תודה שביקרתם באתר Nature.com. אתם משתמשים בגרסת דפדפן עם תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בנוסף, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
לאחרונה פותחה פלטפורמה אנטי-מיקרוביאלית נטולת כימיקלים המבוססת על ננוטכנולוגיה המשתמשת בננו-מבנים מלאכותיים של מים (EWNS). ל-EWNS מטען פני השטח גבוה והם עשירים במיני חמצן ריאקטיביים (ROS) שיכולים לתקשר עם מספר מיקרואורגניזמים ולנטרל אותם, כולל פתוגנים הנישאים במזון. כאן מוכח כי ניתן לכוונן ולמטב את תכונותיהם במהלך הסינתזה כדי לשפר עוד יותר את הפוטנציאל האנטיבקטריאלי שלהם. פלטפורמת המעבדה של EWNS תוכננה לכוונן את תכונות ה-EWNS על ידי שינוי פרמטרי הסינתזה. אפיון תכונות ה-EWNS (מטען, גודל ותכולת ROS) בוצע באמצעות שיטות אנליטיות מודרניות. בנוסף, מיקרואורגניזמים מזון כגון Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum ו-Saccharomyces cerevisiae הוזרקו על פני השטח של עגבניות שרי אורגניות כדי להעריך את פוטנציאל ההשבתה המיקרוביאלית שלהם. התוצאות המוצגות כאן מראות כי ניתן לכוונן את תכונות ה-EWNS במהלך הסינתזה, וכתוצאה מכך לעלייה אקספוננציאלית ביעילות ההשבתה. בפרט, מטען פני השטח גדל פי ארבעה, ותכולת ה-ROS גדלה. קצב הסרת המיקרוביאלים היה תלוי מיקרוביאלית ונע בין 1.0 ל-3.8 לוגריתמים לאחר 45 דקות של חשיפה למינון אירוסול של 40,000 #/cm3 EWNS.
זיהום מיקרוביאלי הוא הגורם העיקרי למחלות הנישאות במזון הנגרמות על ידי בליעת פתוגנים או רעלנים שלהם. מחלות הנישאות במזון מהוות כ-76 מיליון מחלות, 325,000 אשפוזים ו-5,000 מקרי מוות מדי שנה בארצות הברית לבדה1. בנוסף, משרד החקלאות של ארצות הברית (USDA) מעריך כי צריכה מוגברת של תוצרת טרייה אחראית ל-48 אחוזים מכלל המחלות הנישאות במזון המדווחות בארצות הברית2. עלות המחלות והמוות מפתוגנים הנישאים במזון בארצות הברית גבוהה מאוד, ומוערכת על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) ביותר מ-15.6 מיליארד דולר בשנה3.
נכון לעכשיו, התערבויות אנטי-מיקרוביאליות כימיות4, קרינה5 ותרמיות6 להבטחת בטיחות מזון מיושמות בעיקר בנקודות בקרה קריטיות (CCP) מוגבלות בשרשרת הייצור (בדרך כלל לאחר הקטיף ו/או במהלך האריזה) ולא מיושמות באופן רציף באופן שתוצרת טרייה כפופה לזיהום צולב7. יש צורך בהתערבויות אנטי-מיקרוביאליות כדי לשלוט טוב יותר במחלות הנישאות במזון ובקלקול מזון, ויש להן פוטנציאל ליישמן על פני כל הרצף מהחווה לשולחן. פחות השפעה ועלות.
