תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכה מוגבלת ב-CSS.לחוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
מורפוגנזה של המעי האנושי מבסס תכונות קריפטה-ווילוס של מיקרו-ארכיטקטורה אפיתל תלת-ממדית וארגון מרחבי. מבנה ייחודי זה נדרש לשמירה על הומאוסטזיס של המעי על-ידי הגנה על גומחה תאי הגזע בקריפטה הבסיסית מפני אנטיגנים מיקרוביאליים אקסוגניים ומטבוליטים שלהם. בנוסף, חיידקי המעי והריר המופרשים מציגים ברזציה פונקציונלית עם תאים מגן על פני השטח. שימוש במבני אפיתל תלת-ממדיים חיוני לבניית מודלים של מעיים חוץ גופיים. יש לציין שהמעי המימטי האורגני-על-שבב יכול לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית ספונטנית של אפיתל המעי עם תפקודים פיזיולוגיים וביו-מכניקה משופרים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול שניתן לשחזר במעיים וב-שבב חיידקי כמו גם במעיים. שבב היברידי משובץ. אנו מתארים שיטות מפורטות לייצור מכשירים, התרבות של תאי אפיתל אורגנואידיים של Caco-2 או מעיים במסגרות קונבנציונליות, כמו גם בפלטפורמה מיקרופלואידית, אינדוקציה של מורפוגנזה תלת מימדית ואפיון אפיתליה תלת מימדית מבוססת באמצעות שיטות הדמיה מרובות. פרוטוקול זה של זרימה מיקרו-צדדית של נוזלים משיג זרימה של זרימה מיקרו-צדדית עבור זרימת נוזלים. שיטת tro morphogenesis משתמשת בלחץ גזירה ותנועה מכנית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ואינה דורשת הנדסה או מניפולציה של תאים מורכבים, אשר עשויים לעלות על טכניקות קיימות אחרות. אנו רואים שלפרוטוקול המוצע שלנו עשויות להיות השלכות רחבות על קהילת המחקר הביו-רפואי, ומספקת שיטה לחידוש שכבות אפיתל מעיים תלת-ממדיות במבחנה עבור יישומים ביו-רפואיים ותרופות.
ניסויים מראים שתאי Caco-2 של אפיתל המעי התורבתים במכשירים מיקרו-נוזליים במעיים 1,2,3,4,5 או דו-שכבתיים 6,7 יכולים לעבור מורפוגנזה תלת-ממדית ספונטנית במבחנה ללא הבנה ברורה של המנגנון הבסיסי. במחקר האחרון שלנו, מצאנו שהסרה של תרבית מורפו-צדדית והתקן אפי-דוצני 3D הינה הכרחית באופן סודי. מורפוגנזה תליאלית במבחנה, אשר הוכחה על ידי Caco-2 ואורגנואידים מעיים שמקורם במטופל.תאי אפיתל אומתו. במחקר זה, התמקדנו במיוחד בייצור תאים ופיזור ריכוזים של אנטגוניסט Wnt חזק, Dickkopf-1 (DKK-1), במעי-על-שבב ובמכשירים מיקרו-נוזליים מתוקנים המכילים תוספות Transwell, המכונים "Chip Hybrid". אנו מדגימים כי תוספת של אנטגוניסט אקסוגני, Wn-1, דנק, 1. חלבון הקשור ל-zzled 1, או Soggy-1) למעי על השבב מעכב מורפוגנזה או משבש את שכבת האפיתל התלת-ממדית המובנית מראש, מה שמרמז שלחץ אנטגוניסטי במהלך התרבות אחראי למורפוגנזה של המעי במבחנה. לכן, גישה מעשית להשגת מורפוגנזה חזקה ברמת הממשק הבסיסי של האפיתל או שמירה על ממשק אפיתליאלי. מנטציה על ידי שטיפה אקטיבית (למשל, בפלטפורמות בטן-על-שבב או היברידיות-על-שבב) או דיפוזיה. מדיה בזולטרלית (למשל, מכניסות Transwell למאגרים בזולטרליים גדולים בבארות).
בפרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה מפורטת לייצור מיקרו-מכשירי מעי-על-שבב ושבבים היברידיים הניתנים להחדרה של Transwell (שלבים 1-5) לתרבית תאי אפיתל מעיים על ממברנות נקבוביות מבוססות פולידימתילסילוקסן (PDMS) (שלבים 6A, 7A, 8, 9) או בקרומי פוליאסטר 6B ו-9B בממברנות Transsteps, 9B. ed 3D morphogenesis in vitro (שלב 10). זיהינו גם מאפיינים תאיים ומולקולריים המעידים על היסטוגנזה ספציפית לרקמות והתמיינות תאית תלוית שושלת על ידי יישום שיטות הדמיה מרובות (שלבים 11-24). אנו מעוררים מורפוגנזה באמצעות תאי אפיתל מעיים אנושיים, כגון פורמטים טכניים של תרבית איברים של המעי, כולל פורמטים טכניים של תרבית איבר-2 של המעי. יצירת מונו-שכבות דו-ממדיות, וביוכימיקלים במעיים ושחזור של המיקרו-סביבה הביומכנית.in vitro.כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית משכבות דו-ממדיות של אפיתל, הסרנו אנטגוניסטים של מורפוגנים בשתי הצורות התרבותיות על ידי הזרמת המדיום לתוך התא הבסיסי של התרבית. לדגמן גידול אפיתל תלוי מורפוגן, תרבויות משותפות מארח-מיקרוביום אורכי, זיהום פתוגן, פציעה דלקתית, תפקוד לקוי של מחסום אפיתל וטיפולים מבוססי פרוביוטיקה לדוגמה.השפעות.
