תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
ביופסיה נוזלית (LB) היא מושג שצובר פופולריות במהירות בתחום הביו-רפואי.הרעיון מתבסס בעיקר על זיהוי שברי DNA חוץ תאי במחזור (ccfDNA), המשתחררים בעיקר כשברים קטנים לאחר מוות תאי ברקמות שונות.חלק קטן מהשברים הללו מקורם ברקמות או אורגניזמים זרים (זרים).בעבודה הנוכחית, יישמנו את המושג הזה על מולים, זן זקיף הידוע ביכולת סינון מי הים הגבוהה שלהם.אנו משתמשים ביכולת של מולים לפעול כמסננים טבעיים כדי ללכוד שברי DNA סביבתיים ממגוון מקורות כדי לספק מידע על המגוון הביולוגי של מערכות אקולוגיות של החוף הימי.התוצאות שלנו מראות שהמולימפית מולים מכילה שברי DNA המשתנים מאוד בגודלם, בין 1 ל-5 קילובייט.רצף רובה ציד הראה שמספר רב של שברי DNA הם ממקור חיידקי זר.ביניהם, מצאנו שברי DNA מחיידקים, ארכאים ווירוסים, כולל וירוסים הידועים כמדביקים מגוון מארחים הנמצאים בדרך כלל במערכות אקולוגיות ימיות של החוף.לסיכום, המחקר שלנו מדגים שהמושג LB המיושם על מולים מייצג מקור עשיר אך עדיין לא נחקר של ידע על מגוון מיקרוביאלי במערכות אקולוגיות של החוף הימי.
השפעת שינויי האקלים (CC) על המגוון הביולוגי של מערכות אקולוגיות ימיות היא תחום מחקר שצומח במהירות.התחממות כדור הארץ לא רק גורמת ללחצים פיזיולוגיים חשובים, אלא גם דוחפת את הגבולות האבולוציוניים של היציבות התרמית של אורגניזמים ימיים, משפיעה על בית הגידול של מספר מינים, ומניעה אותם לחפש תנאים נוחים יותר [1, 2].בנוסף להשפעה על המגוון הביולוגי של מטאזואים, CC משבש את האיזון העדין של אינטראקציות מארח-מיקרוביאליות.דיסבקטריוזיס מיקרוביאלית זו מהווה איום רציני על מערכות אקולוגיות ימיות מכיוון שהיא הופכת אורגניזמים ימיים לרגישים יותר לפתוגנים מדבקים [3, 4].מאמינים כי SS ממלא תפקיד חשוב במקרי מוות המוניים, המהווה בעיה רצינית לניהול מערכות אקולוגיות ימיות גלובליות [5, 6].זהו נושא חשוב בהתחשב בהשפעות הכלכליות, האקולוגיות והתזונתיות של מינים ימיים רבים.זה נכון במיוחד עבור צלתיים החיים באזורי הקוטב, שבהם ההשפעות של CK הן מיידיות וחמורות יותר [6, 7].למעשה, שני מסתיים כגון Mytilus spp.נמצאים בשימוש נרחב לניטור ההשפעות של CC על מערכות אקולוגיות ימיות.באופן לא מפתיע, פותחו מספר רב יחסית של סמנים ביולוגיים לניטור בריאותם, לעתים קרובות תוך שימוש בגישה דו-שכבתית הכוללת סמנים ביולוגיים פונקציונליים המבוססים על פעילות אנזימטית או תפקודים תאיים כגון קיימות תאים ופעילות פגוציטית [8].שיטות אלו כוללות גם מדידת ריכוז מדדי לחץ ספציפיים המצטברים ברקמות רכות לאחר ספיגת כמויות גדולות של מי ים.עם זאת, יכולת הסינון הגבוהה ומערכת מחזור הדם הפתוחה למחצה של הביסתיים מספקים הזדמנות לפתח סמנים ביולוגיים חדשים של המולימפה תוך שימוש בקונספט של ביופסיה נוזלית (LB), גישה פשוטה ומינימלית פולשנית לטיפול בחולים.דגימות דם [9, 10].למרות שניתן למצוא מספר סוגים של מולקולות במחזור ב-LB אנושי, מושג זה מבוסס בעיקר על ניתוח רצף DNA של שברי DNA חוץ-תאי (ccfDNA) במחזור בפלזמה.למעשה, נוכחות ה-DNA המסתובב בפלסמה אנושית ידועה מאמצע המאה ה-20 [11], אך רק בשנים האחרונות הופעתן של שיטות ריצוף בתפוקה גבוהה הובילה לאבחון קליני המבוסס על ccfDNA.נוכחותם של שברי ה-DNA המסתובבים הללו נובעת בחלקה משחרור פסיבי של DNA גנומי (גרעיני ומיטוכונדריה) לאחר מוות תאי. אצל אנשים בריאים, ריכוז ה-ccfDNA נמוך בדרך כלל (<10 ng/mL), אך ניתן להגדיל אותו פי 5-10 בחולים הסובלים מפתולוגיות שונות או נתונים ללחץ, וכתוצאה מכך נזק לרקמות. אצל אנשים בריאים, ריכוז ה-ccfDNA נמוך בדרך כלל (<10 ng/mL), אך ניתן להגדיל אותו פי 5-10 בחולים הסובלים מפתולוגיות שונות או נתונים ללחץ, וכתוצאה מכך נזק לרקמות. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 посранх логией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. באנשים בריאים, ריכוז cccDNA נמוך בדרך כלל (<10 ננוגרם/מ"ל), אך הוא יכול לעלות פי 5-10 בחולים עם פתולוגיות שונות או תחת לחץ שמוביל לנזק לרקמות.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各姍病理或承壏加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刏可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелично низкие в 5-10 мл. логиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ריכוזי ccfDNA נמוכים בדרך כלל (<10 ng/ml) אצל אנשים בריאים, אך ניתן להגדיל פי 5-10 בחולים עם פתולוגיות שונות או מתח, וכתוצאה מכך נזק לרקמות.גודלם של שברי ccfDNA משתנה מאוד, אך בדרך כלל נע בין 150 ל-200 bp.[12].ניתן להשתמש בניתוח של ccfDNA שמקורו בעצמו, כלומר, ccfDNA מתאי מארח נורמליים או שעברו טרנספורמציה, כדי לזהות שינויים גנטיים ואפיגנטיים הקיימים בגנום הגרעיני ו/או המיטוכונדריאלי, ובכך לעזור לרופאים לבחור טיפולים ספציפיים ממוקדי מולקולרי [13] .עם זאת, ניתן להשיג ccfDNA ממקורות זרים כגון ccfDNA מתאי עובר במהלך ההריון או מאיברים מושתלים [14,15,16,17].ccfDNA הוא גם מקור מידע חשוב לאיתור נוכחות של חומצות גרעין של גורם זיהומי (זר), המאפשר זיהוי לא פולשני של זיהומים נרחבים שאינם מזוהים על ידי תרביות דם, תוך הימנעות מביופסיה פולשנית של רקמה נגועה [18].מחקרים עדכניים אכן הראו כי דם אנושי מכיל מקור עשיר של מידע שניתן להשתמש בו לזיהוי פתוגנים ויראליים וחיידקיים, וכי כ-1% מה-ccfDNA שנמצא בפלסמה אנושית הוא ממקור זר [19].מחקרים אלה מוכיחים שניתן להעריך את המגוון הביולוגי של המיקרוביום במחזוריות של אורגניזם באמצעות ניתוח ccfDNA.עם זאת, עד לאחרונה, מושג זה היה בשימוש בלעדי בבני אדם, ובמידה פחותה, בבעלי חוליות אחרים [20, 21].
