תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
ביופסיה נוזלית (LB) היא מושג שצובר פופולריות במהירות בתחום הביו-רפואי. הקונספט מבוסס בעיקר על זיהוי של שברי DNA חוץ-תאי במחזור הדם (ccfDNA), אשר משתחררים בעיקר כשברים קטנים לאחר מוות תאי ברקמות שונות. חלק קטן מהשברים הללו מקורם ברקמות או אורגניזמים זרים. בעבודה הנוכחית, יישמנו מושג זה על צדפות, מין זקיף הידוע ביכולת סינון מי הים הגבוהה שלהם. אנו משתמשים ביכולתן של צדפות לשמש כמסננים טבעיים כדי ללכוד שברי DNA סביבתיים ממגוון מקורות כדי לספק מידע על המגוון הביולוגי של מערכות אקולוגיות ימיות חופיות. תוצאותינו מראות כי המולימפה של צדפות מכילה שברי DNA בגודל משתנה מאוד, מ-1 עד 5 קילו-בייט. ריצוף רובה ציד הראה שמספר רב של שברי DNA הם ממקור מיקרוביאלי זר. ביניהם, מצאנו שברי DNA מחיידקים, ארכאונים ווירוסים, כולל וירוסים הידועים כמדביקים מגוון של מארחים הנמצאים בדרך כלל במערכות אקולוגיות ימיות חופיות. לסיכום, מחקרנו מדגים כי המושג LB המיושם על צדפות מייצג מקור ידע עשיר אך טרם נחקר על מגוון מיקרוביאלי במערכות אקולוגיות ימיות חופיות.
השפעת שינויי האקלים (CC) על המגוון הביולוגי של מערכות אקולוגיות ימיות היא תחום מחקר שצומח במהירות. ההתחממות הגלובלית לא רק גורמת ללחצים פיזיולוגיים משמעותיים, אלא גם דוחפת את הגבולות האבולוציוניים של היציבות התרמית של אורגניזמים ימיים, ומשפיעה על בית הגידול של מספר מינים, ומניעה אותם לחפש תנאים נוחים יותר [1, 2]. בנוסף להשפעה על המגוון הביולוגי של המטזואים, CC משבשת את האיזון העדין של אינטראקציות בין מארח למיקרוביאל. דיסבקטריוזיס מיקרוביאלית זו מהווה איום רציני על מערכות אקולוגיות ימיות מכיוון שהיא הופכת אורגניזמים ימיים לפגיעים יותר לפתוגנים זיהומיים [3, 4]. ההערכה היא ש-SS ממלאים תפקיד חשוב במוות המוני, וזו בעיה רצינית לניהול מערכות אקולוגיות ימיות גלובליות [5, 6]. זוהי סוגיה חשובה בהתחשב בהשפעות הכלכליות, האקולוגיות והתזונתיות של מינים ימיים רבים. זה נכון במיוחד לגבי צדפות החיים באזורי הקוטב, שם ההשפעות של CK מיידיות וחמורות יותר [6, 7]. למעשה, צדפות כמו Mytilus spp. נמצאות בשימוש נרחב לניטור השפעות של CC על מערכות אקולוגיות ימיות. באופן לא מפתיע, פותחו מספר גדול יחסית של סמנים ביולוגיים לניטור בריאותם, לרוב תוך שימוש בגישה דו-שלבית הכוללת סמנים ביולוגיים פונקציונליים המבוססים על פעילות אנזימטית או תפקודים תאיים כגון כדאיות תאים ופעילות פגוציטים [8]. שיטות אלו כוללות גם מדידת ריכוז של מדדי לחץ ספציפיים המצטברים ברקמות רכות לאחר ספיגת כמויות גדולות של מי ים. עם זאת, קיבולת הסינון הגבוהה ומערכת הדם הפתוחה למחצה של צדפות מספקות הזדמנות לפתח סמנים ביולוגיים חדשים של המולימפה באמצעות מושג הביופסיה הנוזלית (LB), גישה פשוטה ומינימלית פולשנית לניהול דגימות דם [9, 10]. למרות שניתן למצוא מספר סוגים של מולקולות במחזור הדם ב-LB אנושי, מושג זה מבוסס בעיקר על ניתוח ריצוף DNA של שברי DNA חוץ-תאי במחזור הדם (ccfDNA) בפלזמה. למעשה, נוכחות DNA במחזור הדם בפלזמה אנושית ידועה מאמצע המאה ה-20 [11], אך רק בשנים האחרונות הופעתן של שיטות ריצוף בעלות תפוקה גבוהה הובילה לאבחון קליני המבוסס על ccfDNA. נוכחותם של שברי DNA אלה במחזור הדם נובעת בין היתר משחרור פסיבי של DNA גנומי (גרעיני ומיטוכונדריאלי) לאחר מוות תאי. אצל אנשים בריאים, ריכוז ה-ccfDNA נמוך בדרך כלל (<10 ng/mL) אך יכול להיות מוגבר פי 5-10 אצל חולים הסובלים מפתולוגיות שונות או נתונים ללחץ, מה שגורם נזק לרקמות. אצל אנשים בריאים, ריכוז ה-ccfDNA נמוך בדרך כלל (<10 ng/mL) אך יכול להיות מוגבר פי 5-10 אצל חולים הסובלים מפתולוגיות שונות או נתונים ללחץ, מה שגורם נזק לרקמות. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 сразли патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. אצל אנשים בריאים, ריכוז ה- cccDNA נמוך בדרך כלל (<10 ng/mL), אך הוא יכול לעלות פי 5-10 אצל חולים עם פתולוגיות שונות או הנמצאים תחת לחץ המוביל לנזק לרקמות.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导燴组在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刏中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 расин патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ריכוזי ccfDNA בדרך כלל נמוכים (<10 ng/ml) אצל אנשים בריאים, אך יכולים להיות מוגברים פי 5-10 אצל חולים עם פתולוגיות שונות או לחץ, וכתוצאה מכך נגרם נזק לרקמות.גודלם של שברי ccfDNA משתנה מאוד, אך בדרך כלל נע בין 150 ל-200 בסיסים. [12]. ניתוח של ccfDNA שמקורו בעצמו, כלומר ccfDNA מתאי מארח רגילים או תאים שעברו טרנספורמציה, יכול לשמש לזיהוי שינויים גנטיים ואפיגנטיים הקיימים בגנום הגרעיני ו/או המיטוכונדריאלי, ובכך לסייע לרופאים לבחור טיפולים ספציפיים המכוונים מולקולרית [13]. עם זאת, ניתן להשיג ccfDNA ממקורות זרים כגון ccfDNA מתאים עובריים במהלך ההריון או מאיברים מושתלים [14,15,16,17]. ccfDNA הוא גם מקור מידע חשוב לזיהוי נוכחות חומצות גרעין של גורם זיהומי (זר), המאפשר זיהוי לא פולשני של זיהומים נרחבים שלא זוהו על ידי תרביות דם, תוך הימנעות מביופסיה פולשנית של רקמה נגועה [18]. מחקרים אחרונים אכן הראו כי דם אנושי מכיל מקור מידע עשיר שניתן להשתמש בו לזיהוי פתוגנים ויראליים וחיידקיים, וכי כ-1% מה-ccfDNA שנמצא בפלזמה אנושית הוא ממקור זר [19]. מחקרים אלה מראים כי ניתן להעריך את המגוון הביולוגי של המיקרוביום במחזור הדם של אורגניזם באמצעות ניתוח ccfDNA. עם זאת, עד לאחרונה, מושג זה שימש אך ורק בבני אדם, ובמידה פחותה, בבעלי חוליות אחרים [20, 21].
