תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
מורפוגנזה של המעי האנושי מבססת מאפייני קריפטה-וילוס של מיקרו-ארכיטקטורה תלת-ממדית של אפיתל וארגון מרחבי. מבנה ייחודי זה נדרש לשמירה על הומאוסטזיס של המעי על ידי הגנה על גומחה של תאי גזע בקריפטה הבסיסית מפני אנטיגנים מיקרוביאליים חיצוניים ומטבוליטים שלהם. בנוסף, ויל המעי והריר המפריש מציגים תאי אפיתל מובחנים פונקציונלית עם מחסום מגן על פני רירית המעי. לכן, שחזור מבנים אפיתליאליים תלת-ממדיים הוא קריטי לבניית מודלים של מעי חוץ-גופי. ראוי לציין כי המעי-על-שבב המימטי האורגני יכול לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית ספונטנית של אפיתל המעי עם תפקודים פיזיולוגיים וביומכניקה משופרים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניתן לשחזור כדי לגרום בצורה חזקה למורפוגנזה של המעי במעיים על שבב מיקרופלואידי וכן בשבב היברידי משובץ Transwell. אנו מתארים שיטות מפורטות לייצור המכשיר, גידול של תאי אפיתל Caco-2 או תאי אפיתל אורגנואידים של המעי בסביבות קונבנציונליות וכן על פלטפורמה מיקרופלואידית, אינדוקציה של מורפוגנזה תלת-ממדית ואפיון. של אפיתל תלת-ממדי מבוסס באמצעות שיטות הדמיה מרובות. פרוטוקול זה משיג התחדשות של מיקרו-ארכיטקטורה תפקודית של המעי על ידי שליטה בזרימת נוזלים בזו-צדדית למשך 5 ימים. שיטת המורפוגנזה in vitro שלנו משתמשת במאמץ גזירה רלוונטי פיזיולוגית ותנועה מכנית ואינה דורשת הנדסת תאים מורכבת או מניפולציה, אשר עשויים לעלות על טכניקות קיימות אחרות. אנו צופים כי לפרוטוקול המוצע שלנו עשויות להיות השלכות רחבות על קהילת המחקר הביו-רפואית, ויספק שיטה לחידוש שכבות אפיתל תלת-ממדיות של המעי in vitro עבור יישומים ביו-רפואיים, קליניים ופרמצבטיים.
ניסויים מראים שתאי Caco-2 אפיתל מעיים שגודלו בגידולים מסוג gut-on-chip1,2,3,4,5 או במכשירים מיקרופלואידיים דו-שכבתיים6,7 יכולים לעבור מורפוגנזה תלת-ממדית ספונטנית במבחנה ללא הבנה ברורה של המנגנון הבסיסי. במחקר האחרון שלנו, מצאנו כי הסרת אנטגוניסטים מורפוגנים המופרשים באופן basolateral ממכשירי תרבית היא הכרחית ומספיקה כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל במבחנה, אשר הודגם על ידי Caco-2 ואורגנואידים מעיים שמקורם במטופלים. תאי אפיתל אומתו. במחקר זה, התמקדנו במיוחד בייצור התאים ובפיזור הריכוזים של אנטגוניסט Wnt חזק, Dickkopf-1 (DKK-1), במכשירי מעי על שבב ובמכשירים מיקרופלואידיים שעברו שינוי המכילים מוספים של Transwell, המכונים "שבב היברידי". אנו מדגימים כי הוספת אנטגוניסטים אקסוגניים של Wnt (כגון DKK-1, מדכא Wnt 1, חלבון מופרש הקשור ל-frizzled 1, או Soggy-1) למעי על השבב מעכבת מורפוגנזה או משבשת את שכבת האפיתל התלת-ממדית המובנית מראש, דבר המצביע על כך שעקה אנטגוניסטית במהלך התרבית אחראית למורפוגנזה של המעי במבחנה. לכן, גישה מעשית להשגת מורפוגנזה חזקה בממשק האפיתל היא להסיר או לשמור באופן מינימלי על רמות האנטגוניסטים של Wnt בתא הבזולטרלי על ידי שטיפה אקטיבית (למשל, בפלטפורמות מעי על שבב או היברידי על שבב) או דיפוזיה. מדיה בזוטרלית (למשל, ממוספים של Transwell למאגרים בזוטרליים גדולים ב...). בארות).
בפרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה מפורטת לייצור מיקרו-התקנים מסוג gut-on-a-chip ושבבים היברידיים הניתנים להחדרה ב-Transwell (שלבים 1-5) לתרבית תאי אפיתל מעיים על ממברנות נקבוביות מבוססות פולידימתיל סילוקסאן (PDMS) (שלבים 6A, 7A, 8, 9) או ממברנות פוליאסטר של מוספים ב-Transwell (שלבים 6B, 7B, 8, 9) והשרינו מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה (שלב 10). זיהינו גם מאפיינים תאיים ומולקולריים המעידים על היסטוגנזה ספציפית לרקמה והתמיינות תאית תלוית שושלת על ידי יישום שיטות הדמיה מרובות (שלבים 11-24). אנו משריעים מורפוגנזה באמצעות תאי אפיתל מעיים אנושיים, כגון Caco-2 או אורגנואידים של המעי, בשני פורמטים של תרבית עם פרטים טכניים הכוללים שינוי פני השטח של ממברנות נקבוביות, יצירת שכבות חד-ממדיות דו-ממדיות, ועיבוד ביוכימי של המעי ורבייה של המיקרו-סביבה הביומכנית במבחנה. כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית משכבות חד-ממדיות של אפיתל דו-ממדיות, הסרנו מורפוגן. אנטגוניסטים בשתי צורות התרבית על ידי הזרמת המדיום לתוך התא הבזולטרלי של התרבית. לבסוף, אנו מספקים ייצוג של התועלת של שכבת אפיתל תלת-ממדית מתחדשת שניתן להשתמש בה למידול גדילה אפיתל תלוית מורפוגן, תרבויות משותפות אורכיות של מארח-מיקרוביום, זיהום פתוגן, פגיעה דלקתית, תפקוד לקוי של מחסום האפיתל וטיפולים מבוססי פרוביוטיקה. דוגמה. השפעות.