במאמר הנוכחי, אנו משתמשים בפוטנציאל ה-LB כדי לנתח את ה-ccfDNA של Aulacomya atra, מין דרומי שנמצא בדרך כלל באיי Kerguelen התת-אנטארקטיים, קבוצת איים על גבי רמה גדולה שנוצרה לפני 35 מיליון שנה.התפרצות געשית.באמצעות מערכת ניסויים חוץ גופית, מצאנו ששברי DNA במי ים נספגים במהירות על ידי מולים ונכנסים לתא ההמולימפה.רצף רובה ציד הראה שהמולימפית ccfDNA של מולים מכילה שברי DNA ממקור משלו ולא עצמי, כולל חיידקים סימביוטיים ושברי DNA מביומות האופייניות למערכות אקולוגיות חוף ימי געש געש.Hemolymph ccfDNA מכיל גם רצפים ויראליים שמקורם בנגיפים עם טווחי מארח שונים.מצאנו גם שברי DNA מבעלי חיים רב-תאיים כמו דגים גרמיים, כלניות ים, אצות וחרקים.לסיכום, המחקר שלנו מדגים שניתן ליישם בהצלחה את הרעיון של LB על חסרי חוליות ימיים כדי ליצור רפרטואר גנומי עשיר במערכות אקולוגיות ימיות.
מבוגרים (55-70 מ"מ אורך) Mytilus platensis (M. platensis) ו-Aulacomya atra (A. atra) נאספו מהחופים הסלעיים בין הגאות והשפל של פורט-או-פרנס (049°21.235 S, 070°13.490 E .).איי Kerguelen בדצמבר 2018. מולים כחולים בוגרים אחרים (Mytilus spp.) הושגו מספק מסחרי (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, קנדה) והונחו במיכל מאוורר מבוקר טמפרטורה (4°C) המכיל 10-20 ליטר של מי מלח מלאכותי 32‰.(מלח ים מלאכותי ריף קריסטל, אינסטנט אושן, וירג'יניה, ארה"ב).עבור כל ניסוי, אורך ומשקל של קונכיות בודדות נמדדו.
פרוטוקול גישה פתוחה בחינם לתוכנית זו זמין באינטרנט (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).בקצרה, LB hemolymph נאספה משרירי חוטף כמתואר [22].ההמולימפה הובהרה על ידי צנטריפוגה ב-1200×g למשך 3 דקות, הסופרנטנט הוקפא (-20 מעלות צלזיוס) עד לשימוש.לצורך בידוד וטיהור של cfDNA, דגימות (1.5-2.0 מ"ל) הופשרו ועובדו באמצעות ערכת NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) לפי הוראות היצרן.ccfDNA אוחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.בניסויים מסוימים, ccfDNA בודד וטיהרו באמצעות ערכת QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, טורונטו, אונטריו, קנדה).DNA מטוהר כמת באמצעות מבחן PicoGreen סטנדרטי.התפלגות המקטעים של ה-ccfDNA המבודד נותחה על ידי אלקטרופורזה נימית באמצעות ניתוח ביולוגי של Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) באמצעות ערכת DNA בעלת רגישות גבוהה.הבדיקה בוצעה באמצעות 1 μl מדגימת ccfDNA לפי הוראות היצרן.
עבור רצף של שברי hemolymph ccfDNA, Génome Québec (מונטריאול, קוויבק, קנדה) הכין ספריות רובה ציד באמצעות ערכת Illumina DNA Mix של ערכת Illumina MiSeq PE75.נעשה שימוש במתאם סטנדרטי (BioO).קבצי נתונים גולמיים זמינים מארכיון רצף הקריאה של NCBI (SRR8924808 ו-SRR8924809).איכות הקריאה הבסיסית הוערכה באמצעות FastQC [23].Trimmomatic [24] שימש עבור מתאמי חיתוך וקריאה באיכות ירודה.קריאות רובה ציד עם קצוות זוגיים מוזגו FLASH לקריאות בודדות ארוכות יותר עם חפיפה מינימלית של 20 bp כדי למנוע אי התאמה [25]. קריאות ממוזגות סומנו עם BLASTN באמצעות מסד נתונים דו-סתמיים של טקסונומיה NCBI (ערך e < 1e-3 ו-90% הומולוגיה), ומיסוך של רצפים בעלי מורכבות נמוכה בוצע באמצעות DUST [26]. קריאות ממוזגות סומנו עם BLASTN באמצעות מסד נתונים דו-סתמיים של טקסונומיה NCBI (ערך e < 1e-3 ו-90% הומולוגיה), ומיסוך של רצפים בעלי מורכבות נמוכה בוצע באמצעות DUST [26]. (Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двулхорче 1e-3 ו-90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием [26]. קריאות מאוחדות צוינו ב-BLASTN באמצעות מסד הנתונים של טקסונומיה דו-סתמית של NCBI (ערך e < 1e-3 ו-90% הומולוגיה), ומיסוך רצף במורכבות נמוכה בוצע באמצעות DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的缿唌DUST 2低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 2 读濹]行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двинчов е e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использ [26]. קריאות מאוחדות צוינו ב-BLASTN באמצעות מסד הנתונים הטקסונומי הדו-סתמיים של NCBI (ערך e <1e-3 ו-90% הומולוגיה), ומיסוך רצף במורכבות נמוכה בוצע באמצעות DUST [26].קריאות חולקו לשתי קבוצות: קשורות לרצפים דו-מסתיים (הנקראים כאן קריאה עצמית) ולא קשורה (לא-קריאה עצמית).שתי קבוצות הורכבו בנפרד באמצעות MEGAHIT ליצירת קונטיגים [27].בינתיים, ההתפלגות הטקסונומית של קריאות מיקרוביום חייזרים סווגה באמצעות Kraken2 [28] ומיוצגת גרפית על ידי תרשים עוגה של קרונה בגלקסיה [29, 30].הקמ'רים האופטימליים נקבעו כ-kmers-59 מהניסויים המקדימים שלנו. לאחר מכן זוהו קונטיגים עצמיים על ידי יישור עם BLASTN (בסיס נתונים דו-סתמיים של NCBI, ערך e < 1e-10 ו-60% הומולוגיה) לצורך ביאור סופי. לאחר מכן זוהו קונטיגים עצמיים על ידי יישור עם BLASTN (בסיס נתונים דו-סתמיים של NCBI, ערך e < 1e-10 ו-60% הומולוגיה) לצורך ביאור סופי. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатлию, 1 e e 10 м. и гомология 60%) для окончательной аннотации. לאחר מכן זוהו קונטיגים עצמיים על ידי התאמה מול BLASTN (מסד נתונים דו-סתמיים של NCBI, ערך e <1e-10 ו-60% הומולוגיה) לצורך ביאור סופי.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (бинкор х моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). לאחר מכן זוהו קונטיגים עצמיים לצורך ביאור סופי על ידי התאמה מול BLASTN (מסד נתונים דו-סתמיים של NCBI, ערך e <1e-10 והומולוגיה של 60%). במקביל, קבוצות שאינן עצמיות צוינו ב-BLASTN (מסד נתונים nt NCBI, e value < 1e-10 ו-60% הומולוגיה). במקביל, קבוצות שאינן עצמיות צוינו ב-BLASTN (מסד נתונים nt NCBI, e value < 1e-10 ו-60% הומולוגיה). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (באמצעות NCBI, 50%-10%). במקביל, קבוצות זרות צוינו ב-BLASTN (מסד נתונים של NT NCBI, e value <1e-10 ו-60% הומולוגיה).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组羇〠〠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组羇〠〠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныче, база данныче и гомология 60%. במקביל, קונטיגים לא-עצמיים צוינו ב-BLASTN (מסד נתונים nt NCBI, e value <1e-10 והומולוגיה של 60%). BLASTX נערך גם על קונטיגים שאינם עצמיים באמצעות מסדי הנתונים nr ו-RefSeq חלבון NCBI (ערך e < 1e-10 ו-60% הומולוגיה). BLASTX נערך גם על קונטיגים שאינם עצמיים באמצעות מסדי הנתונים nr ו-RefSeq חלבון NCBI (ערך e < 1e-10 ו-60% הומולוגיה). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (בחודשים 010-10 NCBI) אחוזים. BLASTX בוצע גם על קונטיגים שאינם עצמיים באמצעות מסדי הנתונים של חלבון nr ו-RefSeq NCBI (ערך e < 1e-10 ו-60% הומולוגיה).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和 和怉 咧% 傧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和 和怉 咧% 傧 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX בוצע גם על קונטיגים שאינם עצמיים באמצעות מסדי הנתונים של חלבון nr ו-RefSeq NCBI (ערך e <1e-10 ו-60% הומולוגיה).מאגר ה-BLASTN ו-BLASTX של לא-עצמי-contigs מייצגים את ה-contigs הסופי (ראה קובץ משלים).
הפריימרים המשמשים ל-PCR מפורטים בטבלה S1.Taq DNA פולימראז (Bio Basic Canada, Markham, ON) שימש להגברת גני היעד של ccfDNA.נעשה שימוש בתנאי התגובה הבאים: דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך דקה, טמפרטורת חישול מוגדרת למשך דקה, התארכות ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה, 35 מחזורים, ולבסוף 72 מעלות צלזיוס תוך 10 דקות..מוצרי PCR הופרדו על ידי אלקטרופורזה בג'לי אגרוז (1.5%) המכילים SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, קנדה) ב-95 V.
מולים (Mytilus spp.) התאקלמו ב-500 מ"ל מי ים מחומצנים (32 PSU) למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.דנ"א פלסמיד המכיל אינסרט המקודד לרצף ה-cDNA של גלקטין-7 האנושי (מספר גישה של NCBI L07769) נוסף לבקבוקון בריכוז סופי של 190 מיקרוגרם/מיקרוליטר.מולים שהודגרו באותם תנאים ללא תוספת DNA היו הביקורת.מיכל הבקרה השלישי הכיל DNA ללא מולים.כדי לנטר את איכות ה-DNA במי הים, נלקחו דגימות מי ים (20 μl; שלוש חזרות) מכל מיכל בזמן המצוין.עבור עקיבות DNA של פלסמיד, מולים LB נקצרו בזמנים המצוינים ונותחו על ידי qPCR ו-ddPCR.בשל תכולת המלח הגבוהה של מי הים, מנות הודללו במים באיכות PCR (1:10) לפני כל מבחני ה-PCR.
PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR) בוצע באמצעות פרוטוקול BioRad QX200 (מיססאוגה, אונטריו, קנדה).השתמש בפרופיל הטמפרטורה כדי לקבוע את הטמפרטורה האופטימלית (טבלה S1).טיפות נוצרו באמצעות מחולל טיפות QX200 (BioRad).ddPCR בוצע באופן הבא: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 50 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות וטמפרטורת חישול נתונה למשך דקה אחת ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו-90 מעלות צלזיוס תוך 5 דקות.מספר הטיפות והתגובות החיוביות (מספר עותקים/µl) נמדדו באמצעות קורא טיפות QX200 (BioRad).דגימות עם פחות מ-10,000 טיפות נדחו.בקרת דפוס לא בוצעה בכל פעם ש-ddPCR הופעל.
qPCR בוצע באמצעות Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, סידני, אוסטרליה) ו-LGALS7 פריימרים ספציפיים.כל בדיקות ה-PCR הכמותיות בוצעו ב-20 μl באמצעות ערכת ה-PCR Green QuantiFast SYBR (QIAGEN).qPCR הוחל בדגירה של 15 דקות ב-95°C ולאחריה 40 מחזורים ב-95°C למשך 10 שניות וב-60°C למשך 60 שניות עם איסוף נתונים אחד.עקומות התכה נוצרו באמצעות מדידות עוקבות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות ו-97 מעלות צלזיוס בסוף ה-qPCR.כל qPCR בוצע בשלושה עותקים, למעט דגימות ביקורת.