הפרוטוקול שלנו עשוי להיות שימושי למגוון רחב של מדענים בביולוגיה בסיסית (למשל, ביולוגיה של רירית המעי, ביולוגיה של תאי גזע וביולוגיה התפתחותית) ומחקר יישומי (למשל, בדיקות תרופות פרה-קליניות, מודלים של מחלות, הנדסת רקמות וגסטרואנטרולוגיה) השפעה רחבה. להיות מופץ לקהל החוקרים את הדינמיקה של איתות תאים במהלך התפתחות מעיים, התחדשות או הומאוסטזיס. ​​בנוסף, הפרוטוקול שלנו שימושי לחקירת זיהום תחת גורמים זיהומיים שונים כגון Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typebrio או Salmonella.קהלים של פתולוגיה ופתוגנזה של מחלות מועילים גם הם. השימוש במערכת מיקרופיזיולוגיה של המעי על-שבב עשוי לאפשר תרבות משותפת לאורך 10 והערכה שלאחר מכן של הגנת המארח, תגובות חיסון ותיקון פציעות הקשורות לפתוגן במערכת העיכול (GI) 11. הפרעות GI אחרות הקשורות למחלת המעי הדולפת, מחלת המעי הדליפה, או דלקת המעי הדולפת, מחלת המעי הדליפה, או דלקת המעי הדולפת, או מחלת המעי הדליפה ניתן לדמות תסמונת המעי הרגיז כאשר מכינים שכבות אפיתל תלת-ממדיות של המעי באמצעות שכבות אפיתל מעיים תלת-ממדיות של המטופל, מחלות אלו כוללות ניוון מרושע, קיצור קריפטה, נזק לרירית או מחסום אפיתל לקוי. ביופסיה או תאי גזע שמקורם בתאי גזע, עשויות להתייחס למודל של מחלה אורגנואידית גבוהה יותר של מחלות מעיים12. סוגי תאים, כגון תאים מונו-גרעיניים בדם היקפיים של חולים (PBMCs), ועד למודלים המכילים מיקרו-ארכיטקטורות תלת-ממדיות של קריפטת מעיים.תאי חיסון ספציפיים לרקמות, 5.
מכיוון שניתן לתקן ולהמחיש מיקרו-מבנה אפיתל תלת-ממדי ללא תהליך החיתוך, צופים שעובדים על תעתיק מרחבי והדמיה ברזולוציה גבוהה או ברזולוציה סופר עשויים להתעניין במיפוי שלנו של הדינמיקה המרחבית-זמנית של גנים וחלבונים בנישות אפיתל.מתעניין בטכנולוגיה. תגובה לגירויים מיקרוביאליים או חיסוניים. יתרה מכך, ניתן לבסס הצלבה מארח-מיקרוביום 10, 14 המתאמת הומאוסטזיס של המעי בשכבת רירית המעי התלת-ממדית על ידי תרבות משותפת של מינים מיקרוביאליים שונים, קהילות מיקרוביאליות או מיקרוביוטה צואתית, במיוחד בשבב צואה.בפלטפורמה. גישה זו אטרקטיבית במיוחד עבור קהלים הלומדים אימונולוגיה רירית, גסטרואנטרולוגיה, מיקרוביום אנושי, תרבות ומיקרוביולוגיה קלינית המבקשים לטפח מיקרוביוטת מעיים שלא התרבתה בעבר במעבדה. אם ניתן להתאים את פרוטוקול המורפוגנזה שלנו במבחנה לפורמטים של תרבית ניתנת להרחבה, כגון צלחת רציפה, 248, 238 תאים צדדיים, הפרוטוקול יכול להיות מופץ גם לאלה המפתחים פלטפורמות סינון או אימות תפוקה פרמצבטיות, ביו-רפואיות או תפוקות גבוהות לתעשיית המזון. כהוכחה לעיקרון, הדגמנו לאחרונה את היתכנותה של מערכת מורפוגנזה מרובה בתפוקה גבוהה הניתנת להרחבה לפורמט של 24-בארות צלחת מרובת-שבב,1,8, 7,1,8 מוצרים מסחריים של צלחת 7,1,8. ניתן להאיץ את האימות של שיטת המורפוגנזה החוץ-גופית שלנו ולאמץ אותו בפוטנציה על ידי מעבדות מחקר רבות, תעשייה או סוכנויות ממשלתיות ורגולטוריות כדי להבין תכנות מחדש תאי של מורפוגנזה במעיים חוץ גופית ברמת התעתיק לבדיקת תרופות או ביו-תרפיות הקליטה וההובלה של מועמדים לתרופות הוערכו באמצעות מודל תלת-ממד של מודלים מסחריים של המעי או הפונדקאיות המותאמות אישית של המעי. תהליך אחותי.
נעשה שימוש במספר מצומצם של מודלים ניסויים הרלוונטיים לאדם כדי לחקור מורפוגנזה של אפיתל מעיים, בעיקר בשל היעדר פרוטוקולים ניתנים ליישום להשראת מורפוגנזה תלת מימדית במבחנה. למעשה, חלק ניכר מהידע הנוכחי על מורפוגנזה במעיים מבוסס על מחקרים בבעלי חיים (למשל, דג זברה20, עכברים 21 או תרנגולות, עלות, 21, הן יכולות להיות עלות, 21 או עלות, 21). והכי חשוב, לא קובעים במדויק תהליכי התפתחות אנושיים. מודלים אלה מוגבלים מאוד ביכולתם להיבדק בצורה מדרגית רב-כיוונית. לכן, הפרוטוקול שלנו לחידוש מבני רקמה תלת-ממדיים במבחנה עולה בביצועים של מודלים של בעלי חיים in vivo כמו גם מודלים סטטיים סטטיים דו-ממדיים אחרים של תרבית תאים. כפי שתואר בעבר, תוך שימוש במודלים מקומיים של תאים אפיטיאליים, תוך שימוש במודלים שונים של תאים אפיטיאליים. ציר crypt-villus בתגובה לגירויים ריריים או חיסוניים שונים. שכבות אפיתל 3D יכולות לספק מרחב לחקור כיצד תאים מיקרוביאליים מתחרים על יצירת נישות מרחביות ואבולוציה אקולוגית בתגובה לגורמי מארח (למשל, שכבות ריר פנימיות לעומת חיצוניות, הפרשת IgA וחיידקים אנטי-מיקרוביאליים יכולים להבין את המיקרו-פפטידים האחרים, 3D). ta מבנה את הקהילות שלה ומייצר באופן סינרגיסטי מטבוליטים מיקרוביאליים (למשל, חומצות שומן קצרות שרשרת) המעצבים ארגון תאי וגומחות של תאי גזע בקריפטות הבסיסיות. ניתן להדגים תכונות אלו רק כאשר שכבות אפיתל תלת-ממדיות מבוססות במבחנה.
בנוסף לשיטה שלנו ליצירת מבני אפיתל מעיים תלת-ממדיים, ישנן מספר שיטות חוץ-גופית. תרבית אורגנואידית מעיים היא טכניקה מתקדמת של הנדסת רקמות המבוססת על טיפוח של תאי גזע מעיים בתנאים מורפוגנים ספציפיים23,24,25. עם זאת, השימוש במודלים אורגנואידים תלת-ממדיים לניתוח תחבורה ביומי או מארח הוא לרוב מאתגר. סד בתוך האורגנואיד, ולכן, החדרת רכיבים לומינליים כגון תאים מיקרוביאליים או אנטיגנים אקסוגניים מוגבלת.ניתן לשפר את הגישה ללומנס אורגנואידי באמצעות מזרק מיקרו,26,27 אך שיטה זו היא פולשנית ועתירת עבודה ודורשת ידע מיוחד לביצוע. יתר על כן, תרבויות אורגנואידיות מסורתיות המתוחזקות בפיגומי הידרוג'ל בתנאים סטטיים אינן משקפות במדויק ביו-מכניקה פעילה in vivo.
