Immagini rappresentative di sezioni cardiache colorate con troponina-T e AZP (a sinistra) e quantificazione della dimensione cellulare (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) da 10 diverse sezioni di diversi suini) Cellule/gruppo, criterio a due code Student's t;****p < 0,0001 rispetto al ceppo normale). c Immagini rappresentative per le fette di cuore MTOS del giorno 0 e del giorno 6 immunomarcate per troponina-T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nei nuclei dei CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppo da diversi maiali, viene eseguito il t-test Student a due code; * p <0,05). c Immagini rappresentative per le fette di cuore MTOS del giorno 0 e del giorno 6 immunomarcate per troponina-T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nei nuclei dei CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppo da diversi maiali, Viene eseguito il t-test Student a due code; * p <0,05). c Identificazione rappresentativa per velocità di trasmissione di 0 e 6 giorni MTOS, immunità per troponia-Т e NFATC4, e количественна я оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двуст оронний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Immagini rappresentative per sezioni cardiache a 0 e 6 giorni MTOS, immunomarcate per troponina-T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione NFATC4 nel nucleo delle cellule cavernose (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppo da diversi suini) ha eseguito il test t di Student a due code;*p<0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Immagini rappresentative di fette di cuore con immunoetichettatura di calcanin-T e NFATC4 第0天和第6天MTOS e NFATC4 da diverse quantità di nucleo cellulare NFATC4 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Rappresentazione dell'isolamento della velocità di trasmissione MTOS a 0 e 6 giorni per l'immunità troponica e NFATC4 e alimentazione я оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-criterina Стьюдента; * p<0,05). c Immagini rappresentative di fette di cuore MTOS al giorno 0 e 6 per l'immunoetichettatura di troponina-T e NFATC4 e la quantificazione della traslocazione di NFATC4 nel nucleo di CM da diversi suini (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppo, criterio t a due code Student's; * p <0,05).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
La ricerca cardiovascolare traslazionale richiede modelli cellulari che riproducano accuratamente l'ambiente cardiaco.In questo studio è stato sviluppato e caratterizzato un dispositivo CTCM in grado di stimolare sezioni ultrasottili del cuore.Il sistema CTCM include la stimolazione elettromeccanica fisiologicamente sincronizzata e l'arricchimento di fluidi T3 e Dex.Quando le sezioni di cuore suino sono state esposte a questi fattori, la loro vitalità, integrità strutturale, attività metabolica ed espressione trascrizionale sono rimaste le stesse del tessuto cardiaco fresco dopo 12 giorni di coltura.Inoltre, l'eccessivo stiramento del tessuto cardiaco può causare ipertrofia del cuore causata dall'iperestensione.Nel complesso, questi risultati supportano il ruolo critico delle condizioni fisiologiche di coltura nel mantenimento di un normale fenotipo cardiaco e forniscono una piattaforma per lo screening dei farmaci.
Molti fattori contribuiscono a creare un ambiente ottimale per il funzionamento e la sopravvivenza dei cardiomiociti.I più ovvi di questi fattori sono correlati a (1) interazioni intercellulari, (2) stimolazione elettromeccanica, (3) fattori umorali e (4) substrati metabolici.Le interazioni fisiologiche cellula-cellula richiedono complesse reti tridimensionali di più tipi di cellule supportate da una matrice extracellulare.Tali interazioni cellulari complesse sono difficili da ricostruire in vitro mediante co-coltura di singoli tipi di cellule, ma possono essere facilmente ottenute utilizzando la natura organotipica delle sezioni cardiache.