מכיוון שהמולים ידועים בקצב הסינון הגבוה שלהם, בדקנו תחילה האם הם יכולים לסנן ולשמור על שברי DNA הנמצאים במי ים.התעניינו גם האם השברים הללו מצטברים במערכת הלימפה הפתוחה למחצה שלהם.פתרנו בעיה זו בניסוי על ידי מעקב אחר גורלם של שברי DNA מסיסים שנוספו למיכלי מולים כחולים.כדי להקל על מעקב אחר שברי DNA, השתמשנו ב-DNA פלסמיד זר (לא עצמי) המכיל את הגן האנושי גלקטין-7.ddPCR עוקב אחר שברי DNA של פלסמיד במי ים ומולים.התוצאות שלנו מראות שאם כמות שברי ה-DNA במי הים נשארה קבועה יחסית לאורך זמן (עד 7 ימים) בהיעדר מולים, אז בנוכחות מולים רמה זו נעלמה כמעט לחלוטין תוך 8 שעות (איור 1a,b).שברים של DNA אקסוגני זוהו בקלות תוך 15 דקות בנוזל תוך מסתיים ובהמולימפה (איור 1c).עדיין ניתן היה לזהות שברים אלו עד 4 שעות לאחר החשיפה.פעילות סינון זו ביחס לשברי DNA דומה לפעילות הסינון של חיידקים ואצות [31].תוצאות אלו מצביעות על כך שמולים יכולים לסנן ולצבור DNA זר בתאי הנוזלים שלהם.
ריכוזים יחסיים של DNA פלסמיד במי ים בנוכחות (A) או היעדר (B) של מולים, נמדד על ידי ddPCR.ב-A, התוצאות מבוטאות באחוזים, כאשר גבולות התיבות מייצגים את האחוזון ה-75 וה-25.העקומה הלוגריתמית המותאמת מוצגת באדום, והאזור המוצלל באפור מייצג את רווח הסמך של 95%.ב-B, הקו האדום מייצג את הממוצע והקו הכחול מייצג את רווח הסמך של 95% לריכוז.C הצטברות של DNA פלסמיד בנוזל ההמולימפה והמסתם של מולים בזמנים שונים לאחר הוספת ה-DNA הפלסמיד.התוצאות מוצגות כעותקים מוחלטים שזוהו/מ"ל (±SE).
לאחר מכן, חקרנו את מקורו של ccfDNA במולים שנאספו מערוגות מולים באיי קרגלן, קבוצה מרוחקת של איים עם השפעה אנתרופוגנית מוגבלת.למטרה זו, cccDNA מהמולימפים של מולים בודד וטיהרו בשיטות הנפוצות לטיהור cccDNA אנושי [32, 33].מצאנו כי ריכוזי המולימפה הממוצעים של ccfDNA במולים הם בטווח הנמוך של מיקרוגרם למ"ל המולימפה (ראה טבלה S2, מידע משלים).טווח ריכוזים זה גדול בהרבה מאשר אצל אנשים בריאים (ננוגרם נמוך למיליליטר), אך במקרים נדירים, בחולי סרטן, רמת ה-ccfDNA יכולה להגיע לכמה מיקרוגרם למיליליטר [34, 35].ניתוח של התפלגות הגודל של המולימפה ccfDNA הראה ששברים אלה משתנים מאוד בגודלם, נע בין 1000 bp ל-1000 bp.עד 5000 bp (איור 2).תוצאות דומות הושגו באמצעות ה-QIAamp Investigator Kit המבוסס על סיליקה, שיטה הנפוצה במדעי הזיהוי הפלילי לבידוד וטיהור מהיר של DNA גנומי מדגימות DNA בריכוז נמוך, כולל ccfDNA [36].
אלקטרופורגרם נציג ccfDNA של המולימפה מולים.חולץ עם NucleoSnap Plasma Kit (למעלה) ו-QIAamp DNA Investigator Kit.עלילת כינור B המציגה את התפלגות ריכוזי המולימפה ccfDNA (±SE) במולים.הקווים השחורים והאדומים מייצגים את החציון ואת הרבעון הראשון והשלישי, בהתאמה.
לכ-1% מה-ccfDNA בבני אדם ופרימטים יש מקור זר [21, 37].בהתחשב במערכת הדם הפתוחה למחצה של צלתיים, מי ים עשירים בחיידקים ותפוצת הגודל של ccfDNA של מולים, שיערנו שהמולימפית ccfDNA של מולים עשויה להכיל מאגר עשיר ומגוון של DNA מיקרוביאלי.כדי לבדוק השערה זו, רצנו רצף המולימפה ccfDNA מדגימות Aulacomya atra שנאספו מאיי Kerguelen, והניבו למעלה מ-10 מיליון קריאות, 97.6% מהן עברו בקרת איכות.לאחר מכן, הקריאות סווגו לפי מקורות עצמיים ולא-עצמיים באמצעות מאגרי המידע הדו-סתמיים של BLASTN ו-NCBI (איור S1, מידע משלים).
בבני אדם, DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי יכול להשתחרר לזרם הדם [38].עם זאת, במחקר הנוכחי, לא ניתן היה לתאר בפירוט את ה-DNA הגנומי הגרעיני של מולים, בהתחשב בכך שהגנום A. atra לא עבר רצף או תואר.עם זאת, הצלחנו לזהות מספר שברי ccfDNA ממקורנו באמצעות ספריית הביסתיים (איור S2, מידע משלים).אישרנו גם את נוכחותם של שברי DNA ממקורנו על ידי הגברה מכוונת של PCR של אותם גנים A. atra שנרשמו (איור 3).באופן דומה, בהתחשב בכך שהגנום המיטוכונדריאלי של A. atra זמין במאגרי מידע ציבוריים, ניתן למצוא עדויות לנוכחות של שברי ccfDNA מיטוכונדריאלי בהמולימפה של A. atra.נוכחותם של שברי DNA מיטוכונדריאלי אושרה על ידי הגברה של PCR (איור 3).
גנים מיטוכונדריאליים שונים היו נוכחים בהמולימפה של A. atra (נקודות אדומות - מספר מלאי: SRX5705969) ו-M. platensis (נקודות כחולות - מספר מלאי: SRX5705968) המוגברים באמצעות PCR.איור מותאם מ-Breton et al., 2011 B Amplification of hemolymph supernatant from A. atra מאוחסן על נייר FTA.השתמש באגרוף של 3 מ"מ כדי להוסיף ישירות לצינור ה-PCR המכיל את תערובת ה-PCR.
