תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
פוריותן של ציפורים תלויה ביכולתן לאחסן מספיק זרע בר-קיימא למשך זמן ממושך בצינורות אחסון הזרע (SST). המנגנון המדויק שבו תאי זרע נכנסים, שוהים ויוצאים מה-SST נותר שנוי במחלוקת. זרען של תרנגולות שרקאסי הראה נטייה גבוהה להתלכדות, ויוצר צרורות ניידים סיביים המכילים תאים רבים. בשל הקושי לצפות בתנועתיות ובהתנהגות של תאי זרע בחצוצרה אטומה, השתמשנו במכשיר מיקרופלואידי בעל חתך רוחב של מיקרו-תעלה הדומה לזה של תאי זרע כדי לחקור את התלכדות ותנועתיותם של תאי זרע. מחקר זה דן כיצד נוצרות צרורות זרע, כיצד הן נעות, ותפקידן האפשרי בהארכת שהות הזרע ב-SST. חקרנו את מהירות הזרע ואת ההתנהגות הריאולוגית כאשר זרימת נוזלים נוצרת בתוך תעלה מיקרופלואידית על ידי לחץ הידרוסטטי (קצב זרימה = 33 מיקרומטר/שנייה). תאי הזרע נוטים לשחות נגד הזרם (ריאולוגיה חיובית) ומהירות צרור תאי הזרע מופחתת משמעותית בהשוואה לתאי זרע בודדים. נצפו צרורות זרע נעים בספירלה ועולים באורכם ובעובים ככל שמגויסים יותר זרעונים בודדים. צרורות זרע נצפו מתקרבים ונצמדים לדפנות הצדדיות של תעלות המיקרופלואידים כדי להימנע מלהיסחף במהירות זרימת נוזל > 33 מיקרומטר/שנייה. צרורות זרע נצפו מתקרבים ונצמדים לדפנות הצדדיות של תעלות המיקרופלואידים כדי להימנע מלהיסחף במהירות זרימת נוזל > 33 מיקרומטר/שנייה. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюкаюных, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. צרורות זרע נצפו מתקרבים ונצמדים לדפנות הצדדיות של תעלות המיקרופלואידים כדי להימנע מלהיסחף בקצבי זרימת נוזלים >33 מיקרומטר/שנייה.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 ש'33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. צרורות זרע נצפו מתקרבים ונצמדים לדפנות הצדדיות של תעלת המיקרופלואידים כדי להימנע מלהיסחף על ידי זרימת נוזלים בקצב של >33 מיקרומטר/שנייה.מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ומיקרוסקופ אלקטרונים חודר גילו כי צרורות הזרע נתמכו על ידי חומר צפוף בשפע. הנתונים שהתקבלו מדגימים את הניידות הייחודית של תאי זרע של עוף שרקאזי, כמו גם את יכולתם של תאי הזרע להתלכד וליצור צרורות ניידים, דבר התורם להבנה טובה יותר של אחסון ארוך טווח של תאי זרע ב-SMT.
כדי להשיג הפריה בבני אדם וברוב בעלי החיים, זרע וביצים חייבים להגיע לאתר ההפריה בזמן הנכון. לכן, ההזדווגות חייבת להתרחש לפני או בזמן הביוץ. מצד שני, חלק מהיונקים, כמו כלבים, כמו גם מינים שאינם יונקים, כמו חרקים, דגים, זוחלים וציפורים, מאחסנים זרע באיברי הרבייה שלהם למשך תקופה ממושכת עד שביציהן מוכנות להפריה (הפריה אסינכרונית 1). ציפורים מסוגלות לשמור על קיומם של תאי זרע המסוגלים להפרות ביצים למשך 2-10 שבועות 2.
זהו מאפיין ייחודי המבדיל ציפורים מבעלי חיים אחרים, שכן הוא מספק סבירות גבוהה להפריה לאחר הזרעה אחת במשך מספר שבועות ללא הזדווגות וביוץ בו זמנית. איבר אחסון הזרע העיקרי, הנקרא צינור אחסון הזרע (SST), ממוקם בקפלים הריריים הפנימיים בצומת הרחם-ווגינלי. עד כה, המנגנונים שבאמצעותם זרע נכנס, שוכן ויוצא מבנק הזרע אינם מובנים במלואם. בהתבסס על מחקרים קודמים, הועלו השערות רבות, אך אף אחת מהן לא אושרה.
פורמן4 שיער כי תאי זרע שומרים על מקום מגוריהם בחלל תאי האפיתל של ה-SST באמצעות תנועה תנודתית מתמשכת כנגד כיוון זרימת הנוזל דרך תעלות חלבון הממוקמות על תאי אפיתל של ה-SST (ריאולוגיה). ATP מתדלדל עקב פעילות הדגל המתמדת הדרושה כדי לשמור על תאי הזרע בלומן של ה-SST והתנועתיות יורדת בסופו של דבר עד שהזרעים נישאים מבנק הזרע על ידי זרימת נוזלים ומתחילים מסע חדש במורד החצוצרה העולה כדי להפרות את הזרע. ביצה (פורמן4). מודל זה של אחסון זרע נתמך על ידי זיהוי באמצעות אימונוציטוכימיה של אקוופורינים 2, 3 ו-9 הקיימים בתאי אפיתל של ה-SST. נכון להיום, חסרים מחקרים על ריאולוגיה של זרע תרנגולות ותפקידה באחסון ה-SST, ברירת זרע בנרתיק ותחרות זרע. אצל תרנגולות, זרע נכנס לנרתיק לאחר הזדווגות טבעית, אך יותר מ-80% מהזרעים נפלטים מהנרתיק זמן קצר לאחר ההזדווגות. ממצא זה מצביע על כך שהנרתיק הוא האתר העיקרי לברירת זרע אצל ציפורים. בנוסף, דווח כי פחות מ-1% מהזרעונים המופרים בנרתיק מגיעים בסופו של דבר לתאי זרע מסוג SST2. בהזרעה מלאכותית של אפרוחים בנרתיק, מספר הזרעונים המגיעים ל-SST נוטה לעלות 24 שעות לאחר ההזרעה. עד כה, מנגנון ברירת הזרע במהלך תהליך זה אינו ברור, ותנועתיות הזרע עשויה למלא תפקיד חשוב בקליטת זרע מסוג SST. בשל הדפנות העבות והאטומות של החצוצרות, קשה לנטר ישירות את תנועתיות הזרע בחצוצרות של ציפורים. לכן, חסר לנו ידע בסיסי על אופן המעבר של זרעונים לתאי זרע מסוג SST לאחר הפריה.
