חלק מהנושאים של פתרון תקלות LC לעולם אינם מעודכנים, מכיוון שיש בעיות בתרגול LC, גם כאשר טכנולוגיית המכשיר משתפרת עם הזמן. ישנן דרכים רבות שבהן בעיות יכולות להתעורר במערכת LC ולהסתיים במצב שיא ירוד. כאשר מתעוררות בעיות הקשורות לצורת שיא, רשימה קצרה של סיבות אפשריות לתוצאות אלו עוזרת לפשט את חווית פתרון הבעיות שלנו.
היה כיף לכתוב את העמודה "פתרון בעיות LC" ולחשוב על נושאים מדי חודש, מכיוון שחלק מהנושאים לעולם אינם יוצאים מהאופנה. בעוד שבתחום מחקר הכרומטוגרפיה נושאים או רעיונות מסוימים מתיישנים מכיוון שהם מוחלפים על ידי רעיונות חדשים וטובים יותר, בתחום פתרון הבעיות, מכיוון שהמאמר הראשון בנושא פתרון בעיות זה הופיעו בכתב העת הרלוונטי של LC זה בזמן (1) 983(1).במהלך השנים האחרונות, התמקדתי בכמה סעיפים של LC Troubleshooting במגמות עכשוויות המשפיעות על כרומטוגרפיה נוזלית (LC) (לדוגמה, ההשוואה היחסית של ההבנה שלנו לגבי השפעת הלחץ על השמירה [2] New Advances) הפרשנות שלנו לתוצאות LC וכיצד לפתור בעיות שבהן התחילו במכשירי ה-LC המודרניים בדצמבר,'20, (במסדרה זו, 1200, 2000). , שהתמקד בחלק מהנושאים של "חיים ומוות" של פתרון בעיות LC - אלמנטים נהדרים עבור כל פותר בעיות הם חיוניים, לא משנה מה גיל המערכת שבה אנו משתמשים. נושא הליבה של סדרה זו רלוונטי מאוד לתרשים הקיר המפורסם "LC Troubleshooting Guide" (4) של LCGC, התלוי במעבדות רבות הקשורות לסדרה זו, לסוגיות שיא הקשורות לדמות זו או לסוגיות שיא של סדרה זו. bly, תרשים הקיר מפרט 44 גורמים פוטנציאליים שונים לצורת שיא ירודה! איננו יכולים לשקול את כל הנושאים הללו בפירוט במאמר אחד, אז בפרק ראשון זה בנושא, אתמקד בכמה מאלה שאני רואה בתדירות הגבוהה ביותר. אני מקווה שמשתמשי LC צעירים ומבוגרים ימצאו כמה עצות מועילות ותזכורות בנושא חשוב זה.
אני מוצא את עצמי עונה יותר ויותר לשאלות פתרון בעיות ב"הכל אפשרי". התגובה הזו עשויה להיראות קלה כאשר בוחנים תצפיות שקשה לפרש, אבל אני מוצאת אותה מתאימה לעתים קרובות. עם הרבה סיבות אפשריות לצורת שיא ירודה, חשוב לשמור על ראש פתוח כאשר שוקלים מה יכולה להיות הבעיה, וכדי להיות מסוגלים לתעדף סיבות פוטנציאליות כדי להתחיל באותן מאמצי פתרון בעיות חשובים ביותר, האפשרויות החשובות ביותר.
שלב מרכזי בכל תרגיל פתרון בעיות - אבל אחד שלדעתי הוא לא מוערך - הוא ההכרה שיש בעיה שצריך לפתור. הכרה בכך שקיימת בעיה פירושה לעתים קרובות להכיר שמה שקורה לכלי שונה מהציפיות שלנו, המעוצבות על ידי תיאוריה, ידע אמפירי וניסיון (5). y, קצה מוביל, tailing וכו'), אלא גם לרוחב. הציפיות שלנו לצורת שיא בפועל הן פשוטות. תיאוריה (6) תומכת היטב בציפייה של ספר הלימוד שברוב המקרים, הפסגות הכרומטוגרפיות צריכות להיות סימטריות ולהתאים לצורה של התפלגות גאוסית, כפי שמוצג באיור 1a. מה שאנו מצפים ממאמר שיא מורכב יותר, ונושא זה נדון בשיא רחב בעתיד. s באיור 1 מציגים כמה מהאפשרויות האחרות שניתן לצפות בהן - במילים אחרות, כמה מהדרכים שבהן דברים עלולים להשתבש. בהמשך פרק זה, נקדיש זמן לדיון בכמה דוגמאות ספציפיות למצבים שיכולים להוביל לסוגי צורות אלה.