במאמר זה, אנו משתמשים בפוטנציאל LB כדי לנתח את ה-ccfDNA של Aulacomya atra, מין דרומי הנפוץ באיי קרגולן הסובאנטארקטיים, קבוצת איים בראש רמה גדולה שנוצרה לפני 35 מיליון שנה. התפרצות געשית. באמצעות מערכת ניסויית חוץ גופית, מצאנו ששברי DNA במי ים נספגים במהירות על ידי צדפות ונכנסים לתא המולימפה. ריצוף רובה ציד הראה ש-ccfDNA של המולימפה של צדפות מכיל שברי DNA ממקור עצמאי ולא ממקור עצמי, כולל חיידקים סימביוטיים ושברי DNA מביומות האופייניות למערכות אקולוגיות חופיות ימיות געשיות קרות. ccfDNA של המולימפה מכיל גם רצפים ויראליים שמקורם בווירוסים עם טווחי פונדקאים שונים. מצאנו גם שברי DNA מבעלי חיים רב-תאיים כמו דגי גרם, שושנות ים, אצות וחרקים. לסיכום, המחקר שלנו מדגים שניתן ליישם בהצלחה את מושג ה-LB על חסרי חוליות ימיים כדי ליצור רפרטואר גנומי עשיר במערכות אקולוגיות ימיות.
צדפות כחולות בוגרות (M. platensis) (Mytilus platensis) וצדפות צדפות (A. atra) נאספו מחופי הסלעים הבין-גאותיים של פורט-או-פראנס (049°21.235 דרום, 070°13.490 מזרח). באיי קרגולן בדצמבר 2018. צדפות כחולות בוגרות אחרות (Mytilus spp.) התקבלו מספק מסחרי (PEI Mussel King Inc., אי הנסיך אדוארד, קנדה) והוכנסו למיכל מאוורר בטמפרטורה מבוקרת (4°C) המכיל 10-20 ליטר של מי מלח מלאכותיים 32‰ (מלח ים מלאכותי Reef Crystal, Instant Ocean, וירג'יניה, ארה"ב). עבור כל ניסוי, נמדדו אורך ומשקל הקונכיות הבודדות.
פרוטוקול גישה פתוחה וחינמי לתוכנית זו זמין באינטרנט (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). בקצרה, המולימפה של LB נאספה משרירי חוטפים כמתואר [22]. ההמולימפה נוקה על ידי צנטריפוגה ב-1200×g למשך 3 דקות, הסופרנטנט הוקפא (-20°C) עד לשימוש. לבידוד וטיהור של cfDNA, דגימות (1.5-2.0 מ"ל) הופשרו ועובדו באמצעות ערכת cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) בהתאם להוראות היצרן. ccfDNA אוחסן ב--80°C עד לניתוח נוסף. בניסויים מסוימים, ccfDNA בודד וטוהר באמצעות ערכת QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, טורונטו, אונטריו, קנדה). DNA מטוהר נמדד כמותית באמצעות מבחן PicoGreen סטנדרטי. פיזור הפרגמנטים של ה-ccfDNA המבודד נותח באמצעות אלקטרופורזה קפילרית באמצעות ביואנליזר Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., סנטה קלרה, קליפורניה) תוך שימוש בערכת DNA בעלת רגישות גבוהה. הבדיקה בוצעה באמצעות 1 מיקרוליטר של דגימת ccfDNA בהתאם להוראות היצרן.
לצורך ריצוף מקטעי ccfDNA של המולימפה, Genome Québec (מונטריאול, קוויבק, קנדה) הכינה ספריות shotgun באמצעות ערכת Illumina DNA Mix של ערכת Illumina MiSeq PE75. נעשה שימוש במתאם סטנדרטי (BioO). קבצי נתונים גולמיים זמינים מארכיון קריאת הרצפים של NCBI (SRR8924808 ו-SRR8924809). איכות הקריאה הבסיסית הוערכה באמצעות FastQC [23]. Trimmomatic [24] שימש למתאמים עם חיתוך וקריאות באיכות ירודה. קריאות Shotgun עם קצוות מזווגים אוחדו באמצעות FLASH לקריאות בודדות ארוכות יותר עם חפיפה מינימלית של 20 bps כדי למנוע אי התאמות [25]. הקריאות הממוזגות סומנו באמצעות BLASTN באמצעות מסד נתונים של טקסונומיה של NCBI של צדפות (ערך e < 1e−3 והומולוגיה של 90%), ומיסוך של רצפים בעלי מורכבות נמוכה בוצע באמצעות DUST [26]. הקריאות הממוזגות סומנו באמצעות BLASTN באמצעות מסד נתונים של טקסונומיה של NCBI של צדפות (ערך e < 1e−3 והומולוגיה של 90%), ומיסוך של רצפים בעלי מורכבות נמוכה בוצע באמצעות DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двлустворч (значение e < 1e-3 ו 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельз с 26польностей קריאות מקובצות סומנו באמצעות BLASTN באמצעות מסד הנתונים של טקסונומיית צדפות NCBI (ערך e < 1e-3 והומולוגיה של 90%), ובוצעה מיסוך רצף בעל מורכבות נמוכה באמצעות DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的輯幕，2]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 2.进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двунской (זנאчение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельнольз исполнельов с исполностей קריאות מקובצות סומנו באמצעות BLASTN באמצעות מסד הנתונים הטקסונומי של צדפות NCBI (ערך e <1e-3 והומולוגיה של 90%), ובוצעה מיסוך רצף בעל מורכבות נמוכה באמצעות DUST [26].הקריאות חולקו לשתי קבוצות: קבוצות קשורות לרצפי צדפות (כאן נקראות קריאות עצמיות) וקבוצות לא קשורות (לא קריאות עצמיות). שתי קבוצות הורכבו בנפרד באמצעות MEGAHIT כדי ליצור קונטיגים [27]. בינתיים, ההתפלגות הטקסונומית של קריאות המיקרוביום הזר סווגה באמצעות Kraken2 [28] ויוצגה גרפית על ידי תרשים עוגה של Krona ב-Galaxy [29, 30]. נקבע כי ה-kmers האופטימליים הם kmers-59 מהניסויים המקדימים שלנו. לאחר מכן זוהו קונטיגים עצמיים על ידי יישור עם BLASTN (מסד נתונים של NCBI דו-צדדי, ערך e < 1e-10 והומולוגיה של 60%) לצורך ביאור סופי. לאחר מכן זוהו קונטיגים עצמיים על ידי יישור עם BLASTN (מסד נתונים של NCBI דו-צדדי, ערך e < 1e-10 והומולוגיה של 60%) לצורך ביאור סופי. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. לאחר מכן זוהו קונטיגים עצמיים על ידי התאמה מול BLASTN (מסד נתונים של צדפות NCBI, ערך e <1e-10 והומולוגיה של 60%) לצורך ביאור סופי.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (биNC) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). לאחר מכן זוהו קונטיגים עצמיים לצורך ביאור סופי על ידי התאמה מול BLASTN (מסד נתונים של צדפות NCBI, ערך e <1e-10 והומולוגיה של 60%). במקביל, קבוצות קונטיגים לא-עצמיות סומנו באמצעות BLASTN (מסד נתונים nt NCBI, ערך e < 1e-10 והומולוגיה של 60%). במקביל, קבוצות קונטיגים לא-עצמיות סומנו באמצעות BLASTN (מסד נתונים nt NCBI, ערך e < 1e-10 והומולוגיה של 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (באמצעות NCBI, ינואר 10-10 ביוני 60%). במקביל, סומנו קונטיגים של קבוצות זרות באמצעות BLASTN (מסד נתונים של NT NCBI, ערך e <1e-10 והומולוגיה של 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组羇〠〠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组羇〠〠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныNC) <1e-10 и гомология 60%). במקביל, קבוצות קונטיגים שאינן קבוצתיות עצמיות סומנו באמצעות BLASTN (מסד נתונים nt NCBI, ערך e <1e-10 והומולוגיה של 60%). BLASTX בוצע גם על קונטיגים שאינם עצמיים באמצעות מסדי הנתונים של חלבוני nr ו- RefSeq NCBI (ערך e < 1e-10 והומולוגיה של 60%). BLASTX בוצע גם על קונטיגים שאינם עצמיים באמצעות מסדי הנתונים של חלבוני nr ו- RefSeq NCBI (ערך e < 1e-10 והומולוגיה של 60%). BLASTX ניתנת לסיוע בקשר עם תקשורת כלכלית בסיוע בנקאי מס. гомология 60%. BLASTX בוצע גם על קונטיגים שאינם עצמיים באמצעות מסדי הנתונים של חלבונים nr ו-RefSeq NCBI (ערך e < 1e-10 והומולוגיה של 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和 和怉 咧% 傧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和 和怉 咧% 傧 BLASTX תקף את התקנות האפשריות לתקשורת בשיתוף פעולה עם קרן היסוד בבסיס ה-RefSeq NCBI (בחודשים 01-1) гомология 60%. BLASTX בוצע גם על קונטיגים שאינם עצמיים באמצעות מסדי הנתונים של חלבונים nr ו- RefSeq NCBI (ערך e <1e-10 והומולוגיה של 60%).מאגרי BLASTN ו-BLASTX של קונטיגים שאינם עצמיים מייצגים את הקונטיגים הסופיים (ראה קובץ משלים).
הפריימרים ששימשו ל-PCR מפורטים בטבלה S1. פולימראז Taq DNA (Bio Basic Canada, Markham, ON) שימש להגברת גני המטרה של ccfDNA. תנאי התגובה הבאים נערכו: דנטורציה ב-95°C למשך 3 דקות, 95°C למשך דקה אחת, טמפרטורת חישול קבועה למשך דקה אחת, התארכות ב-72°C למשך דקה אחת, 35 מחזורים, ולבסוף 72°C תוך 10 דקות. תוצרי ה-PCR הופרדו באמצעות אלקטרופורזה בג'לי אגרוז (1.5%) המכילים את צבע הג'ל SYBRTM Safe DNA (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ב-95 וולט.
צדפות (Mytilus spp.) עברו אקלום ב-500 מ"ל מי ים מחומצנים (32 PSU) למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4°C. DNA פלסמיד המכיל תוסף המקודד את רצף cDNA הגלקטין-7 האנושי (מספר גישה של NCBI L07769) נוסף לבקבוקון בריכוז סופי של 190 מיקרוגרם/מיקרוליטר. צדפות שדוגרו באותם תנאים ללא תוספת DNA היוו את קבוצת הביקורת. מיכל הביקורת השלישי הכיל DNA ללא צדפות. כדי לנטר את איכות ה-DNA במי הים, נלקחו דגימות מי ים (20 מיקרוליטר; שלוש חזרות) מכל מיכל בזמן שצוין. לצורך מעקב אחר DNA פלסמיד, צדפות LB נאספו בזמנים שצוינו ונותחו באמצעות qPCR ו-ddPCR. בשל תכולת המלח הגבוהה של מי הים, מנות קטנות דוללו במים באיכות PCR (1:10) לפני כל מבחני ה-PCR.
בדיקת PCR דיגיטלית של טיפות (ddPCR) בוצעה באמצעות פרוטוקול BioRad QX200 (מיסיסוגה, אונטריו, קנדה). השתמשו בפרופיל הטמפרטורה כדי לקבוע את הטמפרטורה האופטימלית (טבלה S1). טיפות נוצרו באמצעות מחולל טיפות QX200 (BioRad). ddPCR בוצע באופן הבא: 95°C למשך 5 דקות, 50 מחזורים של 95°C למשך 30 שניות וטמפרטורת חישול נתונה למשך דקה אחת ו-72°C למשך 30 שניות, 4°C למשך 5 דקות ו-90°C תוך 5 דקות. מספר הטיפות והתגובות החיוביות (מספר עותקים/µl) נמדדו באמצעות קורא טיפות QX200 (BioRad). דגימות עם פחות מ-10,000 טיפות נדחו. בקרת דפוס לא בוצעה בכל פעם שבוצע ddPCR.
qPCR בוצע באמצעות Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, סידני, אוסטרליה) ופריימרים ספציפיים ל-LGALS7. כל ה-PCR הכמותיים בוצעו ב-20 מיקרוליטר באמצעות ערכת QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR התחיל בדגירה של 15 דקות ב-95°C ולאחר מכן 40 מחזורים ב-95°C למשך 10 שניות וב-60°C למשך 60 שניות עם איסוף נתונים אחד. עקומות התכה נוצרו באמצעות מדידות עוקבות ב-95°C למשך 5 שניות, 65°C למשך 60 שניות, ו-97°C בסוף ה-qPCR. כל qPCR בוצע בשלושה עותקים, למעט דגימות בקרה.