לאחרונה הוכרה ריאולוגיה כגורם חשוב השולט במעבר זרע באיברי המין של יונקים. בהתבסס על יכולתם של תאי זרע ניידים לנדוד בכיוון נגד הזרם, זפרני ועמיתיו השתמשו במערכת מיקרופלואידית מסוג corra כדי לבודד באופן פסיבי תאי זרע ניידים מדגימות זרע כלואות. סוג זה של מיון זרע חיוני לטיפול רפואי בפוריות ולמחקר קליני, והוא עדיף על פני שיטות מסורתיות הדורשות זמן ועבודה עתירות ויכולות לפגוע במורפולוגיה ובשלמות המבנית של הזרע. עם זאת, עד כה, לא נערכו מחקרים על השפעת הפרשות מאיברי המין של תרנגולות על תנועתיות הזרע.
ללא קשר למנגנון ששומר על אחסון תאי זרע ב-SST, חוקרים רבים הבחינו כי תאי זרע מקומיים נקשרים ראש בראש ב-SST של תרנגולות 9, 10, שליו 2 ותרנגולי הודו 11 ויוצרים צרורות זרע נקשרים. המחברים מציעים כי קיים קשר בין נקטר זה לבין אחסון ארוך טווח של תאי זרע ב-SST.
טינגארי ולייק12 דיווחו על קשר חזק בין תאי זרע בבלוטה קולטת הזרע של העוף ותהו האם תאי זרע של עופות מתקבצים באותו אופן כמו תאי זרע של יונקים. הם סבורים שהקשרים העמוקים בין תאי זרע בצינור הזרע עשויים לנבוע מהלחץ הנגרם מנוכחות מספר רב של תאי זרע בחלל קטן.
כאשר מעריכים את התנהגות תאי הזרע על גבי שקופיות זכוכית תלויות טריות, ניתן לראות סימנים חולפים של התלכדות, במיוחד בקצוות טיפות הזרע. עם זאת, ההתלכדות הופרעה לעיתים קרובות על ידי הפעולה הסיבובית הקשורה לתנועה מתמשכת, מה שמסביר את האופי החולף של תופעה זו. החוקרים שמו לב גם שכאשר הוסיפו את המדלל לזרע, הופיעו צבירי תאים מוארכים "דמויי חוט".
ניסיונות מוקדמים לחקות תא זרע נעשו על ידי הסרת חוט דק מטיפה תלויה, מה שהוביל ליצירת שלפוחית ​​מוארכת דמוית זרע הבולטת מטיפת הזרע. תאי הזרע הסתדרו מיד בצורה מקבילה בתוך השלפוחית, אך היחידה כולה נעלמה במהירות עקב המגבלה התלת-ממדית. לכן, כדי לחקור את תהליך ההצטברות של תאי זרע, יש צורך לצפות בתנועתיות ובהתנהגות של תאי זרע ישירות בתוך צינורות אחסון זרע מבודדים, דבר שקשה להשיג. לכן, יש צורך לפתח מכשיר המחקה תאי זרע כדי לתמוך במחקרים של תנועתיות והתנהגות הצטברות של תאי זרע. ברילארד ועמיתיו דיווחו כי האורך הממוצע של צינורות אחסון זרע באפרוחים בוגרים הוא 400-600 מיקרומטר, אך חלק מצינורות ה-SST יכולים להיות באורך של עד 2000 מיקרומטר. מרו ואוגאסווארה14 חילקו את בלוטות הזרע לצינורות אחסון זרע מוגדלים ולא מוגדלים, שתיהן זהות באורך (~500 מיקרומטר) וברוחב הצוואר (~38 מיקרומטר), אך קוטר החלל הממוצע של הצינורות היה 56.6 ו-56.6 מיקרומטר, בהתאמה 11.2 מיקרומטר. במחקר הנוכחי, השתמשנו במכשיר מיקרופלואידי בעל גודל תעלה של 200 מיקרומטר × 20 מיקרומטר (רוחב × גובה), שחתך הרוחב שלו קרוב במידה מסוימת לזה של ה-SST המוגבר. בנוסף, בדקנו את תנועתיות הזרע והתנהגות ההצטברות בנוזל זורם, דבר התואם את השערתו של פורמן לפיה נוזל המיוצר על ידי תאי אפיתל SST שומר על הזרע בלומן בכיוון נגדי (ריאולוגי).
מטרת מחקר זה הייתה להתגבר על הבעיות הכרוכים בתצפית על תנועתיות תאי זרע בחצוצרה ולהימנע מהקשיים הכרוכים בחקר הריאולוגיה וההתנהגות של תאי זרע בסביבה דינמית. נעשה שימוש במכשיר מיקרופלואידי היוצר לחץ הידרוסטטי כדי לדמות תנועתיות תאי זרע באיברי המין של תרנגולת.
כאשר טיפה של דגימת זרע מדוללת (1:40) הועמסה לתוך המכשיר המיקרו-תעלה, ניתן היה לזהות שני סוגים של תנועתיות זרע (זרע מבודד וזרע קשור). בנוסף, תאי הזרע נטו לשחות נגד הזרם (ריאולוגיה חיובית; סרטון 1, 2). למרות שלצרורות זרע הייתה מהירות נמוכה יותר מזו של זרע בודד (p < 0.001), הם הגדילו את אחוז הזרע שהציג ריוטקסיס חיובי (p < 0.001; טבלה 2). למרות שלצרורות זרע הייתה מהירות נמוכה יותר מזו של זרע בודד (p < 0.001), הם הגדילו את אחוז הזרע שהציג ריוטקסיס חיובי (p < 0.001; טבלה 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), ливи сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). למרות שלצרורות הזרע הייתה מהירות נמוכה יותר מזו של תאי זרע בודדים (p < 0.001), הם הגדילו את אחוז תאי הזרע שהראו ריוטקסיס חיובי (p < 0.001; טבלה 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 昧 倧倲礧 逳百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。）)）))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличиви сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). למרות שמהירות צרורות הזרע הייתה נמוכה יותר מזו של תאי זרע בודדים (p < 0.001), הם הגדילו את אחוז תאי הזרע עם ריאולוגיה חיובית (p < 0.001; טבלה 2).ריאולוגיה חיובית עבור תאי זרע בודדים ותאי זרע מוערכת בכ-53% ו-85%, בהתאמה.