לפעמים לא נצפים שיאים כלל בכרומטוגרמה שבה הם צפויים להיפלט. תרשים הקיר לעיל מצביע על כך שהיעדר שיא (בהנחה שהדגימה מכילה למעשה את אנליט המטרה בריכוז שאמור לגרום לתגובת הגלאי להספיק לראות אותה מעל הרעש) קשור בדרך כלל לבעיה כלשהי במכשיר או לא נכון בכל תנאי הפאזה הניידת (אם נצפה).פסגות, בדרך כלל "חלשות" מדי). רשימה קצרה של בעיות ופתרונות פוטנציאליים בקטגוריה זו ניתן למצוא בטבלה I.
כפי שהוזכר לעיל, השאלה עד כמה יש לסבול את הרחבת השיא לפני שמתייחסים ומנסים לתקן את זה היא נושא מורכב שאדון בו במאמר עתידי. הניסיון שלי הוא שהרחבת שיא משמעותית מלווה לעתים קרובות בשינוי משמעותי בצורת השיא, והזנב של הפסגה שכיח יותר מאשר טרום-שיא או פיצול.
כל אחת מהנושאים הללו נדונה בפירוט בגיליונות קודמים של Troubleshooting LC, וקוראים המתעניינים בנושאים אלה יכולים לעיין במאמרים קודמים אלה לקבלת מידע על הסיבות השורשיות ופתרונות פוטנציאליים לבעיות אלה.פרטים נוספים.
זנב שיא, חזית שיא ופיצול יכולים להיגרם כולם על ידי תופעות כימיות או פיזיקליות, ורשימת הפתרונות הפוטנציאליים לבעיות אלה משתנה מאוד, תלוי אם יש לנו עסק בבעיה כימית או פיזיקלית. לעתים קרובות, על ידי השוואת הפסגות השונות בכרומטוגרמה, אתה יכול למצוא רמזים חשובים לגבי מי הגורם הדומה, אם לא כל הגורם הדומה, אם הוא הגורם הדומה. פיזית. אם רק פסגות אחד או כמה מושפעים, אבל השאר נראים בסדר, הסיבה היא ככל הנראה כימית.
הגורמים הכימיים של peak tailing מורכבים מכדי לדון בקצרה כאן. הקורא המעוניין מופנה לגיליון האחרון של "LC Troubleshooting" לדיון מעמיק יותר (10). עם זאת, דבר שקל לנסות הוא להפחית את המסה של האנליט המוזרק ולראות אם צורת השיא משתפרת. אם כן, אז זהו רמז טוב. , או שיש לשנות את התנאים הכרומטוגרפיים כך שניתן יהיה להשיג צורות שיא טובות גם עם הזרקת מסות גדולות יותר.
ישנן גם סיבות פיזיות פוטנציאליות רבות לשיא זנב. קוראים המעוניינים בדיון מפורט על האפשרויות מופנים לגיליון אחר של "LC Troubleshooting" (11). אחת הסיבות הפיזיקליות השכיחות יותר ל-peak tailing היא חיבור לקוי בנקודה שבין המזרק לגלאי (12). דוגמה קיצונית מוצגת באיור 1d שלי, שהושגה בתמונה 1d, שבוע זה נבנה במערכת חדשה, לפני שבוע. ve שלא השתמשנו בו קודם, והתקנו לולאת הזרקה בנפח קטן עם פרול שנוצק על גבי נימי נירוסטה. לאחר כמה ניסויים ראשוניים של פתרון בעיות, הבנו שעומק היציאה בסטטור שסתום ההזרקה היה הרבה יותר עמוק ממה שהתרגלנו אליו, וכתוצאה מכך נפח מת גדול בתחתית הצינור פותרים בקלות את הבעיה עם לולאה אחרת עם הצינור. למיקום הנכון כדי לחסל את הנפח המת בתחתית הנמל.