L'allungamento meccanico e la stimolazione elettrica dei cardiomiociti sono fondamentali per il mantenimento del fenotipo cardiaco33,34,35.Mentre la stimolazione meccanica è stata ampiamente utilizzata per il condizionamento e la maturazione hiPSC-CM, diversi studi eleganti hanno recentemente tentato la stimolazione meccanica di fette di cuore in coltura utilizzando il carico uniassiale.Questi studi dimostrano che il carico meccanico uniassiale 2D ha un effetto positivo sul fenotipo del cuore durante la coltura.In questi studi, le sezioni del cuore sono state caricate con forze di trazione isometriche17, carico auxotonico lineare18 oppure il ciclo cardiaco è stato ricreato utilizzando il feedback del trasduttore di forza e le unità di tensione.Tuttavia, questi metodi utilizzano l'allungamento del tessuto uniassiale senza ottimizzazione ambientale, con conseguente soppressione di molti geni cardiaci o sovraespressione di geni associati a risposte di allungamento anomale.Il CTCM qui descritto fornisce uno stimolo elettromeccanico 3D che imita il ciclo cardiaco naturale in termini di tempo di ciclo e allungamento fisiologico (allungamento 25%, sistole 40%, diastole 60% e 72 battiti al minuto).Sebbene questa stimolazione meccanica tridimensionale da sola non sia sufficiente per mantenere l'integrità del tessuto, è necessaria una combinazione di stimolazione umorale e meccanica utilizzando T3/Dex per mantenere adeguatamente la vitalità, la funzione e l'integrità del tessuto.
I fattori umorali svolgono un ruolo importante nella modulazione del fenotipo del cuore adulto.Ciò è stato evidenziato negli studi HiPS-CM in cui T3 e Dex sono stati aggiunti ai terreni di coltura per accelerare la maturazione cellulare.Il T3 può influenzare il trasporto di amminoacidi, zuccheri e calcio attraverso le membrane cellulari36.Inoltre, T3 promuove l'espressione di MHC-α e la downregulation di MHC-β, promuovendo la formazione di miofibrille a contrazione rapida nei cardiomiociti maturi rispetto alle miofibrille a contrazione lenta nel CM fetale.Il deficit di T3 nei pazienti ipotiroidei determina la perdita delle bande miofibrillari e un ridotto tasso di sviluppo del tono37.Dex agisce sui recettori glucocorticoidi e ha dimostrato di aumentare la contrattilità miocardica nei cuori perfusi isolati;38 si ritiene che questo miglioramento sia correlato all'effetto sull'ingresso guidato dai depositi di calcio (SOCE) 39,40.Inoltre, Dex si lega ai suoi recettori, provocando un'ampia risposta intracellulare che sopprime la funzione immunitaria e l'infiammazione30.
I nostri risultati indicano che la stimolazione fisica meccanica (MS) ha migliorato le prestazioni complessive della coltura rispetto a Ctrl, ma non è riuscita a mantenere la vitalità, l'integrità strutturale e l'espressione cardiaca per 12 giorni in coltura.Rispetto a Ctrl, l'aggiunta di T3 e Dex alle colture CTCM (MT) ha migliorato la vitalità e ha mantenuto profili di trascrizione simili, integrità strutturale e attività metabolica con tessuto cardiaco fresco per 12 giorni.Inoltre, controllando il grado di allungamento del tessuto, è stato creato un modello di ipertrofia cardiaca indotta da iperestensione utilizzando STCM, che illustra la versatilità del sistema STCM.Va notato che sebbene il rimodellamento cardiaco e la fibrosi di solito coinvolgano organi intatti le cui cellule circolanti possono fornire le citochine appropriate così come la fagocitosi e altri fattori di rimodellamento, le sezioni del cuore possono ancora imitare il processo fibrotico in risposta a stress e traumi.nei miofibroblasti.Questo è stato precedentemente valutato in questo modello di fetta cardiaca.Va notato che i parametri CTCM possono essere modulati modificando la pressione/l'ampiezza elettrica e la frequenza per simulare molte condizioni come tachicardia, bradicardia e supporto circolatorio meccanico (cuore meccanico senza carico).Ciò rende il sistema un throughput medio per i test antidroga.La capacità di CTCM di modellare l'ipertrofia cardiaca indotta da sforzi eccessivi apre la strada per testare questo sistema per una terapia personalizzata.In conclusione, il presente studio dimostra che l'allungamento meccanico e la stimolazione umorale sono fondamentali per mantenere la coltura delle sezioni di tessuto cardiaco.