הפרוטוקול שלנו עשוי להיות שימושי למגוון רחב של מדענים במחקר בסיסי (למשל, ביולוגיה של רירית המעי, ביולוגיה של תאי גזע וביולוגיה התפתחותית) ומחקר יישומי (למשל, בדיקות תרופות פרה-קליניות, מידול מחלות, הנדסת רקמות וגסטרואנטרולוגיה) בעל השפעה רחבה. בשל יכולת השחזור והחוסן של הפרוטוקול שלנו לגרימת מורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי במבחנה, אנו צופים כי ניתן יהיה להפיץ את האסטרטגיה הטכנית שלנו לקהל החוקר את הדינמיקה של איתות תאים במהלך התפתחות המעי, התחדשות או הומאוסטזיס. ​​בנוסף, הפרוטוקול שלנו שימושי לחקירת זיהום תחת גורמים זיהומיים שונים כגון נורו-וירוס 8, תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2), קלוסטרידיום דיפיצילה, סלמונלה טיפימוריום 9 או ויבריו כולרה. קהלים של פתולוגיה ופתוגנזה של מחלות גם הם שימושיים. השימוש במערכת מיקרופיזיולוגיה של המעי על שבב עשוי לאפשר תרבית משותפת אורכית 10 והערכה לאחר מכן של הגנת המארח, תגובות חיסוניות ותיקון פגיעות הקשורות לפתוגנים במערכת העיכול (GI) 11. הפרעות אחרות במערכת העיכול הקשורות לתסמונת המעי הדליף, מחלת צליאק, מחלת קרוהן, קוליטיס כיבית, פואצ'יטיס או תסמונת המעי הרגיז ניתנות לסימולציה כאשר שכבות אפיתל תלת-ממדיות של המעי מוכנות באמצעות שכבות אפיתל המעי התלת-ממדיות של המטופל, מחלות אלו כוללות ניוון וילות, קיצור קריפטה, נזק רירי או מחסום אפיתל לקוי. אורגנואידים מעיים שמקורם בביופסיה או בתאי גזע 12,13. כדי לדגמן טוב יותר את המורכבות הגבוהה יותר של סביבת המחלה, הקוראים עשויים לשקול להוסיף סוגי תאים הרלוונטיים למחלה, כגון תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) של המטופל, למודלים המכילים מיקרו-ארכיטקטורות תלת-ממדיות של וילות-קריפטה של ​​המעי. תאי חיסון ספציפיים לרקמה, 5.
מאחר וניתן לתקן ולהמחיש את המיקרו-מבנה התלת-ממדי של האפיתל ללא תהליך החיתוך, צופים העובדים על טרנסקריפטומיקה מרחבית והדמיה ברזולוציה גבוהה או סופר-רזולוציה עשויים להתעניין במיפוי שלנו של הדינמיקה המרחבית-זמנית של גנים וחלבונים בנישות אפיתל. מתעניינים בטכנולוגיה. תגובה לגירויים מיקרוביאליים או חיסוניים. יתר על כן, ניתן ליצור צירוף מילים אורכי בין מארח למיקרוביום 10, 14 המתאם הומאוסטזיס של המעי בשכבת הרירית התלת-ממדית של המעי על ידי תרבית משותפת של מינים מיקרוביאליים שונים, קהילות מיקרוביאליות או מיקרוביוטה צואתית, במיוחד במעי על שבב. בפלטפורמה. גישה זו מושכת במיוחד לקהלים הלומדים אימונולוגיה רירית, גסטרואנטרולוגיה, מיקרוביום אנושי, קולטורומיקה ומיקרוביולוגיה קלינית המבקשים לטפח מיקרוביוטה של ​​מעיים שלא טופלה בעבר במעבדה. אם ניתן להתאים את פרוטוקול המורפוגנזה in vitro שלנו לפורמטים ניתנים להרחבה, כגון הוספות מרובות בארות בצלחות של 24, 96 או 384 בארות הממלאות באופן רציף תאים בזולטרליים, ניתן להפיץ את הפרוטוקול גם לאלו המפתחים פלטפורמות סינון או אימות פרמצבטיות, ביו-רפואיות או פלטפורמות סינון או אימות בעלות תפוקה גבוהה עבור תעשיית המזון. כהוכחת עקרון, לאחרונה הדגמנו את היתכנותה של מערכת מורפוגנזה מרובת-פלקס בעלת תפוקה גבוהה הניתנת להרחבה לפורמט של צלחת של 24 בארות. בנוסף, מספר מוצרי איברים על שבב הופצו למסחר16,17,18. לכן, ניתן להאיץ את האימות של שיטת המורפוגנזה in vitro שלנו ולאמץ אותה באופן פוטנציאלי על ידי מעבדות מחקר רבות, תעשייה או גופים ממשלתיים ורגולטוריים כדי להבין תכנות מחדש תאי של מורפוגנזה של מעיים in vitro ברמה הטרנסקריפטומית כדי לבדוק תרופות או ביו-רפואיות. הספיגה ו הוערכה הובלת תרופות פוטנציאליות באמצעות פונדקאיות תלת-ממדיות של המעי או באמצעות מודלים מותאמים אישית או מסחריים של איברים על שבב כדי להעריך את יכולת השחזור של תהליך המורפוגנזה של המעי.
מספר מוגבל של מודלים ניסיוניים רלוונטיים לבני אדם שימשו לחקר מורפוגנזה של אפיתל המעי, בעיקר בשל היעדר פרוטוקולים ניתנים ליישום כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה. למעשה, חלק ניכר מהידע הנוכחי על מורפוגנזה במעיים מבוסס על מחקרים בבעלי חיים (למשל, דגי זברה20, עכברים21 או תרנגולות22). עם זאת, הם עתירי עבודה ועלויות, יכולים להיות מפוקפקים מבחינה אתית, וחשוב מכל, אינם קובעים במדויק תהליכי התפתחות אנושיים. מודלים אלה מוגבלים מאוד גם ביכולתם להיבדק בצורה רב-כיוונית ניתנת להרחבה. לכן, הפרוטוקול שלנו לשחזור מבני רקמה תלת-ממדיים במבחנה עולה בביצועיו של מודלים של בעלי חיים in vivo כמו גם מודלים מסורתיים אחרים של תרבית תאים דו-ממדית סטטית. כפי שתואר קודם לכן, שימוש במבני אפיתל תלת-ממדיים אפשר לנו לבחון את המיקום המרחבי של תאים ממוינים בציר הקריפטה-וילוס בתגובה לגירויים ריריים או חיסוניים שונים. שכבות אפיתל תלת-ממדיות יכולות לספק מרחב לחקר האופן שבו תאים מיקרוביאליים מתחרים על יצירת נישות מרחביות ואבולוציה אקולוגית בתגובה לגורמי מארח (למשל, שכבות ריר פנימיות לעומת חיצוניות, הפרשת...). IgA ופפטידים אנטי-מיקרוביאליים). יתר על כן, מורפולוגיה תלת-ממדית של אפיתל יכולה לאפשר לנו להבין כיצד המיקרוביוטה של ​​המעי בונה את הקהילות שלה ומייצרת באופן סינרגטי מטבוליטים מיקרוביאליים (למשל, חומצות שומן קצרות שרשרת) המעצבים את הארגון התאי ואת נישות תאי הגזע בקריפטות הבסיסיות. ניתן להדגים תכונות אלו רק כאשר שכבות אפיתל תלת-ממדיות נוצרות במבחנה.
בנוסף לשיטה שלנו ליצירת מבני אפיתל תלת-ממדיים של המעי, קיימות מספר שיטות חוץ גופיות (in vitro). תרבית אורגנואידים במעיים היא טכניקת הנדסת רקמות חדישה המבוססת על גידול תאי גזע במעיים בתנאי מורפוגן ספציפיים23,24,25. עם זאת, השימוש במודלים תלת-ממדיים של אורגנואידים לניתוח הובלה או תרבויות משותפות של מארח-מיקרוביום הוא לעתים קרובות מאתגר מכיוון שתאי המעי סגורים בתוך האורגנואיד, ולכן, החדרת רכיבים לומינליים כגון תאים מיקרוביאליים או אנטיגנים אקסוגניים מוגבלת. ניתן לשפר את הגישה לתאי אורגנואיד באמצעות מזרק מיקרו,26,27 אך שיטה זו פולשנית ועתירת עבודה ודורשת ידע מיוחד לביצוע. יתר על כן, תרבויות אורגנואידים מסורתיות המוחזקות בפיגומי הידרוג'ל בתנאים סטטיים אינן משקפות במדויק ביומכניקה פעילה in vivo.