חזיתות שיא כמו אלו המוצגות באיור 1ה יכולות להיגרם גם מבעיות פיזיקליות או כימיות. סיבה פיזיקלית שכיחה לקצה המוביל היא שמצע החלקיקים של העמוד אינו ארוז היטב, או שהחלקיקים התארגנו מחדש עם הזמן. כמו עם זנב שיא הנגרמת על ידי תופעה פיזיקלית זו, הדרך הטובה ביותר לתקן זאת היא להחליף את העמוד ולהמשיך בדרך כלל בצורת קצה כימי מובילה, בדרך כלל אנו קוראים לו "קו קצה מוביל מחדש". תנאי החזקה. בתנאים אידיאליים (לינארים), כמות האנליט שנשמרת על ידי השלב הנייח (ולכן, גורם ההחזקה) קשורה לריכוז של האנליט בעמודה. מבחינה כרומטוגרפית, זה אומר שכאשר מסת האנליט המוזרק לעמוד עולה, הפסגה נהיית גבוהה יותר, אך לא רחבה יותר. הקשר הזה נשבר כאשר המסה רחבה יותר, אלא גם כאשר המסה רחבה יותר, אלא גם כאשר המסה רחבה יותר. ed. בנוסף, צורות לא ליניאריות קובעות את צורת הפסגות הכרומטוגרפיות, וכתוצאה מכך קצוות מובילים או נגררים. כמו בעומס יתר הגורם לשיא זנב (10), ניתן לאבחן את ההובלה של שיא הנגרמת על ידי שמירה לא ליניארית על ידי הפחתת מסת האנליט המוזרקת. אם צורת השיא משתפרת, אין לשנות את השיטה בתנאי הקצה המובילים למינימום כדי לשנות את האיכות. לחקות את ההתנהגות הזו.
לפעמים אנו צופים במה שנראה כשיא "מפוצל", כפי שמוצג באיור 1f. השלב הראשון בפתרון בעיה זו הוא לקבוע אם צורת השיא נובעת מפילה חלקית (כלומר, נוכחותן של שתי תרכובות נפרדות אך פולטות באופן הדוק). אם יש למעשה שני אנליטים שונים שנפלטים קרוב זה לזה, אז זה מגדיל את הרזולוציה, הרזולוציה, או ספירה מחדש שלהם, למשל. והפסגות ה"מפוצלות" לכאורה קשורות לביצועים פיזיים אין שום קשר לטור עצמו. לעתים קרובות, הרמז החשוב ביותר להחלטה זו הוא האם כל הפסגות בכרומטוגרמה מציגות צורות מפוצלות, או רק אחת או שתיים. אם זה רק אחד או שניים, כנראה שמדובר בבעיה של אלוציה משותפת;אם כל הפסגות מפוצלות, כנראה שמדובר בבעיה פיזית, קרוב לוודאי שקשורה לעמודה עצמה.
פסגות מפוצלות הקשורות לתכונות הפיזיקליות של העמוד עצמו נובעות בדרך כלל מסיגי כניסה או יציאה חסומים חלקית, או ארגון מחדש של חלקיקים בעמוד, מה שמאפשר לשלב הנייד לזרום מהר יותר מהשלב הנייד באזורים מסוימים של היווצרות תעלת העמוד .באזורים אחרים (11). ניתן לפעמים לנקות פריט סתום חלקית על ידי היפוך הזרימה דרך העמוד;עם זאת, מניסיוני, זה בדרך כלל פתרון לטווח קצר ולא לטווח ארוך. זה לעתים קרובות קטלני עם עמודות מודרניות אם החלקיקים מתחברים מחדש בתוך העמוד. בשלב זה, עדיף להחליף את העמוד ולהמשיך.