לאחרונה פותחה פלטפורמה אנטי-מיקרוביאלית נטולת כימיקלים מבוססת ננוטכנולוגיה כדי להשבית חיידקים על משטחים ובאוויר באמצעות ננו-מבנים מלאכותיים של מים (EWNS). לסינתזה של EVNS, נעשה שימוש בשני תהליכים מקבילים: אלקטרוספרייס ויינון מים (איור 1א). בעבר הוכח כי ל-EWNS סט ייחודי של תכונות פיזיקליות וביולוגיות8,9,10. ל-EWNS יש בממוצע 10 אלקטרונים לכל מבנה וגודל ננומטרי ממוצע של 25 ננומטר (איור 1ב,ג)8,9,10. בנוסף, תהודה של ספין אלקטרונים (ESR) הראתה כי EWNS מכילים כמות גדולה של מיני חמצן ריאקטיביים (ROS), בעיקר רדיקלים של הידרוקסיל (OH•) וסופראוקסיד (O2-) (איור 1ג)8. EWNS נשארו באוויר זמן רב ויכולים להתנגש במיקרובים התלויים באוויר ונמצאים על משטחים, תוך שהם מספקים את מטען ה-ROS שלהם וגורמים להשבתה מיקרוביאלית (איור 1ד). מחקרים קודמים אלה הראו גם כי EWNS יכול לתקשר ולנטרל חיידקים שונים של גרם-שליליים וגרם-חיוביים בעלי חשיבות לבריאות הציבור, כולל מיקובקטריה, על משטחים ובאוויר8,9. מיקרוסקופ אלקטרונים חודר הראתה כי ההשבתה נגרמה עקב שיבוש קרום התא. בנוסף, מחקרי שאיפה חריפה הראו כי מינונים גבוהים של EWNS אינם גורמים נזק לריאות או דלקת8.
(א) אלקטרוספרייס מתרחש כאשר מופעל מתח גבוה בין נימי המכיל נוזל לבין אלקטרודה נגדית. (ב) הפעלת מתח גבוה גורמת לשתי תופעות שונות: (i) אלקטרוספרייס של מים ו-(ii) יצירת מיני חמצן ריאקטיביים (יונים) הלכודים בתוך ה-EWNS. (ג) המבנה הייחודי של EWNS. (ד) EWNS ניידים מאוד בשל אופיים הננומטרי ויכולים לתקשר עם פתוגנים הנישאים באוויר.
לאחרונה הודגמה גם יכולתה של פלטפורמת האנטי-מיקרוביאלית EWNS להשבית מיקרואורגניזמים הנישאים במזון על פני השטח של מזון טרי. כמו כן, הוכח כי ניתן להשתמש במטען השטח של EWNS בשילוב עם שדה חשמלי לצורך אספקה ​​ממוקדת. חשוב מכך, תוצאה ראשונית מבטיחה של הפחתה של כ-1.4 לוגריתמים בפעילות עגבניות אורגניות כנגד מיקרואורגניזמים שונים במזון כגון E. coli וליסטריה נצפתה תוך 90 דקות מחשיפה ל-EWNS בריכוז של כ-50,000#/cm311. בנוסף, בדיקות הערכה אורגנולפטיות ראשוניות לא הראו השפעה אורגנולפטית בהשוואה לעגבניית הביקורת. למרות שתוצאות ההשבתה הראשוניות הללו מבטיחות בטיחות מזון אפילו במינונים נמוכים מאוד של EWNS של 50,000#/cc.2, ברור שפוטנציאל השבתה גבוה יותר יהיה מועיל יותר להפחתה נוספת של הסיכון לזיהום וקלקול.
כאן, נתמקד במחקר שלנו בפיתוח פלטפורמת יצירת EWNS כדי לכוונן את פרמטרי הסינתזה ולמטב את התכונות הפיזיקוכימיות של EWNS כדי לשפר את הפוטנציאל האנטיבקטריאלי שלהם. בפרט, האופטימיזציה התמקדה בהגדלת מטען השטח שלהם (לשיפור המסירה הממוקדת) ותכולת ה-ROS (לשיפור יעילות ההשבתה). אפיון של תכונות פיזיקוכימיות אופטימליות (גודל, מטען ותכולת ROS) באמצעות שיטות אנליטיות מודרניות ותוך שימוש במיקרואורגניזמים נפוצים במזון כגון E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae ו-M. parafortuitum.
EVNS סונתז על ידי ריסוס אלקטרוני ויינון בו זמנית של מים בעלי טוהר גבוה (18 MΩ cm–1). האטומייזר החשמלי 12 משמש בדרך כלל לאטומיזציה של נוזלים וחלקיקי פולימר וקרמיקה סינתטיים 13 וסיבים 14 בגודל מבוקר.