גישות אחרות בהן משתמשים מספר קבוצות מחקר משתמשות בפיגומי הידרוג'ל תלת-ממדיים מובנים מראש כדי לחקות את מבנה האפיתל של המעי על ידי גידול תאי מעי אנושיים מבודדים על פני הג'ל. יוצרים פיגומי הידרוג'ל באמצעות תבניות מודפסות בתלת-ממד, מיקרו-מלוטשות או ליתוגרפיות. שיטה זו מציגה את הסידור העצמי של תאי אפיתל מבודדים במבחנה עם גרדיאנטים מורפוגניים רלוונטיים פיזיולוגית, תוך יצירת מבנה אפיתל בעל יחס גובה-רוחב גבוה וצלבת סטרומה-אפיתל על ידי הכללת תאי סטרומה בפיגום. עם זאת, אופי הפיגומים המובנים מראש עשוי למנוע את הצגת התהליך המורפוגנטי הספונטני עצמו. מודלים אלה גם אינם מספקים זרימה לומינלית או אינטרסטיציאלית דינמית, וחסרים את מאמץ הגזירה הנוזלי שתאי מעי צריכים כדי לעבור מורפוגנזה ולהשיג תפקוד פיזיולוגי. מחקר נוסף שנערך לאחרונה השתמש בפיגומי הידרוג'ל בפלטפורמה מיקרופלואידית ובדוגמת מבנים אפיתליאליים של המעי באמצעות טכניקות איכול לייזר. אורגנואידים של מעי עכבר עוקבים אחר דפוסים חרוטים כדי ליצור מבנים צינוריים של המעי, וניתן לשחזר את זרימת הנוזל התוך-לומינלית באמצעות... מודול מיקרופלואידיקה. עם זאת, מודל זה אינו מציג תהליכים מורפוגנטיים ספונטניים ואינו כולל תנועות מכנו-ביולוגיות של המעי. טכניקות הדפסה תלת-ממדית מאותה קבוצה הצליחו ליצור צינורות מעיים מיניאטוריים עם תהליכים מורפוגנטיים ספונטניים. למרות הייצור המורכב של מקטעי מעיים שונים בתוך הצינור, מודל זה חסר גם זרימת נוזל לומינלי ועיוות מכני. בנוסף, יכולת הפעולה של המודל עשויה להיות מוגבלת, במיוחד לאחר השלמת תהליך ההדפסה הביולוגית, מה שמפריע לתנאי הניסוי או לאינטראקציות בין תאים. במקום זאת, הפרוטוקול המוצע שלנו מספק מורפוגנזה ספונטנית של המעי, מאמץ גזירה רלוונטי פיזיולוגית, ביומכניקה המחקה את תנועתיות המעי, נגישות לתאים אפיקליים ובזולטרליים עצמאיים, ויצירה מחדש של מיקרו-סביבות ביולוגיות מורכבות של מודולריות. לכן, פרוטוקול המורפוגנזה התלת-ממדית שלנו במבחנה עשוי לספק גישה משלימה להתגברות על האתגרים של השיטות הקיימות.
הפרוטוקול שלנו מתמקד כולו במורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל, כאשר רק תאי אפיתל נמצאים בתרבית ואין סוגים אחרים של תאים מסביב כגון תאים מזנכימליים, תאי אנדותל ותאי חיסון. כפי שתואר קודם לכן, ליבת הפרוטוקול שלנו היא אינדוקציה של מורפוגנזה אפיתלית על ידי הסרת מעכבי מורפוגן המופרשים בצד הבזו-לטרלי של המדיום המוכנס. בעוד שהמודולריות החזקה של מערכת המעי-על-שבב וההיבריד-על-שבב שלנו מאפשרת לנו לשחזר את שכבת האפיתל התלת-ממדית הגלית, מורכבויות ביולוגיות נוספות כגון אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות33,34, שקיעת מטריצה ​​חוץ-תאית (ECM)35, ובמודל שלנו, תכונות של קריפטה-וילוס המעבירות נישות של תאי גזע בקריפטות בסיסיות נותרו להיבחן עוד. תאי סטרומה (למשל, פיברובלסטים) במזנכימה ממלאים תפקיד מפתח בייצור חלבוני ECM ובוויסות מורפוגנזה של המעי in vivo35,37,38. הוספת תאים מזנכימליים המודל שלנו שיפר את התהליך המורפוגנטי ואת יעילות התקשרות התאים. שכבת האנדותל (כלומר, נימים או כלי דם) ממלאת תפקיד חשוב בוויסות הובלה מולקולרית39 וגיוס תאי חיסון40 בסביבת המעי הקטנה. יתר על כן, רכיבי כלי דם שניתן לחבר בין מודלים של רקמות הם תנאי הכרחי כאשר מודלים של רקמות מתוכננים להדגים אינטראקציות מרובות איברים. לכן, ייתכן שיהיה צורך לכלול תאי אנדותל כדי לדמות מאפיינים פיזיולוגיים מדויקים יותר עם רזולוציה ברמת האיבר. תאי חיסון שמקורם במטופל חיוניים גם להצגת תגובות חיסוניות מולדות, הצגת אנטיגנים, צירוף מילים חיסוני אדפטיבי מולד וחסינות ספציפית לרקמה בהקשר של חיקוי מחלות מעיים.
השימוש בשבבים היברידיים הוא פשוט יותר מאשר "מעי על שבב" מכיוון שהתקנת המכשיר פשוטה יותר והשימוש בתוספות Transwell מאפשר תרבית ניתנת להרחבה של אפיתל המעי. עם זאת, תוספות Transwell הזמינות מסחרית עם ממברנות פוליאסטר אינן אלסטיות ואינן יכולות לדמות תנועות דמויות פריסטלטיקה. יתר על כן, התא האפיקלי של תוסף Transwell שהונח בשבב ההיברידי נותר נייח ללא מאמץ גזירה בצד האפיקלי. ברור שהתכונות הסטטיות בתא האפיקלי לעיתים רחוקות מאפשרות תרבית משותפת של חיידקים לטווח ארוך בשבבים היברידיים. בעוד שאנו יכולים לגרום בצורה חזקה למורפוגנזה תלת-ממדית בתוספות Transwell בעת שימוש בשבבים היברידיים, המחסור בביומכניקה רלוונטית פיזיולוגית וזרימת נוזלים אפיקלית עשוי להגביל את היתכנות פלטפורמות שבבים היברידיים עבור יישומים פוטנציאליים.