בהתחשב בתכולת החיידקים השופעת במי הים, התמקדנו בתחילה באפיון רצפי DNA מיקרוביאליים בהמולימפה.לשם כך, אנו משתמשים בשתי אסטרטגיות שונות.האסטרטגיה הראשונה השתמשה ב-Kraken2, תוכנית סיווג רצפים מבוססת אלגוריתמים שיכולה לזהות רצפים מיקרוביאליים עם דיוק השווה ל-BLAST וכלים אחרים [28].יותר מ-6719 קריאות נקבעו כמקור חיידקי, בעוד ש-124 ו-64 היו מארכיאה ונגיפים, בהתאמה (איור 4).שברי ה-DNA החיידקיים הנפוצים ביותר היו Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) ו-Bacteroidetes (17%) (איור 4a).התפלגות זו עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים של מיקרוביום מולים כחולים ימיים [39, 40].Gammaproteobacteria היו המחלקה העיקרית של Proteobacteria (44%), כולל Vibrionales רבים (איור 4b).שיטת ddPCR אישרה את נוכחותם של שברי DNA של Vibrio ב-ccfDNA של A. atra hemolymph (איור 4c) [41].כדי לקבל מידע נוסף על המקור החיידקי של ccfDNA, ננקטה גישה נוספת (איור S2, מידע משלים). במקרה זה, קריאות שחופפו הורכבו כקריאת קצה זוגית וסווגו כמקור עצמי (שני מסתיים) או לא-עצמי באמצעות BLASTN וערך e של 1e-3 וחתך עם הומולוגיה של מעל 90%. במקרה זה, קריאות שחופפו הורכבו כקריאת קצה זוגית וסווגו כמקור עצמי (שני מסתיים) או לא-עצמי באמצעות BLASTN וערך e של 1e-3 וחתך עם הומולוגיה של מעל 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классивы ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 ו отсечения> с гого. במקרה זה, קריאות חופפות נאספו כקריאות זוגיות וסווגו כמקוריים (שני מסתיים) או לא מקוריים באמצעות BLASTN וערך e של 1e-3 ו-cutoff עם יותר מ-90% הומולוגיה.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒倢暒倢倢嚒值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使焨 使缄的 焿缄用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфиков ые моллюски) או несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомолог. במקרה זה, קריאות חופפות נאספו כקריאות זוגיות וסווגו כעצמן (שני מסתיים) או לא מקוריים באמצעות ערכי e BLASTN ו-1e-3 וסף הומולוגיה של מעל 90%.כיוון שהגנום A. atra עדיין לא עבר רצף, השתמשנו באסטרטגיית ההרכבה דה נובו של ה- MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).סך של 147,188 קונטיגים זוהו כתלויים (שני מסתיים) במקור.לאחר מכן התפוצצו הקבצים האלה עם ערכים אלקטרוניים של 1e-10 באמצעות BLASTN ו-BLASTX.אסטרטגיה זו אפשרה לנו לזהות 482 שברים שאינם דו מסתיים הנמצאים ב-A. atra ccfDNA.יותר ממחצית (57%) ממקטעי ה-DNA הללו התקבלו מחיידקים, בעיקר מסימביונטים של זימים, כולל סימביונים סולפוטרופיים, ומסימביונטים של זימים Solemya velum (איור 5).
שפע יחסי ברמת הטיפוס.B מגוון מיקרוביאלי של שני פילות עיקריות (Firmicutes ו-Proteobacteria).הגברה מייצגת של ddPCR C Vibrio spp.א.שברים של הגן rRNA 16S (כחול) בשלוש המולימפיות אטרה.
בסך הכל נותחו 482 קונטיגים שנאספו.פרופיל כללי של ההתפלגות הטקסונומית של ביאורים מטאנומיים (פרוקריוטים ואיקריוטים).ב הפצה מפורטת של שברי DNA חיידקיים שזוהו על ידי BLASTN ו-BLASTX.
ניתוח Kraken2 הראה גם ש-ccfDNA של מולים הכיל שברי DNA ארכאיים, כולל שברי DNA של Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) ו-Thaurmarcheota (11%) (איור 6a).נוכחותם של שברי DNA שמקורם ב-Euryarchaeota ו-Crenarchaeota, שנמצאו בעבר בקהילה המיקרוביאלית של מולים קליפורניים, לא צריכה להפתיע [42].למרות ש-Euryarchaeota קשורה לעתים קרובות לתנאים קיצוניים, כיום ידוע כי גם Euryarchaeota וגם Crenarcheota הם מהפרוקריוטים הנפוצים ביותר בסביבה הקריוגנית הימית [43, 44].נוכחותם של מיקרואורגניזמים מתנוגניים במולים אינה מפתיעה, בהתחשב בדיווחים האחרונים על דליפות מתאן נרחבות מדליפות תחתית במישור קרגלן [45] וייצור מתאן מיקרוביאלי אפשרי שנצפה מול חופי איי קרגלן [46].
תשומת הלב שלנו עברה אז לקריאות מנגיפי DNA.למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון מחוץ למטרה של תכולת הנגיפים של מולים.כצפוי, מצאנו שברי DNA של בקטריופאג'ים (Caudovirales) (איור 6b).עם זאת, ה-DNA הנגיפי הנפוץ ביותר מגיע מקבוצת נגיפי נוקלוציטוווירוס, הידוע גם בשם נגיף ה-DNA הגדול (NCLDV) הגרעיני, בעל הגנום הגדול ביותר מכל וירוס.בתוך הפילום הזה, רוב רצפי ה-DNA שייכים למשפחות Mimimidoviridae (58%) ו- Poxviridae (21%), שהמארחים הטבעיים שלהן כוללים חולייתנים ופרוקי רגליים, בעוד שחלק קטן מרצפי ה-DNA הללו שייכים לאצות וירולוגיות ידועות.מדביק אצות אוקריוטיות ימיות.הרצפים התקבלו גם מנגיף הפנדורה, הנגיף הענק בעל גודל הגנום הגדול ביותר מכל סוג ויראלי ידוע.מעניין לציין שטווח המארחים הידועים כנגועים בנגיף, כפי שנקבע על ידי רצף המולימפה ccfDNA, היה גדול יחסית (איור S3, מידע משלים).הוא כולל וירוסים שמדביקים חרקים כמו Baculoviridae ו- Iridoviridae, וכן וירוסים שמדביקים אמבות, אצות ובעלי חוליות.מצאנו גם רצפים התואמים את הגנום Pithovirus sibericum.פיטו-וירוס (הידוע גם בשם "נגיפי זומבים") בודדו לראשונה מ-permafrost בן 30,000 שנה בסיביר [47].לפיכך, התוצאות שלנו עולות בקנה אחד עם דיווחים קודמים שהראו שלא כל המינים המודרניים של הנגיפים הללו נכחדו [48] וכי נגיפים אלה עשויים להיות נוכחים במערכות אקולוגיות ימיות תת-ארקטיות מרוחקות.
לבסוף, בדקנו אם נוכל למצוא שברי DNA מבעלי חיים רב-תאיים אחרים.סך של 482 זרמים זרים זוהו על ידי BLASTN ו-BLASTX עם ספריות nt, nr ו-RefSeq (גנומי וחלבון).התוצאות שלנו מראות שבין השברים הזרים של ccfDNA של בעלי חיים רב-תאיים שולט DNA של עצמות גרמיות (איור 5).כמו כן נמצאו שברי DNA מחרקים ומינים אחרים.חלק גדול יחסית מקטעי ה-DNA לא זוהה, אולי בשל תת-ייצוג של מספר רב של מינים ימיים במאגרי מידע גנומיים בהשוואה למינים יבשתיים [49].
