רכישה והפצה של חומרים מזינים משלבות תכונות של חיפוש מזון על ידי חרקים ותכונות היסטוריית חיים. כדי לפצות על ליקויים בחומרים מזינים ספציפיים בשלבי חיים שונים, חרקים יכולים להשיג חומרים מזינים אלה באמצעות תזונה משלימה, למשל, על ידי אכילה מהפרשות של חוליות בתהליך המכונה שלוליות. נראה כי היתוש אנופלס ערביאני סובל מתת תזונה ולכן זקוק לחומרים מזינים הן לחילוף חומרים והן לרבייה. מטרת מחקר זה הייתה להעריך האם ערבוב של יתוש An. arabiensis על שתן פרה לצורך רכישת חומרים מזינים משפר את מאפייני היסטוריית החיים.
ודאו שזה בטוח. arabiensis נמשך לריח של שתן פרה טרי, בן 24 שעות, 72 שעות ו-168 שעות, ונקבות המחפשות מארח וניזונות מדם (48 שעות לאחר ארוחה בדם) נמדדו באולפקטומטר בצינור Y, ונקבות בהריון הוערכו לבדיקת הטלה. לאחר מכן נעשה שימוש בניתוח כימי ואלקטרופיזיולוגי משולב כדי לזהות תרכובות ביו-אקטיביות בשתן פרה בכל ארבע קבוצות הגיל. תערובות סינתטיות של תרכובות ביו-אקטיביות הוערכו בניסויי Y ובניסויי שדה. כדי לחקור את שתן הפרה ואת התרכובת העיקרית שלו המכילה חנקן, אוריאה, כתזונה משלימה פוטנציאלית עבור וקטורי מלריה, נמדדו פרמטרי האכלה ומאפייני היסטוריית חיים. הוערכו שיעור היתושים הנקבות וכמות השתן והאוריאה של הפרה שנספגו. לאחר האכלה, הנקבות הוערכו להישרדות, תעופה קשורה ורבייה.
חפשו את הדם והמזון של הפונדקאי. במחקרי מעבדה ושדה, ערבים נמשכו לריח הטבעי והסינתטי של שתן פרה טרי ומיושן. נקבות בהריון היו אדישות לתגובות שתן פרה באתרי הרבייה. נקבות המחפשות דם ומוצצות דם סופגות באופן פעיל שתן פרה ואוריאה ומקצות משאבים אלה בהתאם לפשרות היסטוריית החיים כפונקציה של מצב פיזיולוגי לתעופה, הישרדות או רבייה.
איסוף והפצה של שתן פרה על ידי Anopheles arabinis לשיפור מאפייני היסטוריית החיים. הזנה משלימה של שתן פרה משפיעה ישירות על קיבולת הווקטורים על ידי הגדלת ההישרדות היומית וצפיפות הווקטורים, ובעקיפין על ידי שינוי פעילות התעופה ולכן יש לשקול זאת במודלים עתידיים.
רכישה והפצה של חומרי הזנה משלבות מאפייני חיפוש מזון של חרקים ומאפייני היסטוריית חיים [1,2,3]. חרקים מסוגלים לבחור ולרכוש מזון ולבצע הזנה מפצה על סמך זמינות המזון ודרישות החומרים המזינים [1, 3]. פיזור החומרים המזינים תלוי בתהליך היסטוריית החיים ועשוי להוביל לדרישות שונות לאיכות וכמות התזונה בשלבי חיים שונים של חרקים [1, 2]. כדי לפצות על מחסור בחומרי הזנה ספציפיים, חרקים יכולים להשיג חומרים מזינים אלה באמצעות הזנה משלימה, כגון מבוץ, צואה והפרשות שונות של בעלי חוליות, ופגר, תהליך המכונה שלוליות [2]. למרות שמגוון מיני פרפרים ועשים מתוארים בעיקר, נקודות השקיה מתרחשות גם בסדרות חרקים אחרות, ומשיכה והאכלה מסוגים אלה של משאבים יכולים להיות בעלי השפעות משמעותיות על הבריאות ותכונות היסטוריית חיים אחרות [2, 4, 5, 6], 7]. יתוש המלריה Anopheles gambiae sensu lato (sl) מתגלה כבוגר "סובל מתת תזונה" [8], ולכן השקיה עשויה למלא תפקיד חשוב במאפייני היסטוריית החיים שלו, אך התנהגות זו הוזנחה עד כה. השימוש בתנועות אדמה כאמצעי להגברת צריכת חומרים מזינים בכלי חשוב זה מצדיק תשומת לב, שכן הדבר עשוי להיות בעל השלכות אפידמיולוגיות חשובות.
צריכת חנקן אצל יתושי אנופלס בוגרים מוגבלת עקב עתודות קלוריות נמוכות הנישאות משלב הזחל וניצול לא יעיל של קמח דם [9]. נקבות ה-Ann.gambiae sl בדרך כלל מפצות על כך על ידי תוספת של ארוחות דם משלימות [10, 11], ובכך מעמידות יותר אנשים בסיכון להידבקות במחלה ומגדילות את הסיכון לטריפה של יתושים. לחלופין, יתושים יכולים להשתמש בהזנה משלימה של צואת חוליות כדי לרכוש תרכובות חנקניות המשפרות את ההסתגלות ואת יכולת התמרון של הטיסה, כפי שהודגם על ידי חרקים אחרים [2]. בהקשר זה, המשיכה החזקה והמובחנת של אחד המינים האחים בתוך An. קומפלקס המינים הגמבי sl, Anopheles arabinis, שתן פרה טרי ומיושן [12,13,14], מעניינת. Anopheles arabinis הוא אופורטוניסטי בהעדפותיו המארחות וידוע שהוא מקיים קשרים עם בקר וניזון ממנו. שתן פרה הוא משאב עשיר בתרכובות חנקניות, כאשר אוריאה מהווה 50-95% מכלל החנקן בשתן טרי [15, 16]. עם הגיל של שתן פרה, מיקרואורגניזמים מנצלים משאבים אלה כדי להפחית את מורכבות התרכובות החנקניות תוך 24 שעות [15]. עם העלייה המהירה ברמות האמוניה, הקשורה לירידה בחנקן האורגני, משגשגים מיקרואורגניזמים אלקלופיליים (שרבים מהם מייצרים תרכובות רעילות ליתושים) [15], שעשויים להיות נקבות מסוג Ann.arabiensis ונמשכות באופן עדיף לשתן שגילו 24 שעות או פחות [13, 14].
במחקר זה, חיפשו יתושים מארחים ויתושים שניזונו מדם. במהלך מחזור הגונדוטרופין הראשון שלו, נבדקה רכישת תרכובות חנקניות, כולל אוריאה, על ידי ערבוב שתן. לאחר מכן, נערכה סדרת ניסויים כדי להעריך כיצד יתושות נקבות מקצות משאב תזונתי פוטנציאלי זה לשיפור הישרדות, רבייה וחיפוש מזון נוסף. לבסוף, נבדק ריח שתן פרה טרי ומיושן כדי לקבוע האם אלה סיפקו רמזים אמינים עבור יתוש מארחים ויתושים שניזונו מדם. בחיפוש אחר משאב תזונתי פוטנציאלי זה, גילו יתושים ערביים קורלציות כימיות מאחורי האטרקטיביות השונה שנצפתה. תערובות ריח סינתטיות של תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) שזוהו בשתן מיושן של 24 שעות הוערכו עוד יותר בתנאי שדה, תוך הרחבתם של התוצאות שהתקבלו בתנאי מעבדה והדגמת השפעת ריח שתן בקר על מצבים פיזיולוגיים שונים. משיכת יתושים. התוצאות שהתקבלו מאשרות כי יתוש ערביים רוכש ומפיץ תרכובות חנקניות הנמצאות בשתן של בעלי חוליות כדי להשפיע על מאפייני היסטוריית החיים. תוצאות אלו נידונות בהקשר של השלכות אפידמיולוגיות פוטנציאליות וכיצד ניתן להשתמש בהן למעקב ובקרה של וקטורים.