שחזורים בקנה מידה מלא של ציר הקריפטה-וילוס האנושי בתרביות מעי-על-שבב והיברידיות-על-שבב לא הוקמו במלואם. מכיוון שהמורפוגנזה מתחילה משכבה חד-שכבתית של אפיתל, מיקרו-ארכיטקטורות תלת-ממדיות אינן בהכרח מספקות דמיון מורפולוגי לקריפטים in vivo. למרות שאפיינו את אוכלוסיית התאים המתרבים ליד תחום הקריפטה הבסיסית באפיתל התלת-ממדי המהונדס במיקרו, אזורי הקריפטה והוילוס לא סומנו בבירור. למרות שערוצים עליונים גבוהים יותר על השבב מובילים לגובה מוגבר של האפיתל המהונדס במיקרו, הגובה המרבי עדיין מוגבל ל-~300-400 מיקרומטר. העומק בפועל של קריפטות המעי האנושיות במעי הדק והגס הוא ~135 מיקרומטר ו-~400 מיקרומטר, בהתאמה, וגובה וסילות המעי הדק הוא ~600 מיקרומטר.
מנקודת מבט של הדמיה, הדמיה in situ ברזולוציה גבוהה של מיקרו-ארכיטקטורות תלת-ממדיות עשויה להיות מוגבלת למעי על גבי שבב, מכיוון שמרחק העבודה הנדרש מעדשת האובייקטיב לשכבת האפיתל הוא בסדר גודל של כמה מילימטרים. כדי להתגבר על בעיה זו, ייתכן שיידרש אובייקטיב מרוחק. יתר על כן, יצירת חתכים דקים להכנת דגימת הדמיה היא מאתגרת בשל האלסטיות הגבוהה של PDMS. יתר על כן, מכיוון שהמיקרו-ייצור שכבה אחר שכבה של המעי על גבי שבב כרוך בהדבקה קבועה בין כל שכבה, מאתגר ביותר לפתוח או להסיר את השכבה העליונה כדי לבחון את מבנה פני השטח של שכבת האפיתל. לדוגמה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
ההידרופוביות של PDMS הייתה גורם מגביל במחקרים מבוססי מיקרופלואידיקה העוסקים במולקולות קטנות הידרופוביות, מכיוון ש-PDMS יכול לספוג מולקולות הידרופוביות כאלה באופן לא ספציפי. ניתן לשקול חלופות ל-PDMS עם חומרים פולימריים אחרים. לחלופין, ניתן לשקול שינוי פני השטח של PDMS (למשל, ציפוי בחומרים ליפופיליים 42 או פולי(אתילן גליקול) 43) כדי למזער את הספיחה של מולקולות הידרופוביות.
לבסוף, השיטה שלנו לא אופיינה היטב מבחינת מתן סינון בעל תפוקה גבוהה או פלטפורמת ניסוי ידידותית למשתמש של "מידה אחת מתאימה לכולם". הפרוטוקול הנוכחי דורש משאבת מזרק לכל מיקרו-התקן, אשר תופסת מקום באינקובטור CO2 ומונע ניסויים בקנה מידה גדול. ניתן לשפר משמעותית מגבלה זו על ידי יכולת ההרחבה של פורמטי תרבית חדשניים (למשל, מוסיפים נקבוביים של 24 בארות, 96 בארות או 384 בארות המאפשרים חידוש והסרה רציפה של מצע בזו-צדדי).
כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי האנושי במבחנה, השתמשנו במכשיר מיקרופלואידי של מעי המכיל שני מיקרו-תעלות מקבילות וקרום נקבובי אלסטי ביניהן כדי ליצור ממשק לומן-נימי. אנו מדגימים גם את השימוש במכשיר מיקרופלואידי בעל ערוץ אחד (שבב היברידי) המספק זרימה בזו-צדדית רציפה מתחת לשכבות אפיתל מקוטבות הגדלות על גבי מוספים של Transwell. בשתי הפלטפורמות, ניתן להדגים מורפוגנזה של תאי אפיתל מעי אנושיים שונים על ידי יישום מניפולציה כיוונית של הזרימה כדי להסיר אנטגוניסטים של מורפוגנים מהתא הבזו-צדדי. כל ההליך הניסויי (איור 1) מורכב מחמישה חלקים: (i) מיקרו-ייצור של שבב המעי או שבב היברידי הניתן להחדרה של Transwell (שלבים 1-5; תיבה 1), (ii) הכנת תאי אפיתל מעי (תאי Caco-2) או אורגנואידים של מעי אנושי; תיבות 2-5), (iii) תרבית של תאי אפיתל מעיים על שבבי מעיים או שבבי היברידיים (שלבים 6-9), (iv) אינדוקציה של מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה (שלב 10) ו-(v)) לאפיון המיקרו-מבנה התלת-ממדי של האפיתל (שלבים 11-24). לבסוף, קבוצת בקרה מתאימה (שיידון בהרחבה בהמשך) תוכננה כדי לאמת את יעילות המורפוגנזה במבחנה על ידי השוואת מורפוגנזה אפיתלית לבקרות מרחביות, זמניות, מותנות או פרוצדורליות.
השתמשנו בשתי פלטפורמות תרבית שונות: מעי-על-שבב עם ערוצים ישרים או ערוצים מפותלים לא ליניאריים, או שבבים היברידיים המכילים מוספים של Transwell (TW) במכשיר מיקרופלואידי, שיוצר כמתואר בתיבה 1, ושלב 1-5. "ייצור המכשיר" מציג את השלבים העיקריים ביצירת שבב יחיד או שבב היברידי. "תרבית של תאי אפיתל מעיים אנושיים" מסבירה את מקור התא (Caco-2 או אורגנואידים של מעיים אנושיים) ואת הליך התרבית המשמש בפרוטוקול זה. "מורפוגנזה במבחנה" מציגה את השלבים הכוללים שבהם תאי אפיתל שמקורם ב-Caco-2 או באורגנואידים מגדלים על שבב מעיים או על מוספים של Transwell של שבב היברידי, ולאחר מכן אינדוקציה של מורפוגנזה תלת-ממדית ויצירת מבנה אפיתל מאופיין. מספר שלב התוכנית או מספר התיבה מוצג מתחת לכל חץ. היישום מספק דוגמאות לאופן שבו ניתן להשתמש בשכבות אפיתל מעיים מבוססות, למשל, באפיון התמיינות תאים, מחקרים פיזיולוגיים של מעיים, הקמת מערכות אקולוגיות של מארח-מיקרוביום ומידול מחלות. אימונופלואורסצנציה תמונות ב"התמיינות תאים" המציגות גרעינים, F-actin ו-MUC2 המתבטאים בשכבת האפיתל התלת-ממדית Caco-2 שנוצרה על שבב המעי. איתות MUC2 קיים בתאי גביע וריר המופרש ממשטחי רירית. תמונות פלואורסצנטיות ב-Gut Physiology מראות ריר המיוצר על ידי צביעה לשאריות חומצה סיאלית ו-N-אצטילגלוקוזאמין באמצעות אגלוטינין נבט חיטה פלואורסצנטי. שתי התמונות החופפות ב"תרבויות משותפות של מארח-מיקרוביום" מראות תרבויות משותפות מייצגות של מארח-מיקרוביום במעיים על שבב. הפאנל השמאלי מציג את התרבית המשותפת של E. coli המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) עם תאי אפיתל Caco-2 תלת-ממדיים מהונדסים במיקרו. הפאנל הימני מציג את המיקום של GFP E. coli שגודל יחד עם תאי אפיתל Caco-2 תלת-ממדיים, ולאחר מכן צביעה אימונופלואורסצנטית עם F-actin (אדום) וגרעינים (כחול). מידול מחלות ממחיש מעי בריא לעומת מעי דולף בשבבי דלקת מעיים תחת אתגר פיזיולוגי עם אנטיגנים חיידקיים (למשל, ליפופוליסכריד, LPS) ותאי חיסון (למשל, PBMC; ירוק). תאי Caco-2 גודלו כדי ליצור שכבת אפיתל תלת-ממדית. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. תמונות בשורה התחתונה: "התמיינות של תאים" מותאמת באישור מהפניה.2. הוצאת אוניברסיטת אוקספורד; שוחזר באישור מהפניה 5. NAS; "תרבית משותפת של מארח-חיידק" מותאמת באישור מהפניה 3. NAS; "מידול מחלות" מותאמת באישור מהפניה 5. NAS.