במאמר הנוכחי, אנו מיישמים את המושג LB על מולים, בטענה שרצף זריקות המולימפה ccfDNA יכול לספק תובנה לגבי הרכב המערכות האקולוגיות של החוף הימי.בפרט, מצאנו כי 1) המולימפה של מולים מכילה ריכוזים גבוהים יחסית (רמות מיקרוגרם) של שברי DNA גדולים יחסית (~1-5 kb) במחזור;2) שברי ה-DNA הללו הם גם עצמאיים וגם לא עצמאיים. 3) בין המקורות הזרים של שברי ה-DNA הללו, מצאנו DNA של חיידקים, ארכאיים וויראליים, וכן DNA של בעלי חיים רב-תאיים אחרים;4) הצטברות של שברי ccfDNA זרים אלה בהמולימפה מתרחשת במהירות ותורמת לפעילות הסינון הפנימי של מולים.לסיכום, המחקר שלנו מדגים שהמושג LB, שיושם עד כה בעיקר בתחום הביו-רפואה, צופן למקור ידע עשיר אך לא נחקר שניתן להשתמש בו כדי להבין טוב יותר את האינטראקציה בין מיני זקיף וסביבתם.
בנוסף לפרימטים, בידוד ccfDNA דווח ביונקים, כולל עכברים, כלבים, חתולים וסוסים [50, 51, 52].עם זאת, למיטב ידיעתנו, המחקר שלנו הוא הראשון שמדווח על זיהוי ורצף של ccfDNA במינים ימיים עם מערכת מחזור פתוחה.תכונה אנטומית זו ויכולת הסינון של מולים עשויים, לפחות חלקית, להסביר את מאפייני הגודל השונים של שברי DNA במחזור בהשוואה למינים אחרים.בבני אדם, רוב שברי ה-DNA שמסתובבים בדם הם שברים קטנים בגודל של 150 עד 200 bp.עם שיא מקסימלי של 167 bp [34, 53].חלק קטן אך משמעותי של שברי DNA הם בגודל של בין 300 ל-500 bp, וכ-5% הם יותר מ-900 bp.[54].הסיבה להתפלגות גדלים זו היא שהמקור העיקרי של ccfDNA בפלזמה מתרחש כתוצאה ממוות תאי, בין אם עקב מוות תאי או עקב נמק של תאים המטופואטיים במחזור באנשים בריאים או עקב אפופטוזיס של תאי גידול בחולי סרטן (המכונה DNA במחזור הדם)., ctDNA).התפלגות הגודל של המולימפה ccfDNA שמצאנו במולים נעה בין 1000 ל-5000 bp, מה שמצביע על כך של-ccfDNA של מולים יש מקור שונה.זוהי השערה הגיונית, שכן למולים מערכת כלי דם פתוחה למחצה והם חיים בסביבות ימיות המכילות ריכוזים גבוהים של DNA גנומי מיקרוביאלי.למעשה, ניסויי המעבדה שלנו באמצעות DNA אקסוגני הראו כי מולים צוברים שברי DNA במי ים, לפחות לאחר מספר שעות הם מתכלים לאחר קליטה תאית ו/או משתחררים ו/או מאוחסנים בארגונים שונים.בהתחשב בנדירותם של תאים (הן פרוקריוטים והן אוקריוטיים), השימוש בתאים תוך מסתיים יקטין את כמות ה-ccfDNA ממקורות עצמיים כמו גם ממקורות זרים.בהתחשב בחשיבות החסינות המולדת של שני מסתיים והמספר הגדול של פגוציטים במחזור, שיערנו עוד שאפילו ccfDNA זר מועשר בפגוציטים במחזור שצוברים DNA זר עם בליעה של מיקרואורגניזמים ו/או פסולת תאים.ביחד, התוצאות שלנו מראות שה-ccfDNA של המולימפה דו-סתמית היא מאגר ייחודי של מידע מולקולרי ומחזקת את מעמדם כמין זקיף.
הנתונים שלנו מצביעים על כך שרצף וניתוח של שברי המולימפה ccfDNA שמקורם בחיידקים יכולים לספק מידע מפתח על פלורת החיידקים המארח והחיידקים הקיימים במערכת האקולוגית הימית שמסביב.טכניקות רצף זריקות חשפו רצפים של חיידקי הקומנסלי A. atra gill שהיו מתגעגעים אילו היו משתמשים בשיטות זיהוי קונבנציונליות של 16S rRNA, בין היתר בשל הטיית ספריית התייחסות.למעשה, השימוש שלנו בנתוני LB שנאספו מ-M. platensis באותה שכבת מולים ב-Kerguelen הראה שהרכב הסימביונטים של חיידקים הקשורים לזימים היה זהה עבור שני מיני מולים (איור S4, מידע משלים).דמיון זה של שני מולים שונים מבחינה גנטית עשוי לשקף את הרכבן של קהילות חיידקים במרבצים הקרים, הגפריתיים והוולקניים של Kerguelen [55, 56, 57, 58].רמות גבוהות יותר של מיקרואורגניזמים מפחיתי גופרית תוארו היטב בעת קצירת מולים מאזורי חוף מעורפלים [59], כגון החוף של פורט-או-פרנס.אפשרות נוספת היא שפלורת המולים הקומנלית עשויה להיות מושפעת מהעברה אופקית [60, 61].דרוש מחקר נוסף כדי לקבוע את המתאם בין הסביבה הימית, פני קרקעית הים והרכב החיידקים הסימביוטיים במולים.מחקרים אלו נמשכים כעת.