גישות אחרות המופעלות על ידי מספר קבוצות מחקר משתמשות בפיגומי הידרוג'ל תלת מימדיים מובנים מראש כדי לחקות את מבנה האפיתל של המעי על ידי טיפוח תאי מעיים אנושיים מבודדים על פני הג'ל. ייצור פיגומי הידרוג'ל באמצעות תבניות מודפסות בתלת מימד, מיקרו טחינה או ליטוגרפיות מפוברקות. שיטה זו מציגה את הסדר הרלוונטי של תאים מאורגנים ב-vitrophogen מבודדים בעצמם. ביסוס מבנה אפיתל יחס גובה-רוחב גבוה והצלבה בין סטרומה לאפיתל על ידי הכללת תאי סטרומה בפיגום. עם זאת, טבעם של פיגומים מובנים מראש עשוי למנוע את הצגת התהליך המורפוגנטי הספונטני עצמו. מודלים אלו גם אינם מספקים זרימה דינאמית של luminal או interstitial, חסרי הלחץ של גזירת תאים הנוזליים המשמשים תחת מחקר פיזיולוגי של המעיים ולחקור תא נוזלים לאחרונה. פיגומים בפלטפורמה מיקרופלואידית ומבני אפיתל מעיים מעוצבים באמצעות טכניקות תחריט בלייזר. אורגנואידים במעיים של עכברים עוקבים אחר דפוסים חרוטים ליצירת מבנים צינוריים במעיים, וניתן לשחזר את זרימת הנוזלים התוך-לומינליים באמצעות מודול מיקרו-נוזליות. עם זאת, מודל זה אינו מציג טכניקת תנועה ספונטנית של תנועה מורפוגנטית ומסוגלת ליצור תהליכים מורפוגנטיים ספונטניים. צינורות מעיים מיניאטוריים עם תהליכים מורפוגנטיים ספונטניים. למרות הייצור המורכב של מקטעי מעיים שונים בתוך הצינור, מודל זה חסר גם זרימת נוזל luminal ועיוות מכני. בנוסף, תפעול המודל עשוי להיות מוגבל, במיוחד לאחר השלמת תהליך ההדפסה הביולוגית, מטריד תנאים ניסיוניים או אינטראקציות תא לתא אינטראקציות תא לתא. לחקות תנועתיות מעיים, נגישות של תאים אפיקיים ובזו-צדדיים עצמאיים, ויצירה מחדש של מיקרו-סביבות ביולוגיות מורכבות של מודולריות. לכן, פרוטוקול המורפוגנזה התלת-ממדי שלנו במבחנה עשוי לספק גישה משלימה להתגבר על האתגרים של השיטות הקיימות.
הפרוטוקול שלנו מתמקד כולו במורפוגנזה אפיתל תלת-ממדית, עם רק תאי אפיתל בתרבית וללא סוגים אחרים של תאים מסביב כגון תאי מזנכימליים, תאי אנדותל ותאי חיסון. כפי שתואר קודם לכן, הליבה של הפרוטוקול שלנו היא השראת מורפוגנזה אפיתל על ידי הסרת הפרוטוקול המורפוגן החזק של המעכבים הבסיסיים המוכנסים שלנו. t-on-a-chip ו-hybrid-on-a-chip מאפשרים לנו ליצור מחדש את שכבת האפיתל התלת-ממדית המתגלגלת, מורכבויות ביולוגיות נוספות כגון אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות33,34, תצהיר מטריקס חוץ-תאי (ECM) 35, ובמודל שלנו, תכונות קריפט-villus המעבירות נישות נוספות של תאי גזע ב-mebla, לדוגמא, ב-fibrosale cryptroms. סנכימים ממלאים תפקיד מפתח בייצור חלבוני ECM ובוויסות של מורפוגנזה של המעי ב-vivo35,37,38. הוספה של תאים mesenchymal למודל שלנו שיפרה את התהליך המורפוגנטי ואת יעילות התקשרות התאים. שכבת האנדותל (כלומר, נימי דם או לימפה) ממלאת תפקיד חשוב בוויסות התחבורה המולקולרית של התאים המיקרו-ווירונטרים, ותחבורה המולקולרית. רכיבי תרבות הניתנים לחיבור בין מודלים של רקמות הם תנאי הכרחי כאשר מודלים של רקמות מתוכננים להדגים אינטראקציות מרובות איברים. לכן, ייתכן שיהיה צורך לכלול תאי אנדותל כדי לדגמן מאפיינים פיזיולוגיים מדויקים יותר עם רזולוציה ברמת האיברים. תאי חיסון שמקורם במטופל חיוניים גם להצגת תגובות חיסוניות מולדות, הצגת אנטיגן בהקשר מולד חיסוני של רקמה חיסונית, הסתגלות מולד חיסוני של רקמה חיסונית.
השימוש בשבבים היברידיים הוא פשוט יותר מאשר בטן-על-שבב מכיוון שהגדרת המכשיר פשוטה יותר והשימוש בתוספות של Transwell מאפשר תרבית ניתנת להרחבה של אפיתל מעי. עם זאת, תוספות Transwell זמינות מסחרית עם ממברנות פוליאסטר אינן אלסטיות ואינן יכולות לדמות תנועות דמויות פריסטלטיות. יתר על כן, המתחם הטרנסוולי אינו ממוקם בנקודת המתח ההיברידית. הצד האפיקלי. ברור שהמאפיינים הסטטיים בתא האפיקי רק לעתים רחוקות מאפשרים תרבות משותפת של חיידקים בשבבים היברידיים לטווח ארוך. בעוד שאנו יכולים לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית בתוספות Transwell בעת שימוש בשבבים היברידיים, המחסור בביו-מכניקה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ובזרימת נוזל אפיקלית עשוי להגביל את ההיתכנות של פלטפורמות יישום היברידיות.