השיא באיור 1g, גם ממקרה אחרון במעבדה שלי, מצביע בדרך כלל על כך שהאות כל כך גבוה עד שהגיע לקצה הגבוה של טווח התגובה. עבור גלאי ספיגה אופטיים (UV-vis במקרה זה), כאשר ריכוז האנליט גבוה מאוד, האנליט סופג את רוב האור העובר בתא הזרימה של הגלאי, ומשאיר את מעט מאוד האור של תא הזרימה של הגלאי, ומשאיר את מעט מאוד האור בתנאי צילום אלה שניתן לזהות בתנאים שונים. מקורות רעש, כגון אור תועה ו"זרם אפל", מה שהופך את האות ל"מטושטש" מאוד במראהו ובלתי תלוי בריכוז האנליטים.כאשר זה קורה, לעתים קרובות ניתן לפתור את הבעיה בקלות על ידי הפחתת נפח ההזרקה של האנליט - הפחתת נפח ההזרקה, דילול הדגימה או שניהם.
In chromatography school, we use the detector signal (ie, the y-axis in the chromatogram) as an indicator of the analyte concentration in the sample.So it seems odd to see a chromatogram with a signal below zero, as the simple interpretation is that this indicates a negative analyte concentration – which of course is not physically possible.In my experience, negative peaks are most often observed when using optical absorbance detectors (eg, UV-vis).
במקרה זה, שיא שלילי פירושו פשוט שהמולקולות הנפלטות מהעמודה סופגות פחות אור מהפאזה הניידת עצמה מיד לפני ואחרי השיא. זה יכול להתרחש, למשל, כאשר משתמשים באורכי גל זיהוי נמוכים יחסית (<230 ננומטר) ותוספי פאזה ניידים שסופגים את רוב האור באורכי גל אלו. תוספים כאלה יכולים להיות רכיבים של מתנול אצטט שלילי, כגון מתנול אצטט בפורמט שלילי. הכנת עקומת כיול וקבלת מידע כמותי מדויק, ולכן אין סיבה מהותית להימנע מהם כשלעצמם (שיטה זו מכונה לפעמים "גילוי UV עקיף") (13). עם זאת, אם אנו באמת רוצים להימנע מפסגות שליליות לחלוטין, במקרה של זיהוי ספיגה, הפתרון הטוב ביותר הוא להשתמש בזיהוי שונה משלב הגל של האנליט, כך שהשלב הנייד של האור ישנה יותר משלב הגל הנייד של האנליט, כך שהשלב הנייד של האור ישנה יותר משלב האור הנייד. .
פסגות שליליות יכולות להופיע גם בעת שימוש בזיהוי מקדם שבירה (RI) כאשר אינדקס השבירה של רכיבים שאינם האנליט בדגימה, כגון מטריצת הממס, שונה ממקדם השבירה של השלב הנייד. זה קורה גם עם זיהוי UV-vis, אך השפעה זו נוטה להיות מוחלשת ביחס לזיהוי RI. בשני המקרים, ניתן להתאים את ההרכב של המטריצה ​​לשלילית יותר בהרכב שלילי יותר. שלב נייד.
בחלק השלישי בנושא הבסיסי של פתרון תקלות LC, דנתי במצבים שבהם צורת השיא הנצפית שונה מצורת השיא הצפויה או הרגילה. פתרון בעיות אפקטיבי של בעיות מסוג זה מתחיל בידע של צורות שיא צפויות (בהתבסס על תיאוריה או ניסיון קודם עם שיטות קיימות), כך שהסטיות מציפיות אלו ברורות. בבעיות צורה שיא, פוטנציאל רחב, פוטנציאל התקנה מוביל, וכו'. בפירוט כמה מהסיבות שאני רואה בתדירות הגבוהה ביותר. ידיעת הפרטים הללו מספקת מקום טוב להתחיל בפתרון בעיות, אך אינה תופסת את כל האפשרויות. קוראים המעוניינים ברשימה מעמיקה יותר של סיבות ופתרונות יכולים לעיין בתרשים הקיר של LCGC "מדריך לפתרון בעיות LC".
(4) תרשים קיר של LCGC "מדריך לפתרון בעיות" של LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Processing Signal in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), עמ' 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF and Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.