נצפה כי תאי הזרע של תרנגולות שרקאשי מיד לאחר השפיכה יוצרים צרורות ליניאריים, המורכבים מעשרות פרטים. צרורות אלו גדלים באורכם ובעובים עם הזמן ויכולים להישאר במבחנה במשך מספר שעות לפני שהם מתפוגגים (סרטון 3). צרורות חוטיים אלו מעוצבים כמו תאי זרע של אכידנה הנוצרים בקצה האפידידימיס. נמצא כי לזרע של תרנגולת שרקאשי יש נטייה גבוהה להתקבץ וליצור צרור רשתי בפחות מדקה לאחר האיסוף. אלומות אלו דינמיות ויכולות להידבק לכל קירות או חפצים סטטיים בקרבת מקום. למרות שצרורות זרע מפחיתים את מהירות תאי הזרע, ברור שמבחינה מקרוסקופית הן מגדילות את הלינאריות שלהן. אורך הצרורות משתנה בהתאם למספר הזרעים שנאספו בצרורות. בודדו שני חלקים של הצרור: החלק הראשוני, הכולל את הראש החופשי של הזרע המגודר, והחלק הסופי, הכולל את הזנב ואת כל הקצה הדיסטלי של הזרע. באמצעות מצלמה במהירות גבוהה (950 פריימים לשנייה), נצפו ראשים חופשיים של תאי זרע מצוברים בחלק הראשוני של הצרור, האחראים לתנועת הצרור עקב תנועתם התנודתית, וגררו את הנותרים לתוך הצרור בתנועה סלילית (וידאו 4). עם זאת, בקבוצות זרע ארוכות, נצפה שכמה ראשי זרע חופשיים דבוקים לגוף והחלק הסופי של הקבוצה משמשים כלונסאות המסייעות להניע את הקבוצה.
בזמן זרימה איטית של נוזל, צרורות הזרע נעים במקביל זה לזה, אולם הם מתחילים לחפוף ולהידבק לכל מה שדומם, כדי לא להישטף על ידי הזרימה הנוכחית ככל שמהירות הזרימה עולה. הצרורות נוצרים כאשר קומץ תאי זרע מתקרבים זה לזה, הם מתחילים לנוע בסנכרון ולעטוף זה את זה, ואז נדבקים לחומר דביק. איורים 1 ו-2 מראים כיצד תאי הזרע מתקרבים זה לזה, ויוצרים צומת כאשר הזנבות עוטפים זה את זה.
החוקרים הפעילו לחץ הידרוסטטי כדי ליצור זרימת נוזלים במיקרו-תעלה כדי לחקור את הריאולוגיה של תאי הזרע. נעשה שימוש במיקרו-תעלה בגודל 200 מיקרומטר × 20 מיקרומטר (רוחב × גובה) ובאורך של 3.6 מיקרומטר. נעשה שימוש במיקרו-תעלות בין המיכלים עם מזרקים המותקנים בקצוות. צבעי מאכל שימשו כדי להפוך את התעלות לגלויות יותר.
קשרו כבלי חיבור ואביזרים לקיר. הסרטון צולם במיקרוסקופ ניגוד פאזה. עם כל תמונה מוצגות תמונות מיקרוסקופ ניגוד פאזה ותמונות מיפוי. (א) החיבור בין שני זרמים מתנגד לזרימה עקב תנועה סלילית (חץ אדום). (ב) החיבור בין צרור הצינור לדופן התעלה (חיצים אדומים), בו זמנית הם מחוברים לשתי צרורות אחרות (חיצים צהובים). (ג) צרורות זרע בתעלה המיקרופלואידית מתחילות להתחבר זו לזו (חיצים אדומים), ויוצרות רשת של צרורות זרע. (ד) היווצרות רשת של צרורות זרע.
כאשר טיפה של זרע מדולל הועמסה לתוך המכשיר המיקרופלואידי ונוצרה זרימה, נצפתה אלומת הזרע נעה נגד כיוון הזרימה. הצירים מתאימים היטב לדפנות המיקרו-תעלות, והראשים החופשיים בחלק הראשוני של הצירים מתאימים היטב אליהם (סרטון 5). הם גם נדבקים לכל חלקיקים נייחים בדרכם, כגון פסולת, כדי להתנגד להיסחף על ידי הזרם. עם הזמן, ציציות אלו הופכות לחוטים ארוכים הלוכדים תאי זרע בודדים אחרים וציציות קצרות יותר (סרטון 6). ככל שהזרימה מתחילה להאט, שורות ארוכות של זרע מתחילות ליצור רשת של קווי זרע (סרטון 7; איור 2).
במהירות זרימה גבוהה (V > 33 מיקרומטר/שנייה), התנועות הספירליות של החוטים מוגברות בניסיון לתפוס צרורות זרע רבים היוצרים זרע כדי להתנגד טוב יותר לכוח הסחיפה של הזרימה. במהירות זרימה גבוהה (V > 33 מיקרומטר/שנייה), התנועות הספירליות של החוטים מוגברות בניסיון לתפוס צרורות זרע רבים היוצרים זרע כדי להתנגד טוב יותר לכוח הסחיפה של הזרימה. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку опытаю множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующих силей. בקצבי זרימה גבוהים (V > 33 מיקרומטר/שנייה), התנועות הסליליות של הגדילים גוברות כשהן מנסות לתפוס תאי זרע בודדים רבים ויוצרות צרורות המסוגלים טוב יותר להתנגד לכוח הסחף של הזרימה.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 缾坟 形成 澍从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захть отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. בקצבי זרימה גבוהים (V > 33 מיקרומטר/שנייה), התנועה הסלילית של הסיבים גוברת בניסיון ללכוד תאי זרע רבים היוצרים צרורות כדי להתנגד טוב יותר לכוחות הסחיפה של הזרימה.הם גם ניסו לחבר מיקרו-תעלות לדפנות הצדדיות.
צרורות זרע זוהו כאשכולות של ראשי זרע וזנבות מסתלסלים באמצעות מיקרוסקופ אור (LM). צרורות זרע עם מגוון אגרגטים זוהו גם כראשים מעוותים וצבריגדי שוטון, זנבות זרע מרובים שהתמזגו, ראשי זרע המחוברים לזנב, וראשי זרע עם גרעינים כפופים כגרעינים מרובים שהתמזגו. מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM). מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הראתה כי צרורות הזרע היו אגרגטים עטופים של ראשי זרע וצבריגי הזרע הראו רשת מחוברת של זנבות עטופים.
המורפולוגיה והאולטרה-מבנה של תאי זרע, היווצרות צרורות תאי זרע נחקרו באמצעות מיקרוסקופיית אור (חצי חתך), מיקרוסקופיית אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופיית אלקטרונים חודר (TEM), מריחות זרע נצבעו בכתום אקרידין ונבדקו באמצעות מיקרוסקופיית אפיפלואורסצנציה.