שחזורים בקנה מידה מלא של ציר הקריפטה-ווילוס האנושי בתרביות מעי-על-שבב ותרבויות היברידיות-על-שבב לא הוקמו במלואן. מאחר והמורפוגנזה מתחילה משכבת ​​אפיתל, מיקרו-ארכיטקטורות תלת-ממדיות אינן מספקות בהכרח דמיון מורפולוגי לקריפטות in vivo.למרות שאפיינו את אוכלוסיית תאים מיקרו-דימיים 3D-based בסמוך ליום, הקריפטה והאזורים הוויליים לא היו מסודרים בבירור. למרות שתעלות עליונות גבוהות יותר בשבב מובילות לגובה מוגבר של האפיתל המיקרו-מהנדסי, הגובה המרבי עדיין מוגבל ל-300-400 מיקרומטר. העומק האמיתי של קריפטות מעיים אנושיות במעי הדק והגס הוא ~135 מיקרומטר וגובהו של ~135 µm, בהתאמה, ~600 מיקרומטר41.
מנקודת מבט של הדמיה, הדמיה ברזולוציית-על באתר של מיקרו-ארכיטקטורות תלת-ממד עשויות להיות מוגבלות למעי בשבב, שכן מרחק העבודה הנדרש מעדשת האובייקטיב לשכבת האפיתל הוא בסדר גודל של מילימטרים בודדים. כדי להתגבר על בעיה זו, ייתכן שיידרש אובייקט מרוחק. יתר על כן, יצירת קטעים דקים להדמיה גבוהה יותר של הכנת הדגימה של PD להכנת הדגימה הגבוהה של ה-PD. ייצור מיקרו-שכבתי של המעי על שבב כרוך בהדבקה קבועה בין כל שכבה, זה מאתגר ביותר לפתוח או להסיר את השכבה העליונה כדי לבחון את מבנה פני השטח של שכבת האפיתל. לדוגמה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM).
ההידרופוביות של PDMS הייתה גורם מגביל במחקרים מבוססי מיקרו-נוזלים העוסקים במולקולות קטנות הידרופוביות, שכן PDMS יכול לספוג באופן לא ספציפי מולקולות הידרופוביות כאלה. ניתן לשקול חלופות ל-PDMS עם חומרים פולימריים אחרים. לחילופין, שינוי פני השטח של PDMS (למשל, ציפוי ב-422glycerine) יכול להיחשב חומרי 42-42 או פוליפיליים (לדוגמה ספיגה של מולקולות הידרופוביות.
לבסוף, השיטה שלנו לא אופיינה היטב במונחים של אספקת הקרנה בתפוקה גבוהה או פלטפורמת ניסוי ידידותית למשתמש "בגודל אחד". הפרוטוקול הנוכחי דורש משאבת מזרק לכל מכשיר מיקרו, אשר תופסת מקום בחממת CO2 ומונעת ניסויים בקנה מידה גדול. מגבלה זו ניתנת לשיפור משמעותי על ידי יכולת הרחבה של תרבות פורמטים חדשניים, 4, 4, 4, 4 או 4 תוספות המאפשרות מילוי רציף והסרה של מדיה בזולטרלית).
כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל מעי אנושי במבחנה, השתמשנו בהתקן מעיים של שבב מיקרו-נוזל המכיל שני מיקרו-ערוצים מקבילים וממברנה נקבובית אלסטית ביניהם כדי ליצור ממשק לומן-נימי. אנו גם מדגימים את השימוש במכשיר מיקרו-נוזל חד-ערוצי (שבב היברידי בזרימה אפי-צדדית בזרימה רציפה של השכבה היבשתית-תוך-צדדית. שתי הפלטפורמות, ניתן להדגים מורפוגנזה של תאי אפיתל מעיים אנושיים שונים על ידי הפעלת מניפולציה כיוונית של זרימה כדי להסיר אנטגוניסטים של מורפוגן מהתא הבסיסי. כל ההליך הניסיוני (איור 1) מורכב מחמישה חלקים: (i) מיקרו-ייצור של שבב המעי או Transwell insertable hybrid cell 1-5; תאי Caco-2) או אורגני מעיים אנושיים;תיבות 2-5), (iii) תרבית של תאי אפיתל מעיים על שבבי מעיים או שבבים היברידיים (שלבים 6-9), (iv) אינדוקציה של מורפוגנזה תלת מימדית במבחנה (שלב 10) ו-(v) ) כדי לאפיין את המיקרו-מבנה האפיתל התלת-ממדי (שלבים 11-24). על ידי השוואת מורפוגנזה אפיתל לבקרות מרחביות, זמניות, מותנות או פרוצדורליות.
השתמשנו בשתי פלטפורמות תרבות שונות: בטן-על-שבב עם ערוצים ישרים או ערוצים מפותלים לא ליניאריים, או שבבים היברידיים המכילים תוספות Transwell (TW) במכשיר מיקרו-נוזל, שיוצרו כמתואר בתיבה 1, ושלב 1 -5."יייצור התקן" מציג את השלבים העיקריים ביצירת שבב בודד או של תא היברידי של תא אנושי 2C (המקור של תא אנושי 2C). אורגנואידים מעיים) ונוהל תרבית המשמש בפרוטוקול זה. "מורפוגנזה במבחנה" מציג את השלבים הכוללים שבהם מגדלים תאי אפיתל מסוג Caco-2 או תאי אפיתל שמקורם באורגנואידים על שבב מעי או על תוספות Transwell של שבב היברידי, ולאחר מכן אינדוקציה של מורפוגנזה תלת-ממדית והיווצרות של מבנה של תוכנית אפיתל מאופיין מציגה דוגמה של יישום אפיתל מאופיין להלן. ניתן להשתמש בשכבות אפיתל סטינאליות, למשל, באפיון התמיינות תאים, מחקרים בפיזיולוגיה של המעיים, הקמת מערכות אקולוגיות מארח-מיקרוביום ומודלים של מחלות. תמונות אימונופלורסצנטיות ב"התבדל תאים" המציגות גרעינים, F-אקטין ו-MUC2 המתבטאים בשכבת ה-Caco-2 התלת-ממדית המייצרות את תא ה-Caco-2 הקיים ב-MuC-chip ו-MUC. קוס המופרש ממשטחי רירית. תמונות פלואורסצנטיות בפיזיולוגיה של המעיים מציגות ריר שנוצר על ידי צביעה עבור שאריות של חומצה סיאלית ו-N-אצטיל גלוקוזאמין באמצעות agglutinin של נבט חיטה פלואורסצנטי. שתי התמונות החופפות ב-"Host-Microbe Co-Cultures" מציגות מראה מייצג מארח-מיקרוביום ב-co-culture בפאנל הירוק של col-culture ב-co-culture. חלבון פלואורסצנטי (GFP) עם תאי אפיתל תלת-ממדיים Caco-2 מהונדסים. הלוח הימני מציג את הלוקליזציה של GFP E. coli בתרבית משותפת עם תאי אפיתל תלת-ממדיים Caco-2, ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית עם F-אקטין (אדום) וגרעינים (כחולים). גנים (למשל, ליפופוליסכריד, LPS) ותאי חיסון (למשל, PBMC;ירוק). תאי Caco-2 תורבו ליצירת שכבת אפיתל תלת מימדית. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. תמונות בשורה התחתונה: "הבחנה של תאים" שהותאמו באישור מהפניה.2.הוצאת אוניברסיטת אוקספורד;משוכפל באישור מ-Ref.5.NAS;"מארח-מיקרובי קו-תרבות" מותאם באישור מ-Ref.3.NAS;"מודל מחלות" מותאם באישור מהפניה.5.NAS.