Sebbene i dati qui presentati suggeriscano che CTCM è una piattaforma molto promettente per modellare il miocardio intatto, questo metodo di coltura presenta alcune limitazioni.Il limite principale della cultura CTCM è che impone continue sollecitazioni meccaniche dinamiche sulle fette, che preclude la capacità di monitorare attivamente le contrazioni della fetta cardiaca durante ogni ciclo.Inoltre, a causa delle ridotte dimensioni delle sezioni cardiache (7 mm), la capacità di valutare la funzione sistolica al di fuori dei sistemi di coltura utilizzando sensori di forza tradizionali è limitata.Nell'attuale manoscritto, abbiamo parzialmente superato questa limitazione valutando la tensione ottica come indicatore della funzione contrattile.Tuttavia, questa limitazione richiederà ulteriore lavoro e potrebbe essere affrontata in futuro introducendo metodi per il monitoraggio ottico della funzione delle fette di cuore in coltura, come la mappatura ottica utilizzando coloranti sensibili al calcio e alla tensione.Un'altra limitazione del CTCM è che il modello di lavoro non manipola lo stress fisiologico (precarico e postcarico).In CTCM, la pressione è stata indotta in direzioni opposte per riprodurre il 25% di allungamento fisiologico in diastole (allungamento completo) e sistole (lunghezza della contrazione durante la stimolazione elettrica) in tessuti molto grandi.Questa limitazione dovrebbe essere rimossa nei futuri progetti CTCM mediante un'adeguata pressione sul tessuto cardiaco da entrambi i lati e applicando le esatte relazioni pressione-volume che si verificano nelle camere del cuore.
Il rimodellamento indotto dall'overstretch riportato in questo manoscritto è limitato all'imitazione dei segnali ipertrofici dell'iperstretch.Pertanto, questo modello può aiutare nello studio della segnalazione ipertrofica indotta dall'allungamento senza la necessità di fattori umorali o neurali (che non esistono in questo sistema).Sono necessari ulteriori studi per aumentare la molteplicità del CTCM, ad esempio la co-coltura con cellule immunitarie, i fattori umorali del plasma circolante e l'innervazione quando la co-coltura con cellule neuronali migliorerà le possibilità di modellizzazione della malattia con CTCM.
In questo studio sono stati utilizzati tredici maiali.Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Louisville.L'arco aortico è stato clampato e il cuore è stato perfuso con 1 L di cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL eparina, pH fino a 7,4); i cuori sono stati conservati in una soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto in laboratorio su ghiaccio, che di solito è <10 min. i cuori sono stati conservati in una soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto in laboratorio su ghiaccio, che di solito è <10 min. Serdца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 min. i cuori sono stati conservati in una soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto al laboratorio su ghiaccio, che di solito richiede <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Derivare dal cardiopalmo principale per il trasporto in laboratorio a lungo, entro 10 minuti. Tenere i cuori su ghiaccio cardioplegia fino al trasporto al laboratorio in ghiaccio, di solito <10 min.
Il dispositivo CTCM è stato sviluppato con il software CAD (Computer-Aided Design) SolidWorks.Le camere di coltura, i divisori e le camere d'aria sono realizzati in plastica acrilica trasparente CNC.L'anello di supporto di 7 mm di diametro è realizzato in polietilene ad alta densità (HDPE) al centro e presenta una scanalatura per o-ring per accogliere l'o-ring in silicone utilizzato per sigillare il supporto sottostante.Una sottile membrana di silice separa la camera di coltura dalla piastra di separazione.La membrana in silicone è tagliata al laser da un foglio di silicone spesso 0,02 pollici e ha una durezza di 35A.Le guarnizioni in silicone inferiore e superiore sono tagliate al laser da un foglio di silicone spesso 1/16″ e hanno una durezza di 50A.Viti e dadi ad alette in acciaio inossidabile 316L vengono utilizzati per fissare il blocco e creare una chiusura ermetica.
Un circuito stampato (PCB) dedicato è progettato per essere integrato con il sistema C-PACE-EM.Le prese del connettore della macchina svizzera sul PCB sono collegate agli elettrodi di grafite mediante fili di rame argentato e viti di bronzo 0-60 avvitate negli elettrodi.Il circuito stampato è posizionato nel coperchio della stampante 3D.