כפי שפורט בפרסומים קודמים 8, 9, 10, 11, בניסוי טיפוסי, מופעל מתח גבוה בין נימי מתכת לאלקטרודה נגדית מוארקת. במהלך תהליך זה מתרחשות שתי תופעות שונות: 1) ריסוס אלקטרו ו-2) יינון מים. שדה חשמלי חזק בין שתי האלקטרודות גורם להצטברות מטענים שליליים על פני המים המעובה, וכתוצאה מכך להיווצרות חרוטי טיילור. כתוצאה מכך, נוצרות טיפות מים טעונות מאוד, אשר ממשיכות להתפרק לחלקיקים קטנים יותר, על פי תיאוריית ריילי16. במקביל, שדה חשמלי חזק גורם לחלק ממולקולות המים להתפצל ולקלוט אלקטרונים (יינון), ובכך לייצר כמות גדולה של מיני חמצן פעילים (ROS)17. מנות ROS18 שנוצרו בו זמנית נאטמו ב-EWNS (איור 1c).
איור 2א' מציג את מערכת ייצור ה-EWNS שפותחה ושימשה בסינתזת ה-EWNS במחקר זה. מים מטוהרים המאוחסנים בבקבוק סגור הוזנו דרך צינור טפלון (קוטר פנימי 2 מ"מ) למחט נירוסטה 30G (נימי מתכת). כפי שמוצג באיור 2ב', זרימת המים נשלטת על ידי לחץ האוויר בתוך הבקבוק. המחט מחוברת לקונסולת טפלון שניתן לכוונן ידנית למרחק מסוים מהאלקטרודה הנגדית. האלקטרודה הנגדית היא דיסק אלומיניום מלוטש עם חור במרכז לדגימה. מתחת לאלקטרודה הנגדית נמצא משפך דגימה מאלומיניום, המחובר לשאר מערך הניסוי דרך פתח דגימה (איור 2ב'). כל רכיבי הדוגם מחוברים חשמלית כדי למנוע הצטברות מטען שעלולה לפגוע בדגימת החלקיקים.
(א) מערכת לייצור ננו-מבנים מהונדסים של מים (EWNS). (ב) חתך רוחב של דוגם ויחידת ריסוס אלקטרוכימי המציג את הפרמטרים החשובים ביותר. (ג) מערך ניסויי לאינטאקטיבציה של חיידקים.
מערכת יצירת ה-EWNS שתוארה לעיל מסוגלת לשנות פרמטרי הפעלה מרכזיים כדי להקל על כוונון עדין של תכונות ה-EWNS. יש להתאים את המתח המופעל (V), את המרחק בין המחט לאלקטרודה הנגדית (L), ואת זרימת המים (φ) דרך הקפילר כדי לכוונן את מאפייני ה-EWNS. הסמלים [V (kV), L (cm)] משמשים לציון שילובים שונים. יש להתאים את זרימת המים כדי לקבל חרוט טיילור יציב של קבוצה מסוימת [V, L]. למטרות מחקר זה, צמצם האלקטרודה הנגדית (D) נקבע ל-0.5 אינץ' (1.29 ס"מ).
בשל הגיאומטריה המוגבלת והאסימטריה, לא ניתן לחשב את עוצמת השדה החשמלי מעקרונות ראשוניים. במקום זאת, נעשה שימוש בתוכנת QuickField™ (סוונדבורג, דנמרק)19 לחישוב השדה החשמלי. השדה החשמלי אינו אחיד, ולכן ערך השדה החשמלי בקצה הקפילר שימש כערך ייחוס עבור תצורות שונות.
במהלך המחקר, הוערכו מספר שילובים של מתח ומרחק בין המחט לאלקטרודה הנגדית במונחים של היווצרות חרוט טיילור, יציבות חרוט טיילור, יציבות ייצור EWNS ושחזור. שילובים שונים מוצגים בטבלה המשלימה S1.