גם שבבי מעי-על-שבב וגם שבבים היברידיים יוצרו באמצעות העתקים של PDMS שפורקו מתבניות סיליקון על-ידי ליטוגרפיה רכה1,44 ועוצבו בדוגמת SU-8. העיצוב של המיקרו-ערוצים בכל שבב נקבע על-ידי התחשבות בהידרודינמיקה כגון מתח גזירה ולחץ הידרודינמי1,4,12. עיצוב המעי המקורי על-גבי 1-צ'יפ מורכב מ-Big-On-A-Chip המקורי. מיקרו-ערוצים ישרים, התפתח למעי מורכב-על-שבב (תמונה מורחב נתונים איור 1b) הכולל זוג מיקרו-ערוצים מעוקלים כדי לגרום לזמן שהייה מוגבר של נוזל, דפוסי זרימה לא ליניאריים ועיוות רב-צירי של תאים מתורבתים (איור 2a-f) הוכחנו שה-Gut-Chip המפותל גורם מאוד גם למורפוגנזה תלת-ממדית במסגרת זמן דומה עם מידה דומה של צמיחת אפיתל בהשוואה ל-Gut-Chip המקורי, ללא קשר לסוג התא התרבותי. לפיכך, כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית, ניתנים להחלפה תכונות שליליות בטן ומורכבות על-שבב על-שבב עם דפוסים שליליים שליליים ב-SU עם תבניות שליליות ב-SU. לאחר פירוק התבנית (איור.2a). כדי לייצר את המעי על שבב, שכבת ה-PDMS העליונה המוכנה נקשרה ברצף לסרט PDMS נקבובי ולאחר מכן מיושרת עם שכבת ה-PDMS התחתונה על-ידי התקשרות בלתי הפיכה באמצעות טיפול קורונה (איור 2b-f). כדי לייצר שבבים היברידיים, העתקים של PDMS מעובדים נקשרו למכשירי זכוכית חד-תכליתיים שיכולים ליצור שקופיות מיקרו-תעלות זכוכית חד-פעמית. 2 שעות ונתונים מורחבים איור 2). תהליך ההתקשרות מתבצע על ידי טיפול במשטחים של העתק PDMS והזכוכית בפלזמה חמצן או טיפול בקורונה. לאחר עיקור של המכשיר המיקרו-מפודר המחובר לשפופרת הסיליקון, התקנת המכשיר הייתה מוכנה לביצוע מורפוגנזה תלת מימדית של אפיתל המעי (איור 2).
א, המחשה סכמטית של הכנת חלקי PDMS מתבניות סיליקון בדוגמת SU-8. תמיסת PDMS לא נרפאה נשפכה על תבנית סיליקון (משמאל), נרפאה ב-60 מעלות צלזיוס (באמצע) והוצאה מהתבנית (מימין). PDMS שנפרק נחתך לחתיכות ונוקה לשימוש נוסף. תבנית המשמשת לייצור הממברנה הנקבוביה של PDMS.d, סדרת תצלומים של רכיבי PDMS העליונים והתחתונים והתקן המעי המורכב על-שבב.e, סכימה של היישור של רכיבי ה-PDMS העליון, הממברנה והתחתון. כל שכבה קשורה באופן בלתי הפיך על ידי טיפול בפלזמה או קורונה. um chambers.g, התקנה של מעי-על-שבב לתרבית תאים מיקרופלואידיים. המעי המיוצר על שבב שהורכב עם צינור סיליקון ומזרק הונח על כיסוי כיסוי. התקן השבב הונח על מכסה של צלחת פטרי בגודל 150 מ"מ לעיבוד. הקלסר משמש לסגירת סיליקון שבבי בדים היברידיים של Morgen 3 ו-Hybrid שבבי טרנספו ג'י. ארטים שהוכנו באופן עצמאי לתרבות מונו-שכבות דו-ממדיות של תאי אפיתל מעיים הוכנסו לשבב ההיברידי כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית של המעי. המדיום עובר זילוף דרך מיקרו-ערוצים מתחת לשכבת התאים שהוקמה על התוספת של Transwell. סרגל קנה מידה, 1 ס"מ. ש' נדפס מחדש עם אישור מהפניה.4.Elsevier.
בפרוטוקול זה, שורת התאים Caco-2 ואורגנואידים של המעי שימשו כמקורות אפיתל (איור 3a). שני סוגי התאים תורבו באופן עצמאי (תיבה 2 ותיבה 5) ושימשו לזריעת המיקרו-ערוצי ה-ECM המצופים ב-ECM של תוספות בטן שבשבב או Transwell. en קטעים 10 ו-50) ב-T-flasks נקצרים כדי להכין תרחפי תאים מפורקים על ידי נוזל טריפסיניזציה (תיבה 2). אורגני מעיים אנושיים מביופסיות מעיים או כריתות כירורגיות תורבו בכיפות פיגום Matrigel בצלחות 24-בארות כדי לתמוך במיקרו-סביבה המבנית, המכילות מורפונדין ו-נוג'ין חיוניים (Rondin and Round-Medium). גורמים שהוכנו כמתואר בתיבה 3 נוספו כל יומיים עד שהאורגנואידים גדלו לקוטר של 500 מיקרומטר בערך. אורגנואידים שגדלו במלואם נקצרים ומתפרקים לתאים בודדים לצורך זריעה על גבי מעיים או תוספות Transwell על שבב (תיבה 5). כפי שדיווחנו בעבר, ניתן להבדיל על פי מחלה רגילה, מחלת colorhnic, colorhnic ), אתר הנגע (למשל, נגע לעומת אזור לא פגוע) ומיקום מערכת העיכול בדרכי העיכול (למשל, תריסריון, ג'ג'ונום, ileum, cecum, המעי הגס או פי הטבעת). אנו מספקים פרוטוקול אופטימלי בתיבה 5 לטיפוח אורגנואידים במעי הגס (קולואידים) הדורשים בדרך כלל ריכוזים גבוהים יותר של מורפוגנים איברניים מאשר מעי דק.