אנופלס ערביקנס (זן דונגולה) נשמר בטמפרטורה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס, 65 ± 5% לחות יחסית ומחזור אור:חושך של 12:12 שעות. הזחלים גודלו במגשי פלסטיק (20 ס"מ × 18 ס"מ × 7 ס"מ) מלאים במים מזוקקים והוזנו במזון לדגים Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). גלמים נאספו בכוסות של 30 מ"ל (Nolato Hertila, Åstorp, SE) ולאחר מכן הועברו לכלובי Bugdorm (30 ס"מ × 30 ס"מ × 30 ס"מ; MegaView Science, Taichung, Taiwan) כדי לאפשר לבוגרים להופיע. לבוגרים סופקה תמיסת סוכרוז 10% באופן חופשי עד 4 ימים לאחר ההופעה (dpe), ואז הוצעה לנקבות המחפשות מארח דיאטה מיד לפני הניסוי, או הורעבו למשך הלילה במים מזוקקים לפני הניסוי, כמתואר להלן. נקבות ששימשו לניסויי צינור טיסה הורעבו למשך 4-6 שעות בלבד. עם מים כרצונם. כדי להכין יתושים מוצצי דם לבדיקות ביולוגיות נוספות, 4 נקבות dpe קיבלו דם כבשים דפיברוטי (Håtunalab, Bro, SE) באמצעות מערכת הזנה ממברנלית (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). לאחר מכן, נקבות עמוסות לחלוטין הועברו לכלובים בודדים וקיבלו תזונה ישירה, כמתואר להלן, או 10% סוכרוז כרצונם במשך 3 ימים לפני הניסויים המתוארים להלן. הנקבות האחרונות שימשו לבדיקות ביולוגיות בצינור תעופה והועברו למעבדה, ולאחר מכן קיבלו מים מזוקקים כרצונם במשך 4-6 שעות לפני הניסוי.
מבחני האכלה שימשו לכמת את צריכת השתן והאוריאה בנקבות ערביות בוגרות. נקבות המחפשות מארחים ונקבות שניזונו מדם קיבלו תזונה המכילה 1% שתן פרה טרי ומיושן מדולל, ריכוזים שונים של אוריאה, ושתי קבוצות ביקורת (10% סוכרוז ומים) למשך 48 שעות. בנוסף, צבע מאכל (1 מ"ג מ"ל-1 קסילן ציאניד FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, שטוקהולם, דרום אוסטרליה) נוסף לתזונה וסופק במטריצה ​​של 4 × 4 במבחנות מיקרוצנטריפוגה של 250 מיקרוליטר (Axygen Scientific, יוניון סיטי, קליפורניה, ארה"ב; איור 1A). מלאו עד הקצה (~300 מיקרוליטר). כדי למנוע תחרות בין יתושים והשפעות אפשריות של צבע הצבע, הניחו 10 יתושים בצלחת פטרי גדולה (קוטר 12 ס"מ וגובה 6 ס"מ; Semadeni, Ostermundigen, CH; איור 1A) בחושך מוחלט בטמפרטורה של 25 ± 2 ס"מ מעלות צלזיוס וטמפרטורה יחסית של 65 ± 5%. לחות. ניסויים אלה חזרו על עצמם 5 עד 10 פעמים. לאחר חשיפה לתזונה, היתושים הושמו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.
חפשו שתן בקר ואוריאה שנספגו על ידי הפונדקאי והנקבה מוצצת הדם Anopheles arabianus. בניסוי האכלה (A), יתושות קיבלו תזונה המורכבת משתן פרה טרי ומיושן, ריכוזים שונים של אוריאה, סוכרוז (10%) ומים מזוקקים (H2O). נקבות המחפשות מארח (B) ונקבות שניזונו מדם (C) ספגו יותר סוכרוז מכל תזונה אחרת שנבדקה. שימו לב שנקבות המחפשות מארח ספגו שתן פרה במשך 72 שעות פחות משתן פרה במשך 168 שעות (B). תכולת החנקן הכוללת הממוצעת (± סטיית תקן) של השתן מיוצגת בתמונה המוקטנת. נקבות המחפשות מארח (D, F) ונקבות מוצצות דם (E, G) סופגות אוריאה באופן תלוי מינון. נפחי שאיפה ממוצעים (D, E) עם שמות אותיות שונים היו שונים באופן משמעותי זה מזה (ANOVA חד כיווני באמצעות ניתוח פוסט הוק של Tukey; p < 0.05). סרגלי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע (BE). הקו המקווקו הישר מייצג את קו הרגרסיה הלוגריתמי-לינארית (F, ז)
כדי לשחרר מזון שנספג, היתושים הוכנסו כל אחד בנפרד למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילות 230 מיקרוליטר של מים מזוקקים והרקמה נותקה באמצעות עלי חד פעמי ומנוע אלחוטי (VWR International, לונד, דרום אוסטרליה), ולאחר מכן בוצעה צנטריפוגה במהירות של 10 קרטון לדקה למשך 10 דקות. הנוזל העל-תכליתי (200 מיקרוליטר) הועבר למיקרופלטת 96 בארות (Sigma-Aldrich) והספיגה (λ620) נקבעה באמצעות קורא מיקרופלטות מבוסס ספקטרופוטומטר (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, גרמניה) nm). לחלופין, היתושים נטחנו ב-1 מ"ל של מים מזוקקים, מתוכם 900 מיקרוליטר הועברו לקובטה לניתוח ספקטרופוטומטרי (λ 620 ננומטר; UV 1800, שימאדזו, קיסטה, דרום אוסטרליה). כדי לכמת את הצריכה התזונתית, הוכנה עקומת תקן על ידי דילול סדרתי כדי להניב 0.2 מיקרוליטר עד 2.4 מיקרוליטר של קסילן ב-1 מ"ג מ"ל-1. ציאניד. לאחר מכן, צפיפות אופטית של ריכוזי צבע ידועים שימשה לקביעת כמות המזון שכל יתוש בלע.
נתוני הנפח נותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחר מכן השוואות זוגיות פוסט-הוק של Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). ניתוחי רגרסיה לינארית תיארו צריכת אוריאה תלוית ריכוז והשוו תגובות בין יתושים המחפשים פונדקאים ליתושים מוצצי דם (GraphPad Prism v8.0.0 for Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
כ-20 מיקרוליטר של דגימות שתן מכל קבוצת גיל נקשרו על גבי Chromosorb® W/AW (10 מ"ג רשת 80/100, Sigma Aldrich) ונארזו בקפסולות פח (8 מ"מ × 5 מ"מ). הקפסולות הוכנסו לתא הבעירה של מכשיר אנליזת CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) כדי לקבוע את תכולת החנקן בשתן טרי ומיושן בהתאם לפרוטוקול היצרן. כמות החנקן הכוללת (g N l-1) נמדדה כמותית על סמך ריכוזי אוריאה ידועים המשמשים כסטנדרט.