Il dispositivo CTCM è controllato da un attuatore pneumatico programmabile (PPD) che crea una pressione circolatoria controllata simile a un ciclo cardiaco.All'aumentare della pressione all'interno della camera d'aria, la membrana flessibile in silicone si espande verso l'alto, spingendo il mezzo sotto il sito del tessuto.L'area del tessuto sarà quindi allungata da questa espulsione di fluido, imitando l'espansione fisiologica del cuore durante la diastole.Al culmine del rilassamento, la stimolazione elettrica veniva applicata attraverso elettrodi di grafite, che riducevano la pressione nella camera d'aria e provocavano la contrazione delle sezioni di tessuto.All'interno del tubo è presente una valvola emostatica con un sensore di pressione per rilevare la pressione nel sistema dell'aria.La pressione rilevata dal sensore di pressione viene applicata a un raccoglitore di dati collegato al laptop.Ciò consente il monitoraggio continuo della pressione all'interno della camera a gas.Quando è stata raggiunta la pressione massima della camera (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), è stato ordinato al dispositivo di acquisizione dati di inviare un segnale al sistema C-PACE-EM per generare un segnale di tensione bifasico per 2 ms, impostato su 4 V.
Sono state ottenute sezioni cardiache e le condizioni di coltura in 6 pozzetti sono state eseguite come segue: Trasferire i cuori raccolti dal recipiente di trasferimento in un vassoio contenente cardioplegia fredda (4°C).Il ventricolo sinistro è stato isolato con una lama sterile e tagliato in pezzi di 1-2 cm3.Questi blocchi di tessuto sono stati attaccati a supporti tissutali con adesivo tissutale e posti in un bagno di tessuto microtomo vibrante contenente la soluzione di Tyrode e continuamente ossigenato (3 g/L 2,3-butandione monoossima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucosio (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml di soluzione 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml di soluzione 1 M), fino a 1 L ddH2O).Il microtomo vibrante è stato impostato per tagliare fette spesse 300 µm a una frequenza di 80 Hz, un'ampiezza di vibrazione orizzontale di 2 mm e una velocità di avanzamento di 0,03 mm/s.Il bagno di tessuto è stato circondato da ghiaccio per mantenere la soluzione fresca e la temperatura è stata mantenuta a 4°C.Trasferire le sezioni di tessuto dal bagno del microtomo a un bagno di incubazione contenente la soluzione Tyrode continuamente ossigenata sul ghiaccio fino a quando non si ottengono abbastanza sezioni per una piastra di coltura.Per le colture transwell, le sezioni di tessuto sono state attaccate a supporti sterili in poliuretano larghi 6 mm e poste in 6 ml di terreno ottimizzato (199 medium, 1 supplemento ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalino e 2X antibiotico-antimicotico).La stimolazione elettrica (10 V, frequenza 1,2 Hz) è stata applicata alle sezioni di tessuto attraverso il C-Pace.Per le condizioni TD, T3 e Dex freschi sono stati aggiunti a 100 nM e 1 μM ad ogni cambio medio.Il mezzo è saturo di ossigeno prima della sostituzione 3 volte al giorno.Le sezioni di tessuto sono state coltivate in un incubatore a 37°C e 5% CO2.
Per le colture CTCM, le sezioni di tessuto sono state posizionate su una stampante 3D su misura in una capsula di Petri contenente la soluzione di Tyrode modificata.Il dispositivo è progettato per aumentare le dimensioni della fetta di cuore del 25% dell'area dell'anello di supporto.Questo viene fatto in modo che le sezioni del cuore non si allunghino dopo essere state trasferite dalla soluzione di Tyrode al mezzo e durante la diastole.Utilizzando colla istoacrilica, sezioni di 300 µm di spessore sono state fissate su un anello di supporto di 7 mm di diametro.Dopo aver fissato le sezioni di tessuto all'anello di supporto, tagliare le sezioni di tessuto in eccesso e rimettere le sezioni di tessuto attaccate nel bagno di soluzione Tyrode su ghiaccio (4°C) finché non è stato preparato un numero sufficiente di sezioni per un dispositivo.Il tempo di elaborazione totale per tutti i dispositivi non deve superare le 2 ore.Dopo che 6 sezioni di tessuto sono state attaccate ai loro anelli di supporto, è stato assemblato il dispositivo CTCM.La camera di coltura CTCM è preriempita con 21 ml di terreno preossigenato.Trasferire le sezioni di tessuto nella camera di coltura e rimuovere con cura eventuali bolle d'aria con una pipetta.La sezione di tessuto viene quindi guidata nel foro e pressata delicatamente in posizione.Infine, posizionare il cappuccio dell'elettrodo sul dispositivo e trasferire il dispositivo nell'incubatrice.Quindi collegare il CTCM al tubo dell'aria e al sistema C-PACE-EM.L'attuatore pneumatico si apre e la valvola dell'aria apre il CTCM.Il sistema C-PACE-EM è stato configurato per erogare 4 V a 1,2 Hz durante la stimolazione bifasica per 2 ms.Il mezzo è stato cambiato due volte al giorno e gli elettrodi sono stati cambiati una volta al giorno per evitare l'accumulo di grafite sugli elettrodi.Se necessario, le sezioni di tessuto possono essere rimosse dai rispettivi pozzetti di coltura per espellere eventuali bolle d'aria eventualmente cadute sotto di esse.Per le condizioni di trattamento MT, T3/Dex è stato aggiunto fresco ad ogni cambio di mezzo con 100 nM T3 e 1 μM Dex.I dispositivi CTCM sono stati coltivati ​​in un incubatore a 37°C e 5% CO2.