גם שבבי מעי-על-שבב וגם שבבים היברידיים יוצרו באמצעות רפליקות PDMS שחולקו מתבניות סיליקון על ידי ליתוגרפיה רכה1,44 ועוצבו בתבנית עם SU-8. עיצוב המיקרו-ערוצים בכל שבב נקבע על ידי התחשבות בהידרודינמיקה כגון מאמץ גזירה ולחץ הידרודינמי1,4,12. עיצוב המעי-על-שבב המקורי (איור 1a, נתונים מורחבים), שכלל שני מיקרו-ערוצים ישרים מקבילים זה לזה, התפתח לעיצוב מעי-על-שבב מורכב (איור 1b, נתונים מורחבים) הכולל זוג מיקרו-ערוצים מעוקלים כדי לגרום לזמן שהייה מוגבר של הנוזל, דפוסי זרימה לא ליניאריים ועיוות רב-צירי של תאים בתרבית (איור 2a-f)12. כאשר יש צורך לשחזר ביומכניקה מורכבת יותר של המעי, ניתן לבחור בעיצוב מעי-על-שבב מורכב. הדגמנו ש-Gut-Chip המפותל גם משרה חזקה מורפוגנזה תלת-ממדית במסגרת זמן דומה עם דרגה דומה של צמיחה אפיתלית בהשוואה למקור. Gut-Chip, ללא קשר לסוג התא בתרבית. לכן, כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית, עיצובים ליניאריים ומורכבים של מעיים על שבב ניתנים להחלפה. רפליקות PDMS שהוכשרו על תבניות סיליקון עם תבניות SU-8 סיפקו מאפיינים שליליים לאחר פירוק התבנית (איור 2א'). כדי לייצר את המעיים על שבב, שכבת ה-PDMS העליונה שהוכנה חוברה ברצף לסרט PDMS נקבובי ולאחר מכן יושרתה עם שכבת ה-PDMS התחתונה על ידי הדבקה בלתי הפיכה באמצעות מטפל קורונה (איור 2ב'-ו'). כדי לייצר שבבים היברידיים, רפליקות PDMS שהוכשרו חוברו לשקופיות זכוכית כדי ליצור התקני מיקרופלואידיקה חד-ערוציים שיכולים להכיל מוספים של Transwell (איור 2ח' ונתונים מורחבים איור 2). תהליך ההדבקה מתבצע על ידי טיפול במשטחי רפליקת ה-PDMS והזכוכית בפלזמת חמצן או טיפול קורונה. לאחר עיקור המכשיר המיקרו-מפוברק המחובר לצינור הסיליקון, המכשיר היה מוכן לביצוע מורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי (איור 2ז').
א, איור סכמטי של הכנת חלקי PDMS מתבניות סיליקון מדגם SU-8. תמיסת ה-PDMS הלא מוקשה נמזגה על תבנית סיליקון (משמאל), הוקשה ב-60 מעלות צלזיוס (באמצע) והוצאה ממנה (מימין). ה-PDMS שפורק מהתבנית נחתך לחתיכות ונוקה לשימוש נוסף. ב, צילום של תבנית הסיליקון ששימשה להכנת השכבה העליונה של PDMS. ג, צילום של תבנית הסיליקון ששימשה לייצור קרום הנקבוביות של PDMS. ד, סדרת תצלומים של רכיבי PDMS העליונים והתחתונים והתקן המעי המורכב על השבב. ה, איור סכמטי של יישור רכיבי PDMS העליונים, הממברנה והתחתונים. כל שכבה מחוברת באופן בלתי הפיך על ידי טיפול בפלזמה או בקורונה. ו, איור סכמטי של התקן המעי-על-שבב המיוצר עם מיקרו-תעלות מפותלות ותאי ואקום המונחים על גבי זה. ז, הקמת מעי-על-שבב לתרבית תאים מיקרופלואידית. המעי המיוצר על שבב שהורכב עם צינור סיליקון ומזרק הונח על כיסוי. התקן השבב הונח על ה מכסה של צלחת פטרי 150 מ"מ לעיבוד. הקלסר משמש לסגירת צינור הסיליקון.h, תמונות חזותיות של ייצור שבב היברידי ומורפוגנזה תלת-ממדית באמצעות שבבים היברידיים. מוספים של Transwell שהוכנו באופן עצמאי לתרבית שכבות חד-ממדיות דו-ממדיות של תאי אפיתל מעיים הוכנסו לשבב ההיברידי כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית של המעי. המדיום עובר זילוח דרך מיקרו-תעלות מתחת לשכבת התאים שהוקמה על מוסיף Transwell. סרגל קנה מידה, 1 ס"מ.h הודפס מחדש באישור מהפניה.4. Elsevier.
בפרוטוקול זה, קו התאים Caco-2 ואורגנואידים של המעי שימשו כמקורות אפיתל (איור 3א). שני סוגי התאים גודלו באופן עצמאי (תיבה 2 ותיבה 5) ושימשו לזריעת המיקרו-תעלות המצופות ב-ECM של מעי על שבב או מוספים של Transwell. כאשר התאים שוטפים (כיסוי של >95% בצלוחיות), תאי Caco-2 שגודלו באופן שגרתי (בין מעברים 10 ל-50) בצלוחיות T נקצרים כדי להכין תרחיפים של תאים מנותקים באמצעות נוזל טריפסיניזציה (תיבה 2). אורגנואידים של מעי אנושי מביופסיות מעי או כריתות כירורגיות גודלו בכיפות פיגום Matrigel בצלחות של 24 בארות כדי לתמוך בסביבה המבנית. מצע המכיל מורפוגנים חיוניים (כגון Wnt, R-spondin ו-Noggin) וגורמי גדילה שהוכנו כמתואר בתיבה 3 נוספה כל יומיים עד שהאורגנואידים גדלו לקוטר של ~500 מיקרומטר. אורגנואידים שגודלו במלואם נקצרים ומפורקים לתאים בודדים עבור... זריעה על גבי מעי או תוסף Transwell על גבי שבב (תיבה 5). כפי שדיווחנו בעבר, ניתן להבדיל זאת לפי סוג המחלה12,13 (למשל, קוליטיס כיבית, מחלת קרוהן, סרטן המעי הגס או תורם רגיל), אתר הנגע (למשל, נגע לעומת אזור לא פגוע) ומיקום מערכת העיכול בדרכי השתן (למשל, תריסריון, מעי גס, איליאום, מעי גס, מעי גס או פי הטבעת). אנו מספקים פרוטוקול אופטימלי בתיבה 5 לגידול אורגנואידים קולוניים (קולואידים) שבדרך כלל דורשים ריכוזים גבוהים יותר של מורפוגנים מאשר אורגנואידים של המעי הדק.