כדי להעריך את השפעת התזונה על הישרדותן של נקבות המחפשות ומוצצות דם, היתושים הונחו בנפרד בצלחות פטרי גדולות (12 ס"מ קוטר ו-6 ס"מ גובה; Semadeni) עם חור מכוסה רשת במכסה (3 ס"מ קוטר) לאוורור ואספקת מזון. הדיאטות סופקו מיד לאחר 4 ימים של מנה אחת וכללו 1% שתן פרה טרי ומיושן מדולל, ארבעה ריכוזים של אוריאה, ושני קבוצות ביקורת, 10% סוכרוז ומים. כל דיאטה הוכנסה באמצעות פיפטה לטמפון דנטלי (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) שהוכנס למזרק של 5 מ"ל (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), הבוכנה הוסרה והונחה על גבי צלחת פטרי (איור 1).1א). שנה את התזונה שלך מדי יום. שמור על המעבדה כמתואר לעיל. יתושים ששרדו נספרו פעמיים ביום, בעוד יתושים מתים הושלכו עד למותו של היתוש האחרון (n = 40 לכל טיפול). הישרדות היתושים שניזונו מדיאטות שונות נותחה סטטיסטית באמצעות עקומות הישרדות קפלן-מאייר ומבחני לוג-רנק. כדי להשוות השוואות של התפלגות הישרדות בין דיאטות (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
טחנת מעופפת יתושים בהתאמה אישית המבוססת על Attisano et al.[17], עשויה מפאנלים אקריליים שקופים בעובי 5 מ"מ (רוחב 10 ס"מ x אורך 10 ס"מ x גובה 10 ס"מ) ללא פאנלים קדמיים ואחוריים (איור 3: למעלה). מכלול ציר עם צינור אנכי העשוי מעמודת כרומטוגרפיית גז (קוטר פנימי 0.25 מ"מ; אורך 7.5 ס"מ) עם קצוות מודבקים למחט חרקים התלויה בין זוג מגנטים ניאודימיום במרחק 9 ס"מ זה מזה. צינור אופקי העשוי מאותו חומר (אורך 6.5 ס"מ) חצה את הצינור האנכי כדי ליצור זרוע קשורה וזרוע שנשאה חתיכה קטנה של נייר אלומיניום כאות הפרעה לאור.
נקבות מורעבות במשך 24 שעות קיבלו את התזונה הנ"ל במשך 30 דקות לפני ריסון. נקבות יתושים שניזונו במלואן הורדמו בנפרד על קרח למשך 2-3 דקות וחוברו לסיכות חרקים בעזרת שעוות דבורים (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) ולאחר מכן נקשרו לזרועות הצינורות האופקיים. טחנת מעופפת. סיבובי מעוף נרשמו על ידי לוגר נתונים מותאם אישית, לאחר מכן אוחסנו והוצגו באמצעות תוכנת PC-Lab 2000™ (גרסה 4.01; Velleman, Gavere, BE). טחנת המעוף הוצבה בחדר עם אקלים מווסת (12 שעות:12 שעות, אור:חושך, 25 ± 2 מעלות צלזיוס, 65 ± 5% לחות יחסית).
כדי להמחיש את דפוס פעילות הטיסה, חושבו המרחק הכולל שטסו (במטרים) והמספר הכולל של פעילויות טיסה רצופות לשעה על פני תקופה של 24 שעות. בנוסף, המרחקים הממוצעים שטסו נשים בודדות הושוו בין הטיפולים ונותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני וניתוח פוסט-הוק של Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), כאשר המרחק הממוצע נחשב למשתנה תלוי, בעוד שהטיפול הוא גורם בלתי תלוי. בנוסף, מספר הסיבובים הממוצע מחושב במרווחים של 10 דקות.
כדי להעריך את השפעת התזונה על ביצועי הרבייה של An.arabiensis, שש נקבות (4 יחידות ביצים) הועברו ישירות לכלובי Bugdorm (30 ס"מ × 30 ס"מ × 30 ס"מ) לאחר איסוף דם ולאחר מכן סופקו להן את התזונה הניסיונית למשך 48 שעות כמתואר לעיל. לאחר מכן הוסרו התזונה וכוסות הטלה (30 מ"ל; Nolato Hertila) מלאות ב-20 מ"ל של מים מזוקקים סופקו ביום השלישי למשך 48 שעות, תוך החלפה כל 24 שעות. חזרו על כל משטר תזונה 20-50 פעמים. הביצים נספרו ותועדו עבור כל כלוב ניסיוני. תת-דגימות של ביצים שימשו להערכת גודל ממוצע ושינוי אורך של ביצים בודדות (n ≥ 200 לכל תזונה) באמצעות מיקרוסקופ Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) המצויד במצלמת Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., גרמניה). הביצים הנותרות נשמרו בחדר מבוקר אקלים בתנאי גידול סטנדרטיים למשך 24 שעות, ונמדדה תת-דגימה של זחלים בשלב הראשון שהופיעו לאחרונה (n ≥ 200 לכל דיאטה), כמתואר לעיל. מספר הביצים וגודל הביצים והזחלים הושוו בין הטיפולים ובאמצעות ניתוח ANOVA חד-כיווני וניתוח פוסט-הוק של Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
נדיפות בחלל החזה (Headspace) משתן טרי (שעה לאחר הדגימה), שתן בן 24 שעות, 72 שעות ו-168 שעות נאספו מדגימות שנאספו מבקר זבו, גזעי ארסי. לשם נוחות, דגימות שתן נאספו מוקדם בבוקר, בעוד הפרות עדיין היו ברפת. דגימות שתן נאספו מ-10 פרטים ו-100-200 מ"ל מכל דגימה הועברו לשקיות אפייה פוליאמיד אישיות (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., מינדן, גרמניה) בתפוחי פלסטיק של פוליאמיד בנפח 3 ליטר עם מכסה ויניל כלוריד. נדיפות בחלל החזה מכל דגימת שתן בקר נאספו ישירות (טרי) או לאחר הבשלה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות, 72 שעות ו-168 שעות, כלומר כל דגימת שתן ייצגה כל קבוצת גיל.
לאיסוף חומרים נדיפים בחלל המוח, נעשה שימוש במערכת בלולאה סגורה להזרמת זרם גז מסונן בפחם פעיל (100 מ"ל לדקה) דרך שקית פוליאמיד לעמודת הספיחה למשך 2.5 שעות באמצעות משאבת ואקום דיאפרגמה (KNF Neuberger, פרייבורג, גרמניה). כביקורת, איסוף חומרים בחלל המוח בוצע משקית פוליאמיד ריקה. עמודת הספיחה הייתה עשויה מצינורות טפלון (5.5 ס"מ x 3 מ"מ פנימיים) המכילה 35 מ"ג של Porapak Q (רשת 50/80; Waters Associates, מילפורד, מסצ'וסטס, ארה"ב) בין פקקי צמר זכוכית. לפני השימוש, העמודה נשטפה ב-1 מ"ל n-הקסאן מזוקק מחדש (Merck, דרמשטט, גרמניה) וב-1 מ"ל פנטאן (ממס טהור 99.0% בדרגת GC, Sigma Aldrich). החומרים הנדיפים שנספחו עברו אלציה עם 400 מיקרוליטר של פנטאן. אוספי חומרי המוח אוחדו ולאחר מכן אוחסנו ב-20°C- עד לשימוש לניתוח נוסף.