מכיוון שצדפות ידועות בקצב הסינון הגבוה שלהן, חקרנו תחילה האם הן מסוגלות לסנן ולשמור שברי DNA הקיימים במי ים. התעניינו גם האם שברי DNA אלה מצטברים במערכת הלימפה הפתוחה למחצה שלהן. פתרנו בעיה זו באופן ניסיוני על ידי מעקב אחר גורלם של שברי DNA מסיסים שנוספו למיכלי צדפות כחולות. כדי להקל על המעקב אחר שברי DNA, השתמשנו ב-DNA פלסמיד זר (לא עצמי) המכיל את הגן האנושי גלקטין-7. ddPCR עוקב אחר שברי DNA פלסמיד במי ים ובצדפות. תוצאותינו מראות שאם כמות שברי ה-DNA במי ים נותרה קבועה יחסית לאורך זמן (עד 7 ימים) בהיעדר צדפות, אז בנוכחות צדפות רמה זו נעלמה כמעט לחלוטין תוך 8 שעות (איור 1א', ב'). שברי DNA אקסוגניים זוהו בקלות תוך 15 דקות בנוזל התוך-מסתמי ובהמולימפה (איור 1ג'). עדיין ניתן היה לזהות שברי DNA אלה עד 4 שעות לאחר החשיפה. פעילות סינון זו ביחס לשברי DNA דומה לפעילות הסינון של חיידקים ואצות [31]. תוצאות אלו מצביעות על כך שצדפות יכולות לסנן ולצבור DNA זר בתאי הנוזל שלהן.
ריכוזים יחסיים של DNA פלסמיד במי ים בנוכחות (A) או בהיעדר (B) של צדפות, שנמדדו על ידי ddPCR. ב-A, התוצאות מבוטאות באחוזים, כאשר גבולות התיבות מייצגים את האחוזונים ה-75 וה-25. העקומה הלוגריתמית המותאמת מוצגת באדום, והאזור המוצלל באפור מייצג את רווח הסמך של 95%. ב-B, הקו האדום מייצג את הממוצע והקו הכחול מייצג את רווח הסמך של 95% עבור הריכוז. C הצטברות של DNA פלסמיד בהמולימפה ובנוזל המסתמים של צדפות בזמנים שונים לאחר הוספת DNA פלסמיד. התוצאות מוצגות כעותקים מוחלטים שזוהו/מ"ל (±SE).
לאחר מכן, חקרנו את מקור ה-ccfDNA בצדפים שנאספו ממיטות צדפים באיי קרגולן, קבוצת איים מרוחקת עם השפעה אנתרופוגנית מוגבלת. למטרה זו, בודד וטוהר cccDNA מהמולימפות של צדפים בשיטות הנפוצות לטיהור cccDNA אנושי [32, 33]. מצאנו שריכוזי ccfDNA המולימפה הממוצעים בצדפים הם בטווח הנמוך של מיקרוגרם למיליליטר המולימפה (ראה טבלה S2, מידע משלים). טווח ריכוזים זה גדול בהרבה מאשר אצל אנשים בריאים (ננוגרם נמוך למיליליטר), אך במקרים נדירים, בחולי סרטן, רמת ה-ccfDNA יכולה להגיע למספר מיקרוגרם למיליליטר [34, 35]. ניתוח של התפלגות הגודל של ccfDNA המולימפה הראה שגודלם של מקטעים אלה משתנה מאוד, בין 1000 bp ל-1000 bp ועד 5000 bp (איור 2). תוצאות דומות התקבלו באמצעות ערכת QIAamp Investigator Kit מבוססת סיליקה, שיטה הנפוצה במדע הפורנזי לבידוד וטיהור מהירים של DNA גנומי מדגימות DNA בריכוז נמוך, כולל ccfDNA [36].
אלקטרופורגרם ccfDNA מייצג של המולימפה של צדפה. מופק באמצעות ערכת NucleoSnap Plasma Kit (למעלה) וערכת QIAamp DNA Investigator Kit. תרשים B של כינור המציג את התפלגות ריכוזי ccfDNA של המולימפה (±SE) בצדפות. הקווים השחורים והאדומים מייצגים את החציון ואת הרבעונים הראשון והשלישי, בהתאמה.
כ-1% מה-ccfDNA בבני אדם ובפרימטים מגיע ממקור זר [21, 37]. בהינתן מערכת הדם הפתוחה למחצה של צדפות, מי ים עשירים במיקרובים, והתפלגות הגודל של ccfDNA של צדפות, שיערנו כי ccfDNA המולימפתי של צדפות עשוי להכיל מאגר עשיר ומגוון של DNA מיקרוביאלי. כדי לבחון השערה זו, ריצפנו ccfDNA המולימפתי מדגימות Aulacomya atra שנאספו מאיי קרגולן, והניב למעלה מ-10 מיליון קריאות, ש-97.6% מהן עברו בקרת איכות. הקריאות סווגו לאחר מכן לפי מקורות עצמיים ולא עצמיים באמצעות מסדי הנתונים של צדפות BLASTN ו-NCBI (איור S1, מידע משלים).
בבני אדם, DNA גרעיני ו-DNA מיטוכונדריאלי יכולים להשתחרר לזרם הדם [38]. עם זאת, במחקר הנוכחי, לא ניתן היה לתאר בפירוט את ה-DNA הגנומי הגרעיני של צדפות, בהתחשב בכך שגנום A. atra לא רוצף או תואר. עם זאת, הצלחנו לזהות מספר שברי ccfDNA ממקורנו באמצעות ספריית צדפות (איור S2, מידע משלים). אישרנו גם את נוכחותם של שברי DNA ממקורנו באמצעות הגברה מכוונת של PCR של אותם גנים של A. atra שרוצפו (איור 3). באופן דומה, בהתחשב בכך שגנום המיטוכונדריה של A. atra זמין במאגרי מידע ציבוריים, ניתן למצוא עדויות לנוכחותם של שברי ccfDNA מיטוכונדריאלי בהמולימפה של A. atra. נוכחותם של שברי DNA מיטוכונדריאלי אושרה באמצעות הגברה של PCR (איור 3).
גנים מיטוכונדריאליים שונים נמצאו בהמולימפה של A. atra (נקודות אדומות - מספר מלאי: SRX5705969) ו-M. platensis (נקודות כחולות - מספר מלאי: SRX5705968) שהוגברו על ידי PCR. איור מעובד מ-Breton et al., 2011 B הגברה של נוזל עליון המולימפה מ-A. atra אוחסן על נייר FTA. השתמשו במחורר 3 מ"מ כדי להוסיף ישירות למבחנת ה-PCR המכילה את תערובת ה-PCR.