א, זרימת עבודה לאינדוקציה של מורפוגנזה של המעי בשבב המעי. Caco-2 אפיתל מעי אנושי ואורגנואידים מעיים משמשים בפרוטוקול זה כדי להדגים מורפוגנזה תלת מימדית. תאי האפיתל המבודדים נזרעו במכשיר המעי המוכן על שבב (הכנת שבב). ברגע שהתאים מחוברים ל-PDD וזרעים ביום. 0 (D0), זרימה אפיקלית (AP) מתחילה ונשמרת במשך 2 הימים הראשונים (זרימה, AP, D0-D2). זרימה Basolateral (BL) מתחילה גם יחד עם תנועות מתיחה מחזוריות (מתיחה, זרימה, AP ו-BL) כאשר נוצרת מונו-שכבה דו-ממדית מלאה. התרבות תלת-ממדית של המעי מתרחשת 5 ימים ספונטנית של P-5 ימים. תמונות ניגודיות מציגות מורפולוגיה מייצגת של תאי Caco-2 בכל שלב ניסוי או נקודת זמן (גרף עמודות, 100 מיקרומטר). ארבע דיאגרמות סכמטיות הממחישות את המפלים המקבילים של מורפוגנזה של המעי (מימין למעלה). החצים המקווקוים בסכמטיים מייצגים את כיוון זרימת הנוזל. תיבה מקווקו) מציגה את המיקרו-ווילי המחודשים בשכבת Caco-2 התלת-ממדית (מימין). ג, מבט חזיתי אופקי של Caco-2 תלת-ממד הקבוע, קלאודין (ZO-1, אדום) וממברנות גבול מברשת רציפות המסומנות F-אקטין (ירוק) וגרעינים (כחול) אימונופלואורסצנטיות (כחול). מישור מוקד עבור כל תצוגה קונפוקלית.d, מהלך הזמן של שינויים מורפולוגיים באורגנואידים שתורבתו על שבב שהושג על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בימים 3, 7, 9, 11 ו-13. ההוספה (מימין למעלה) מציגה את ההגדלה הגבוהה של התמונה המסופקת. e, צילום מיקרוסקופ של DIC של תמונות 3D organoid 3D שצולמו ב-gut fluorescence שצולמו על סמן חיסון על גבי סמן חיסון. תאי גזע (LGR5;מגנטה), תאי גביע (MUC2; ירוק), F-אקטין (אפור) וגרעינים (ציאן) שגדלו על שבבי מעי במשך 3 ימים, בהתאמה (שמאל) ו-13 ימים (אמצע) אורגנואידים בשכבת האפיתל. ראה גם נתונים מורחבים באיור 3, המדגיש תמונות של איתות LGR5 של מבנה האפיתל של MUC3D, בלי שמראות את האותות של MUC3D. אפיתל אורגנואידי שהוקם במעי על שבב על ידי צביעה של קרום הפלזמה עם צבע CellMask (מימין) ביום 13 של התרבות. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר אלא אם צוין אחרת. ב נדפס מחדש עם אישור מהפניה.2.הוצאת אוניברסיטת אוקספורד;ג מותאם באישור מ-Reference.2.הוצאת אוניברסיטת אוקספורד;e ו-f הותאמו באישור על ידי הפניה.12 תחת רישיון Creative Commons CC BY 4.0.
במעיים על שבב, יש צורך לשנות את פני השטח ההידרופוביים של הממברנה הנקבוביה של PDMS לציפוי מוצלח של ECM. בפרוטוקול זה, אנו מיישמים שתי שיטות שונות כדי לשנות את ההידרופוביות של ממברנות PDMS. לטיפוח תאי Caco-2, הפעלת פני השטח על ידי טיפול UV/אוזון בלבד הספיקה כדי להפחית את פני השטח של Caco-PD ו-Coach של תא ECMMS2, לצמצום פני השטח של Caco-PD. עם זאת, תרבית מיקרופלואידית של אפיתל אורגנואידי דורשת פונקציונליזציה של פני השטח על בסיס כימי כדי להשיג שקיעה יעילה של חלבוני ECM על ידי יישום רציף של פוליאתילןאימין (PEI) וגלוטראלדהיד למיקרו-ערוצי PDMS. לאחר שינוי פני השטח, חלבוני ECM הופקדו כדי לכסות את ה-PDMS המתפקדים, ואז מוכנסים לתא ה-PDMS המתפקד, ואז מוכנסים ה-PDMS המבודדים. תרבית תאים אידיק מתחילה על ידי זילוף רק של המדיום לתוך המיקרו-ערוץ העליון עד שהתאים יוצרים חד-שכבה מלאה, בעוד שהמיקרו-תעלת התחתונה שומרת על תנאים סטטיים. שיטה אופטימלית זו להפעלת פני השטח וציפוי ECM מאפשרת הצמדת אפיתל אורגנואידי כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית על פני השטח של PDMS.
תרביות Transwell דורשות גם ציפוי ECM לפני זריעת תאים;עם זאת, תרביות Transwell אינן דורשות שלבי טיפול מקדים מורכבים כדי להפעיל את פני השטח של תוספות נקבוביות. לגידול תאי Caco-2 בתוספות של Transwell, ציפוי ECM על תוספות נקבוביות מאיץ את ההתקשרות של תאי Caco-2 מנותקים (<1 שעה) ויצירת מחסום צומת צמתים (<1-2 ימים בתרבית אורגנואידית של ECM, בתרבית ECM ב-TransTowell seedd organoid). תוספות מצופים, מחוברות למשטח הממברנה (<3 שעות) ונשמרות עד שהאורגנואידים יוצרים מונו-שכבה מלאה עם שלמות מחסום. תרביות Transwell מבוצעות בצלחות 24-בארות ללא שימוש בשבבים היברידיים.
ניתן להתחיל מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה על ידי הפעלת זרימת נוזלים על ההיבט הבזולטרלי של שכבת אפיתל מבוססת. במעיים על שבב, מורפוגנזה אפיתל החלה כאשר המדיום הוזרם לתוך המיקרו-תעלות העליונות והתחתונות (איור 3a). כפי שתואר קודם לכן, חיוני להחדיר זרימת נוזלים בכיוון ה-inferior inferior inferior inferior-morphogentor (איור 3a). כדי לספק מספיק חומרים מזינים וסרום לתאים הקשורים על ממברנות נקבוביות וליצור מתח גזירה luminal, אנו מפעילים בדרך כלל זרימה כפולה במעי על שבב. בשבבים היברידיים, תוספות Transwell המכילות מונו-שכבות אפיתל הוכנסו לתוך השבבים ההיברידיים. לאחר מכן, המדיום הוחל מתחת לצד הבזולטרלי של ה-Morphogenesis הנקבובי של ימי ה-Morphogenesis של ה-Morchannels הנקבוביים. זרימה בזולטרלית בשתי פלטפורמות התרבות.