תגובות התנהגותיות של יתושי אֶרַבִּידוֹפְּסִי המחפשים ואוכלים דם. תמציות נדיפות ממרחב הראש שנאספו משתן טרי, בן 24 שעות, 72 שעות ו-168 שעות, נותחו עבור תמציות נדיפות מיתושי אֶרַבִּידוֹפְּסִיס באמצעות אולפקטומטר בצינור זכוכית ישר [18]. הניסויים נערכו במהלך תקופת ה-ZT 13-15, תקופת השיא של פעילות חיפוש הבית של אֶרַבִּידוֹפְּסִיסִיס. ערבי [19]. אולפקטומטר בצינור זכוכית (80 ס"מ × 9.5 ס"מ קוטר פנימי) הואר באור אדום בעוצמה של 3 ± 1 ליטר מלמעלה. זרימת אוויר מסוננת ולחה בפחם (25 ± 2 מעלות צלזיוס, 65 ± 2% לחות יחסית) עברה את הבדיקה הביולוגית ב-30 ס"מ לשנייה. אוויר מועבר דרך סדרה של מסכי רשת מפלדת אל-חלד, ויוצר זרימה למינרית ומבנה פלומה אחיד. מתקן טמפונים דנטליים (4 ס"מ × 1 ס"מ; L:D; DAB Dental AB), התלוי מסליל של 5 ס"מ בקצה הרוח של האולפקטומטר. עם החלפת גירוי כל 5 דקות. לצורך הניתוח, 10 מיקרוליטר מכל תמצית headspace, מדוללת 1:10, שימשה כגירוי. כמות שווה של פנטאן שימשה כביקורת. יתושים המחפשים מארח או מוצצי דם הונחו בכלובי שחרור בודדים 2-3 שעות לפני תחילת הניסוי. כלוב השחרור הוצב בצד הרוח של האולפקטומטר, והיתושים הורשו להסתגל למשך דקה אחת, ולאחר מכן נפתח שסתום הפרפר של הכלוב לשחרור. משיכה לטיפול או לבקרה נותחה כשיעור היתושים שבאו במגע עם המקור תוך 5 דקות משחרור. כל תמצית נדיפה headspace ובקרה שוכפלו לפחות 30 פעמים, וכדי להימנע מההשפעות של כל יום אחד, נבדק אותו מספר של טיפולים ובקרות בכל יום ניסוי. תגובות חיפוש מהמארח ומקבוצות headspace שניזונו מדם. ערבית לעומת קבוצות headspace נותחו באמצעות רגרסיה לוגיסטית נומינלית ולאחר מכן השוואות זוגיות עבור יחסים אי-זוגיים (JMP Pro, v14.0.0, SAS המכון בע"מ).
תגובת ההטלה של An. תמציות Headspace משתן פרה טרי ומיושן נותחו בכלובי Bugdorm (30 ס"מ × 30 ס"מ × 30 ס"מ; MegaView Science). כוסות פלסטיק (30 מ"ל; Nolato Hertila) מלאות ב-20 מ"ל של מים מזוקקים סיפקו את מצע ההטלה והונחו בפינות מנוגדות של הכלוב, במרחק של 24 ס"מ זו מזו. כוסות הטיפול הותאמו עם 10 מיקרוליטר מכל תמצית headspace בדילול של 1:10. כמות שווה של פנטאן שימשה להתאמת כוס הבקרה. כוסות טיפול וכוס בקרה הוחלפו בין כל ניסוי כדי לשלוט על השפעות מיקום. עשר נקבות שניזונו מדם שוחררו לכלובים ניסיוניים ב-ZT 9-11 וביצים בכוסות נספרו 24 שעות לאחר מכן. הנוסחה לחישוב מדד ההטלה היא: (מספר הביצים שהוטלו בכוס הטיפול - מספר הביצים שהוטלו בכוס הבקרה) / (המספר הכולל של הביצים שהוטלו). כל טיפול חזר על עצמו 8 פעמים.
ניתוח כרומטוגרפיית גז וגילוי דפוסי אנטנה אלקטרונית (GC-EAD) של נקבת צמח ה-An.arabiensis בוצע כפי שתואר קודם לכן [20]. בקצרה, תמציות נדיפות טריות מהמרווח הראשוני הופרדו באמצעות מכשיר Agilent Technologies 6890 GC (סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב) המצויד בעמודה HP-5 (קוטר פנימי של 30 מטר × 0.25 מ"מ, עובי שכבה של 0.25 מיקרומטר, Agilent Technologies). ושתן מזדקן. מימן שימש כפאזה ניידת עם קצב זרימה ליניארי ממוצע של 45 ס"מ לשנייה. כל דגימה (2 מיקרוליטר) הוזרק למשך 30 שניות במצב ללא פיצול עם טמפרטורת כניסה של 225 מעלות צלזיוס. טמפרטורת תנור ה-GC תוכנתה מ-35 מעלות צלזיוס (החזקה של 3 דקות) ל-300 מעלות צלזיוס (החזקה של 10 דקות) ב-10 מעלות צלזיוס לדקה ל-1. במפצל השפכים של GC, נוספו 4 psi של חנקן ופוצלו ביחס של 1:1 בצלבת Gerstel 3D/2 בעלת נפח מת נמוך (Gerstel, Mülheim, DE) בין גלאי יינון הלהבה ל-EAD. נימי השפכים של GC עבור EAD הועבר דרך קו העברה Gerstel ODP-2, העוקב אחר טמפרטורת תנור ה-GC ועוד 5 מעלות צלזיוס, לתוך צינור זכוכית (10 ס"מ × 8 מ"מ), שם עורבב עם אוויר מסונן פחמן ולח (1.5 ליטר לדקה ל-1). האנטנה הוצבה 0.5 ס"מ מפתח הצינור. כל יתוש היווה שכפול אחד, ועבור יתושים המחפשים פונדקאים, בוצעו לפחות שלושה שכפולים על דגימות שתן מכל גיל.
זיהוי תרכובות ביו-אקטיביות באוספי headspace של שתן בקר טרי ומיושן באמצעות ספקטרומטר GC משולב וספקטרומטר מסה (GC-MS; 6890 GC ו-5975 MS; Agilent Technologies) כדי לעורר תגובות מחושים בניתוח GC-EAD, הפועל במצב יינון השפעת אלקטרונים ב-70 eV. ה-GC צויד בעמודה נימית סיליקה התכה מצופה HP-5MS UI (קוטר פנימי 60 מטר × 0.25 מ"מ, עובי שכבה 0.25 מיקרומטר) תוך שימוש בהליום כפאזה ניידת עם קצב זרימה ליניארי ממוצע של 35 ס"מ לשנייה. דגימה של 2 מיקרוליטר הוזרקה באמצעות אותן הגדרות הזרקה וטמפרטורת תנור כמו בניתוח GC-EAD. התרכובות זוהו על סמך זמן החזקתן (אינדקס קובאט) וספקטרום המסה בהשוואה לספרייה המותאמת אישית ולספריית NIST14 (Agilent). התרכובות שזוהו אושרו על ידי הזרקת סטנדרטים אותנטיים (קובץ נוסף 1: טבלה S2). לצורך כימות, הפטיל אצטט (10 ng, טוהר כימי של 99.8%, אולדריץ') הוזרק כסטנדרט חיצוני.
הערכת יעילותה של תערובת ריח סינתטית המורכבת מתרכובות ביו-אקטיביות שזוהו בשתן טרי ומיושן כדי למשוך Ans.arabiensis המחפש מארח ומוצץ דם, תוך שימוש באותו אולפקטומטר ופרוטוקול כנ"ל. תערובות סינתטיות חיקו את ההרכב והפרופורציות של תרכובות בתמציות נדיפות מעורבות במרווח הראש של שתן טרי, מיושן 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו-168 שעות (איור 5D-G; קובץ נוסף 1: טבלה S2). לניתוח, השתמשו ב-10 מיקרוליטר של דילול 1:100 של התערובת הסינתטית המלאה, עם קצב שחרור כולל הנע בין כ-140-2400 ננוגרם שעה-1, להערכת האטרקטיביות ליתושים מארחים וליתושי דם. לאחר מכן, הבדיקה מבוצעת על תערובות שלמות, בהן מוסרות תערובות חיסוריות של תרכובות בודדות של התערובת המלאה. תגובות חיפוש ממארח ​​ומ-Ans שניזון מדם. תערובות ערביות לעומת תערובות סינתטיות וחיסוריות נותחו באמצעות רגרסיה לוגיסטית נומינלית ולאחריה השוואות זוגיות עבור יחסים אי-זוגיים. (JMP Pro, גרסה 14.0.0, מכון SAS בע"מ).