א, תהליך עבודה להשראת מורפוגנזה של המעי בשבב המעי. אפיתל המעי האנושי Caco-2 ואורגנואידים של המעי משמשים בפרוטוקול זה כדי להדגים מורפוגנזה תלת-ממדית. תאי האפיתל המבודדים נזרעו במכשיר המעי-על-שבב שהוכן (הכנת שבב). לאחר שתאים נזרעו (נזרעו) וצורפו (מחוברים) לממברנה הנקבובית של PDMS ביום 0 (D0), זרימה אפיקלית (AP) מתחילה ומתוחזקת במשך היומיים הראשונים (זרימה, AP, D0-D2). זרימה בזולטרית (BL) מתחילה גם היא יחד עם תנועות מתיחה מחזוריות (מתיחה, זרימה, AP ו-BL) כאשר נוצרת שכבה חד-ממדית דו-ממדית שלמה. מורפוגנזה תלת-ממדית של המעי התרחשה באופן ספונטני לאחר 5 ימים של תרבית מיקרופלואידית (מורפוגנזה, D5). תמונות ניגודיות פאזה מציגות מורפולוגיה מייצגת של תאי Caco-2 בכל שלב ניסיוני או נקודת זמן (גרף עמודות, 100 מיקרומטר). ארבע דיאגרמות סכמטיות הממחישות את הקסקדות המתאימות של מורפוגנזה של המעי (מימין למעלה). הקו המקווקו חצים בסכמטי מייצגים את כיוון זרימת הנוזל.ב, תמונת SEM המציגה את טופולוגיית פני השטח של אפיתל Caco-2 תלת-ממדי שהוקם (משמאל). התמונה המוקטנת המדגישה את האזור המוגדל (תיבה מקווקו לבנה) מציגה את המיקרו-וילי שהתחדשו על שכבת Caco-2 התלת-ממדית (מימין).ג, מבט חזיתי אופקי של ממברנות Caco-2 תלת-ממדיות, קלאודין (ZO-1, אדום) וגבול מברשת רציף המסומנות ב-F-actin (ירוק) וגרעינים (כחול). הדמיה קונפוקלית אימונופלואורסצנציה של תאי אפיתל על שבבי מעיים.חיצים המצביעים על הסכמטי האמצעי מציינים את מיקום מישור המוקד עבור כל מבט קונפוקלי.ד, מהלך זמן של שינויים מורפולוגיים באורגנואידים שגודלו על שבב שהתקבל על ידי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה בימים 3, 7, 9, 11 ו-13. התמונה המוקטנת (למעלה מימין) מציגה את ההגדלה הגבוהה של התמונה המצורפת.ה, פוטומיקרוגרף DIC של אפיתל תלת-ממדי אורגנואיד שהוקם במעיים על פרוסה שצולמה ביום 7.ו, תמונות אימונופלואורסצנציה שכוסות עליהן. מציג סמנים לתאי גזע (LGR5; מג'נטה), תאי גביע (MUC2; ירוק), F-אקטין (אפור) וגרעינים (ציאן) שגודלו על שבבי מעיים במשך 3 ימים, בהתאמה (שמאל) ו-13 יום (אמצעי) אורגנואידים על שכבת האפיתל. ראה גם איור 3 של נתונים מורחבים, המדגיש את איתות LGR5 ללא איתות MUC2. תמונות פלואורסצנציה המראות את המיקרו-מבנה האפיתל (מימין) של אפיתל אורגנואיד תלת-ממדי שהוקם במעיים על שבב על ידי צביעת קרום הפלזמה בצבע CellMask (מימין) ביום 13 של התרבית. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר אלא אם כן צוין אחרת. ב הודפס מחדש באישור מההפניה. 2. הוצאת אוניברסיטת אוקספורד; ג מעובד באישור מההפניה. 2. הוצאת אוניברסיטת אוקספורד; ה ו-ו מעובדים באישור באמצעות הפניה. 12 תחת רישיון Creative Commons CC BY 4.0.
במעי על שבב, יש צורך לשנות את המשטח ההידרופובי של קרום ה-PDMS הנקבובי לציפוי ECM מוצלח. בפרוטוקול זה, אנו מיישמים שתי שיטות שונות לשינוי ההידרופוביות של ממברנות PDMS. עבור גידול תאי Caco-2, הפעלת פני השטח על ידי טיפול UV/אוזון בלבד הספיקה כדי להפחית את ההידרופוביות של פני השטח של PDMS, לצפות את ה-ECM ולחבר תאי Caco-2 לממברנת PDMS. עם זאת, תרבית מיקרופלואידית של אפיתל אורגנואידי דורשת פונקציונליזציה של פני השטח מבוססת כימיקלים כדי להשיג שיקוע יעיל של חלבוני ECM על ידי יישום רציף של פוליאתילן-אימין (PEI) וגלוטרלדהיד על מיקרו-תעלות PDMS. לאחר שינוי פני השטח, חלבוני ECM הופקדו כדי לכסות את פני השטח של PDMS שעברו פונקציונליזציה ולאחר מכן הוכנסו לאפיתל אורגנואידי מבודד. לאחר חיבור התאים, תרבית התאים המיקרופלואידית מתחילה על ידי הזרמת המדיום בלבד לתוך המיקרו-תעלה העליונה עד שהתאים יוצרים שכבה חד-שכבתית שלמה, בעוד שהמיקרו-תעלה התחתונה שומרת על תנאים סטטיים. שיטה אופטימלית זו להפעלת פני השטח וציפוי ECM מאפשרת את הצמדת האורגנואידים. אפיתל כדי לגרום למורפוגנזה תלת-ממדית על פני השטח של PDMS.
תרביות Transwell דורשות גם ציפוי ECM לפני זריעת התאים; עם זאת, תרביות Transwell אינן דורשות שלבי טיפול מקדים מורכבים כדי להפעיל את פני השטח של תאי מילוי נקבוביים. עבור גידול תאי Caco-2 על גבי תאי Transwell, ציפוי ECM על גבי תאי מילוי נקבוביים מאיץ את ההיצמדות של תאי Caco-2 מנותקים (פחות משעה) ואת היווצרות מחסום הצומת ההדוק (פחות מ-1-2 ימים). כדי לגדל אורגנואידים על גבי תאי Transwell, אורגנואידים מבודדים נזרעים על גבי תאים מצופים ECM, מחוברים לפני השטח של הממברנה (פחות מ-3 שעות) ומתוחזקים עד שהאורגנואידים יוצרים שכבה חד-שכבתית שלמה עם שלמות המחסום. תרביות Transwell מבוצעות בצלחות של 24 בארות ללא שימוש בשבבים היברידיים.