הפלט של מערכת יצירת ה-EWNS חובר ישירות ל-Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, דגם 3936, TSI, Shoreview, מינסוטה) למדידת ריכוז מספר החלקיקים, ונעשה בו שימוש עם אלקטרומטר אירוסול Faraday (TSI, דגם 3068B, Shoreview, ארה"ב). MN) למדידת זרימות אירוסול, כמתואר בפרסום הקודם שלנו9. גם ה-SMPS וגם אלקטרומטר האירוסול דגמו בקצב זרימה של 0.5 ליטר/דקה (סך זרימת הדגימה 1 ליטר/דקה). ריכוזי החלקיקים ושטפי האירוסול נמדדו במשך 120 שניות. חזרו על המדידה 30 פעמים. סך מטען האירוסול מחושב ממדידות הזרם, ומטען ה-EWNS הממוצע מוערך מהמספר הכולל של חלקיקי ה-EWNS שנדגמו. ניתן לחשב את העלות הממוצעת של EWNS באמצעות משוואה (1):
כאשר IEl הוא הזרם הנמדד, NSMPS הוא ריכוז המספרים הנמדד באמצעות ה-SMPS, ו-φEl הוא קצב הזרימה לאלקטרומטר.
מכיוון שהלחות היחסית (RH) משפיעה על מטען פני השטח, הטמפרטורה וה-(RH) נשמרו קבועות על 21°C ו-45%, בהתאמה, במהלך הניסוי.
מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM), ‏Asylum MFP-3D (Asylum Research, סנטה ברברה, קליפורניה) וגשש AC260T (Olympus, טוקיו, יפן) שימשו למדידת גודל ומשך החיים של ה-EWNS. קצב סריקת ה-AFM הוא 1 הרץ ושטח הסריקה הוא 5 מיקרומטר × 5 מיקרומטר עם 256 קווי סריקה. כל התמונות עברו יישור תמונה מסדר ראשון באמצעות תוכנת Asylum (מסכה עם טווח של 100 ננומטר וסף של 100 מיקרומטר).
הסר את משפך הדגימה והנח את משטח הנציץ במרחק של 2.0 ס"מ מהאלקטרודה הנגדית למשך זמן ממוצע של 120 שניות כדי למנוע התלכדות של חלקיקים והיווצרות טיפות לא סדירות על פני השטח של הנציץ. EWNS יושם ישירות על משטחי נציץ טריים (Ted Pella, Redding, CA). מיד לאחר ההתזה, משטח הנציץ הוצג באמצעות AFM. זווית המגע של פני השטח של נציץ טרי שלא עבר שינוי קרובה ל-0°, כך ש-EWNS מתפשט על פני השטח של הנציץ בצורה כיפתית20. הקוטר (a) והגובה (h) של הטיפות המפוזרות נמדדו ישירות מטופוגרפיית AFM ושימשו לחישוב נפח הדיפוזיה הכיפתי EWNS באמצעות השיטה שאושרה בעבר שלנו8. בהנחה של-EVNS המובנה יש את אותו נפח, ניתן לחשב את הקוטר המקביל ממשוואה (2):
בהתאם לשיטה שפיתחנו בעבר, נעשה שימוש במלכודת ספין של תהודה ספין אלקטרונית (ESR) כדי לזהות נוכחות של תוצרי ביניים רדיקליים קצרי מועד ב-EWNS. אירוסולים הועברו דרך תמיסה המכילה 235 mM DEPMPO (5-(דיאתוקסיפוספוריל)-5-מתיל-1-פירולין-N-אוקסיד) (Oxis International Inc., פורטלנד, אורגון). כל מדידות ה-EPR בוצעו באמצעות ספקטרומטר Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ארה"ב) ומערכי תאים שטוחים. תוכנת Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ארה"ב) שימשה לאיסוף וניתוח הנתונים. אפיון ROS בוצע רק עבור קבוצת תנאי הפעלה [-6.5 kV, 4.0 cm]. ריכוזי EWNS נמדדו באמצעות SMPS לאחר התחשבות באובדן EWNS במפגע.