צביעת משטח זרע עם אקרידין כתום (איור 3B) הראתה שראשי תאי הזרע היו דבוקים זה לזה ומכוסים בחומר הפרשה, מה שהוביל להיווצרות גושי זרע גדולים (איור 3D). צרורות הזרע הורכבו מצרפי זרע עם רשת של זנבות מחוברים (איור 4A-C). צרורות זרע מורכבים מזנבות של תאי זרע רבים הדבוקים זה לזה (איור 4D). סודות (איור 4E,F) כיסו את ראשי צרורות תאי הזרע.
היווצרות צרור תאי הזרע באמצעות מיקרוסקופיית ניגוד פאזה ומשטחי זרע צבועים באקרידין כתום, הראו שראשי תאי הזרע נדבקים זה לזה. (א) היווצרות מוקדמת של ציצית זרע מתחילה עם זרע אחד (עיגול לבן) ושלושה זרעונים (עיגול צהוב), כאשר הספירלה מתחילה בזנב ומסתיימת בראש. (ב) פוטומיקרוגרפיה של משטח זרע צבוע באקרידין כתום המציגה ראשי זרע דבוקים (חיצים). הפריקה מכסה את הראש/ים. הגדלה × 1000. (ג) התפתחות של קרן גדולה המועברת על ידי זרימה בתעלה מיקרופלואידית (באמצעות מצלמה במהירות גבוהה ב-950 פריימים לשנייה). (ד) מיקרוסקופיה של משטח זרע צבוע באקרידין כתום המציג ציצית גדולה (חיצים). הגדלה: ×200.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של קרן זרע ומשטח זרע צבוע בכתום אקרידין. (A, B, D, E) הן מיקרוסקופ אלקטרונים סורק דיגיטלי בצבע של תאי זרע, ו-C ו-F הן מיקרוסקופיות של משטחי זרע צבועים בכתום אקרידין המראות הצמדות של תאי זרע מרובים העוטפים את רשת הזנב. (AC) צבירי זרע מוצגים כרשת של זנבות מחוברים (חיצים). (D) הידבקות של מספר תאי זרע (עם חומר דבק, מתאר ורוד, חץ) עוטפים את הזנב. (E ו-F) צבירי ראשי זרע (מצביעים) מכוסים בחומר דבק (מצביעים). תאי הזרע יצרו צרורות עם מספר מבנים דמויי מערבולת. (F). הגדלות (C) ×400 ו-(F) ×200.
באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר, מצאנו כי לחבילות הזרע היו זנבות מחוברים (איור 6A, C), ראשים מחוברים לזנבות (איור 6B), או ראשים מחוברים לזנבות (איור 6D). ראשי תאי הזרע בצרור מעוקלים, ומוצגים בחתך שני אזורים גרעיניים (איור 6D). בצרור החתך, לזרע היה ראש מעוות עם שני אזורי גרעין ואזורי שוטונים מרובים (איור 5A).
מיקרוסקופ אלקטרונים צבעוני דיגיטלי המציג את הזנבות המחברים בצרור הזרע ואת החומר המאגד המחבר את ראשי הזרע. (א) זנב מחובר של מספר רב של תאי זרע. שימו לב כיצד הזנב נראה הן בהקרנה אופקית (חץ) והן בהקרנה לרוחב (חץ). (ב) ראש הזרע (חץ) מחובר לזנב (חץ). (ג) מספר זנבות זרע (חיצים) מחוברים. (ד) חומר אגלוטינציה (AS, כחול) מחבר ארבעה ראשי זרע (סגול).
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק שימש לגילוי ראשי זרע בצרורות זרע המכוסים בהפרשות או ממברנות (איור 6B), דבר המצביע על כך שצרורות הזרע עוגנו על ידי חומר חוץ-תאי. החומר המגודר התרכז בראש הזרע (מכלול דמוי ראש מדוזה; איור 5B) והתרחב לדיסטלית, מה שנתן מראה צהוב בוהק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כאשר נצבע בכתום אקרידין (איור 6C). חומר זה נראה בבירור תחת מיקרוסקופ סורק ונחשב לחומר מקשר. חתכים דקים למחצה (איור 5C) ומשטחי זרע מוכתמים בכתום אקרידין הראו צרורות זרע המכילים ראשים דחוסים וזנבות מסולסלים (איור 5D).
מגוון פוטומיקרוסקופים המציגים צבירת ראשי זרע וזנבות מקופלים בשיטות שונות. (א) מיקרוסקופ אלקטרונים דיגיטלי בצבע חתך רוחב של צרור זרע המציג ראש זרע מפותל עם גרעין דו-חלקי (כחול) וכמה חלקים דמויי שוטון (ירוק). (ב) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק דיגיטלי בצבע המציג צביר של ראשי זרע דמויי מדוזות (חיצים) שנראים מכוסים. (ג) חתך דק למחצה המציג ראשי זרע צבורים (חיצים) וזנבות מסולסלים (חיצים). (ד) מיקרוסקופ של משטח זרע צבוע בכתום אקרידין המציג צבירת ראשי זרע (חיצים) וזנבות מסולסלים דבוקים (חיצים). שימו לב שחומר דביק (S) מכסה את ראש תא הזרע. (ד) הגדלה של × 1000.
באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (איור 7A), צוין גם שראשי הזרע היו מעוותים והגרעינים היו בעלי צורה ספירלית, כפי שאושר על ידי מריחות זרע צבועות בתפוז אקרידין ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 7B).
(א) מיקרוסקופ אלקטרונים דיגיטלי צבעוני ו-(ב) משטח זרע בצבע אקרידין כתום המציג ראשים מפותלים וחיבור ראשי וזנבות זרע (חיצים). (ב) הגדלה × 1000.
ממצא מעניין הוא שזרעו של שרקאזי מתקבץ ויוצר צרורות סיבים ניידים. תכונותיהם של צרורות אלו מאפשרות לנו להבין את תפקידם האפשרי בקליטה ובאחסון של תאי זרע בתאי ה-SST.
לאחר ההזדווגות, תאי הזרע נכנסים לנרתיק ועוברים תהליך סלקציה אינטנסיבי, וכתוצאה מכך רק מספר מוגבל של תאי זרע נכנסים לתא הזרע הפתוח (SST)15,16. נכון להיום, המנגנונים שבאמצעותם תאי זרע נכנסים ויוצאים מה-SST אינם ברורים. אצל עופות, תאי זרע מאוחסנים בתא הזרע הפתוח (SST) למשך תקופה ממושכת של שבועיים עד עשרה שבועות, תלוי במין6. נותרה מחלוקת לגבי מצב הזרע במהלך האחסון בתא הזרע הפתוח. האם הם בתנועה או במנוחה? במילים אחרות, כיצד תאי זרע שומרים על מיקומם בתא הזרע הפתוח למשך זמן כה רב?