כדי להעריך האם שתן פרה יכול לשמש כסימן לבית גידול לפונדקאי ליתושי מלריה, שתן פרה טרי ומיושן, שנאסף כמתואר לעיל, ומים הונחו בדליים מרושתים של 3 ליטר (100 מ"ל) והוצבו במלכודות פיתיון לפונדקאי. (גרסת BG-HDT; BioGents, רגנסבורג, גרמניה). עשר מלכודות הוצבו במרחק של 50 מטר זו מזו במרעה, 400 מטר מקהילת הכפר (סיליי, אתיופיה, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) וללא בקר, באתרי רבייה קבועים ובכפרים. חמש מלכודות חוממו כדי לדמות את נוכחותו של פונדקאי, בעוד שחמש מלכודות נותרו ללא חימום. כל מיקום טיפול מתחלף מדי לילה למשך חמישה לילות בסך הכל. מספרי יתושים שנלכדו במלכודות עם פיתיון של שתן בגילאים שונים הושוו באמצעות רגרסיה לוגיסטית עם התפלגות בינומית בטא (JMP Pro, גרסה 14.0.0, SAS Institute Inc.).
בכפר אנדמי למלריה ליד העיירה מאקי, אזור אורומיה, אתיופיה (8° 11′ 08″ צפון, 38° 81′ 70″ מזרח; איור 6A). המחקר נערך בין אמצע אוגוסט לאמצע ספטמבר לפני הריסוס השנתי בתוך הבית, יחד עם עונת גשמים ארוכה. חמישה זוגות בתים (במרחק של 20-50 מטר זה מזה) הממוקמים בפאתי הכפר נבחרו למחקר (איור 6A). הקריטריונים ששימשו לבחירת הבתים היו: אין להכניס בעלי חיים לבית, אין לבשל בתוך הבית (שאיבת עצי הסקה או פחמים) (לפחות בתקופת הניסוי), ובתים עם מקסימום של שני תושבים, הלנים בתוך תכשירים שאינם קוטלי חרקים. מתחת לכילה המטופלת. אישור אתי ניתן על ידי הוועדה המוסדית לביקורת אתיקה במחקר (IRB/022/2016) של הפקולטה למדעי הטבע (CNS-IRB), אוניברסיטת אדיס אבבה, בהתאם להנחיות שנקבעו בהצהרת הלסינקי של האיגוד הרפואי העולמי. הסכמה מכל ראש משק בית התקבלה בסיוע צוות הרחבת הבריאות. התהליך כולו מאושר על ידי המנהלים המקומיים ברמת המחוז והמחלקה ('קבלה'). תכנון הניסוי עקב אחר תכנון ריבוע לטיני 2 × 2, שבו תערובות סינתטיות וקבוצות בקרה הוקצו לבתים זוגיים בלילה הראשון והוחלפו בין הבתים בלילה הניסויי הבא. תהליך זה חזר על עצמו עשר פעמים. בנוסף, כדי להעריך את פעילות היתושים בבתים נבחרים, מלכודות ה-CDC נקבעו כך שיפעלו חמישה לילות רצופים בתחילת, אמצע וסוף ניסוי השדה באותה שעה ביום.
תערובת סינתטית המכילה שש תרכובות ביו-אקטיביות הומסה בהפטן (97.0% ממס בדרגת GC, Sigma Aldrich) ושוחררה ב-140 ננוגרם שעה-1 באמצעות מתקן פתיל כותנה [20]. מתקן הפתיל איפשר שחרור של כל התרכובות בפרופורציות קבועות לאורך הניסוי בן 12 השעות. הפטן שימש כביקורת. הבקבוקון הונח ליד נקודת הכניסה של מלכודת האור של המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) (חברת John W. Hock, גיינסוויל, פלורידה, ארה"ב; איור 6A). המלכודות נתלו בגובה 0.8-1 מטר מעל הקרקע, ליד רגלי המיטה, ומתנדב ישן מתחת לכילה נגד יתושים שלא טופלה ופעל בין השעות 18:00 ל-06:30. יתושים שנלכדו לפי מין ומצב פיזיולוגי (לא אכלו, אכלו, בהריון למחצה ובריון [21] נבדקו לאחר מכן באמצעות ניתוח תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לזהות את המין שזוהה מורפולוגית כ-A. gambiae sl. חברי הקומפלקס [23]. ב... במחקר השדה, לכידת מלכודות של בתים מזווגים נותחה באמצעות מודל התאמה לוגיסטית נומינלית, כאשר משיכה הייתה המשתנה התלוי והטיפול (תערובת סינתטית לעומת ביקורת) היה האפקט הקבוע (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). כאן, אנו מדווחים על ערכי χ2 ו-p ממבחן יחס הסבירות.
הערכו האם זה בטוח. arabiensis הצליח להשיג שתן, מקור החנקן העיקרי שלו, אוריאה, על ידי האכלה ישירה, תוך 48 שעות מהמתן במשך 4 ימים לאחר (dpe) ניסויי האכלה של נקבות המחפשות מארח ונקבות שניזונו מדם (איור 1A). גם נקבות המחפשות מארח וגם נקבות מוצצות דם ספגו משמעותית יותר סוכרוז מכל תזונה או מים אחרים (F(5,426) = 20.15, p < 0.0001 ו-F(5,299) = 56.00, p < 0.0001, בהתאמה; איור 1B,C). יתר על כן, נקבות המחפשות מארח אכלו פחות בשתן לאחר 72 שעות בהשוואה לשתן לאחר 168 שעות (איור 1B). כאשר הוצעה להן תזונה המכילה אוריאה, נקבות המחפשות מארח ספגו כמות משמעותית גדולה יותר של אוריאה ב-2.69 mM בהשוואה לכל הריכוזים והמים האחרים, בעוד שלא ניתן היה להבחין בינו לבין סוכרוז 10% (F(10,813)). = 15.72, p < 0.0001; איור 1D). ממצא זה עמד בניגוד לתגובה של נקבות שניזונו מדם, אשר בדרך כלל ספגו משמעותית יותר מזונות המכילים אוריאה מאשר מים, אם כי משמעותית פחות מ-10% סוכרוז (F(10,557) = 78.35, p < 0.0001; איור 1).1E). יתר על כן, כאשר משווים בין שני המצבים הפיזיולוגיים, נקבות שעברו פלבוטומיה ספגו יותר אוריאה מאשר נקבות המחפשות פונדקאים בריכוזים הנמוכים ביותר, ונקבות אלו ספגו כמויות דומות של אוריאה בריכוזים גבוהים יותר (F(1,953)= 78.82, p < 0.0001; איור 1F, G). בעוד שצריכה מתזונה המכילה אוריאה נראתה כבעלת ערכים אופטימליים (איור 1D,E), נקבות בשני המצבים הפיזיולוגיים הצליחו לווסת את כמות האוריאה הנספגת על פני כל טווח ריכוזי האוריאה בצורה לוגריתמית-לינארית (איור 1F,G). באופן דומה, נראה כי יתושים שולטים בספיגת החנקן שלהם על ידי ויסות כמות השתן הנספגת, שכן כמות החנקן בשתן משתקפת בכמות הנספגת (איור 1B, C ו-B).