בהינתן תכולת המיקרוביאלים העשירה במי ים, התמקדנו בתחילה באפיון רצפי DNA מיקרוביאליים בהמולימפה. לשם כך, אנו משתמשים בשתי אסטרטגיות שונות. האסטרטגיה הראשונה השתמשה ב-Kraken2, תוכנת סיווג רצפים מבוססת אלגוריתם שיכולה לזהות רצפי מיקרוביאלים בדיוק דומה ל-BLAST ולכלים אחרים [28]. יותר מ-6719 קריאות נקבעו כממקור חיידקי, בעוד ש-124 ו-64 היו מארכאונים ווירוסים, בהתאמה (איור 4). שברי ה-DNA החיידקיים הנפוצים ביותר היו Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) ו-Bacteroidetes (17%) (איור 4a). התפלגות זו עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים של המיקרוביום של צדפות כחולות ימיות [39, 40]. Gammaproteobacteria היו המחלקה העיקרית של Proteobacteria (44%), כולל Vibrionales רבים (איור 4b). שיטת ddPCR אישרה את נוכחותם של מקטעי DNA של Vibrio ב-ccfDNA של המולימפה של A. atra (איור 4c) [41]. כדי לקבל מידע נוסף על המקור החיידקי של ccfDNA, ננקטה גישה נוספת (איור S2, מידע משלים). במקרה זה, קריאות חופפות הורכבו כקריאות זוגיות וסווגו כממקור עצמי (צדפות) או לא עצמי באמצעות BLASTN וערך e של 1e-3 וסף עם הומולוגיה >90%. במקרה זה, קריאות חופפות הורכבו כקריאות זוגיות וסווגו כממקור עצמי (צדפות) או לא עצמי באמצעות BLASTN וערך e של 1e-3 וסף עם הומולוגיה >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были клаксифики (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения > 0%. במקרה זה, קריאות חופפות נאספו כקריאות זוגיות וסווגו כמקוריות (צדפות) או לא מקוריות באמצעות BLASTN וערך e של 1e-3 וסף עם הומולוגיה >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和和和和和和和和和和和和和和和和和和嚒e>值%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使焨 使焚焚 焿用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классинфиковики (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порого. במקרה זה, קריאות חופפות נאספו כקריאות זוגיות וסווגו כעצמן (צדפות) או לא מקוריות באמצעות ערכי e BLASTN ו-1e-3 וסף הומולוגיה >90%.מאחר שגנום A. atra טרם רוצף, השתמשנו באסטרטגיית ההרכבה de novo של מרכיב MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). סך של 147,188 קונטיגים זוהו כבעלי מקור תלוי (צדפות). לאחר מכן, קונטיגים אלו פורקו עם ערכי e של 1e-10 באמצעות BLASTN ו-BLASTX. אסטרטגיה זו אפשרה לנו לזהות 482 מקטעים שאינם צדפות הנמצאים ב-ccfDNA של A. atra. יותר ממחצית (57%) משברי ה-DNA הללו התקבלו מחיידקים, בעיקר מסימביונטים זימים, כולל סימביונטים סולפוטרופיים, ומסימביונטים זימים Solemya velum (איור 5).
שפע יחסי ברמת הסוג. ב. מגוון מיקרוביאלי של שתי תפיסות עיקריות (Firmicutes ו-Proteobacteria). הגברה מייצגת של ddPCR. ג. Vibrio spp. א. שברי גן 16S rRNA (כחול) בשלושה המולימפות אטרה.
סך של 482 קונטיגים שנאספו נותחו. פרופיל כללי של התפלגות טקסונומית של אנוטציות קונטיגים מטאגנומיות (פרוקריוטים ואאוקריוטים). ב. התפלגות מפורטת של מקטעי DNA חיידקי שזוהו על ידי BLASTN ו-BLASTX.
ניתוח Kraken2 הראה גם כי ה-ccfDNA של צדפות הכיל שברי DNA ארכאיים, כולל שברי DNA של Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) ו-Thaurmarcheota (11%) (איור 6a). נוכחותם של שברי DNA שמקורם ב-Euryarchaeota ו-Crenarchaeota, שנמצאו בעבר בקהילה המיקרוביאלית של צדפות קליפורניות, אינה צריכה להפתיע [42]. למרות ש-Euryarchaeota קשורה לעתים קרובות לתנאים קיצוניים, כיום מוכר כי גם Euryarchaeota וגם Crenarcheota הם בין הפרוקריוטים הנפוצים ביותר בסביבה הקריוגנית הימית [43, 44]. נוכחותם של מיקרואורגניזמים מתנוגניים בצדפות אינה מפתיעה, בהתחשב בדיווחים אחרונים על דליפות מתאן נרחבות מדליפות תחתית ברמת קרגולן [45] וייצור מתאן מיקרוביאלי אפשרי שנצפתה מול חופי איי קרגולן [46].
לאחר מכן, תשומת ליבנו עברה לקריאות מוירוסי DNA. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון מחוץ למטרה של תכולת הווירוס במולים. כצפוי, מצאנו שברי DNA של בקטריופאג'ים (Caudovirales) (איור 6b). עם זאת, ה-DNA הנגיפי הנפוץ ביותר מגיע ממערכה של נוקלאוציטוזירו-וירוסים, הידועה גם בשם וירוס ה-DNA הגדול הציטופלזמי הגרעיני (NCLDV), בעלת הגנום הגדול ביותר מכל וירוס אחר. בתוך מערכה זו, רוב רצפי ה-DNA שייכים למשפחות Mimimidoviridae (58%) ו-Poxviridae (21%), שהמארחים הטבעיים שלהן כוללים בעלי חוליות ופרוקי רגליים, בעוד שחלק קטן מרצפי ה-DNA הללו שייכים לאצות וירולוגיות ידועות. מדביק אצות אאוקריוטיות ימיות. הרצפים התקבלו גם מווירוס פנדורה, הווירוס הענק בעל גודל הגנום הגדול ביותר מכל סוג ויראלי ידוע. מעניין לציין, שטווח המארחים הידועים כנגועים בווירוס, כפי שנקבע על ידי ריצוף ccfDNA של המולימפה, היה גדול יחסית (איור S3, מידע משלים). זה כולל וירוסים שמדביקים חרקים כמו Baculoviridae ו-Iridoviridae, כמו גם וירוסים שמדביקים אמבות, אצות ובעלי חוליות. מצאנו גם רצפים התואמים את הגנום של Pithovirus sibericum. פיטווירוסים (הידועים גם כ"וירוסי זומבים") בודדו לראשונה מקפאת-עד בת 30,000 שנה בסיביר [47]. לפיכך, תוצאותינו עולות בקנה אחד עם דיווחים קודמים המראים שלא כל המינים המודרניים של וירוסים אלה נכחדו [48] וכי וירוסים אלה עשויים להימצא במערכות אקולוגיות ימיות תת-ארקטיות מרוחקות.
לבסוף, בדקנו אם נוכל למצוא שברי DNA מבעלי חיים רב-תאיים אחרים. סך של 482 קונטיגים זרים זוהו על ידי BLASTN ו-BLASTX עם ספריות nt, nr ו-RefSeq (גנומיות וחלבוניות). תוצאותינו מראות שבין השברים הזרים של ccfDNA של בעלי חיים רב-תאיים, DNA של עצמות גרמיות שולט (איור 5). נמצאו גם שברי DNA מחרקים וממינים אחרים. חלק גדול יחסית משברי ה-DNA לא זוהו, כנראה עקב תת-ייצוג של מספר רב של מינים ימיים במאגרי מידע גנומיים בהשוואה למינים יבשתיים [49].