רמות האוזון נוטרו באמצעות מכשיר מדידת אוזון 205 Dual Beam™ (2B Technologies, בולדר, קולורדו)8,9,10.
עבור כל מאפייני EWNS, ערך המדידה הוא ממוצע המדידות, ושגיאת המדידה היא סטיית התקן. בוצע מבחן t כדי להשוות את ערך תכונת ה-EWNS המותאמת לערך המתאים של EWNS הבסיסי.
איור 2c מציג מערכת מעבר משקעים אלקטרוסטטיים (EPES) שפותחה ואופיינה בעבר, שניתן להשתמש בה כדי לכוון EWNS11 למשטחים. EPES משתמש במטען EWNS בשילוב עם שדה חשמלי חזק כדי "לכוון" ישירות אל פני המטרה. פרטים על מערכת EPES מוצגים בפרסום שנערך לאחרונה על ידי Pyrgiotakis et al.11. לפיכך, EPES מורכבת מתא PVC מודפס בתלת-ממד עם קצוות מחודדים המכילים שתי לוחות מתכת מקבילים מפלדת אל-חלד (פלדת אל-חלד 304, מלוטשת בראי) במרכז, במרחק של 15.24 ס"מ זו מזו. הלוחות חוברו למקור מתח גבוה חיצוני (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), הלוח התחתון היה תמיד חיובי והלוח העליון היה תמיד מוארק (צף). דפנות התא מכוסות בנייר אלומיניום, המוארק חשמלית כדי למנוע אובדן חלקיקים. לתא דלת טעינה קדמית אטומה המאפשרת להניח את משטחי הבדיקה על מתלים מפלסטיק, ולהרים אותם מלוח המתכת התחתון כדי למנוע הפרעות מתח גבוה.
יעילות השיקוע של EWNS ב-EPES חושבה לפי פרוטוקול שפותח קודם לכן, המפורט באיור המשלים S111.
כתא בקרה, הזרימה השנייה דרך התא הגלילי מחוברת בטור עם מערכת EPES באמצעות מסנן HEPA ביניים כדי להסיר EWNS. כפי שמוצג באיור 2c, תרסיס ה-EWNS נשאב דרך שני תאים המחוברים בטור. המסנן בין חדר הבקרה ל-EPES מסיר כל EWNS שנותר, וכתוצאה מכך רמות הטמפרטורה (T), הלחות היחסית (RH) ורמות האוזון זהות.
נמצא כי מיקרואורגניזמים חשובים הנישאים במזון מזהמים תוצרת טרייה כגון אשריכיה קולי (ATCC #27325), אינדיקטור צואה, סלמונלה enterica (ATCC #53647), פתוגן הנישא במזון, ליסטריה אינוקואה (ATCC #33090), חלופה לליסטריה מונוציטוגנים הפתוגנית, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) כחלופה לשמרים מקלקלים, ו-Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) כחיידק חי עמיד יותר שנרכשו מ-ATCC (מנאסאס, וירג'יניה).
קנו באופן אקראי קופסאות של עגבניות שרי אורגניות מהשוק המקומי שלכם ושמרו במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (עד 3 ימים). בחרו עגבניות כדי להתנסות בגודל אחד, בקוטר של כ-1.5 ס"מ.
הפרוטוקולים לדגירה, חיסון, חשיפה וספירת מושבות פורטו בפרסומים קודמים שלנו והוסברו בפירוט בנתונים משלימים 11. ביצועי EWNS הוערכו על ידי חשיפת עגבניות מחוסנות ל-40,000 #/cm3 למשך 45 דקות. בקצרה, בזמן t = 0 דקות, שלוש עגבניות שימשו להערכת המיקרואורגניזמים ששרדו. שלוש עגבניות הונחו ב-EPES ונחשפו ל-EWNS ב-40,000 #/cc (עגבניות שנחשפו ל-EWNS) ושלוש אחרות הונחו בתא הבקרה (עגבניות בקרה). אף אחת מקבוצות העגבניות לא עברה עיבוד נוסף. עגבניות שנחשפו ל-EWNS ובקרות הוסרו לאחר 45 דקות כדי להעריך את השפעת EWNS.