כדי להעריך את השפעות השתן והאוריאה על הישרדות יתושים המחפשים פונדקאים ומוצצי דם, נקבות ניזונו משתן מכל ארבעת הגילאים (טרי, 24 שעות, 72 שעות ו-168 שעות לאחר ההפקדה) ומגוון ריכוזי אוריאה, כמו גם מים מזוקקים ו-10% סוכרוז שימשו כביקורת (איור 2א'). ניתוח הישרדות זה הראה כי לתזונה הייתה השפעה משמעותית על ההישרדות הכוללת בנקבות המחפשות פונדקאים (שתן: χ2 = 108.5, df = 5, p < 0.0001; אוריאה: χ2 = 122.8, df = 5, p < 0.0001; איור 2ב', ג') ובנקבות שניזונו מדם (שתן: χ2 = 93.0, df = 5, p < 0.0001; אוריאה: χ2 = 137.9, df = 5, p < 0.0001; איור 2D,E). בכל הניסויים, נקבות שניזונו מדיאטה של ​​שתן, אוריאה ומים הציגו שיעורי הישרדות נמוכים משמעותית בהשוואה לנקבות שניזונו מדיאטה של ​​סוכרוז (איור 2B-E). נקבות המחפשות מארח שניזונו משתן טרי ועבש הציגו שיעורי הישרדות שונים, כאשר אלו שניזונו משתן מעופש במשך 72 שעות (p = 0.016) היו בעלות הסתברות ההישרדות הנמוכה ביותר (איור 2B). יתר על כן, נקבות המחפשות מארח שניזונו מ-135 mM אוריאה שרדו זמן רב יותר מקבוצת ביקורת במים (p < 0.04) (איור 2C). בהשוואה למים, נשים שניזונו משתן טרי ושתן בן 24 שעות שרדו זמן רב יותר (p = 0.001 ו-p = 0.012, בהתאמה; איור 2D), בעוד שנשים שניזונו משתן בן 72 שעות שרדו זמן רב יותר מאלו שניזונו משתן טרי קצר ושתן בן 24 שעות (p < 0.0001 ו-p = 0.013, בהתאמה; איור 2D). כאשר ניזונו מ-135 mM אוריאה, נקבות שניזונו מדם... שרדו זמן רב יותר מכל ריכוזי האוריאה והמים האחרים (p < 0.013; איור 2E).
הישרדות של יתוש מארח ונקבות מוצצות דם (Anopheles arabinis) הניזונות משתן פרה ואוריאה. בניסוי הביולוגי (A), יתושות קיבלו תזונה המורכבת משתן פרה טרי ומיושן, ריכוזים שונים של אוריאה, סוכרוז (10%) ומים מזוקקים (H2O). הישרדותן של יתושות מחפשות מארח (B, C) ויתושות מוצצות דם (D, E) נרשמה כל 12 שעות עד שכל הנקבות שניזונו משתן (B, D) ואוריאה (C, E), וקבוצת הביקורת, סוכרוז ומים, מתו.
המרחק הכולל ומספר הכדורים שנקבעו במבחן טחנת המעוף במשך 24 שעות היו שונים בין יתושים המחפשים מארח ליתושים מוצצי דם, אשר הראו פחות פעילות תעופה בסך הכל (איור 3). יתושים המחפשים מארח שסיפקו שתן טרי ומיושן או סוכרוז ומים הראו דפוסי תעופה שונים (איור 3), כאשר נקבות שניזונו משתן טרי היו פעילות יותר עם שחר, בעוד שאלה שניזונו מיתושים בני 24 ו-168 שעות שניזונו משתן הציגו דפוסי תעופה שונים והיו פעילות בעיקר במהלך היום. נקבות יתושים שסיפקו סוכרוז או שתן בן 72 שעות הראו פעילות לאורך כל תקופת 24 השעות, בעוד שנקבות שסיפקו מים היו פעילות יותר באמצע התקופה. יתושים שניזונו מסוכרוז הציגו את רמות הפעילות הגבוהות ביותר בשעות הלילה המאוחרות ובשעות הבוקר המוקדמות, בעוד שאלה שבלעו שתן בן 72 שעות חוו ירידה מתמדת בפעילות במשך 24 שעות (איור 3).
ביצועי תעופה של נקבת יתוש מוצצת דם ציידת-מחפשת, הניזונה משתן פרה ואוריאה. במבחן טחנת תעופה, נקבות יתוש שניזונו משתן פרה טרי ומיושן, ריכוזים שונים של אוריאה, סוכרוז (10%) ומים מזוקקים (H2O) נקשרו לזרועות אופקיות המסתובבות בחופשיות (למעלה). עבור נקבות מחפשות-מארח (משמאל) ונקבות מוצצות-דם (מימין), נרשמו המרחק הכולל ומספר הטיסות לשעה עבור כל דיאטה על פני תקופה של 24 שעות (כהה: אפור; בהיר: לבן). מרחק ממוצע ומספר ממוצע של התקפות מוצגים מימין לגרף הפעילות היומית. סרגלי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע. ניתוח סטטיסטי ראה טקסט.
באופן כללי, פעילות הטיסה הכוללת של נקבות המחפשות מארחים עקבה אחר דפוס דומה לזה של מרחק הטיסה לאורך תקופה של 24 שעות. מרחק הטיסה הממוצע הושפע באופן משמעותי מהתזונה שנצרכה (F(5, 138) = 28.27, p < 0.0001), ונקבות המחפשות מארחים שצרכו 72 שעות של שתן עפו למרחקים ארוכים משמעותית בהשוואה לכל שאר הדיאטות (p < 0.0001), ויתושים שניזונו מסוכרוז עפו זמן רב יותר מיתושים טריים (p = 0.022) ושתן בן 24 שעות (p = 0.022). בניגוד לדפוס פעילות הטיסה המתואר על ידי דיאטת השתן, נקבות המחפשות מארחים שניזונו מאוריאה הציגו פעילות טיסה מתמשכת לאורך תקופה של 24 שעות, כשהיא מגיעה לשיא במחצית השנייה של השלב החשוך (איור 3). למרות שדפוסי הפעילות היו דומים, נקבות המחפשות מארחים שניזונו מאוריאה הגדילו משמעותית את מרחק הטיסה הממוצע בהתאם לריכוז הנספג (F(5, 138) = 1310.91, p < נקבות המחפשות מארח שקיבלו כל ריכוז של אוריאה עפו זמן רב יותר בהשוואה לנקבות שקיבלו מים או סוכרוז (p < 0.03).
פעילות התעופה הכוללת של יתושים מוצצי דם הייתה יציבה ונמשכה לאורך 24 שעות בכל הדיאטות, עם פעילות שתן מוגברת במהלך המחצית השנייה של תקופת החשיכה עבור נקבות שניזונו ממים וכן עבור נקבות שניזונו טריות ובנות 24 שעות (תמונה 3). בעוד שדיאטת שתן השפיעה באופן משמעותי על מרחק התעופה הממוצע בנקבות שניזונו מדם (F(5, 138) = 4.83, p = 0.0004), דיאטת אוריאה לא השפיעה (F(5, 138) = 1.36, p = 0.24) עם שתן אחר ודיאטת ביקורת (טרי, p = 0.0091; 72 שעות, p = 0.0022; 168 שעות, p = 0.001; סוכרוז, p = 0.0017; dH2O, p = 0.036).
השפעות האכלה בשתן ובאוריאה על פרמטרי הרבייה הוערכו בבדיקות ביולוגיות של הטלת ביצים (איור 4א') ונחקרו בהתאם למספר הביצים שהטילה כל נקבה, גודל הביצה והזחלים בשלב הראשון שבקעו זה עתה. מספר הביצים שהוטלו. נקבות ערביות שניזונו משתן השתנה בהתאם לתזונה (F(5,222) = 4.38, p = 0.0008; איור 4ב'). נקבות שניזונו מקמח שתן ודם במשך 24 שעות הטילו משמעותית יותר ביצים בהשוואה לנקבות שניזונו מקמח שתן אחר, והיו דומות לאלו שניזונו מסוכרוז (איור 4ב'). באופן דומה, גודל הביצים שהוטלו על ידי נקבות שניזונו מקמח שתן השתנה בהתאם לתזונה (F(5, 209) = 12.85, p < 0.0001), כאשר נקבות שניזונו מקמח שתן וסוכרוז במשך 24 שעות הטילו ביצים גדולות משמעותית בהשוואה לנקבות שניזונו ממים, בעוד שביצי הנקבות שניזונו מ-168 שעות של שתן היו קטנות משמעותית (איור 4ג'). בנוסף, תזונת השתן השפיעה משמעותית על גודל הזחל. (F(5, 187) = 7.86, p < 0.0001), כאשר זחלים גדולים משמעותית הופיעו מביצים שהוטלו על ידי נקבות בנות 24 ו-72 שעות שניזונו משתן, בהשוואה לביצים שהוטלו מזחלי נקבות שניזונו ממים ונקבות בנות 168 שעות שניזונו משתן (איור 4D).