במאמר הנוכחי, אנו מיישמים את מושג ה-LB על צדפות, וטוענים כי ריצוף ccfDNA של המולימפה יכול לספק תובנות לגבי הרכבן של מערכות אקולוגיות ימיות בחופים. בפרט, מצאנו כי 1) המולימפה של צדפות מכילה ריכוזים גבוהים יחסית (רמות מיקרוגרם) של מקטעי DNA גדולים יחסית (~1-5 קילו-בייט) במחזור הדם; 2) מקטעי DNA אלה הם גם עצמאיים וגם לא עצמאיים. 3) בין המקורות הזרים של מקטעי DNA אלה, מצאנו DNA חיידקי, ארכאלי וויראלי, כמו גם DNA של בעלי חיים רב-תאיים אחרים; 4) הצטברות מקטעי ccfDNA זרים אלה בהמולימפה מתרחשת במהירות ותורמת לפעילות הסינון הפנימית של צדפות. לסיכום, מחקרנו מדגים כי מושג ה-LB, אשר יושם עד כה בעיקר בתחום הביו-רפואה, מקודד מקור ידע עשיר אך לא נחקר, שניתן להשתמש בו כדי להבין טוב יותר את האינטראקציה בין מיני זקיף לסביבתם.
בנוסף לפרימטים, דווח על בידוד ccfDNA גם אצל יונקים, כולל עכברים, כלבים, חתולים וסוסים [50, 51, 52]. עם זאת, למיטב ידיעתנו, המחקר שלנו הוא הראשון המדווח על גילוי וריצוף של ccfDNA במינים ימיים עם מערכת מחזור פתוחה. מאפיין אנטומי זה ויכולת הסינון של צדפות עשויות, לפחות בחלקן, להסביר את מאפייני הגודל השונים של שברי DNA במחזור הדם בהשוואה למינים אחרים. בבני אדם, רוב שברי ה-DNA במחזור הדם הם שברים קטנים בגודל של 150 עד 200 בסיסים, עם שיא מקסימלי של 167 בסיסים [34, 53]. חלק קטן אך משמעותי משברי ה-DNA הם בגודל של 300 עד 500 בסיסים, וכ-5% ארוכים מ-900 בסיסים [54]. הסיבה להתפלגות גודל זו היא שהמקור העיקרי של ccfDNA בפלזמה מתרחש כתוצאה ממוות תאי, בין אם עקב מוות תאי ובין אם עקב נמק של תאים המטופויאטיים במחזור הדם אצל אנשים בריאים או עקב אפופטוזיס של תאי גידול בחולי סרטן (הידוע כ-DNA גידולי במחזור הדם, ctDNA). התפלגות הגודל של ccfDNA המולימפתי שמצאנו בצדפות נעה בין 1000 ל-5000 בסיסים, דבר המצביע על כך של-ccfDNA של צדפות מקור שונה. זוהי השערה הגיונית, מכיוון שלצדפות יש מערכת כלי דם פתוחה למחצה והן חיות בסביבות ימיות מימיות המכילות ריכוזים גבוהים של DNA גנומי מיקרוביאלי. למעשה, ניסויי המעבדה שלנו המשתמשים ב-DNA אקסוגני הראו שמצדפות צוברות שברי DNA במי ים, שלפחות לאחר מספר שעות הן מתפרקות לאחר קליטה תאית ו/או משתחררות ו/או מאוחסנות בארגונים שונים. בהתחשב בנדירותם של תאים (הן פרוקריוטיים והן אאוקריוטיים), השימוש בתאים תוך-מסתמיים יפחית את כמות ה-ccfDNA ממקורות עצמיים וכן ממקורות זרים. בהתחשב בחשיבותה של החסינות המולדת של צדפות ובמספר הרב של פגוציטים במחזור הדם, שיערנו עוד שגם ccfDNA זר מועשר בפגוציטים במחזור הדם אשר צוברים DNA זר בעת בליעת מיקרואורגניזמים ו/או פסולת תאית. בסך הכל, תוצאותינו מראות ש-ccfDNA המולימפתי של צדפות הוא מאגר ייחודי של מידע מולקולרי ומחזק את מעמדן כמין זקיף.
הנתונים שלנו מצביעים על כך שריצוף וניתוח של מקטעי ccfDNA המולימפתי שמקורם בחיידקים יכולים לספק מידע מפתח על פלורת החיידקים המארחית ועל החיידקים הקיימים במערכת האקולוגית הימית שמסביב. טכניקות ריצוף מהיר חשפו רצפים של חיידק הקומנסל A. atra gill שהיו מתפספסים אילו היו משתמשים בשיטות זיהוי קונבנציונליות של 16S rRNA, בין היתר בשל הטיה של ספריית ייחוס. למעשה, השימוש שלנו בנתוני LB שנאספו מ-M. platensis באותה שכבת צדפות ב-Kerguelen הראה שהרכב הסימביונטים החיידקיים הקשורים לזימים היה זהה עבור שני מיני הצדפות (איור S4, מידע משלים). דמיון זה של שתי צדפות שונות גנטית עשוי לשקף את הרכב קהילות החיידקים במשקעים הקרים, הגופריתיים והגעשיים של Kerguelen [55, 56, 57, 58]. רמות גבוהות יותר של מיקרואורגניזמים מפחיתי גופרית תוארו היטב בעת קצירת צדפות מאזורים חופיים בעלי טורבינות ביולוגיות [59], כמו חוף פורט-או-פראנס. אפשרות נוספת היא שפלורת הצדפות הקומנסליות עשויה להיות מושפעת מהעברה אופקית [60, 61]. יש צורך במחקר נוסף כדי לקבוע את המתאם בין הסביבה הימית, פני קרקעית הים והרכב החיידקים הסימביוטיים בצדפות. מחקרים אלה נמשכים כעת.