כל ניסוי בוצע בשלושה עותקים. ניתוח הנתונים בוצע בהתאם לפרוטוקול המתואר בנתונים המשלימים.
דגימות חיידקים של E. coli, Enterobacter ו-L. innocua שנחשפו ל-EWNS (45 דקות, ריכוז אירוסול EWNS 40,000 #/cm3) ולא נחשפו, גודרו לכדורים כדי להעריך מנגנוני אי-אקטיבציה. המשקע קיבע למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתמיסת נתרן קקודילאט 0.1 M (pH 7.4) עם מקבע של 2.5% גלוטראלדהיד, 1.25% פאראפורמלדהיד ו-0.03% חומצה פיקרית. לאחר השטיפה, הם קיבעו עם 1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO4)/1.5% אשלגן פרוציאניד (KFeCN6) למשך שעתיים, נשטפו 3 פעמים במים והודגרו ב-1% אורניל אצטט למשך שעה אחת, ולאחר מכן נשטפו פעמיים במים. לאחר מכן התייבשות למשך 10 דקות כל אחת של 50%, 70%, 90%, 100% אלכוהול. לאחר מכן הונחו הדגימות בפרופילן אוקסיד למשך שעה אחת והוספגו בתערובת ביחס של 1:1 של פרופילן אוקסיד ו-TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). הדגימות הוטבעו ב-TAAB Epon ועברו פולימריזציה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. השרף הגרגירי שהוקשה נחתך והוצג באמצעות TEM באמצעות JEOL 1200EX (JEOL, טוקיו, יפן), מיקרוסקופ אלקטרונים חודר קונבנציונלי המצויד במצלמת CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים. עבור כל נקודת זמן, שטיפות חיידקים צולמו בשלושה עותקים, וכתוצאה מכך נתקבלו תשע נקודות נתונים בסך הכל לכל נקודה, כאשר הממוצע שלהן שימש כריכוז החיידקים עבור אותו אורגניזם מסוים. סטיית התקן שימשה כטעות המדידה. כל הנקודות נחשבות.
הלוגריתם של הירידה בריכוז החיידקים בהשוואה ל-t = 0 דקות חושב באמצעות הנוסחה הבאה:
כאשר C0 הוא ריכוז החיידקים בדגימת הביקורת בזמן 0 (כלומר, לאחר שהמשטח התייבש אך לפני הכנסתו לתא) ו-Cn הוא ריכוז החיידקים על פני השטח לאחר n דקות של חשיפה.
כדי להתחשב בפירוק הטבעי של חיידקים במהלך תקופת החשיפה של 45 דקות, חושבה גם רמת Log-Reduction בהשוואה לקבוצת הביקורת לאחר 45 דקות כדלקמן:
כאשר Cn הוא ריכוז החיידקים בדגימת הבקרה בזמן n ו-Cn-Control הוא ריכוז חיידקי הבקרה בזמן n. הנתונים מוצגים כהפחתה לוגריתמית בהשוואה לביקורת (ללא חשיפה ל-EWNS).
במהלך המחקר, הוערכו מספר שילובים של מתח ומרחק בין המחט לאלקטרודת הנגד מבחינת היווצרות חרוט טיילור, יציבות חרוט טיילור, יציבות ייצור EWNS ושחזור. שילובים שונים מוצגים בטבלה המשלימה S1. נבחרו שני מקרים למחקר מלא המציג תכונות יציבות ושחזוריות (חרוט טיילור, ייצור EWNS ויציבות לאורך זמן). באיור 3 מוצגות התוצאות על המטען, הגודל ותכולת ה-ROS עבור שני מקרים. התוצאות מסוכמות גם בטבלה 1. לעיון, איור 3 וטבלה 1 כוללים את התכונות של EWNS8, 9, 10, 11 שסונתזו בעבר ולא אופטימליים (EWNS בסיסי). חישובי מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t דו-צדדי מתפרסמים מחדש בטבלה המשלימה S2. בנוסף, נתונים נוספים כוללים מחקרים על השפעת קוטר חור הדגימה של אלקטרודת הנגד (D) והמרחק בין אלקטרודת ההארקה לקצה המחט (L) (איורים משלימים S2 ו-S3).