ביצועי הרבייה של נקבות ים מסוג אנופלס עראבינס הניזונות משתן פרה ואוריאה. יתושים נקבות שניזונו מדם ניזונו מדיאטות המורכבות משתן פרה טרי ומיושן, ריכוזים שונים של אוריאה, סוכרוז (10%) ומים מזוקקים (H2O) במשך 48 שעות לפני הכנסתם לבדיקות ביולוגיות וקבלת מצעים להטלת ביצים (A). מספר הביצים (B, E), גודל הביצים (C, F) וגודל הזחלים (D, G) הושפעו באופן משמעותי מהדיאטה שסופקה (שתן פרה: BD; אוריאה: EG). הממוצעים עבור כל פרמטר שנמדד באמצעות שמות אותיות שונים היו שונים באופן משמעותי זה מזה (ANOVA חד כיווני באמצעות ניתוח פוסט הוק של Tukey; p < 0.05). סרגלי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע.
אוריאה, כמרכיב החנקני העיקרי בשתן, כאשר ניתנה כתזונה לנקבות שניזונו מדם, השפיעה באופן משמעותי על פרמטרי הרבייה בכל המחקרים. מספר הביצים שהוטלו על ידי נקבות שניזונו מאוריאה, לאחר ארוחת דם, בהתאם לריכוז האוריאה (F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001), נקבות שניזונו מריכוזי אוריאה בין 134 מיקרומולר ל-1.34 mM הטילו יותר ביצים (איור 4E). נקבות שניזונו מריכוזי אוריאה של 134 מיקרומולר ומעלה הטילו ביצים גדולות יותר מנקבות שניזונו ממים (F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; איור 4F), וגודל הזחל, למרות שהושפע מריכוזים דומים של אוריאה אצל אמהות (F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001), היה משתנה יותר (איור 4G).
האטרקטיביות הכוללת לתמציות נדיפות של שתן בקר המחפש מארח. ה- arabiensis שנבדק באולפקטומטר בצינור זכוכית (איור 5A) הושפע באופן משמעותי מגיל השתן (χ2 = 15.9, df = 4, p = 0.0032; איור 5B). ניתוח פוסט-הוק הראה שריח שתן מעופש לאחר 24 שעות גרם לרמות גבוהות משמעותית של האטרקטיביות בהשוואה לכל הטיפולים האחרים (72 שעות: p = 0.0060, 168 שעות: p = 0.012, פנטאן: p = 0.00070), למעט ריח של שתן טרי (p = 0.13; איור 5B). למרות שהמשיכה הכוללת של יתושים מוצצי דם לריח שתן לא הייתה שונה באופן משמעותי (χ2 = 8.78, df = 4, p = 0.067; איור 5C), נמצא כי נקבות אלו היו מושכות משמעותית יותר לתמציות נדיפות של שתן ישן במשך 72 שעות בהשוואה לקבוצת הביקורת (p = 0.0066; איור 5C).
תגובות התנהגותיות לריחות שתן פרה טבעיים וסינתטיים בחיפוש אחר אנופלס ערביאנוס מארח ומוגן בדם. תרשים סכמטי של אולפקטומטר בצינור זכוכית (A). משיכת תמציות נדיפות בחלל הראש משתן פרה טרי ומיושן ליתושים מארחים (B) ומוצצי דם (C). מצא את תגובת הזרוע של הלורד אן. מוצגות תמציות בחלל הראש שבודדו משתן פרה טרי (D), 24 שעות (E), 72 שעות (F) ו-168 שעות (G). עקבות גילוי אנטנת אלקטרונים (EAD) מראות שינויי מתח בתגובה לתרכובות ביו-אקטיביות בחלל הראש שנפלטו מכרומטוגרף הגז וזוהו על ידי גלאי יינון להבה (FID). סרגל קנה המידה מייצג אמפליטודת תגובה (mV) לעומת זמן שמירה (שניות). מוצגות התכונות וקצבי השחרור (µg h-1) של התרכובות הפעילות ביולוגית. כוכבית אחת (*) מציינת תגובה עקבית במשרעת נמוכה. כוכביות כפולות (**) מציינות תגובות שאינן ניתנות לשחזור. מצא את המארח (H) ו... ל-An.arabiensis מוצץ הדם (I) יש נטייה שונה לתערובות סינתטיות של ריחות שתן פרה טריים ומיושנים. הפרופורציות הממוצעות של יתושים שנמשכו לשמות אותיות שונים היו שונות משמעותית זו מזו (ANOVA חד-כיווני באמצעות ניתוח פוסט-הוק של טוקי; p < 0.05). סרגלי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של הסקאלה.
נקבת Ann.arabiensis, 72 שעות ו-120 שעות לאחר ארוחה בדם, במהלך ההטלה, לא נמצאה העדפה לתמציות נדיפות בחלל החזה משתן פרה טרי ומיושן בהשוואה לקבוצת ביקורת פנטאן (χ2 = 3.07, p > 0.05; קובץ נוסף 1: איור S1).
עבור נקבת ה- Ann.arabiensis, ניתוחי GC-EAD ו- GC-MS זיהו שמונה, שש, שלוש ושלוש תרכובות ביו-אקטיביות (איור 5D-G). למרות שנצפו הבדלים במספר התרכובות שעוררו תגובות אלקטרופיזיולוגיות, רוב התרכובות הללו היו קיימות בכל תמצית נדיפה במרווח הראש שנאספה משתן טרי ומיושן. לכן, עבור כל תמצית, רק תרכובות שגרמה לתגובה פיזיולוגית מהמחושים הנקביים מעל הסף נכללו בניתוחים נוספים.
קצב השחרור הנדיף הכולל של תרכובות ביו-אקטיביות באוסף headspace עלה מ-29 מיקרוגרם שעה-1 בשתן טרי ל-242 מיקרוגרם שעה-1 בשתן שהתיישן במשך 168 שעות, בעיקר עקב עלייה ברמות p-קרסול ו-m-פורמלדהיד פנול וכן פנול. לעומת זאת, קצב השחרור של תרכובות אחרות, כגון 2-ציקלוהקסן-1-און ודקנאל, ירדו עם עליית גיל השתן, דבר שתאם לירידה שנצפתה בעוצמת האות (שפע) בכרומטוגרמה (איור 5D) ולתגובות פיזיולוגיות לתרכובות אלו (איור 5D) בצד ימין.
בסך הכל, לתערובת הסינתטית היה יחס טבעי דומה של תרכובות ביו-אקטיביות שזוהו בתמציות נדיפות של שתן טרי ומיושן (איור 5D-G) ולא נראה כי היא עוררה משיכה משמעותית בחיפוש אחר פונדקאי (χ2 = 8.15, df = 4, p = 0.083; איור 5H) או יתושים מוצצי דם (χ2 = 4.91, df = 4, p = 0.30; איור 5I). עם זאת, השוואות זוגיות פוסט-הוק בין טיפולים הראו כי יתושים המחפשים פונדקאי היו מושכים משמעותית לתערובת הסינתטית של שתן מיושן במשך 24 שעות בהשוואה לקבוצת ביקורת פנטאן (p = 0.0086; איור 5H).