ניתן להתחיל מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה על ידי הפעלת זרימת נוזלים לצד הבזו-לטרלי של שכבת אפיתל מבוססת. במעי על שבב, מורפוגנזה אפיתלית החלה כאשר המדיום הוזרם לתוך המיקרו-תעלות העליונות והתחתונות (איור 3א). כפי שתואר קודם לכן, חיוני להכניס זרימת נוזלים לתא התחתון (הבזו-לטרלי) להסרה רציפה של מעכבי מורפוגן מופרשים כיווניים. כדי לספק מספיק חומרים מזינים וסרום לתאים הקשורים לממברנות נקבוביות וליצור מאמץ גזירה לומינלי, אנו בדרך כלל מיישמים זרימה כפולה במעי על שבב. בשבבים היברידיים, הוכנסו לתוך השבבים ההיברידיים מוספים של Transwell המכילים שכבות חד-צדדיות של אפיתל. לאחר מכן, המדיום יושם מתחת לצד הבזו-לטרלי של מוסיף Transwell הנקבובי דרך המיקרו-תעלה. מורפוגנזה מעיים התרחשה 3-5 ימים לאחר תחילת הזרימה הבזו-לטרלית בשתי פלטפורמות התרבית.
ניתן לנתח את התכונות המורפולוגיות של שכבות אפיתל תלת-ממדיות שעברו מיקרו-הנדסה על ידי יישום שיטות הדמיה שונות, כולל מיקרוסקופיית ניגוד פאזה, מיקרוסקופיית ניגוד התערבות דיפרנציאלי (DIC), SEM או מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה קונפוקלית (איורים 3 ו-4). ניתן לבצע בקלות הדמיית ניגוד פאזה או DIC בכל עת במהלך התרבית כדי לנטר את הצורה והבליטה של ​​שכבות אפיתל תלת-ממדיות. בשל השקיפות האופטית של PDMS וסרטי פוליאסטר, הן פלטפורמות gut-on-a-chip והן פלטפורמות שבב היברידי יכולות לספק הדמיה בזמן אמת באתר ללא צורך בחתך או פירוק של המכשיר. בעת ביצוע הדמיית אימונופלואורסצנציה (איורים 1, 3c, f ו-4b, c), תאים מקובעים בדרך כלל עם 4% (wt/vol) פאראפורמלדהיד (PFA), ולאחר מכן Triton X-100 ו-2% (wt/vol) אלבומין בסרום בקר (BSA), לפי הסדר. בהתאם לסוג התא, ניתן להשתמש בחומרים מקבעים, חדירות וחוסמים שונים. נוגדנים ראשוניים המכוונים סמני תאים או אזורים תלויי שושלת משמשים להדגשת תאים מקובעים באתר על השבב, ולאחר מכן נוגדנים משניים יחד עם צבע נגדי המכוון לגרעין (למשל, 4′,6-דיאמידינו-2-פנילן) אינדול, DAPI) או F-אקטין (למשל, פאלואידין המסומן בפלואורסצנציה). ניתן לבצע הדמיה חיה מבוססת פלואורסצנציה גם באתר כדי לזהות ייצור ריר (איור 1, "התמיינות תאים" ו"פיזיולוגיה של המעי"), קולוניזציה אקראית של תאים מיקרוביאליים (איור 1, "תרבית משותפת של מארח-חיידק"), גיוס תאי חיסון (איור 1, 'מידול מחלות') או קווי המתאר של מורפולוגיה אפיתל תלת-ממדית (איור 3c,f ו-4b,c). בעת שינוי המעי על השבב כדי להפריד את השכבה העליונה משכבת ​​המיקרו-תעלה התחתונה, כמתואר במקור. כפי שמוצג באיור 2, ניתן לדמיין את המורפולוגיה האפיתל התלת-ממדית כמו גם את המיקרו-וילי על גבול המברשת האפיקלי באמצעות SEM. (איור 3b). ניתן להעריך את ביטוי סמני ההתמיינות על ידי ביצוע PCR5 כמותי או ריצוף RNA של תא בודד. במקרה זה, שכבות תלת-ממדיות של תאי אפיתל הגדלים בשבבי מעיים או שבבי היברידיים נקצרות על ידי טריפסיניזציה ולאחר מכן משמשות לניתוח מולקולרי או גנטי.
א. תהליך עבודה להשראת מורפוגנזה של מעיים בשבב היברידי. Caco-2 ואורגנואידים של המעיים משמשים בפרוטוקול זה כדי להדגים מורפוגנזה תלת-ממדית בפלטפורמת שבב היברידי. תאי אפיתל מנותקים נזרעו בתוספות Transwell מוכנות (הכנת TW; ראה איור למטה). לאחר שתאים נזרעו (נוצרו) וחוברו לממברנות פוליאסטר בתוספות Transwell, כל התאים גודלו בתנאים סטטיים (תרבית TW). לאחר 7 ימים, תוסף Transwell יחיד המכיל שכבה חד-ממדית דו-ממדית של תאי אפיתל שולב בשבב היברידי כדי להכניס זרימה בזולטרית (Flow, BL), מה שהוביל בסופו של דבר ליצירת שכבת אפיתל תלת-ממדית (מורפוגנזה). מיקרוגרפים של ניגוד פאזה המציגים מאפיינים מורפולוגיים של תאי אפיתל של איברים אנושיים שמקורם במעי הגס העולה של תורם רגיל (קו C103) בכל שלב או נקודת זמן ניסיוני. הסכמות בשכבות העליונות ממחישות את התצורה הניסויית עבור כל שלב. ב. שבבים היברידיים (סכמטי משמאל) יכולים להוביל למורפוגנזה תלת-ממדית של תאי אפיתל אורגנואידים עם תצוגות מיקרוסקופיה קונפוקלית מלמעלה למטה שצולמו במיקומי Z שונים (עליון, אמצעי ותחתון; ראה סכמה ימנית וקווים מקווקווים תואמים). הראה מאפיינים מורפולוגיים ברורים. F-אקטין (ציאן), גרעין (אפור). c, מיקרוגרפים קונפוקליים פלואורסצנטיים (תצוגה זוויתית תלת-ממדית) של תאי אפיתל שמקורם באורגנואידים שגודלו ב-Transwell סטטי (TW; הכנס בתוך תיבה מקווקו לבנה) לעומת שבב היברידי (התמונה המלאה הגדולה ביותר) המשווים מורפולוגיה דו-ממדית לעומת תלת-ממדית, בהתאמה. זוג תצוגות חיתוך אנכי דו-ממדיות (הכנסה בפינה הימנית העליונה; "XZ") מציגות גם תכונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. c הודפס מחדש באישור מהפניה. 4. אלסוויר.
ניתן להכין בקרות על ידי גידול אותם תאים (Caco-2 או תאי אפיתל אורגנואידים של המעי) לתוך שכבות חד-ממדיות דו-ממדיות בתנאי גידול סטטיים קונבנציונליים. ראוי לציין כי דלדול חומרים מזינים עלול להיגרם עקב קיבולת הנפח המוגבלת של המיקרו-תעלות (כלומר ~4 µL בערוץ העליון בעיצוב המקורי של שבב המעי). לכן, ניתן גם להשוות את המורפולוגיה האפיתלית לפני ואחרי יישום הזרימה הבזו-לטרלית.
יש לבצע את תהליך הליתוגרפיה הרכה בחדר נקי. עבור כל שכבה על השבב (שכבות עליונות ותחתונות וממברנות) ועל השבבים ההיברידיים, נעשה שימוש בפוטומסכות שונות ויוצרו על פרוסות סיליקון נפרדות מכיוון שגבהים של המיקרו-תעלות היו שונים. גובה היעד של המיקרו-תעלות העליונות והתחתונות של המעי על השבב הוא 500 מיקרומטר ו-200 מיקרומטר, בהתאמה. גובה יעד הערוץ של השבב ההיברידי הוא 200 מיקרומטר.