(א-ג) התפלגות גודל AFM. (ד-ו) מאפיין מטען פני השטח. (ז) אפיון ROS ו-ESR.
חשוב גם לציין כי עבור כל התנאים הנ"ל, זרמי היינון שנמדדו היו בטווח של 2-6 מיקרו-אמפר, והמתחים היו בטווח של -3.8 עד -6.5 קילו-וולט, מה שהביא לצריכת חשמל עבור מודול ייצור EWNS חד-ממשקי זה של פחות מ-50 מיליוואט. למרות ש-EWNS סונתז בלחץ גבוה, רמות האוזון היו נמוכות מאוד, ומעולם לא עברו את 60 ppb.
איור משלים S4 מציג את השדות החשמליים המדומים עבור התרחישים [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ], בהתאמה. השדות לפי התרחישים [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ] מחושבים כ-2 × 105 וולט/מטר ו-4.7 × 105 וולט/מטר, בהתאמה. זה צפוי, מכיוון שהיחס בין המתח למרחק גבוה בהרבה במקרה השני.
איור 3א', 3ב' מציג את קוטר ה-EWNS שנמדד באמצעות ה-AFM8. קוטרי ה-EWNS הממוצעים עבור התרחישים [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ] חושבו כ-27 ננומטר ו-19 ננומטר, בהתאמה. סטיית התקן הגיאומטרית של ההתפלגויות עבור המקרים [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ] הן 1.41 ו-1.45, בהתאמה, דבר המצביע על התפלגות גודל צרה. גם הגודל הממוצע וגם סטיית התקן הגיאומטרית קרובים מאוד ל-EWNS הבסיסי, והם 25 ננומטר ו-1.41, בהתאמה. איור 3ג' מציג את התפלגות הגודל של ה-EWNS הבסיסי שנמדד באותה שיטה באותם תנאים.
באיור 3ד', ה' מציגים את תוצאות אפיון המטען. הנתונים הם מדידות ממוצעות של 30 מדידות בו-זמניות של ריכוז (#/cm3) וזרם (I). הניתוח מראה כי המטען הממוצע על ה-EWNS הוא 22 ± 6 e- ו-44 ± 6 e- עבור [-6.5 kV, 4.0 cm] ו-[-3.8 kV, 0.5 cm], בהתאמה. בהשוואה ל-EWNS בסיסיים (10 ± 2 e-), מטען השטח שלהם גבוה משמעותית, כפול מזה של התרחיש [-6.5 kV, 4.0 cm] ופי ארבעה מזה של [-3.8 kV, 0.5 cm]. 3f מציג נתוני תשלום בסיסיים של EWNS.
ממפות ריכוז מספרי ה-EWNS (איורים משלימים S5 ו-S6), ניתן לראות כי בסצנה [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] יש מספר חלקיקים גבוה משמעותית מאשר בסצנה [-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ]. כמו כן יש לציין כי ריכוזי מספר ה-EWNS נוטרו עד 4 שעות (איורים משלימים S5 ו-S6), כאשר יציבות יצירת ה-EWNS הראתה את אותן רמות של ריכוזי מספר חלקיקים בשני המקרים.