Per ottenere traiettorie allungate di fette di cuore, è stato sviluppato uno speciale sistema di telecamere.È stata utilizzata una fotocamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Giappone) con un obiettivo macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).La visualizzazione è stata eseguita a temperatura ambiente dopo aver sostituito il mezzo con mezzo fresco.La telecamera è posizionata con un angolo di 51° e il video viene registrato a 30 fotogrammi al secondo.In primo luogo, il software open source (MUSCLEMOTION43) è stato utilizzato con Image-J per quantificare il movimento delle fette di cuore.La maschera è stata creata utilizzando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) per definire le regioni di interesse per le fette di cuore pulsante per evitare il rumore.Le maschere segmentate manualmente vengono applicate a tutte le immagini in una sequenza di fotogrammi e quindi passate al plug-in MUSCLEMOTION.Muscle Motion utilizza l'intensità media dei pixel in ogni fotogramma per quantificare il suo movimento rispetto al fotogramma di riferimento.I dati sono stati registrati, filtrati e utilizzati per quantificare il tempo del ciclo e valutare l'allungamento dei tessuti durante il ciclo cardiaco.Il video registrato è stato post-elaborato utilizzando un filtro digitale a fase zero di primo ordine.Per quantificare l'allungamento del tessuto (picco-picco), è stata eseguita l'analisi picco-picco per distinguere tra picchi e avvallamenti nel segnale registrato.Inoltre, il detrend viene eseguito utilizzando un polinomio di sesto ordine per eliminare la deriva del segnale.Il codice del programma è stato sviluppato in MATLAB per determinare il movimento globale dei tessuti, il tempo del ciclo, il tempo di rilassamento e il tempo di contrazione (codice del programma supplementare 44).
Per l'analisi della deformazione, utilizzando gli stessi video creati per la valutazione dell'allungamento meccanico, abbiamo prima tracciato due immagini che rappresentano i picchi di movimento (i punti di movimento più alti (superiori) e più bassi (inferiori)) secondo il software MUSCLEMOTION.Abbiamo quindi segmentato le regioni del tessuto e applicato una forma di algoritmo di ombreggiatura al tessuto segmentato (Figura 2a supplementare).Il tessuto segmentato è stato quindi suddiviso in dieci sottosuperfici e la sollecitazione su ciascuna superficie è stata calcolata utilizzando la seguente equazione: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, dove Sup e Sdown sono le distanze della forma dalle ombre superiore e inferiore del tessuto, rispettivamente (Figura .2b supplementare).
Le sezioni cardiache sono state fissate in paraformaldeide al 4% per 48 ore.I tessuti fissati sono stati disidratati in saccarosio al 10% e 20% per 1 ora, quindi in saccarosio al 30% durante la notte.Le sezioni sono state quindi incorporate in un composto a temperatura di taglio ottimale (composto OCT) e gradualmente congelate in un bagno di isopentano/ghiaccio secco.Conservare i blocchi di incorporamento OCT a -80 gradi centigradi fino alla separazione.I vetrini sono stati preparati come sezioni con uno spessore di 8 μm.