הניחו פרוסת סיליקון בקוטר 7.5 ס"מ בצלחת עם אצטון. סובבו בעדינות את הצלחת במשך 30 שניות, ולאחר מכן ייבשו את הפרוסת באוויר. העבירו את הפרוסת לצלחת עם IPA, ולאחר מכן סובבו את הצלחת במשך 30 שניות לניקוי.
ניתן להשתמש אופציונלית בתמיסת פיראניה (תערובת של מי חמצן וחומצה גופרתית מרוכזת, 1:3 (נפח/נפח)) כדי למקסם את הסרת השאריות האורגניות מפני השטח של פרוסות הסיליקון.
תמיסת פיראניה היא קורוזיבית ביותר ומייצרת חום. יש לנקוט באמצעי זהירות נוספים. לצורך סילוק פסולת, יש לאפשר לתמיסה להתקרר ולהעביר אותה למיכל פסולת נקי ויבש. יש להשתמש במיכלים משניים ולסמן כראוי את מיכלי הפסולת. יש לפעול לפי הנחיות הבטיחות של המתקן לקבלת נהלים מפורטים יותר.
יבשו את הוופלים על ידי הנחתם על פלטה חמה של 200 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הייבוש, הוופלים נוערו חמש פעמים באוויר כדי להתקרר.
שפכו כ-10 גרם של פוטורזיסט SU-8 2100 על מרכז פרוסת הסיליקון הנקייה. השתמשו בפינצטה כדי לפזר את הפוטורזיסט באופן שווה על פרוסת הסיליקון. מדי פעם הניחו את פרוסת הסיליקון על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי שהפוטורזיסט יהיה פחות דביק וקל יותר למריחה. אין להניח את פרוסת הסיליקון ישירות על פלטת הסיליקון החמה.
SU-8 פוזר באופן שווה על גבי הפרוסה האלקטרונית באמצעות הפעלת ציפוי ספין. יש לתכנת סיבוב נכנס של ה-SU-8 למשך 5-10 שניות כך שיתפשט במהירות של 500 סל"ד בתאוצה של 100 סל"ד/שנייה. יש להגדיר את הסיבוב העיקרי ליצירת דפוס בעובי של 200 מיקרון ב-1,500 סל"ד, או להשיג עובי של 250 מיקרון (מה שיוצר גובה של 500 מיקרון לשכבה העליונה של המעי על השבב; ראה "שלבים קריטיים" להלן) תוך הגדר לתאוצה של 300 סל"ד/שנייה למשך 30 שניות ב-1,200 סל"ד.
ניתן לכוונן את מהירות הסיבוב העיקרית בהתאם לעובי היעד של תבנית SU-8 על פרוסת הסיליקון.
כדי לייצר תבניות SU-8 בגובה 500 מיקרומטר עבור השכבה העליונה של המעי על השבב, שלבי ציפוי הסחרור והאפייה הרכה של קופסה זו (שלבים 7 ו-8) חזרו על עצמם ברצף (ראה שלב 9) כדי לייצר שתי שכבות של SU-8 בעובי 250 מיקרומטר, אותן ניתן לשכב ולחבר באמצעות חשיפה לקרינת UV בשלב 12 של קופסה זו, וליצור שכבה בגובה 500 מיקרומטר.
אפו את הוופלים המצופים SU-8 בעדינות על ידי הנחתם בזהירות על פלטה חמה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לאחר מכן העבירו את ההגדרה ל-95 מעלות צלזיוס ודגרו במשך 40 דקות נוספות.
כדי להשיג גובה של 500 מיקרומטר של תבנית SU-8 במיקרו-תעלה העליונה, חזור על שלבים 7 ו-8 כדי ליצור שתי שכבות SU-8 בעובי של 250 מיקרומטר.
באמצעות יישור מסכת UV, בצעו בדיקת מנורה בהתאם להוראות היצרן כדי לחשב את זמן החשיפה של הוופל. (זמן חשיפה, אלפיות שנייה) = (מינון חשיפה, mJ/cm2)/(הספק מנורה, mW/cm2).
לאחר קביעת זמן החשיפה, יש להניח את הפוטומסכה על בעל המסכה של יישור מסכת ה-UV ולהניח את הפוטומסכה על פרוסות ה-SU-8 המצופות.
הנח את המשטח המודפס של הפוטומסכה ישירות על הצד המצופה SU-8 של פרוסת הסיליקון כדי למזער את פיזור ה-UV.
חשפו את פרוסת האבק המצופה SU-8 ואת הפוטומסכה אנכית ל-260 mJ/cm2 של אור UV למשך זמן החשיפה שנקבע מראש (ראו שלב 10 בתיבה זו).
לאחר חשיפה לקרינת UV, פרוסות סיליקון מצופות SU-8 נאפו ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות על כל פלטה חמה כדי לייצר דוגמאות בגובה של 200 מיקרומטר. הארכו את זמן האפייה לאחר החימום ב-95 מעלות צלזיוס ל-30 דקות כדי לייצר דוגמאות בגובה של 500 מיקרומטר.
המפתח נמזג לצלחת זכוכית, והוופל האפוי מונח בצלחת. נפח מפתח ה-SU-8 עשוי להשתנות בהתאם לגודל לוח הזכוכית. יש לוודא שמשתמשים בכמות מספקת של מפתח SU-8 כדי להסיר לחלוטין את ה-SU-8 שלא נחשף. לדוגמה, בעת שימוש בצלחת זכוכית בקוטר 150 מ"מ ובנפח של 1 ליטר, יש להשתמש בכ-300 מ"ל של מפתח SU-8. יש לפתח את התבנית במשך 25 דקות עם סיבוב עדין מדי פעם.
יש לשטוף את התבנית שפותחה עם ~10 מ"ל של מפתח טרי ואחריו IPA על ידי ריסוס התמיסה באמצעות פיפטה.
הניחו את פרוסת הוופל במנקה פלזמה וחשפו אותה לפלזמת חמצן (גז אטמוספרי, לחץ יעד 1 × 10−5 טור, הספק 125 וואט) למשך 1.5 דקות.
הניחו את הוופלים במייבש ואקום עם שקופית זכוכית בפנים. ניתן להניח ופלים ושקופיות זה לצד זה. אם ייבוש הוואקום מחולק למספר שכבות על ידי צלחת, הניחו את השקופיות בתא התחתון ואת הוופלים בתא העליון. טפטפו 100 מיקרוליטר של תמיסת טריכלורו(1H, 1H, 2H, 2H-פרפלואורואוקטיל)סילאן על שקופית זכוכית והפעילו ואקום לצורך סיליניזציה.
הפשירו בקבוקון של תאי קאקו-2 קפואים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לאחר מכן העבירו את התאים המופשרים לבקבוקון T75 המכיל 15 מ"ל של מצע קאקו-2 שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
כדי להעביר תאי Caco-2 ב-~90% שטף, יש לחמם תחילה את מדיום Caco-2, PBS ו-0.25% טריפסין/1 mM EDTA באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
יש לשאוב את המדיום על ידי שאיבת ואקום. יש לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ"ל של PBS חם על ידי חזרה על שאיבת ואקום והוספת PBS טרי.