איור 3g מציג את ספקטרום ה-EPR לאחר חיסור בקרה (רקע) עבור EWNS ממוטבים ב-[-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ]. ספקטרום ה-ROS מושווה גם לקו הבסיס של ה-EWNS במאמר שפורסם בעבר. המספר המחושב של EWNS המגיבים עם מלכודת הספין הוא 7.5 × 104 EWNS/s, בדומה ל-Baseline-EWNS8 שפורסם בעבר. ספקטרום ה-EPR הצביע בבירור על נוכחותם של שני סוגים של ROS, כאשר O2- שלט, בעוד ש-OH• היה נוכח בכמות קטנה יותר. בנוסף, השוואה ישירה של עוצמות השיא הראתה כי ל-EWNS הממוטבים הייתה תכולת ROS גבוהה משמעותית בהשוואה ל-EWNS הבסיסי.
איור 4 מציג את יעילות השיקוע של EWNS ב-EPES. הנתונים מסוכמים גם בטבלה I ומושווים לנתוני EWNS המקוריים. עבור שני מקרי EUNS, השיקוע היה קרוב ל-100% אפילו במתח נמוך של 3.0 קילו-וולט. בדרך כלל, 3.0 קילו-וולט מספיקים כדי להשיג שיקוע של 100% ללא קשר לשינוי מטען פני השטח. באותם תנאים, יעילות השיקוע של Baseline-EWNS הייתה רק 56% עקב מטען נמוך יותר (ממוצע של 10 אלקטרונים לכל EWNS).
איור 5 וטבלה 2 מסכמים את מידת האינאקטיבציה של מיקרואורגניזמים שהוזרמו על פני השטח של עגבניות לאחר חשיפה לכ-40,000 #/cm3 EWNS למשך 45 דקות בתרחיש האופטימלי [-6.5 kV, 4.0 cm]. E. coli ו-L. innocua שהוזרמו הראו הפחתה משמעותית של 3.8 log לאחר 45 דקות של חשיפה. באותם תנאים, S. enterica הראה הפחתה נמוכה יותר של log של 2.2 log, בעוד ש-S. cerevisiae ו-M. parafortuitum הראו הפחתה של 1.0 log.
מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 6) המתארים את השינויים הפיזיים הנגרמים על ידי EWNS בתאי E. coli, Salmonella enterica ו-L. innocua, המובילים לאינטאקטיביות. חיידקי בקרה הראו קרומי תאים שלמים, בעוד שחיידקים שנחשפו סבלו מקרומים חיצוניים פגומים.
הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים של חיידקי בקרה וחיידקים שנחשפו גילתה נזק לממברנה.
הנתונים על התכונות הפיזיקוכימיות של טיפות המים האופטימליות (EWNS) מראים יחד כי תכונות ה-EWNS (מטען פני השטח ותכולת ROS) השתפרו משמעותית בהשוואה לנתוני הבסיס של EWNS שפורסמו בעבר. מצד שני, גודלם נותר בטווח הננומטרי, הדומה מאוד לתוצאות שפורסמו בעבר, מה שמאפשר להם להישאר באוויר למשך זמן רב. ניתן להסביר את הפיבריזריות הנצפית על ידי שינויים במטען פני השטח, הקובעים את גודל אפקט ריילי, אקראיות ומיזוג פוטנציאלי של EWNS. עם זאת, כפי שפורט על ידי נילסן ואחרים, מטען פני השטח גבוה מפחית אידוי על ידי הגדלה יעילה של אנרגיית/מתח פני השטח של טיפת המים. תיאוריה זו אושרה ניסיונית עבור מיקרו-טיפות ו-EWNS בפרסום הקודם שלנו. אובדן זמן נוסף יכול גם להשפיע על הגודל ולתרום להתפלגות הגודל הנצפית.
בנוסף, המטען לכל מבנה הוא כ-22–44 e-, תלוי בנסיבות, שהוא גבוה משמעותית בהשוואה ל-EWNS הבסיסי, בעל מטען ממוצע של 10 ± 2 אלקטרונים לכל מבנה. עם זאת, יש לציין שזהו המטען הממוצע של EWNS. סטו ועמיתיו. הוכח כי המטען אינו אחיד ועוקב אחר התפלגות לוגריתמית-נורמלית . בהשוואה לעבודתנו הקודמת, הכפלת מטען פני השטח מכפילה את יעילות השיקוע במערכת EPES לכמעט 100%.