Per rimuovere l'OCT dalle sezioni cardiache, riscaldare i vetrini su un blocco riscaldante a 95 gradi centigradi per 5 min.Aggiungere 1 ml di PBS a ciascun vetrino e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi permeare le sezioni impostando 0,1% Triton-X in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.Per evitare che gli anticorpi non specifici si leghino al campione, aggiungere 1 ml di soluzione BSA al 3% ai vetrini e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.La BSA è stata quindi rimossa e i vetrini sono stati lavati con PBS.Segna ogni campione con una matita.Anticorpi primari (diluiti 1:200 in 1% BSA) (connessina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) e troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) sono stati aggiunti in 90 minuti, quindi anticorpi secondari (diluiti 1:200 in 1% BSA) contro il topo Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; # A16079), contro coniglio Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) per altri 90 minuti Lavato 3 volte con PBS Per distinguere la colorazione target dallo sfondo, abbiamo utilizzato solo l'anticorpo secondario come controllo Infine, è stata aggiunta la colorazione nucleare DAPI e i vetrini sono stati posti in un vectashield (Vector Laboratories) e sigillati con smalto per unghie. -x ingrandimento) e microscopio Keyence con ingrandimento 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml in PBS è stato utilizzato per la colorazione WGA e applicato a sezioni fisse per 30 minuti a temperatura ambiente.I vetrini sono stati quindi lavati con PBS e nero Sudan è stato aggiunto a ciascun vetrino e incubato per 30 minuti.I vetrini sono stati quindi lavati con PBS ed è stato aggiunto il mezzo di inclusione vectashield.I vetrini sono stati visualizzati su un microscopio Keyence a 40 ingrandimenti.
L'OCT è stato rimosso dai campioni come descritto sopra.Dopo aver rimosso l'OCT, immergere i vetrini nella soluzione di Bouin durante la notte.I vetrini sono stati quindi risciacquati con acqua distillata per 1 ora e quindi posti in una soluzione Bibrich di fucsina acida di aloe per 10 minuti.Quindi i vetrini sono stati lavati con acqua distillata e posti in una soluzione al 5% di fosfomolibdeno/5% di acido fosfotungstico per 10 minuti.Senza risciacquare, trasferire i vetrini direttamente nella soluzione blu all'anilina per 15 minuti.Quindi i vetrini sono stati lavati con acqua distillata e posti in una soluzione di acido acetico all'1% per 2 minuti.I vetrini sono stati essiccati in etanolo 200 N e trasferiti in xilene.I vetrini colorati sono stati visualizzati utilizzando un microscopio Keyence con un obiettivo 10x.La percentuale dell'area di fibrosi è stata quantificata utilizzando il software Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numero di catalogo V13154, secondo il protocollo del produttore con alcune modifiche.In particolare, è stato utilizzato un punch chirurgico con un diametro di 6 mm per garantire una dimensione uniforme del tessuto durante l'analisi MTT.I tessuti sono stati placcati individualmente nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenente substrato MTT secondo il protocollo del produttore.Le sezioni vengono incubate a 37°C per 3 ore e il tessuto vivente metabolizza il substrato MTT per formare un composto di formazan viola.Sostituire la soluzione MTT con 1 ml di DMSO e incubare a 37 ° C per 15 minuti per estrarre formazan viola dalle sezioni del cuore.I campioni sono stati diluiti 1:10 in DMSO in piastre a fondo trasparente a 96 pozzetti e l'intensità del colore viola è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di piastre Cytation (BioTek).Le letture sono state normalizzate al peso di ciascuna fetta di cuore.
Il supporto per fette di cuore è stato sostituito con un supporto contenente 1 μCi / ml [5-3H] -glucosio (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) per il test di utilizzo del glucosio come descritto in precedenza.Dopo 4 ore di incubazione, aggiungere 100 µl di terreno in una provetta da microcentrifuga aperta contenente 100 µl di 0,2 N HCl.Quindi il tubo è stato posto in un tubo a scintillazione contenente 500 μl di dH2O per far evaporare [3H]2O per 72 ore a 37°C.Quindi rimuovere la provetta per microcentrifuga dal tubo di scintillazione e aggiungere 10 ml di liquido di scintillazione.I conteggi di scintillazione sono stati eseguiti utilizzando un analizzatore di scintillazione liquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).L'utilizzo del glucosio è stato quindi calcolato tenendo conto dell'attività specifica del [5-3H]-glucosio, dell'equilibrio e dello sfondo incompleti, della diluizione del [5-3H]-in glucosio non marcato e dell'efficienza del contatore di scintillazione.I dati sono normalizzati alla massa delle sezioni del cuore.