האורך והריכוז של ccfDNA המולימפתי, קלות הטיהור שלו והאיכות הגבוהה המאפשרת ריצוף מהיר של shotgun הם חלק מהיתרונות הרבים של שימוש ב-ccfDNA של צדפות להערכת המגוון הביולוגי במערכות אקולוגיות ימיות חופיות. גישה זו יעילה במיוחד לאפיון קהילות ויראליות (וירומות) במערכת אקולוגית נתונה [62, 63]. שלא כמו חיידקים, ארכאונים ואאוקריוטים, גנומים ויראליים אינם מכילים גנים שמורים פילוגנטית כגון רצפי 16S. תוצאותינו מצביעות על כך שביופסיות נוזליות ממיני אינדיקטורים כגון צדפות יכולות לשמש לזיהוי מספרים גדולים יחסית של שברי וירוס ccfDNA הידועים כמדביקים פונדקאים שבדרך כלל מאכלסים מערכות אקולוגיות ימיות חופיות. זה כולל וירוסים הידועים כמדביקים פרוטוזואה, פרוקי רגליים, חרקים, צמחים ווירוסים חיידקיים (למשל, בקטריופאג'ים). התפלגות דומה נמצאה כאשר בדקנו את וירומת ccfDNA המולימפתי של צדפות כחולות (M. platensis) שנאספו באותה שכבת צדפות בקרגולן (טבלה S2, מידע משלים). ריצוף ccfDNA באמצעות רובה ציד הוא אכן גישה חדשה שצוברת תאוצה בחקר הווירום של בני אדם או מינים אחרים [21, 37, 64]. גישה זו שימושית במיוחד לחקר נגיפי DNA דו-גדיליים, מכיוון שאף גן בודד אינו שמור מבין כל נגיפי ה-DNA הדו-גדיליים, המייצגים את המחלקה המגוונת והרחבה ביותר של נגיפים בבולטימור [65]. למרות שרוב הנגיפים הללו נותרו בלתי מסווגים ועשויים לכלול נגיפים מחלק בלתי ידוע לחלוטין של עולם הנגיפים [66], מצאנו כי הווירומים ותחומי המארחים של צדפות ה-A. atra ו-M. platensis נופלים באופן דומה בין שני המינים (ראה איור S3, מידע נוסף). דמיון זה אינו מפתיע, שכן הוא עשוי לשקף חוסר סלקטיביות בקליטת DNA הקיים בסביבה. כיום נדרשים מחקרים עתידיים המשתמשים ב-RNA מטוהר כדי לאפיין את הווירום של ה-RNA.
במחקר שלנו, השתמשנו בצינור ריצוף קפדני מאוד המותאם לעבודתם של קוברסקי ועמיתיו [37], אשר השתמשו במחיקה דו-שלבית של קריאות מקובצות וקונטיגים לפני ואחרי הרכבת ccfDNA טבעי, וכתוצאה מכך נוצר שיעור גבוה של קריאות לא ממופות. לכן, איננו יכולים לשלול שחלק מהקריאות הלא ממופות הללו עדיין עשויות להיות מקור משלהן, בעיקר משום שאין לנו גנום ייחוס למין צדפות זה. השתמשנו גם בצינור זה משום שהיינו מודאגים מהכימרות בין קריאות עצמיות לקריאות לא-עצמיות ומאורכי הקריאה שנוצרו על ידי Illumina MiSeq PE75. סיבה נוספת לרוב הקריאות הלא ממופות היא שחלק ניכר מהמיקרובים הימיים, במיוחד באזורים מרוחקים כמו קרגולן, לא סומנו. השתמשנו ב-Illumina MiSeq PE75, בהנחה שאורכי מקטעי ccfDNA דומים ל-ccfDNA אנושי. עבור מחקרים עתידיים, בהתחשב בתוצאות שלנו המראות של-ccfDNA המולימפתי יש קריאות ארוכות יותר מאשר לבני אדם ו/או יונקים, אנו ממליצים להשתמש בפלטפורמת ריצוף המתאימה יותר לשברי ccfDNA ארוכים יותר. נוהג זה יקל הרבה יותר על זיהוי אינדיקציות נוספות לניתוח מעמיק יותר. קבלת רצף הגנום הגרעיני המלא, שאינו זמין כיום, של A. atra תקל מאוד גם על ההבחנה בין ccfDNA למקורות עצמיים ולא-עצמיים. בהתחשב בכך שהמחקר שלנו התמקד באפשרות של יישום מושג הביופסיה הנוזלית על צדפות, אנו מקווים שככל שישתמשו במושג זה במחקר עתידי, יפותחו כלים וצנרת חדשים כדי להגדיל את הפוטנציאל של שיטה זו לחקור את המגוון המיקרוביאלי של צדפות ומערכת אקולוגית ימית.
כסמן ביולוגי קליני לא פולשני, רמות גבוהות של ccfDNA בפלזמה אנושית קשורות למחלות שונות, נזק לרקמות ותנאי עקה [67,68,69]. עלייה זו קשורה לשחרור של שברי DNA ממקורם לאחר נזק לרקמות. התייחסנו לבעיה זו באמצעות עקת חום חריפה, שבה מולים נחשפו לזמן קצר לטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. ביצענו ניתוח זה על שלושה סוגים שונים של מולים בשלושה ניסויים בלתי תלויים. עם זאת, לא מצאנו כל שינוי ברמות ccfDNA לאחר עקת חום חריפה (ראה איור S5, מידע נוסף). תגלית זו עשויה להסביר, לפחות בחלקה, את העובדה שלמולים יש מערכת דם פתוחה למחצה והם צוברים כמויות גדולות של DNA זר עקב פעילות הסינון הגבוהה שלהם. מצד שני, מולים, כמו חסרי חוליות רבים, עשויים להיות עמידים יותר לנזק לרקמות הנגרם מעקה, ובכך להגביל את שחרור ה-ccfDNA בהמולימפה שלהם [70, 71].