האורך והריכוז של המולימפה ccfDNA, קלות הטיהור שלו ואיכות גבוהה כדי לאפשר רצף מהיר של רובה ציד הם חלק מהיתרונות הרבים של שימוש ב-ccfDNA של מולים להערכת המגוון הביולוגי במערכות אקולוגיות של החוף הימי.גישה זו יעילה במיוחד לאפיון קהילות ויראליות (viromes) במערכת אקולוגית נתונה [62, 63].שלא כמו חיידקים, ארכאים ואוקריוטים, גנומים נגיפיים אינם מכילים גנים משומרים פילוגנטית כגון רצפי 16S.התוצאות שלנו מצביעות על כך שניתן להשתמש בביופסיות נוזליות ממינים אינדיקטורים כמו מולים כדי לזהות מספר גדול יחסית של שברי וירוס ccfDNA הידועים כמדביקים מארחים המאכלסים בדרך כלל מערכות אקולוגיות ימיות חופיות.זה כולל וירוסים הידועים כמדביקים פרוטוזואה, פרוקי רגליים, חרקים, צמחים ווירוסים חיידקיים (למשל, בקטריופאג'ים).התפלגות דומה נמצאה כאשר בדקנו את נגיף המולימפה ccfDNA של מולים כחולים (M. platensis) שנאספו באותה שכבת מולים ב- Kerguelen (טבלה S2, מידע משלים).רצף רובה ציד של ccfDNA הוא אכן גישה חדשה שצוברת תאוצה בחקר הווירום של בני אדם או מינים אחרים [21, 37, 64].גישה זו שימושית במיוחד לחקר נגיפי דנ"א דו-גדיליים, מכיוון שאף גן בודד לא נשמר בין כל נגיפי הדנ"א הדו-גדילים, המייצגים את המעמד המגוון והרחב ביותר של וירוסים בבולטימור [65].למרות שרוב הנגיפים הללו נותרים לא מסווגים ועשויים לכלול וירוסים מחלק לא ידוע לחלוטין של העולם הנגיפי [66], מצאנו שהווירוסים וטווחי המארח של המולים A. atra ו- M. platensis נופלים בין שני המינים.באופן דומה (ראה איור S3, מידע נוסף).דמיון זה אינו מפתיע, שכן הוא עשוי לשקף חוסר סלקטיביות בקליטת ה-DNA הקיים בסביבה.מחקרים עתידיים המשתמשים ב-RNA מטוהר דרושים כיום כדי לאפיין את וירום ה-RNA.
במחקר שלנו, השתמשנו בצינור קפדני מאוד המותאם מעבודתם של Kowarski ועמיתיו [37], שהשתמשו במחיקת דו-שלבים של קריאות וקבצים מצטברים לפני ואחרי הרכבה של ccfDNA מקורי, וכתוצאה מכך שיעור גבוה של קריאות לא ממופה.לכן, איננו יכולים לשלול שחלק מהקריאות הלא מפופות הללו עדיין עשויות להיות מקור משלהן, בעיקר בגלל שאין לנו גנום ייחוס לזן מולים זה.השתמשנו גם בצינור הזה מכיוון שהיינו מודאגים מהכימרות בין קריאה עצמית ולא-עצמית ואורכי הקריאה שנוצרו על ידי Illumina MiSeq PE75.סיבה נוספת לרוב הקריאות הבלתי ידועות היא שרוב החיידקים הימיים, במיוחד באזורים מרוחקים כמו Kerguelen, לא עברו הערות.השתמשנו ב- Illumina MiSeq PE75, בהנחה שאורכים של קטעי ccfDNA דומים ל-ccfDNA האנושי.עבור מחקרים עתידיים, בהתחשב בתוצאות שלנו המראות של-hemolymph ccfDNA יש קריאות ארוכות יותר מאשר לבני אדם ו/או יונקים, אנו ממליצים להשתמש בפלטפורמת רצף המתאימה יותר לשברי ccfDNA ארוכים יותר.תרגול זה יקל הרבה יותר על זיהוי אינדיקציות נוספות לניתוח מעמיק יותר.השגת רצף הגנום הגרעיני המלא A. atra, שאינו זמין כעת, תקל מאוד על ההבחנה של ccfDNA ממקורות עצמיים ומקורות שאינם עצמיים.בהתחשב בעובדה שהמחקר שלנו התמקד באפשרות ליישם את הרעיון של ביופסיה נוזלית על מולים, אנו מקווים שככל שמושג זה ישמש במחקר עתידי, יפותחו כלים וצינורות חדשים כדי להגדיל את הפוטנציאל של שיטה זו לחקור את המגוון המיקרוביאלי של מולים.מערכת אקולוגית ימית.
כסמן ביולוגי קליני לא פולשני, רמות גבוהות של ccfDNA בפלזמה אנושית קשורות למחלות שונות, נזק לרקמות ומצבי לחץ [67,68,69].עלייה זו קשורה לשחרור שברי DNA ממקורו לאחר נזק לרקמות.התייחסנו לנושא זה באמצעות לחץ חום חריף, שבו מולים נחשפו לזמן קצר לטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.ביצענו ניתוח זה על שלושה סוגים שונים של מולים בשלושה ניסויים עצמאיים.עם זאת, לא מצאנו שום שינוי ברמות ccfDNA לאחר לחץ חום חריף (ראה איור S5, מידע נוסף).תגלית זו עשויה להסביר, לפחות חלקית, את העובדה שלמולים יש מערכת זרימת דם פתוחה למחצה והם צוברים כמויות גדולות של DNA זר בשל פעילות הסינון הגבוהה שלהם.מצד שני, מולים, כמו חסרי חוליות רבים, עשויים להיות עמידים יותר בפני נזק לרקמות שנגרם כתוצאה מלחץ, ובכך להגביל את שחרור ccfDNA בהמולימפה שלהם [70, 71].