ניתן לנתח את המאפיינים המורפולוגיים של שכבות אפיתל תלת-ממדיות מיקרו-מהנדסות על-ידי יישום שיטות הדמיה שונות, כולל מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, מיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאלית (DIC), SEM או מיקרוסקופיה קונפוקלית של אימונופלואורסצנציה (איורים 3 ו-4). ניתן לבצע ניגודיות שלב או הדמיית DIC כדי לנטר בקלות את הצורה וה-DIC במהלך התרבות ה-3. שקיפות אופטית של סרטי PDMS ופוליאסטר, הן פלטפורמת השבב והשבב ההיברידית יכולות לספק הדמיה בזמן אמת במקום ללא צורך בחתך או פירוק של ההתקן. בעת ביצוע הדמיה של אימונופלואורסצנטי (איורים 1, 3c, f ו-4b, c), התאים מקובעים בדרך כלל עם 4% ו-PFA-10 ו-4%, ו-PFA10. % (wt/vol) ) Bovine Serum Albumin (BSA), לפי הסדר. בהתאם לסוג התא, ניתן להשתמש בחומרים מקבעים שונים, מחדירים וחומרים חוסמים. נוגדנים ראשוניים המכוונים לסמני תאים תלויי שושלת או אזורים תלויי שושלת משמשים כדי להדגיש תאים המקובעים באתרם בשבב, ואחריהם נוגדנים משניים יחד עם נוגדנים משני, א-די-נוקל, 2-phenylene) אינדול, DAPI) או F-actin (למשל, phalloidin שכותרתו פלואורסצנטית). ניתן לבצע הדמיה חיה מבוססת פלואורסצנציה גם באתר כדי לזהות ייצור ריר (איור.1, "התמיינות תאים" ו"פיזיולוגיה של המעי"), התיישבות אקראית של תאים מיקרוביאליים (איור 1, "תרבות משותפת של מיקרובי מארח"), גיוס תאי מערכת החיסון (איור 1, 'מודלים של מחלות') או קווי המתאר של מורפולוגיה תלת-ממדית של אפיתל (איור 3, 3b ו- 3b). השכבה העליונה משכבת ​​המיקרו-ערוץ התחתונה, כמתואר ב-ref.כפי שמוצג באיור 2, ניתן להמחיש את המורפולוגיה התלת-ממדית של האפיתל וכן את המיקרו-ווילי על גבול המברשת הקודקודית באמצעות SEM (איור 3b). ניתן להעריך את הביטוי של סמני בידול על-ידי ביצוע PCR5 כמותי או שכבת תאים בודדים בגידול RNA 3D במקרה זה של תאי גידול 3D. שבבים או שבבים היברידיים נקצרים על ידי טריפסיניזציה ולאחר מכן משמשים לניתוח מולקולרי או גנטי.
א, זרימת עבודה להשראת מורפוגנזה של המעי בשבב היברידי. Caco-2 ואורגנואידים מעיים משמשים בפרוטוקול זה כדי להדגים מורפוגנזה תלת מימדית בפלטפורמת שבב היברידי. תאי אפיתל מנותקים נזרעו בתוספות Transwell מוכנות (TW prep; ראה איור להלן). ברגע שכל התאים הוזרעו בתרבית הפוליאסטר הוזרעו בתרבית והודחו תאי פוליאסטר. בתנאים סטטיים (תרבות TW). לאחר 7 ימים, הוספה יחידה של Transwell המכילה חד-שכבה דו-ממדית של תאי אפיתל שולבה בשבב היברידי כדי להחדיר זרימה בזולטרלית (Flow, BL), מה שהוביל בסופו של דבר ליצירת שכבת אפיתל תלת-ממדית (מורפוגנזה). על בכל שלב ניסוי או נקודת זמן. הסכמות בשכבות העליונות ממחישות את תצורת הניסוי עבור כל שלב. ב, שבבים היברידיים (סכימה משמאל) יכולים להוביל למורפוגנזה תלת מימדית של תאי אפיתל אורגנואידיים עם תצוגות מיקרוסקופיות קונפוקאליות מלמעלה למטה שצולמו במיקומי Z שונים (עליון, אמצעי ותחתון;ראה סכמטי ימני והקווים המקווקוים המתאימים).הראו מאפיינים מורפולוגיים ברורים.F-אקטין (ציאן), גרעין (אפור).c, מיקרוגרפי פלואורסצנטי קונפוקאליים (תצוגת זווית תלת-ממדית) של תאי אפיתל שמקורם באורגנואידים שתורבתו ב-Transwell סטטי (TW; מוכנס בקופסה לבנה מקווקו) לעומת שבב היברידי (צילום מלא הגדול ביותר) בהשוואה בין תצוגות מוצלבות של 32D למורפולוגיה של 32D בהתאמה. (מוכנס בפינה הימנית העליונה; "XZ") מציגים גם תכונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות. סרגל קנה מידה, 100 µm.c נדפס מחדש עם אישור מהפנייה.4.Elsevier.
ניתן להכין בקרות על ידי תרבית אותם תאים (Caco-2 או תאי אפיתל אורגנואידיים של המעי) לשכבות חד-ממדיות בתנאי תרבית סטטיים קונבנציונליים. יש לציין, דלדול חומרי הזנה עלולה להיגרם עקב קיבולת הנפח המוגבלת של המיקרו-ערוצים (כלומר ~4 μL בתעלה העליונה של היישום המקורי של השבב של המעי והזרימה של ה-Basolateral, כמו גם לאחר תכנון הזרימה של ה-basolateral במעיים). .
תהליך הליטוגרפיה הרכה צריך להתבצע בחדר נקי. עבור כל שכבה בשבב (שכבות עליונות וממברנות) ובשבבים היברידיים, נעשה שימוש במסכות פוטו-מסכות שונות ויוצרו על פרוסות סיליקון נפרדות מכיוון שגבהים של המיקרו-ערוצים היו שונים. גבהי המטרה של המיקרו-תעלות העליונות והתחתונות של המעי בשבב הם µ02 µm בהתאמה גובה השבב והיעד של השבב. הוא 200 מיקרומטר.