כדי להעריך את תפקידם של רכיבים בודדים בתערובות סינתטיות של שתן בן 24 שעות, הוערכו שש תערובות חיסוריות כנגד תערובות שלמות במבחן Y-tube, שבו הוסרו תרכובות בודדות. עבור יתושים המחפשים פונדקאים, חיסור תרכובות בודדות מהתערובת המלאה השפיע באופן משמעותי על תגובות התנהגותיות (χ2 = 19.63, df = 6, p = 0.0032; קובץ נוסף 1: איור S2A), כל התערובות החיסוריות היו אטרקטיביות יותר מאשר קטנות יותר מעורבבות לחלוטין. לעומת זאת, הסרת תרכובות בודדות מהתערובת הסינתטית המלאה לא השפיעה על התגובות ההתנהגותיות של יתושים מוצצי דם (χ2 = 11.38, df = 6, p = 0.077), למעט דקנאל, שהביא לרמות נמוכות יותר בהשוואה לתערובת המלאה (p = 0.022; קובץ נוסף 1: איור S2B).
בכפר אנדמי למלריה באתיופיה, הוערכה יעילותה של תערובת סינתטית של שתן פרה 24 שעות ביממה במשיכת יתושים בתנאי שטח במשך עשרה לילות (איור 6A). סך של 4,861 יתושים נלכדו וזוהו, מתוכם 45.7% היו Anthropus.gambiae sl, 18.9% היו Anopheles pharoensis ו-35.4% היו Culex spp. (קובץ נוסף 1: טבלה S1). Anopheles arabinis הוא החבר היחיד בקומפלקס המינים An.Gambian שזוהה על ידי ניתוח PCR. בממוצע, נלכדו 320 יתושים ללילה, שבמהלכם מלכודות עם פיתיונות סינתטיים תפסו יותר יתושים מאשר מלכודות מזווגות ללא תערובת (χ2(0, 3196) = 170.0, p < 0.0001). מלכודות ללא פיתיון הוצבו בכל אחד מחמשת לילות הביקורת בתחילת, באמצע ובסוף הניסוי. מספר דומה של יתושים נלכד בכל זוג של מלכודות, דבר המצביע על כך שאין הטיה בין בתים (χ²(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0.05) ולא נמצאה ירידה באוכלוסייה במהלך תקופת המחקר. בהשוואה למלכודות ביקורת, מספר היתושים שנתפסו במלכודות המכילות את התערובת הסינתטית גדל משמעותית: חיפוש מארח (χ²(0, 2107) = 138.7, p < 0.0001), אכילת דם לאחרונה (χ²(0, 650) = 32.2, p < 0.0001) והריון (χ²(0, 228) = 6.27, p = 0.0123; קובץ נוסף 1: טבלה S1). הדבר משתקף גם במספר הכולל של יתושים שנתפסו: חיפוש מארח > מוצץ דם > בהריון > חצי בהריון > זכר.
הערכת שדה של יעילותה של תערובת ריח סינתטית של שתן פרה למשך 24 שעות. ניסויי שדה נערכו בדרום-מרכז אתיופיה (מפה), ליד העיר מאקי (הכנסה), תוך שימוש במלכודת אור של המרכזים לבקרת מחלות (CDC) (מימין) בבתים זוגיים, עם עיצוב ריבוע לטיני (תמונה אווירית) (א). מלכודות פוטו סינתטיות של CDC עם פיתיון ריח מושכות ולוכדות נקבות של יתושי אנופלס ערבסק (ב), אך לא יתושי אנופלס פארו (ג), באופן שונה, השפעה תלוית מצב פיזיולוגי. בנוסף, מלכודות אלו לכדו מספרים מוגברים משמעותית של יתושי המארח Culex. (ד) בהשוואה לקבוצת הביקורת. הפסים משמאל מייצגים את מדד הברירה הממוצע של יתושים שנתפסו בזוגות של מלכודות פיתיון ריח (ירוק) ומלכודות ביקורת (פתוחות) (N = 10), בעוד שהפסים מימין מייצגים את מדד הברירה הממוצע בזוגות של מלכודות ביקורת (פתוחות; N = 5). כוכביות מציינות רמות מובהקות סטטיסטיות (*p = 0.01 ו-***p < 0.0001)
שלושת המינים נלכדו בצורה שונה במלכודות המכילות תערובות סינתטיות. בחיפוש אחר פונדקאי (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), הזנה מדם (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) והריון (χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134) יתוש Arabiensis נלכד במלכודת ושחרר את התערובת הסינתטית (איור 6B), בעוד שכמות ה-An לא הייתה שונה. נמצאו Pharoensis במצבים פיזיולוגיים שונים (איור 6C). עבור Culex, נמצאה עלייה משמעותית בלבד במספר היתושים המחפשים פונדקאים במלכודות עם פיתיון בתערובת הסינתטית (χ2(1,1319) = 12.6, p = 0.0004; איור 6D), בהשוואה למלכודות הביקורת.
מלכודות פיתיון מארחים הממוקמות מחוץ למארחים פוטנציאליים בין אתרי רבייה לקהילות כפריות באתיופיה שימשו כדי להעריך האם יתושי מלריה משתמשים בריח שתן פרה כרמז לבית גידול מארח. בהיעדר רמזים של מארח, חום, ועם או בלי נוכחות של ריח שתן פרה, לא נלכדו יתושים (קובץ נוסף 1: איור S3). עם זאת, בנוכחות טמפרטורה גבוהה וריח שתן פרה, יתושי מלריה נקבות נמשכו ונתפסו, אם כי במספרים קטנים, ללא קשר לגיל השתן (χ2(5, 25) = 2.29, p = 0.13; קובץ נוסף 1: איור S3). לעומת זאת, קבוצות ביקורת במים לא לכדו יתושי מלריה בטמפרטורות גבוהות (קובץ נוסף 1: איור S3).
יתושי מלריה רוכשים ומפיצים תרכובות המכילות חנקן באמצעות אכילה מפצה על שתן פרה (כלומר, שלוליות) כדי לשפר את תכונות היסטוריה החיים, בדומה לחרקים אחרים [2, 4, 24, 25, 26]. שתן פרה הוא משאב מתחדש זמין וזמין הקשור קשר הדוק למקומות מנוחה עבור וקטורי מלריה, כגון רפתות וצמחייה גבוהה בקרבת בתים כפריים ואתרי הטלה. נקבות היתושים מאתרות משאב זה לפי ריח ומסוגלות לווסת את ספיגת תרכובות חנקניות בשתן, כולל אוריאה, המרכיב החנקני העיקרי בשתן [15, 16]. בהתאם למצב הפיזיולוגי של נקבת היתושה, חומרים מזינים בשתן מוקצים כדי לשפר את פעילות התעופה והישרדות של נקבות היתושים המחפשות מארח, כמו גם את מאפייני ההישרדות והרבייה של פרטים הניזונים מדם במהלך המחזור הגונדוטרופי הראשון. לכן, ערבוב שתן ממלא תפקיד תזונתי חשוב עבור וקטורי מלריה סגורים כמו בוגרים הסובלים מתת תזונה [8], מכיוון שהוא מספק ליתושים את היכולת לרכוש תרכובות חנקניות חשובות על ידי עיסוק באכילה בסיכון נמוך. לממצא זה השלכות אפידמיולוגיות משמעותיות, שכן הנקבות מגדילות את חייהן. תוחלת חיים, פעילות ותפוקת רבייה, שכולם משפיעים על קיבולת הווקטור. יתר על כן, התנהגות זו עשויה להיות מטרה של תוכניות ניהול וקטורים עתידיות.