Dopo l'omogeneizzazione dei tessuti in Trizol, l'RNA è stato isolato dalle sezioni cardiache utilizzando il Qiagen miRNeasy Micro Kit n. 210874 secondo il protocollo del produttore.La preparazione della libreria RNAsec, il sequenziamento e l'analisi dei dati sono stati eseguiti come segue:
1 μg di RNA per campione è stato utilizzato come materiale di partenza per la preparazione della libreria di RNA.Le librerie di sequenziamento sono state generate utilizzando il kit di preparazione della libreria di RNA NEBNext UltraTM per Illumina (NEB, USA) seguendo le raccomandazioni del produttore e i codici indice sono stati aggiunti alle sequenze degli attributi per ciascun campione.In breve, l'mRNA è stato purificato dall'RNA totale utilizzando sfere magnetiche attaccate con oligonucleotidi poli-T.La frammentazione viene eseguita utilizzando cationi bivalenti ad alta temperatura in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Il cDNA del primo filamento è stato sintetizzato utilizzando primer esamerici casuali e trascrittasi inversa M-MuLV (RNase H-).Il cDNA del secondo filamento viene quindi sintetizzato utilizzando DNA polimerasi I e RNasi H. Le rimanenti sporgenze vengono convertite in estremità smussate dall'attività di esonucleasi/polimerasi.Dopo l'adenilazione dell'estremità 3' del frammento di DNA, viene attaccato un adattatore NEBNext con una struttura ad anello a forcina per prepararlo all'ibridazione.Per la selezione di frammenti di cDNA di lunghezza preferita 150-200 bp.i frammenti di libreria sono stati purificati utilizzando il sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Quindi, 3 μl di USER Enzyme (NEB, USA) con cDNA di dimensioni selezionate ligato con un adattatore sono stati utilizzati per 15 minuti a 37 ° C e quindi per 5 minuti a 95 ° C prima della PCR.La PCR è stata quindi eseguita utilizzando Phusion High-Fidelity DNA polimerasi, primer PCR universali e primer Index (X).Infine, i prodotti PCR sono stati purificati (sistema AMPure XP) e la qualità della libreria è stata valutata su un sistema Agilent Bioanalyzer 2100.La libreria di cDNA è stata quindi sequenziata utilizzando un sequenziatore Novaseq.I file di immagini grezze di Illumina sono stati convertiti in letture grezze utilizzando CASAVA Base Calling.I dati grezzi vengono archiviati in file in formato FASTQ(fq) che contengono sequenze di lettura e qualità di base corrispondenti.Selezionare HISAT2 per abbinare le letture di sequenziamento filtrate al genoma di riferimento Sscrofa11.1.In generale, HISAT2 supporta genomi di qualsiasi dimensione, inclusi genomi superiori a 4 miliardi di basi, e per la maggior parte dei parametri sono impostati valori predefiniti.Le letture di splicing dai dati di RNA Seq possono essere allineate in modo efficiente utilizzando HISAT2, il sistema più veloce attualmente disponibile, con la stessa o migliore precisione rispetto a qualsiasi altro metodo.
L'abbondanza di trascrizioni riflette direttamente il livello di espressione genica.I livelli di espressione genica sono valutati dall'abbondanza di trascrizioni (conteggio del sequenziamento) associate al genoma o agli esoni.Il numero di letture è proporzionale ai livelli di espressione genica, alla lunghezza del gene e alla profondità di sequenziamento.Sono stati calcolati FPKM (frammenti per mille coppie di basi di trascrizione sequenziati per milione di coppie di basi) e sono stati determinati i valori P dell'espressione differenziale utilizzando il pacchetto DESeq2.Abbiamo quindi calcolato il tasso di false scoperte (FDR) per ciascun valore P utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg9 basato sulla funzione R incorporata "p.adjust".