עד היום, ניתוח DNA של מגוון ביולוגי במערכות אקולוגיות מימיות התמקד בעיקר בקידוד מטא-בר של DNA סביבתי (eDNA). עם זאת, שיטה זו מוגבלת בדרך כלל בניתוח מגוון ביולוגי כאשר משתמשים בפריימרים. השימוש בריצוף shotgun עוקף את המגבלות של PCR ואת הבחירה המוטה של ​​סטים של פריימרים. לכן, במובן מסוים, השיטה שלנו קרובה יותר לשיטת ריצוף eDNA בעלת תפוקה גבוהה, שנמצאה בשימוש לאחרונה, המסוגלת לרצף ישירות DNA מקוטע ולנתח כמעט את כל האורגניזמים [72, 73]. עם זאת, ישנן מספר סוגיות מהותיות המבדילות LB משיטות eDNA סטנדרטיות. כמובן, ההבדל העיקרי בין eDNA ל-LB הוא השימוש במארחים כמסננים טבעיים. דווח על שימוש במינים ימיים כמו ספוגים וצדפות (Dresseina spp.) כמסנן טבעי לחקר eDNA [74, 75]. עם זאת, המחקר של דרייסנה השתמש בביופסיות רקמה מהן חולץ DNA. ניתוח ccfDNA מ-LB אינו דורש ביופסיית רקמה, ציוד מיוחד ולעיתים יקר ולוגיסטיקה הקשורים ל-eDNA או ביופסיית רקמה. למעשה, דיווחנו לאחרונה כי ניתן לאחסן ולנתח ccfDNA מ-LB עם תמיכת FTA מבלי לשמור על שרשרת קור, וזהו אתגר מרכזי למחקר באזורים מרוחקים [76]. מיצוי ccfDNA מביופסיות נוזליות הוא גם פשוט ומספק DNA באיכות גבוהה עבור ריצוף רובה ציד וניתוח PCR. זהו יתרון גדול בהתחשב בכמה מהמגבלות הטכניות הקשורות לניתוח eDNA [77]. הפשטות והעלות הנמוכה של שיטת הדגימה מתאימות במיוחד גם לתוכניות ניטור ארוכות טווח. בנוסף ליכולת הסינון הגבוהה שלהם, מאפיין ידוע נוסף של צדפות הוא ההרכב הכימי המוקופוליסכרידי של הריר שלהם, אשר מקדם את ספיגת הנגיפים [78, 79]. זה הופך את הצולבות למסנן טבעי אידיאלי לאפיון המגוון הביולוגי והשפעת שינויי האקלים במערכת אקולוגית מימית נתונה. למרות שנוכחותם של שברי DNA שמקורם במארח יכולה להיחשב כמגבלה של השיטה בהשוואה ל-eDNA, העלות הכרוכה בנוכחות ccfDNA טבעי שכזה בהשוואה ל-eDNA מובנת בו זמנית לאור כמות המידע העצומה הזמינה למחקרי בריאות של המארח. זה כולל את נוכחותם של רצפים ויראליים המשולבים בגנום של המארח. זה חשוב במיוחד עבור צדפות, בהתחשב בנוכחותם של רטרו-וירוסים לוקמיים המועברים אופקית בצדפות [80, 81]. יתרון נוסף של LB על פני eDNA הוא שהוא מנצל את הפעילות הפגוציטית של תאי דם במחזור הדם בהמולימפה, אשר בולע מיקרואורגניזמים (ואת הגנומים שלהם). פגוציטוזה היא הפונקציה העיקרית של תאי דם בצדפות [82]. לבסוף, השיטה מנצלת את קיבולת הסינון הגבוהה של צדפות (ממוצע 1.5 ליטר/שעה של מי ים) ואת מחזור הדם של יומיים, אשר מגבירים את הערבוב של שכבות שונות של מי ים, ומאפשרים לכידת eDNA הטרולוגי. [83, 84]. לפיכך, ניתוח ccfDNA של צדפות הוא דרך מעניינת בהתחשב בהשפעות התזונתיות, הכלכליות והסביבתיות של צדפות. בדומה לניתוח LB שנאסף מבני אדם, שיטה זו פותחת גם את האפשרות למדוד שינויים גנטיים ואפיגנטיים ב-DNA המארח בתגובה לחומרים אקסוגניים. לדוגמה, ניתן לדמיין טכנולוגיות ריצוף דור שלישי לביצוע ניתוח מתילציה כלל-גנומי ב-ccfDNA טבעי באמצעות ריצוף ננו-נקבוביות. תהליך זה אמור להיות מוקל על ידי העובדה שאורך שברי ה-ccfDNA של צדפות תואם באופן אידיאלי לפלטפורמות ריצוף ארוכות טווח המאפשרות ניתוח מתילציה כלל-גנומי של DNA מריצוף יחיד ללא צורך בטרנספורמציות כימיות.85,86] זוהי אפשרות מעניינת, שכן הוכח שדפוסי מתילציה של DNA משקפים תגובה ללחץ סביבתי ונמשכים לאורך דורות רבים. לכן, הוא יכול לספק תובנה חשובה לגבי המנגנונים הבסיסיים השולטים בתגובה לאחר חשיפה לשינויי אקלים או למזהמים [87]. עם זאת, השימוש ב-LB אינו נטול מגבלות. מיותר לציין, הדבר דורש נוכחות של מיני אינדיקטורים במערכת האקולוגית. כפי שצוין לעיל, שימוש ב-LB להערכת המגוון הביולוגי של מערכת אקולוגית נתונה דורש גם צינור ביואינפורמטיקה קפדני שלוקח בחשבון את נוכחותם של שברי DNA מהמקור. בעיה מרכזית נוספת היא זמינותם של גנומים ייחוס עבור מינים ימיים. יש לקוות שיוזמות כמו פרויקט הגנום של יונקים ימיים ופרויקט Fish10k שהוקם לאחרונה [88] יאפשרו ניתוח כזה בעתיד. יישום מושג ה-LB על אורגניזמים ימיים הניזונים מסננים תואם גם להתקדמות האחרונה בטכנולוגיית הריצוף, מה שהופך אותו למתאים היטב לפיתוח סמנים ביולוגיים מרובי אוהם כדי לספק מידע חשוב על בריאות בתי הגידול הימיים בתגובה ללחץ סביבתי.
נתוני ריצוף גנום הופקדו בארכיון קריאת הרצפים של NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 תחת Bioprojects SRR8924808.
בריירלי AS, קינגספורד MJ השפעת שינויי האקלים על חיים ימיים ומערכות אקולוגיות. קול ביולוגיה. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, ואחרים. יש לשקול את ההשפעות המשולבות של שינויי האקלים וגורמי לחץ מקומיים אחרים על הסביבה הימית. סביבה מדעית כללית. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). המדע של הראשון במרץ. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. סבילות מופחתת לחום בתנאי עקת חום חוזרים מסבירה את התמותה הגבוהה של מולים כחולות בקיץ. דו"ח מדעי 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, ואחרים. שינויים אחרונים בתדירות, בסיבות ובהיקף תמותת בעלי חיים. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. מספר פתוגנים שאינם ספציפיים למין עשויים לגרום לתמותה המונית של Pinna nobilis. חַיִים. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. ההשפעה הפוטנציאלית של שינויי האקלים על מחלות זואונוטיות באזור הארקטי. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ואחרים. צדפות כחולות (Mytilus edulis spp.) כאורגניזמים איתותים בניטור זיהום חופי: סקירה. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. שילוב של ביופסיה נוזלית בטיפול בסרטן. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. הבשלת ביופסיה נוזלית: מאפשרת ל-DNA של הגידול לזרום. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
מנדל פ., מטאיס פ. חומצות גרעין בפלזמה אנושית. פרוטוקולי ישיבה של חברות הבת של Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. תפקיד חדש עבור DNA נטול תאים כסמן מולקולרי לטיפול בסרטן. כימות של ניתוח ביומולרי. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS ביופסיה נוזלית נכנסת למרפאה - בעיות יישום ואתגרים עתידיים. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ואחרים. דנ"א עוברי קיים בפלזמה ובסרום של האם. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. מחקר על מהלך ההריון וסיבוכיו באמצעות RNA חוץ-תאי במחזור הדם של נשים במהלך ההריון. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. ביופסיה נוזלית: DNA נטול תאי תורם משמש לגילוי נגעים אלוגניים בשתל כליה. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
חואן פ.צ., לו י.מ. חידושים באבחון טרום לידתי: ריצוף גנום בפלזמה אימהית. אנה מ.ד. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. זיהוי מהיר של פתוגנים באמצעות ריצוף מטאגנומי מהדור הבא של נוזלי גוף נגועים. Nat Medicine. 2021;27:115-24.