עד כה, ניתוח DNA של המגוון הביולוגי במערכות אקולוגיות מימיות התמקד בעיקר במטא-ברקוד של DNA (eDNA).עם זאת, שיטה זו מוגבלת בדרך כלל בניתוח המגוון הביולוגי כאשר משתמשים בפריימרים.השימוש ברצף רובה ציד עוקף את מגבלות ה-PCR ואת הבחירה המוטה של ​​ערכות פריימר.לפיכך, במובן מסוים, השיטה שלנו קרובה יותר לשיטת ריצוף eDNA Shotgun בתפוקה גבוהה יותר, המסוגלת לבצע רצף ישיר של DNA מקוטע ולנתח כמעט את כל האורגניזמים [72, 73].עם זאת, ישנן מספר בעיות יסוד המבדילות את LB משיטות eDNA סטנדרטיות.כמובן, ההבדל העיקרי בין eDNA ל-LB הוא השימוש במארחים מסננים טבעיים.דווח על השימוש במינים ימיים כגון ספוגים ושניסתיים (Dresseina spp.) כמסנן טבעי לחקר eDNA [74, 75].עם זאת, המחקר של דרייסנה השתמש בביופסיות רקמה שמהן הופק DNA.ניתוח ccfDNA מ-LB אינו מצריך ביופסיית רקמות, ציוד מיוחד ולעתים יקר ולוגיסטיקה הקשורים ל-eDNA או ביופסיית רקמה.למעשה, לאחרונה דיווחנו שניתן לאחסן ולנתח ccfDNA מ-LB עם תמיכת FTA מבלי לשמור על שרשרת קרה, שהיא אתגר מרכזי למחקר באזורים מרוחקים [76].החילוץ של ccfDNA מביופסיות נוזליות הוא גם פשוט ומספק DNA באיכות גבוהה לרצף רובה ציד וניתוח PCR.זהו יתרון גדול בהתחשב בחלק מהמגבלות הטכניות הקשורות בניתוח eDNA [77].הפשטות והעלות הנמוכה של שיטת הדגימה מתאימה במיוחד גם לתוכניות ניטור ארוכות טווח.בנוסף ליכולת הסינון הגבוהה שלהן, תכונה ידועה נוספת של דו מסתיים היא הרכב המוקופוליסכריד הכימי של הריר שלהן, המקדם את ספיגת הנגיפים [78, 79].זה הופך את הביסתיים למסנן טבעי אידיאלי לאפיון המגוון הביולוגי וההשפעה של שינויי אקלים במערכת אקולוגית מימית נתונה.למרות שניתן לראות בנוכחות של שברי DNA שמקורו מארח כמגבלה של השיטה בהשוואה ל-eDNA, העלות הכרוכה בקיום ccfDNA מקורי שכזה בהשוואה ל-eDNA מובנת בו-זמנית עבור הכמות העצומה של המידע הזמין למחקרי בריאות.מארח אופסט.זה כולל נוכחות של רצפים ויראליים המשולבים בגנום של המארח המארח.זה חשוב במיוחד עבור מולים, בהתחשב בנוכחותם של נגיפי רטרו-לוקמיים המועברים בצורה אופקית בביסתיים [80, 81].יתרון נוסף של LB על פני eDNA הוא בכך שהוא מנצל את הפעילות הפאגוציטית של תאי דם במחזור הדם בהמולימפה, הבולעת מיקרואורגניזמים (והגנום שלהם).פגוציטוזיס היא התפקוד העיקרי של תאי דם בשתיים [82].לבסוף, השיטה מנצלת את יכולת הסינון הגבוהה של מולים (ממוצע של 1.5 ליטר לשעה של מי ים) ומחזור של יומיים, אשר מגבירים את הערבוב של שכבות שונות של מי ים, ומאפשרים לכידת eDNA הטרולוגי.[83, 84].לפיכך, ניתוח ccfDNA של מולים הוא דרך מעניינת בהתחשב בהשפעות התזונתיות, הכלכליות והסביבתיות של מולים.בדומה לניתוח של LB שנאסף מבני אדם, שיטה זו פותחת גם את האפשרות למדוד שינויים גנטיים ואפיגנטיים ב-DNA המארח בתגובה לחומרים אקסוגניים.לדוגמה, ניתן לחזות בטכנולוגיות רצף מהדור השלישי לביצוע ניתוח מתילציה בכל הגנום ב-ccfDNA מקורי באמצעות רצף ננופורי.יש להקל על תהליך זה על ידי העובדה שאורכם של שברי ccfDNA של מולים תואם באופן אידיאלי לפלטפורמות רצף ארוכות קריאה המאפשרות ניתוח מתילציה של DNA לכל אורך הגנום מתוך ריצת רצף בודדת ללא צורך בטרנספורמציות כימיות.לכן, זה יכול לספק תובנה חשובה לגבי המנגנונים הבסיסיים השולטים בתגובה לאחר חשיפה לשינויי אקלים או מזהמים [87].עם זאת, השימוש ב-LB אינו חף ממגבלות.מיותר לציין שזה מצריך נוכחות של מיני אינדיקטור במערכת האקולוגית.כפי שהוזכר לעיל, שימוש ב-LB כדי להעריך את המגוון הביולוגי של מערכת אקולוגית נתונה דורש גם צינור ביואינפורמטיקה קפדני שלוקח בחשבון את נוכחותם של שברי DNA מהמקור.בעיה מרכזית נוספת היא הזמינות של גנומים ייחוסים למינים ימיים.יש לקוות שיוזמות כמו פרויקט הגנום של יונקים ימיים ופרויקט Fish10k שהוקם לאחרונה [88] יאפשרו ניתוח כזה בעתיד.היישום של תפיסת ה-LB על אורגניזמים הניזונים מסננים ימיים תואם גם את ההתקדמות העדכנית ביותר בטכנולוגיית רצף, מה שהופך אותו למתאים היטב לפיתוח של סמנים ביולוגיים מרובי אוהם כדי לספק מידע חשוב על בריאותם של בתי גידול ימיים בתגובה ללחץ סביבתי.
נתוני רצף הגנום הופקדו בארכיון רצף הקריאה של NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 תחת Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ השפעת שינויי האקלים על החיים הימיים ומערכות אקולוגיות.קול ביולוגיה.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.שקול את ההשפעות המשולבות של שינויי אקלים וגורמי לחץ מקומיים אחרים על הסביבה הימית.סביבה מדעית כללית.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).המדע של הראשון במרץ.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. סבילות מופחתת לחום בתנאי לחץ חום חוזרים מסבירים את התמותה הגבוהה בקיץ של מולים כחולים.דו"ח מדעי 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.שינויים אחרונים בתדירות, בגורמים ובהיקף של מקרי מוות של בעלי חיים.Proc Natl Acad Sci ארה"ב.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.מספר פתוגנים שאינם ספציפיים למין עשויים לגרום לתמותה המונית של Pinna nobilis.חַיִים.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.השפעה פוטנציאלית של שינויי אקלים על מחלות זואונוטיות בארקטיות.Int J בריאות Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.מולים כחולים (Mytilus edulis spp.) כאורגניזמים אות בניטור זיהום חופי: סקירה.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. שילוב של ביופסיה נוזלית בטיפול בסרטן.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.הבשלת ביופסיה נוזלית: מאפשרת ל-DNA של הגידול להסתובב.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. חומצות גרעין בפלזמה אנושית.פרוטוקול הישיבה של חברות הבת של Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. תפקיד חדש ל-DNA נטול תאים כסמן מולקולרי לטיפול בסרטן.כימות של ניתוח ביומולרי.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS ביופסיה נוזלית נכנסת למרפאה - בעיות יישום ואתגרים עתידיים.נאט ר' קלינ אונקול.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ואחרים.DNA עוברי קיים בפלזמה ובנסיוב של האם.אִזְמֵל.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR מחקר על מהלך ההריון וסיבוכיו באמצעות RNA חוץ תאי במחזור הדם של נשים במהלך ההריון.דופדיאטריה.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.ביופסיה נוזלית: DNA ללא תאי תורם משמש לזיהוי נגעים אלוגניים בהשתלת כליה.נט ר' נפרול.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM חידושים באבחון טרום לידתי: רצף גנום פלזמה אימהי.אנה MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.זיהוי מהיר של פתוגנים עם רצף מטאנומי מהדור הבא של נוזלי גוף נגועים.נאט רפואה.2021;27:115-24.