L'RNA isolato dalle sezioni cardiache è stato convertito in cDNA a una concentrazione di 200 ng/μl utilizzando la miscela SuperScript IV Vilo Master di Thermo (Thermo, cat. N. 11756050).La RT-PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando una piastra di reazione trasparente Applied Biosystems Endura Plate Microamp a 384 pozzetti (Thermo, cat. N. 4483319) e un adesivo ottico per microamp (Thermo, cat. N. 4311971).La miscela di reazione consisteva in 5 µl di Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl di Taqman Primer e 3,5 µl di H2O miscelati per pozzetto.Sono stati eseguiti cicli qPCR standard e i valori CT sono stati misurati utilizzando uno strumento per PCR in tempo reale Quantstudio 5 di Applied Biosystems (modulo a 384 pozzetti; prodotto n. A28135).I primer Taqman sono stati acquistati da Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) I valori CT di tutti i campioni sono stati normalizzati al gene housekeeping GAPDH.
Il rilascio ai media di NT-ProBNP è stato valutato utilizzando il kit NT-ProBNP (maiale) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) secondo il protocollo del produttore.In breve, 250 µl di ciascun campione e standard sono stati aggiunti in duplicato a ciascun pozzetto.Subito dopo aver aggiunto il campione, aggiungere 50 µl di Assay Reagent A in ogni pozzetto.Agitare delicatamente la piastra e sigillare con sigillante.Quindi le compresse sono state incubate a 37°C per 1 ora.Quindi aspirare la soluzione e lavare i pozzetti 4 volte con 350 µl di soluzione di lavaggio 1X, incubando ogni volta la soluzione di lavaggio per 1-2 minuti.Quindi aggiungere 100 µl di Assay Reagent B per pozzetto e sigillare con sigillante per piastre.La compressa è stata agitata delicatamente e incubata a 37°C per 30 minuti.Aspirare la soluzione e lavare i pozzetti 5 volte con 350 µl di soluzione di lavaggio 1X.Aggiungere 90 ml di soluzione di substrato in ciascun pozzetto e sigillare la piastra.Incubare la piastra a 37°C per 10-20 minuti.Aggiungere 50 µl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto.La piastra è stata immediatamente misurata utilizzando un lettore di piastre Cytation (BioTek) impostato a 450 nm.
Sono state eseguite analisi di potenza per scegliere le dimensioni del gruppo che forniranno >80% di potenza per rilevare una variazione assoluta del 10% nel parametro con un tasso di errore di tipo I del 5%. Sono state eseguite analisi di potenza per scegliere le dimensioni del gruppo che forniranno >80% di potenza per rilevare una variazione assoluta del 10% nel parametro con un tasso di errore di tipo I del 5%. L'analisi della maggior parte dei tassi di crescita per il gruppo di dimensioni, con un punteggio superiore all'80%, raggiunge il 10% di sconto тного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. L'analisi della potenza è stata eseguita per selezionare le dimensioni del gruppo che avrebbero fornito >80% di potenza per rilevare il 10% di variazione assoluta dei parametri con un tasso di errore di tipo I del 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小. Un'analisi molto avanzata può aumentare il numero dei gruppi di dimensioni, con un tasso di crescita superiore all'80% rispetto al 10% di sconto лютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. È stata eseguita un'analisi della potenza per selezionare una dimensione del gruppo che fornisse >80% di potenza per rilevare il 10% di variazione assoluta dei parametri e il 5% di tasso di errore di tipo I.Le sezioni di tessuto sono state selezionate casualmente prima dell'esperimento.Tutte le analisi sono state condizionate alla cieca e i campioni sono stati decodificati solo dopo che tutti i dati erano stati analizzati.Il software GraphPad Prism (San Diego, CA) è stato utilizzato per eseguire tutte le analisi statistiche. Per tutte le statistiche, i valori p sono stati considerati significativi a valori <0,05. Per tutte le statistiche, i valori p sono stati considerati significativi a valori <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per tutte le statistiche, i valori p sono stati considerati significativi a valori <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per tutte le statistiche, i valori p sono stati considerati significativi a valori <0,05.Il test t di Student a due code è stato eseguito sui dati con solo 2 confronti.L'ANOVA unidirezionale o bidirezionale è stata utilizzata per determinare il significato tra più gruppi.Durante l'esecuzione di test post hoc, è stata applicata la correzione di Tukey per tenere conto di confronti multipli.I dati RNAsec hanno considerazioni statistiche speciali durante il calcolo di FDR e p.adjust come descritto nella sezione Metodi.
Per ulteriori informazioni sulla progettazione dello studio, vedere l'estratto del rapporto sulla ricerca sulla natura collegato a questo articolo.