פורמן4 הציע שניתן להסביר את שהיית תאי הזרע והפליטה שלהם במונחים של תנועתיות תאי זרע. המחברים משערים שזרעונים שומרים על מיקומם על ידי שחייה נגד זרימת הנוזלים שנוצרת על ידי אפיתל ה-SST, וכי זרעונים נפלטים מה-SST כאשר מהירותם יורדת מתחת לנקודה שבה הם מתחילים לנוע אחורה עקב חוסר אנרגיה. זניבוני5 אישר את נוכחותם של אקוופורינים 2, 3 ו-9 בחלק האפיקלי של תאי האפיתל של SST, דבר שעשוי לתמוך בעקיפין במודל אחסון הזרע של פורמן. במחקר הנוכחי, מצאנו שכמעט מחצית מתאי הזרע של שרקאשי מראים ריאולוגיה חיובית בנוזל הזורם, וכי צרורות זרע מצומצמים מגדילים את מספר תאי הזרע המראים ריאולוגיה חיובית, אם כי הצמדה מאטה אותם. האופן שבו תאי זרע נעים במעלה החצוצרה של הציפור לאתר ההפריה אינו מובן לחלוטין. אצל יונקים, נוזל הזקיקים מושך זרעונים כימותרפיים. עם זאת, מאמינים כי חומרים כימואטרקטיביים מכוונים תאי זרע להתקרב למרחקים ארוכים7. לכן, מנגנונים אחרים אחראים להובלת תאי זרע. דווח כי יכולתם של תאי הזרע להתמצא ולזרום כנגד נוזל החצוצרה המשתחרר לאחר ההזדווגות היא גורם מרכזי במיקוד תאי זרע בעכברים. פרקר17 הציע שזרעי זרע חוצים את צינורות הביצה על ידי שחייה כנגד הזרם הריסי בציפורים וזוחלים. למרות שהדבר לא הוכח בניסוי בציפורים, אדולפי18 היה הראשון שגילה שזרע עופות נותן תוצאות חיוביות כאשר שכבה דקה של נוזל בין כיסוי למגלשה נוצרת בעזרת רצועת נייר סינון. ריאולוגיה. הינו ויאנאגימאצ'י [19] הציבו קומפלקס שחלה-חצוצרות-רחם של עכבר בטבעת זילוח והזריקו 1 מיקרוליטר של דיו לתוך המצר כדי להמחיש את זרימת הנוזלים בחצוצרות. הם הבחינו בתנועה פעילה מאוד של התכווצות והרפיה בחצוצרה, שבה כל כדורי הדיו נעו בהתמדה לעבר האמפולה של החצוצרה. המחברים מדגישים את חשיבות זרימת נוזל החצוצרות מהחצוצרות התחתונות לעליונות לצורך הרמת הזרע והפריה. Brillard20 דיווח כי אצל תרנגולות ותרנגולי הודו, תאי זרע נודדים בתנועה אקטיבית מפתח הנרתיק, שם הם מאוחסנים, לצומת הרחם-נרתיק, שם הם מאוחסנים. עם זאת, תנועה זו אינה נדרשת בין הצומת הרחמי-ווגינלי לבין ה-infundibulum מכיוון שהזרעונים מועברים בעקירה פסיבית. בהכיר את ההמלצות הקודמות הללו ואת התוצאות שהתקבלו במחקר הנוכחי, ניתן להניח כי יכולתם של תאי הזרע לנוע במעלה הזרם (ריאולוגיה) היא אחת התכונות עליהן מבוסס תהליך הברירה. זה קובע את מעבר הזרעונים דרך הנרתיק ואת כניסתם לתא הגידול הקליני (CCT) לצורך אחסון. כפי שהציע פורמן4, הדבר עשוי גם להקל על תהליך כניסת הזרע לחצוצרות ה-SST ולבית הגידול שלו למשך זמן מה ולאחר מכן יציאתם כאשר מהירותם מתחילה להאט.
מצד שני, Matsuzaki ו-Sasanami 21 הציעו שזרעי זרע עופות עוברים שינויים בתנועתיות מתרדמת לתנועתיות בדרכי הרבייה הזכריות והנקביות. עיכוב תנועתיות הזרע השוכן ב-SST הוצע כמסבר לזמן האחסון הארוך של הזרע ולאחר מכן ההתחדשות שלו לאחר עזיבת ה-SST. בתנאים היפוקסיים, Matsuzaki ועמיתיו 1 דיווחו על ייצור ושחרור גבוהים של לקטט ב-SST, מה שעשוי להוביל לעיכוב תנועתיות הזרע השוכן. במקרה זה, חשיבות הריאולוגיה של הזרע באה לידי ביטוי בברירה ובספיגה של זרעי זרע, ולא באחסונם.
דפוס הצטברות הזרע נחשב להסבר סביר לתקופת האחסון הארוכה של תאי זרע ב-SST, מכיוון שזהו דפוס נפוץ של אצירת זרע בעופות2,22,23. בקסט ועמיתיו2 הבחינו שרוב תאי הזרע נדבקו זה לזה, ויצרו צברים פאסיקולריים, וזרעונים בודדים נמצאו לעיתים רחוקות ב-CCM שליו. מצד שני, וון ועמיתיו24 הבחינו ביותר תאי זרע מפוזרים ופחות ציציות של תאי זרע בלומן ה-SST בתרנגולות. בהתבסס על תצפיות אלו, ניתן להניח שהנטייה להצטברות זרע שונה בין ציפורים ובין תאי זרע באותו שפיכה. בנוסף, ואן קרי ועמיתיו9 הציעו כי דיסוציאציה אקראית של תאי זרע צמודים אחראית לחדירה ההדרגתית של תאי זרע לתוך לומן החצוצרה. על פי השערה זו, תאי זרע בעלי קיבולת הצטברות נמוכה יותר צריכים להיות מגורשים מה-SST תחילה. בהקשר זה, יכולתם של תאי זרע להתלכד עשויה להיות גורם המשפיע על תוצאות תחרות הזרע בציפורים מלוכלכות. בנוסף, ככל שהזרע המולכד מתנתק זמן רב יותר, כך נשמרת הפוריות זמן רב יותר.