מניחים רקיקת סיליקון בגודל 3 אינץ' בכלי עם אצטון. מערבבים בעדינות את הצלחת למשך 30 שניות, ולאחר מכן יבש את הפרוסה באוויר. העבר את הפרוסה לצלחת עם IPA, ואז סובב את הצלחת למשך 30 שניות לניקוי.
ניתן להשתמש בתמיסת פיראנה (תערובת של מי חמצן וחומצה גופרתית מרוכזת, 1:3 (וול/וול)) כדי למקסם את ההסרה של שאריות אורגניות ממשטח פרוסות הסיליקון.
תמיסת Piranha היא קורוזיבית ביותר ומייצרת חום. יש צורך באמצעי זהירות נוספים. לסילוק פסולת, אפשר לתמיסה להתקרר והעברה למיכל פסולת נקי ויבש. השתמש במיכלים משניים ותווי מיכלי פסולת כראוי. אנא עקוב אחר הנחיות הבטיחות של המתקן לקבלת נהלים מפורטים יותר.
ייבשו את הפרוסים על ידי הנחתם על פלטה חמה של 200 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
יוצקים ~10 גרם של photoresist SU-8 2100 על מרכז פרוסת הסיליקון המנוקה. השתמש בפינצטה כדי לפזר את הפוטורסיסט באופן שווה על הפרוסה. מדי פעם הנח את הפרוסה על פלטה חמה של 65 מעלות צלזיוס כדי להפוך את הפוטורסיסט לפחות דביק וקל יותר לפריסה. אל תניח את הפרוסה ישירות על הפלטה החמה.
SU-8 הופץ באופן שווה על הרסק על ידי הפעלת ציפוי ספין. תכננו סיבוב נכנס של ה-SU-8 למשך 5-10 שניות להתפשטות ב-500 סל"ד בתאוצה של 100 סל"ד לשנייה. הגדר את הסיבוב הראשי לתבנית עובי של 200 מיקרומטר בעובי של 1,500 סל"ד ב-500 µm או עובי של µm 250, השכבה העליונה של המעי על השבב; ראה "שלבים קריטיים" להלן) המוגדרת בתאוצה של 300 סל"ד לשנייה 30 שניות ב-1,200 סל"ד.
ניתן לכוונן את מהירות הסחיטה הראשית בהתאם לעובי היעד של תבנית ה-SU-8 על פרוסת הסיליקון.
כדי לייצר דפוסי SU-8 בגובה 500 מיקרומטר עבור השכבה העליונה של המעי בשבב, ציפוי הספין ושלבי האפייה הרכים של קופסה זו (שלבים 7 ו-8) חזרו על עצמם ברצף (ראה שלב 9) כדי לייצר שתי שכבות של 250 מיקרומטר. שכבה עבה של SU-8, אותה ניתן לחבר שכבה של 10 µ0 של קופסה זו של 1 µ0, ולשלב אותה בשכבה µV. מ' גבוה.
אפו רך את הפרוסים המצופים SU-8 על ידי הנחת הפרוסים בזהירות על צלחת חמה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן החלף את ההגדרה ל-95 מעלות צלזיוס ודגירה למשך 40 דקות נוספות.
כדי להשיג גובה של 500 מיקרומטר של תבנית SU-8 במיקרו-ערוץ העליון, חזור על שלבים 7 ו-8 כדי ליצור שתי שכבות SU-8 בעובי של 250 מיקרון.
באמצעות ה-UV Mask Aligner, בצעו בדיקת מנורה לפי הוראות היצרן כדי לחשב את זמן החשיפה של הפרוסה.(זמן חשיפה, ms) = (מינון חשיפה, mJ/cm2)/(הספק מנורה, mW/cm2).
לאחר קביעת זמן החשיפה, הנח את הפוטומסק על מחזיק המסכה של מיישר מסכת ה-UV והנח את הפוטומסק על פרוסת ה-SU-8 המצופה.
הנח את המשטח המודפס של הפוטומסק ישירות על הצד המצופה SU-8 של פרוסת הסיליקון כדי למזער פיזור UV.
חשפו את הפרוסה המצופה SU-8 ואת הפוטומסק אנכית ל-260 mJ/cm2 של אור UV למשך זמן החשיפה שנקבע מראש (ראה שלב 10 בתיבה זו).
לאחר חשיפת UV, פרוסות סיליקון מצופות SU-8 נאפו ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות על כל פלטה חמה כדי לייצר דפוסים בגובה של 200 מיקרומטר. האריכו את זמן האפייה שלאחר האפייה ב-95 מעלות צלזיוס ל-30 דקות כדי לייצר דפוסים בגובה של 500 מיקרומטר.
המפתח נמזג לכלי זכוכית, והפלטה האפויה מונחת בכלי. נפח מפתח SU-8 עשוי להשתנות בהתאם לגודל צלחת הזכוכית. הקפד להשתמש בכמות מספקת של מפתח SU-8 כדי להסיר לחלוטין את SU-8 שלא נחשף. לדוגמה, כאשר משתמשים בכלי זכוכית בקוטר 150 מ"מ עם קיבולת 1 ליטר עם קיבולת של 5 SU-0 מ"ל, השתמש ב-~30 SU-0 מ"ל. סיבוב.
שטפו את התבנית שפותחה עם ~ 10 מ"ל של מפתח טרי ואחריו IPA על ידי ריסוס התמיסה באמצעות פיפטה.
הנח את הפרוסה במנקה פלזמה וחשוף לפלסמת חמצן (גז אטמוספרי, לחץ יעד 1 × 10-5 טור, הספק 125 W) למשך 1.5 דקות.
מניחים את הוופל במייבש ואקום עם שקף זכוכית בפנים. ניתן להניח פרוסות ושקופיות זה לצד זה. אם מייבש הוואקום מחולק למספר שכבות על ידי צלחת, הניחו את השקופיות בתא התחתון ואת הפרוסות בתא העליון. שחררו 100 μL של trichloro(1H, 2H, fluorsilane glasse, 12) תמיסה על גבי זכוכית 1H, 12. ואקום לסילניזציה.
הפשר בקבוקון של תאי Caco-2 קפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן העביר את התאים המופשרים לבקבוק T75 המכיל 15 מ"ל של מדיום Caco-2 שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
כדי להעביר תאי Caco-2 ב-90% ריכוז, תחילה חם Caco-2 בינוני, PBS ו-0.25% טריפסין/1 מ"מ EDTA באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
שאבו את המדיום על ידי שאיבת ואקום. שטפו תאים פעמיים עם 5 מ"ל של PBS חם על ידי חזרה על שאיבת ואקום והוספת PBS טרי.