למרות שנצפו הצטברות של תאי זרע והצטברות לחבילות במספר מחקרים2,22,24, הן לא תוארו בפירוט עקב מורכבות התצפית הקינמטית שלהן בתוך ה-SST. נעשו מספר ניסיונות לחקור הצטברות של תאי זרע במבחנה. נצפתה הצטברות נרחבת אך חולפת כאשר החוט הדק הוסר מטיפה התלויה של הזרע. זה מוביל לעובדה שבועה מוארכת בולטת מהטיפה, ומחקה את בלוטת הזרע. עקב מגבלות תלת-ממדיות וזמני ייבוש קצרים בטפטוף, כל הגוש התדרדר במהירות9. במחקר הנוכחי, תוך שימוש בתרנגולות שרקאשי ושבבי מיקרופלואידיקה, הצלחנו לתאר כיצד נוצרות גושי זרע אלה וכיצד הן נעות. צרורות זרע נוצרו מיד לאחר איסוף הזרע ונמצאו כי נעים בספירלה, ומראים ריאולוגיה חיובית כאשר הם נוכחים בזרימה. יתר על כן, בצפייה מקרוסקופית, נצפו צרורות זרע מגבירים את הלינאריות של התנועתיות בהשוואה לזרעונים מבודדים. ממצא זה מצביע על כך שייתכן והתרחשה אגלוטינציה של תאי זרע לפני חדירת ה-SST וכי ייצור הזרע אינו מוגבל לאזור קטן עקב לחץ כפי שהוצע בעבר (Tingari and Lake12). במהלך היווצרות ציציות הזרע, תאי הזרע שוחים בסנכרון עד שהם יוצרים צומת, ואז זנבותיהם עוטפים זה את זה וראש תא הזרע נשאר חופשי, אך הזנב והחלק הדיסטלי של תא הזרע נדבקים יחד באמצעות חומר דביק. לכן, הראש החופשי של הרצועה אחראי לתנועה, וגורר את שאר הרצועה. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של צרורות הזרע הראתה ראשי זרע מחוברים מכוסים בהרבה חומר דביק, דבר המצביע על כך שראשי הזרע היו מחוברים בצרורות מנוחה, דבר שייתכן שהתרחש לאחר שהגיעו לאתר האחסון (SST).
כאשר משטח זרע נצבע בכתום אקרידין, ניתן לראות חומר דבק חוץ-תאי סביב תאי הזרע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חומר זה מאפשר לחבילות הזרע להידבק ולהיאחז בכל משטח או חלקיקים מסביב, כך שהן לא נסחפות עם הזרימה שמסביב. לפיכך, התצפיות שלנו מראות את תפקיד הידבקות תאי הזרע בצורה של צרורות ניידים. יכולתם לשחות נגד הזרם ולהידבק למשטחים סמוכים מאפשרת לזרע להישאר זמן רב יותר בתאי הזרע.
רוטשילד25 ​​השתמש במצלמת המוציטומטריה כדי לחקור את התפלגות הצפה של זרע בקר בטיפת תרחיף, תוך צילום פוטומיקרוגרפים דרך מצלמה עם ציר אופטי אנכי ואופקי של המיקרוסקופ. התוצאות הראו כי תאי הזרע נמשכו אל פני השטח של החדר. המחברים מציעים שייתכנו אינטראקציות הידרודינמיות בין הזרע לפני השטח. בהתחשב בכך, יחד עם יכולתו של זרע אפרוחי שרקאשי ליצור גומיות דביקות, הדבר עשוי להגביר את הסבירות שזרע יידבק לדופן ה-SST ויאוחסן לפרקי זמן ארוכים.
Bccetti ו-Afzeliu26 דיווחו כי הגליקוקליקס של הזרע נדרש לזיהוי ואגלוטינציה של גמטות. Forman10 ציין כי הידרוליזה של קשרים α-גליקוזידיים בציפויי גליקופרוטאין-גליקוליפיד על ידי טיפול בזרע עופות עם נוירמינידאז הביאה לירידה בפוריות מבלי להשפיע על תנועתיות הזרע. המחברים מציעים כי השפעת הנוירמינידאז על הגליקוקליקס פוגעת בקיבוע הזרע בצומת הרחם-נרתיק, ובכך מפחיתה את הפוריות. תצפיותיהם אינן יכולות להתעלם מהאפשרות שטיפול בנוירמינידאז עשוי להפחית את זיהוי הזרע והביציות. Forman ו-Engel10 מצאו כי הפוריות פחתה כאשר תרנגולות הופרעו תוך-נרתיקית עם זרע שטופל בנוירמינידאז. עם זאת, הפריה חוץ גופית עם זרע שטופל בנוירמינידאז לא השפיעה על הפוריות בהשוואה לתרנגולות ביקורת. המחברים הסיקו כי שינויים בציפוי הגליקופרוטאין-גליקוליפיד סביב קרום הזרע הפחיתו את יכולת הזרע להפרות על ידי פגיעה בקיבוע הזרע בצומת הרחם-נרתיק, מה שבתורו הגביר את אובדן הזרע עקב מהירות הצומת בין הרחם לנרתיק, אך לא משפיע על זיהוי הזרע והביציות.
אצל תרנגולי הודו, בקסט ובאוכן 11 מצאו שלפוחיות קטנות ושברי ממברנה בלומן של תאי הזרע (SST) וצפו שחלק מהגרגירים הללו התמזגו עם קרום הזרע. המחברים מציעים כי קשרים אלה עשויים לתרום לאחסון ארוך טווח של תאי זרע ב-SST. עם זאת, החוקרים לא ציינו את מקור החלקיקים הללו, האם הם מופרשים על ידי תאי אפיתל CCT, מיוצרים ומופרשים על ידי מערכת הרבייה הגברית, או מיוצרים על ידי הזרע עצמו. כמו כן, חלקיקים אלה אחראים לאגלוטינציה. גרוצנר ועמיתיו 27 דיווחו שתאי אפיתל אפידידימליים מייצרים ומפרישים חלבון ספציפי הנדרש להיווצרות דרכי זרע בעלות נקבובית אחת. המחברים מדווחים גם כי פיזור צרורות אלה תלוי באינטראקציה של חלבונים אפידידימליים. ניקסון ועמיתיו 28 מצאו שהאדנקסה מפרישת חלבון, אוסטאונקטין חומצי עשיר בציסטאין; SPARC מעורב ביצירת ציציות זרע באכידנות קצרות מקור ובפלטיפוסים. פיזור הקרניים הללו קשור לאובדן חלבון זה.
במחקר הנוכחי, ניתוח אולטרה-מבני באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הראה כי תאי הזרע נדבקו לכמות גדולה של חומר צפוף. חומרים אלה נחשבים כאחראים להתקבצות שמתעבה בין וסביב הראשים הדבוקים, אך בריכוזים נמוכים יותר באזור הזנב. אנו מניחים שחומר מתקבץ זה מופרש ממערכת הרבייה הזכרית (אפידידימיס או צינור הזרע) יחד עם הזרע, מכיוון שאנו רואים לעתים קרובות נפרדות זרע מהלימפה ומהפלזמה של הזרע במהלך שפיכה. דווח כי כאשר תאי זרע של עופות עוברים דרך האפידידימיס וצינור הזרע, הם עוברים שינויים הקשורים להבשלה התומכים ביכולתם להיקשר לחלבונים ולרכוש גליקופרוטאינים הקשורים ללמה בפלזמה. נוכחותם של חלבונים אלה על קרומי הזרע השוכנים ב-SST מצביעה על כך שחלבונים אלה עשויים להשפיע על רכישת יציבות קרום הזרע 30 ולקבוע את פוריותם 31. אחמד ועמיתיו דיווחו כי תאי זרע שהתקבלו מחלקים שונים של מערכת הרבייה הגברית (מהאשכים ועד צינור הזרע הדיסטלי) הראו עלייה הדרגתית בכדאיות בתנאי אחסון נוזליים, ללא קשר לטמפרטורת האחסון, וכדאיות בתרנגולות עולה גם בחצוצרות לאחר הזרעה מלאכותית.
לקבוצות זרע של תרנגולות שרקאשי מאפיינים ותפקודים שונים מאשר מינים אחרים כמו אכידנות, ברווזנים, עכברי עץ, חולדות צבאים ושרקנים. בתרנגולות שרקאשי, היווצרות צרורות זרע הפחיתה את מהירות השחייה שלהן בהשוואה לזרעונים בודדים. עם זאת, צרורות אלו הגדילו את אחוז הזרעונים החיוביים ריאולוגית והגדילו את יכולתם לייצב את עצמה בסביבה דינמית. לפיכך, תוצאותינו מאשרות את ההצעה הקודמת לפיה התלכדות זרע ב-SST קשורה לאחסון זרע לטווח ארוך. אנו גם משערים כי הנטייה של הזרע ליצור קבוצות זרע עשויה לשלוט בקצב אובדן הזרע ב-SST, דבר שעשוי לשנות את תוצאת תחרות הזרע. על פי הנחה זו, זרעונים עם קיבולת התלכדות נמוכה משחררים SST ראשונים, בעוד שזרעונים עם קיבולת התלכדות גבוהה מייצרים את רוב הצאצאים. היווצרות צרורות זרע בעלי נקבובית אחת מועילה ומשפיעה על יחס הורה-ילד, אך משתמשת במנגנון שונה. אצל עקיצדות ובפלטיפוסים, תאי הזרע מסודרים במקביל זה לזה כדי להגביר את מהירות התקדמות הקרן. צרורות של עקיצדות נעים בערך פי שלושה מהר יותר מאשר תאי זרע בודדים. ההנחה היא שהיווצרות גושי זרע כאלה באקצדות היא הסתגלות אבולוציונית לשמירה על דומיננטיות, מכיוון שהנקבות הן פרוצות ובדרך כלל מזדווגות עם מספר זכרים. לכן, תאי זרע משפיכות שונות מתחרים בעוז על הפריית הביצית.
קל להמחיש זרעונים מצוברים של תרנגולות שרקסי באמצעות מיקרוסקופיית ניגוד פאזה, הנחשבת ליתרון משום שהיא מאפשרת מחקר קל של התנהגות הזרעונים במבחנה. המנגנון שבאמצעותו היווצרות ציציות זרע מקדמת רבייה בתרנגולות שרקסי שונה גם מזה שנצפה אצל כמה יונקים של השליה המייצגים התנהגות זרע שיתופית כמו עכברי עץ, שבהם חלק מהזרעונים מגיעים לביצים, ועוזרים לפרטים קרובים אחרים להגיע ולפגוע בביצים שלהם. להוכיח את עצמך. התנהגות אלטרואיסטית. הפריה עצמית 34. דוגמה נוספת להתנהגות שיתופית בזרעונים נמצאה בעכברי צבאים, שבהם זרעונים הצליחו לזהות ולהשתלב עם הזרעונים הקרובים ביותר מבחינה גנטית וליצור קבוצות שיתופיות כדי להגביר את מהירותם בהשוואה לזרעונים שאינם קשורים 35.
התוצאות שהתקבלו במחקר זה אינן סותרות את התיאוריה של פומן לגבי אחסון ארוך טווח של תאי זרע ב-SWS. החוקרים מדווחים שתאי זרע ממשיכים לנוע בזרם תאי האפיתל המצפים את ה-SST למשך זמן ממושך, ולאחר פרק זמן מסוים, מאגרי האנרגיה של תאי הזרע מתרוקנים, וכתוצאה מכך מתרחשת ירידה במהירות, המאפשרת פליטת חומרים בעלי משקל מולקולרי קטן של אנרגיית הזרע עם זרימת הנוזלים מחלל ה-SST מחלל החצוצרה. במחקר הנוכחי, צפינו שמחצית מהזרעונים הבודדים הראו יכולת לשחות כנגד נוזלים זורמים, והידבקותם בצרור הגבירה את יכולתם להראות ריאולוגיה חיובית. יתר על כן, הנתונים שלנו עולים בקנה אחד עם אלו של מטסוזאקי ואחרים. 1 שדיווחו כי הפרשת לקטט מוגברת ב-SST עשויה לעכב את תנועתיות הזרע המקומית. עם זאת, תוצאותינו מתארות את היווצרות הרצועות התנועתיות של הזרע ואת התנהגותן הריאולוגית בנוכחות סביבה דינמית בתוך מיקרו-תעלה בניסיון להבהיר את התנהגותן ב-SST. מחקר עתידי עשוי להתמקד בקביעת ההרכב הכימי והמקור של החומר המצרב, מה שללא ספק יעזור לחוקרים לפתח דרכים חדשות לאחסון זרע נוזלי ולהגדיל את משך הפוריות.
חמישה עשר שרקאסי זכרים בני 30 שבועות (הומוזיגוטים דומיננטיים; Na Na) בעלי צוואר חשוף נבחרו כתורמי זרע במחקר. העופות גודלו בחוות עופות המחקר של הפקולטה לחקלאות, אוניברסיטת אשיט, מחוז אשיט, מצרים. העופות שוכנו בכלובים נפרדים (30 x 40 x 40 ס"מ), עברו תוכנית תאורה (16 שעות אור ו-8 שעות חושך) וניזונו מתזונה המכילה 160 גרם חלבון גולמי, 2800 קלוריות של אנרגיה ניתנת למטבוליזם, 35 גרם סידן כל אחת, ו-5 גרם זרחן זמין לקילוגרם תזונה.
לפי נתונים 36, 37, נאסף זרע מזכרים באמצעות עיסוי בטן. סך של 45 דגימות זרע נאספו מ-15 גברים במשך 3 ימים. הזרע (n = 15/יום) דולל מיד ביחס של 1:1 (v:v) עם מדלל זרע לעופות בלסוויל, המכיל אשלגן דיפוספט (1.27 גרם), מונוסודיום גלוטמט מונוהידראט (0.867 גרם), פרוקטוז (0.5 דצילינדר), נתרן אצטט נטול מים (0.43 גרם), טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן (0.195 גרם), אשלגן ציטרט מונוהידראט (0.064 גרם), אשלגן מונופוספט (0.065 גרם), מגנזיום כלוריד (0.034 גרם) ו-H2O (100 מ"ל), pH = 7, 5, אוסמולריות 333 mOsm/kg38. דגימות זרע מדוללות נבדקו תחילה תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח איכות זרע טובה (לחות) ולאחר מכן אוחסנו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש תוך חצי שעה לאחר האיסוף.
הקינמטיקה והריאולוגיה של תאי זרע מתוארות באמצעות מערכת של התקנים מיקרופלואידיים. דגימות זרע דוללו עוד יותר ל-1:40 במדלל זרע עופות Beltsville, הועמסו לתוך התקן מיקרופלואידי (ראה להלן), ופרמטרים קינטיים נקבעו באמצעות מערכת ניתוח זרע ממוחשב (CASA) שפותחה בעבר לאפיון מיקרופלואידי על ניידות תאי זרע במדיה נוזלית (המחלקה להנדסת מכונות, הפקולטה להנדסה, אוניברסיטת אסיוט, מצרים). ניתן להוריד את התוסף בכתובת: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. נמדדו מהירות עקומה (VCL, מיקרומטר/שנייה), מהירות ליניארית (VSL, מיקרומטר/שנייה) ומהירות מסלול ממוצעת (VAP, מיקרומטר/שנייה). סרטונים של תאי זרע צולמו באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות Optika XDS-3 פאזה הפוך (עם מטרה 40x) המחובר למצלמת Tucson ISH1000 ב-30 פריימים לשנייה למשך 3 שניות. השתמשו בתוכנת CASA כדי ללמוד לפחות שלושה אזורים ו-500 מסלולי זרע לכל דגימה. הסרטון המוקלט עובד באמצעות CASA תוצרת בית. הגדרת התנועתיות בתוסף CASA מבוססת על מהירות השחייה של הזרע בהשוואה לקצב הזרימה, ואינה כוללת פרמטרים אחרים כגון תנועה מצד לצד, מכיוון שנמצא כי הדבר אמין יותר בזרימת נוזלים. תנועה ריאולוגית מתוארת כתנועה של תאי זרע כנגד כיוון זרימת הנוזל. תאי זרע בעלי תכונות ריאולוגיות חולקו במספר תאי הזרע הנעים; תאי זרע שהיו במנוחה וזרעים הנעים בתנועה קונבקטיבית לא נכללו בספירה.
כל הכימיקלים ששימשו התקבלו מחברת Elgomhoria Pharmaceuticals (קהיר, מצרים) אלא אם כן צוין אחרת. המכשיר יוצר כמתואר על ידי El-sherry et al. 40 עם כמה שינויים. החומרים ששימשו לייצור המיקרו-תעלות כללו לוחות זכוכית (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negative resist (MicroChem, Newton, CA), דיאצטון אלכוהול (Sigma Aldrich, Steinheim, גרמניה), ופוליאצטון. -184, Dow Corning, Midland, מישיגן). המיקרו-תעלות מיוצרות באמצעות ליתוגרפיה רכה. ראשית, מסכת פנים שקופה עם עיצוב המיקרו-תעלות הרצוי הודפסה במדפסת ברזולוציה גבוהה (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON). התבנית המקורית נוצרה באמצעות לוחות זכוכית כמצעים. הלוחות נוקו באצטון, איזופרופנול ומים מזוקקים ולאחר מכן צופו בשכבה של 20 מיקרומטר של SU8-25 באמצעות ציפוי ספין (3000 סל"ד, דקה אחת). לאחר מכן, שכבות SU-8 יובשו בעדינות (65°C, 2 דקות ו-95°C, 10 דקות) ונחשפו לקרינת UV למשך 50 שניות. לאחר החשיפה, אפו ב-65°C ו-95°C למשך דקה אחת ו-4 דקות כדי ליצור קישור צולב בין שכבות SU-8 החשופות, ולאחר מכן פותחו באלכוהול דיאצטון למשך 6.5 דקות. אפו את הוופלים בחום קשה (200°C למשך 15 דקות) כדי לחזק עוד יותר את שכבת SU-8.
PDMS הוכן על ידי ערבוב המונומר והמקשה ביחס משקל של 10:1, לאחר מכן נוקה גזים בייבוש בוואקום ונמזג על גבי המסגרת הראשית של SU-8. ה-PDMS עבר ריפוי בתנור (120 מעלות צלזיוס, 30 דקות), לאחר מכן נחתכו התעלות, הופרדו מהמאסטר ונוקבו כדי לאפשר חיבור צינורות בכניסה וביציאה של המיקרו-תעלה. לבסוף, מיקרו-תעלות PDMS חוברו לצמיתות לשקופיות מיקרוסקופ באמצעות מעבד קורונה נייד (Electro-Technic Products, שיקגו, אילינוי) כמתואר במקום אחר. המיקרו-תעלה ששימשה במחקר זה מודדת 200 מיקרומטר × 20 מיקרומטר (רוחב × גובה) ואורכה 3.6 ס"מ.
זרימת הנוזל הנגרמת על ידי לחץ הידרוסטטי בתוך המיקרו-תעלה מושגת על ידי שמירה על מפלס הנוזל במיכל הכניסה מעל הפרש הגובה Δh39 במיכל היציאה (איור 1).
כאשר f הוא מקדם החיכוך, המוגדר כ- f = C/Re עבור זרימה למינרית בתעלה מלבנית, כאשר C הוא קבוע התלוי ביחס הממדים של התעלה, L הוא אורך המיקרו-תעלה, Vav היא המהירות הממוצעת בתוך המיקרו-תעלה, Dh הוא הקוטר ההידראולי של התעלה, ו- g הוא תאוצת הכבידה. באמצעות משוואה זו, ניתן לחשב את מהירות התעלה הממוצעת באמצעות המשוואה הבאה: