תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכה מוגבלת ב-CSS.לחוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
חלקיקי סיליקה נקבוביים הוכנו בשיטת סול-ג'ל עם שינויים מסוימים להשגת חלקיקים מאקרו-נקבים. חלקיקים אלו הופקו על ידי פילמור הפיך של העברת שרשרת חיבור (RAFT) עם N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) וסטירן להכנת N-phenylmaleimide phase-0MP. 1.8 מ"מ id) נארזו על ידי אריזה תרחיץ. הערכת הפרדת עמודות PMP של תערובת פפטידים המורכבת מחמישה פפטידים (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ביצועים chromatography humans (US chromatography chromatography) ספירת הצלחות התיאורטית של תערובת הפפטידים היא עד 280,000 לוחות/מ"ר. בהשוואה בין ביצועי ההפרדה של העמודה המפותחת עם העמודה המסחרית Ascentis Express RP-Amide, נצפה שביצועי ההפרדה של העמודה PMP היו עדיפים על העמודה המסחרית מבחינת יעילות ורזולוציה של הפרדה.
בשנים האחרונות הפכה תעשיית הביו-פרמצבטיקה לשוק עולמי מתרחב עם גידול משמעותי בנתח השוק. עם הצמיחה הנפיצה של תעשיית הביו-פרמצבטיקה1,2,3, ניתוח פפטידים וחלבונים רצוי מאוד. בנוסף לפפטיד היעד, נוצרים מספר זיהומים במהלך סינתזת הפפטידים, ובכך מצריכים ניתוח כרומטוגרפי של החלבונים הרצויים של החלבונים וטיהור הרקמות הרצויות. s and cells היא משימה מאתגרת ביותר בשל המספר הגדול של מינים שניתן לזהות בדגימה בודדת. למרות שספקטרומטריית מסה היא כלי יעיל לרצף פפטיד וחלבונים, אם דגימות כאלה יוזרקו לתוך ספקטרומטר המסה במעבר אחד, ההפרדה לא תהיה אידיאלית. ניתן לצמצם בעיה זו על ידי הטמעת מסה ניתוחית של כרומט, הפרדות מסה (MS ניתוח chromat) בזמן נתון4,5,6.בנוסף, במהלך הפרדת פאזות נוזל, ניתן למקד את האנליטים באזורים צרים, ובכך לרכז את האנליטים הללו ולשפר את הרגישות לזיהוי טרשת נפוצה. כרומטוגרפיה נוזלית (LC) התקדמה משמעותית בעשור האחרון והפכה לטכניקה פופולרית בניתוח פרוטאומי7,8,9,10.
כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה (RP-LC) נמצאת בשימוש נרחב לטיהור והפרדה של תערובות פפטידים באמצעות סיליקה מסוג אוקטדציל-מודיד (ODS) כפאזה נייח11,12,13. עם זאת, פאזות נייחות RP אינן מספקות הפרדה משביעת רצון של פפטידים וחלבונים בשל מבנה הפאזה המורכבת שלהם, 14,13 התחנה המיוחדת המיועדת למבנה הפאזה המורכב שלהם,14,13 הם מיוחדים. לנתח פפטידים וחלבונים עם חלקים קוטביים ולא קוטביים כדי לקיים אינטראקציה עם האנליטים הללו ולשמור עליהם16. כרומטוגרפיה מעורבת, המספקת אינטראקציות מולטי-מודאליות, יכולה להוות חלופה ל-RP-LC להפרדה של פפטידים, חלבונים ותערובות מורכבות אחרות. הוכנו מספר פאזות נייחות במצב מעורב עם, 1 פאזות, 1 פפטידים הוכנו עם חלבון, 1 פפטידים. 9,20,21. שלבים נייחים במצב מעורב (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, אינטרקלציה קוטבית/RPLC) מתאימים להפרדות פפטידים וחלבונים עקב נוכחותן של קבוצות קוטביות ולא קוטביות כאחד. אנליטים קוטביים ולא קוטביים, שכן ההפרדה תלויה באינטראקציה בין אנליט לשלב נייח.אינטראקציות מולטי-מודאליות 29, 30, 31, 32. לאחרונה, Zhang et al.30 הכין שלב נייח של פוליאמין עם סיומת דודקיל והפריד בהצלחה בין פחמימנים, תרופות נוגדות דיכאון, פלבנואידים, נוקלאוזידים, אסטרוגנים ועוד מספר אנליטים. לאינטרקלטור הקוטבי יש קבוצות קוטביות ולא קוטביות, כך שניתן להשתמש בו להפרדת פפטידים וחלבונים שיש להם עמודים הידרופוביים והידרופיליים, למשל, עמודים הידרופיליים, למשל. ) זמינות מסחרית תחת השם המסחרי Ascentis Express RP-Amide עמודות, אך עמודות אלו משמשות לניתוח של אמין 33 בלבד.
במחקר הנוכחי, הוכן שלב נייח משובץ קוטבי (פוליסטירן מוטבע N-phenylmaleimide) שהוערך עבור הפרדת פפטידים ועיכול טריפסין של HSA. השלב הנייח הוכן באמצעות האסטרטגיה הבאה. חלקיקי סיליקה נקבוביים הוכנו לפי הנוהל שניתן בפרסום הקודם שלנו, עם כמה שינויים בפרוטוקול polyethylOS, (היחס בין פרוטוקולים ל-Glycerolene TM). , חומצה אצטית של מים הותאמה להכנת חלקיקי סיליקה עם גודל נקבוביות גדול. שנית, ליגנד חדש, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, סונתז ושימשו להפקת חלקיקי סיליקה להכנת פאזה נייחת מוטבעת קוטבית. השלב הנייח שהתקבל נארז לתוך עמודת עמודת נירוסטה × אריזה אופטימלית עם 180mm0 packing. רטט מכני כדי להבטיח יצירת מיטה הומוגנית בתוך העמוד. הערכת הפרדת עמודות ארוזה של תערובות פפטידים המורכבות מחמישה פפטידים;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ו-Trypsin digest of human serum albumin (HAS). תערובת הפפטיד ועיכול הטריפסין של HSA נצפו להיפרד ברזולוציה ויעילות טובה. ביצועי ההפרדה של העמודה של PMP-Am היו השוו את ביצועי ההפרדה של PMP-Am. וחלבונים נצפו כפתורים היטב ויעילים בעמודת PMP, שהייתה יעילה יותר מעמודת Ascentis Express RP-Amide.
PEG (פוליאתילן גליקול), אוריאה, חומצה אצטית, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), טריפסין, אלבומין בסרום אנושי (HSA), אמוניום כלוריד, אוריאה, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC,Hydroxyde) (HPLCHydroxyde), Perzodroxyet (HPLC, סטירן, 4-MPO), trile (ACN), מתנול, 2-פרופנול ואציטון נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, מונטג'י ארה"ב).
תערובת של אוריאה (8 גרם), פוליאתילן גליקול (8 גרם) ו-8 מ"ל של חומצה אצטית של 0.01 N עירבבה במשך 10 דקות, ולאחר מכן נוספו אליה 24 מ"ל של TMOS בתנאים קרים כקרח. תערובת התגובה חוממה ל-40 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות ולאחר מכן ב-120 שעות ב-120 מעלות צלזיוס, חומר פלדה יבש ללא מים למשך 8 שעות. d ב-70 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. המסה הרכה המיובשת נטחנה בצורה חלקה בתנור וסולחה ב-550 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. שלוש קבוצות הוכנו ואופיינו לבחינת יכולת השחזור בגודל החלקיקים, גודל הנקבוביות ושטח הפנים.
על ידי שינוי פני השטח של חלקיקי סיליקה עם ליגנד phenylmaleimid-methylvinylisocyanate (PCMP) מסונתז מראש ואחריו פילמור רדיאלי עם סטירן, הוכנה תרכובת המכילה קבוצה קוטבית.שלב נייח עבור אגרגטים ושרשראות פוליסטירן. תהליך ההכנה מתואר להלן.
N-phenylmaleimide (200 מ"ג) ומתיל ויניל איזוציאנט (100 מ"ג) הומסו בטולואן יבש, ו-0.1 מ"ל של 2,2'-azoisobutyronitrile (AIBN) הוסיפו לבקבוק התגובה להכנת פניל-מאלאימיד-מתיל ויניל איזוציאנאט תערובת של 3 שעות ו-°C עברו סינון ב-3 שעות. ד בתנור ב-40 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
חלקיקי סיליקה מיובשים (2 גרם) פוזרו בטולואן יבש (100 מ"ל), עורבבו ועברו צלילים בבקבוק תחתית עגולה של 500 מ"ל למשך 10 דקות. PMCP (10 מ"ג) הומס בטולואן והוסף בצורה טיפה לבקבוק התגובה באמצעות משפך טיפה. התערובת עברה ריפלוקס, עברו סינון של 80 מעלות צלזיוס ועברו סינון של 80 טון. מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. לאחר מכן, חלקיקי סיליקה הקשורים ל-PMCP (100 גרם) הומסו בטולואן (200 מ"ל) ונוספו 4-הידרוקסי-TEMPO (2 מ"ל) בנוכחות 100 μL של דיבוטילטין דילאוראט כזרז. התערובת הוספה ב-50 מעלות צלזיוס ו-3 שעות סינון במשך 8 שעות.
סטירן (1 מ"ל), בנזואיל פרוקסיד BPO (0.5 מ"ל), וחלקיקי סיליקה המחוברים ל-TEMPO-PMCP (1.5 גרם) פוזרו בטולואן וטיהרו בחנקן. הפילמור של סטירן בוצע ב-100 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. המוצר שהתקבל נשטף עם מתנול 1. הסכימה של מתנול הוצגה במשך הלילה.
הדגימות הורדו ב-393 K למשך שעה אחת כדי לקבל לחץ שיורי של פחות מ-10-3 Torr. כמות ה-N2 שנספג בלחץ יחסי של P/P0 = 0.99 שימשה לקביעת נפח הנקבוביות הכולל. המורפולוגיה של חלקיקי סיליקה חשופים וקשורים לליגנד נבדקה באמצעות scanning electron microscopy, Tokyosand-High-D, Microscopy. חלקיקי ed סיליקה) הונחו על עמודת אלומיניום באמצעות סרט פחמן דביק. זהב היה מצופה על הדגימות באמצעות ציפוי מקפיץ Q150T, ושכבת Au של 5 ננומטר הופקדה על הדגימות. זה משפר את יעילות התהליך באמצעות מתחים נמוכים ומספק עדין גרגירים, התזת קר.A Thermo Electron (USA) ניתוח של אלמנט תרמו אלקטרון (Waltham1) השתמש ב-A Thermo Electron (Waltham 1, MA1, MA1. אורסטרשייר, בריטניה) מנתח גודל החלקיקים Mastersizer 2000 שימש כדי להשיג את התפלגות גודל החלקיקים. חלקיקי סיליקה עירומים וחלקיקי סיליקה קשורים לליגנד (5 מ"ג כל אחד) פוזרו ב-5 מ"ל של איזופרופנול, עברו צלילים למשך 10 דקות, עברו מערבולת במשך 5 דקות, והונחו על הספסל האופטי של 5 דקות של ניתוח אופטי של 5 דקות. טווח טמפרטורות של 30 עד 800 מעלות צלזיוס.
עמודי נירוסטה מצופים זכוכית בממדים (100 × 1.8 מ"מ קודי) נארזו בשיטת אריזת הסלורי, תוך יישום אותו הליך שנעשה ב-Ref.31. עמודת נירוסטה (מצופה בזכוכית, 100 × 1.8 מ"מ id) עם אביזר יציאה המכיל פריט של 1 מיקרון חובר לאריזת תרחיץ (Alltech Deerfield, IL, ארה"ב). הכן תרחיץ פאזה נייח על ידי השעיית 150 מ"ג של שלב נייח של 1.2 מתנול לאחסון מתנול כמו 1.2 מתנול המשמש לאחסון. כממס המניע. מלאו את העמוד ברצף על ידי הפעלת לחצים של 100 מגה פיקסל למשך 10 דקות, 80 מגה פיקסל למשך 15 דקות, ו-60 מגה פיקסל למשך 30 דקות. במהלך האריזה, הופעל רטט מכני עם שני מנערי עמודים GC (Alltech, Deerfield, IL, ארה"ב) כדי להבטיח אריזה אחידה של העמודה לאריזת הנזק ולמנוע את שחרור העמוד לאט לאריזה של העמוד. יחידת אריזת הסלרי וחבר אביזר נוסף לכניסה ולמערכת LC כדי לבדוק את הביצועים שלה.
משאבת LC (10AD Shimadzu, יפן), מזרק (Valco (ארה"ב) C14 W.05) עם לולאת הזרקה של 50nL, מסיר ממברנה (Shimadzu DGU-14A), חלון נימי UV-VIS נבנה גלאי התקן µLC מיוחד (UV-2075) ומחבר את העמודים הקטנים והקטנים ביותר של זכוכית קצרה. הרחבת פס. לאחר האריזה, נימים (50 מיקרומטר id 365 ונימי איחוד מצמצמים (50 מיקרומטר) הותקנו בשקע 1/16 אינץ' של האיחוד המצמצם. איסוף נתונים ועיבוד כרומטוגרפי נעשו באמצעות תוכנת Multichro 2000. הניטור ב-254 נתונים אנליטיים נבחנו על ידי 254 מקור. (Northampton, MA).
אלבומין מסרום אנושי, אבקה ליופיליזית, ≥ 96% (אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז) 3 מ"ג מעורבב עם טריפסין (1.5 מ"ג), 4.0 M אוריאה (1 מ"ל) ו-0.2 מ' אמוניום ביקרבונט (1 מ"ל). התמיסה עורבבה במשך 10 דקות ונשמרה באמבט מים של 10 מ"ל למשך 1 מ"ל, לאחר מכן 10 מ"ל. TFA. סנן את התמיסה ואחסן מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
הפרדת תערובות פפטידים ועיכול טריפסין HSA הוערכה בנפרד על עמודות PMP. בדוק את ההפרדה של תערובת הפפטידים ועיכול טריפסין של HSA על ידי עמודת PMP והשווה את התוצאות לעמודת Ascentis Express RP-Amide. מספר הלוחיות התיאורטי מחושב באופן הבא:
תמונות SEM של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצגות באיור.2 תמונות SEM של חלקיקי סיליקה חשופים (A, B) מראים שבניגוד למחקרים הקודמים שלנו, חלקיקים אלה הם כדוריים שבהם החלקיקים מוארכים או בעלי סימטריה לא סדירה. פני השטח של חלקיקי הסיליקה הקשורים לליגנד (C, D) חלקים יותר מזה של חלקיקי הסיליקה החשופים לציפוי של חלקיקי הסיליקה, שעלולים להיות דו-שרשרת של חלקיקי הסיליקה.
סריקת תמונות במיקרוסקופ אלקטרוני של חלקיקי סיליקה חשופים (A, B) וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד (C, D).
התפלגות גודל החלקיקים של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצגות באיור 3(A). עקומות התפלגות גודל החלקיקים מבוססות נפח הראו כי גודל חלקיקי הסיליקה גדל לאחר שינוי כימי (איור 3A). נתוני התפלגות גודל החלקיקים של חלקיקי הסיליקה מהמחקר הנוכחי והמחקר הקודם הושוו בגודל החלקיקים הניתנים ל-P(A T, 0, 1, 0). 3.36 מיקרומטר, בהשוואה למחקר הקודם שלנו עם ערך ad(0.5) של 3.05 מיקרומטר (חלקיקי סיליקה הקשורים לפולסטירן)34. לאצווה זו הייתה התפלגות גודל חלקיקים צרה יותר בהשוואה למחקר הקודם שלנו, עקב היחסים המשתנים של PEG, אוריאה, TMOS, וחומצה אצטית בגודל התערובת של סיליקה-MP היא בגודל של חלקיקי סיליקה בגודל מעט יותר של PMP. שלב שלמדנו בעבר. המשמעות היא שפונקציונליזציה של חלקיקי סיליקה עם סטירן הפקידה רק שכבת פוליסטירן (0.97 מיקרומטר) על פני הסיליקה, בעוד שבשלב PMP עובי השכבה היה 1.38 מיקרומטר.
התפלגות גודל החלקיקים (A) והתפלגות גודל הנקבוביות (B) של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד.
גודל הנקבוביות, נפח הנקבוביות ושטח הפנים של חלקיקי הסיליקה של המחקר הנוכחי ניתנים בטבלה 1(B). פרופילי ה-PSD של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצגים באיור 3(B). התוצאות דומות למחקר הקודם שלנו. גודל הנקבוביות של הסיליקה החשופה ושל חלקיקי הסיליקה החשופים והליגנדים מצביעים על 24310 חלקיקי סיליקה, בהתאמה, שהם 24310, בהתאמה 69 לאחר שינוי כימי, כפי שמוצג בטבלה 1(B), ושינוי העקומה מוצג באיור. 3(B). באופן דומה, נפח הנקבוביות של חלקיקי הסיליקה ירד מ-0.67 ל-0.58 cm3/g לאחר שינוי כימי. שטח הפנים הספציפי של חלקיקי הסיליקה הנחקרים כעת הוא 1,26 מ"ר ל-m2/g/g במחקרנו הקודם. מסוגל 1(B), שטח הפנים (m2/g) של חלקיקי הסיליקה ירד גם הוא מ-116 m2/g ל-105 m2/g לאחר שינוי כימי.
התוצאות של ניתוח אלמנטים של השלב הנייח מוצגות בטבלה 2. העמסת הפחמן של השלב הנייח הנוכחי הוא 6.35%, וזה נמוך מעומס הפחמן של המחקר הקודם שלנו (חלקיקי סיליקה קשורים בפוליסטירן, 7.93%35 ו-10.21%, בהתאמה) 42. העמסת הפחמן של הפאזה הנייחת הנוכחית היא נמוכה, מכיוון שהעמסת הפחמן של הפאזה הנייחת הנוכחית היא נמוכה, מכיוון שההכנה של ה-SP לשלב הנייח הנוכחי הוא נמוך. נעשה שימוש ב-phenylmaleimid-methylvinylisocyanate (PCMP) ו-4-hydroxy-TEMPO. אחוז משקל החנקן של השלב הנייח הנוכחי הוא 2.21%, בהשוואה ל-0.1735 ו-0.85% לפי משקל של חנקן במחקרים קודמים, בהתאמה. משמעות הדבר היא שאחוז משקל החנקן של הפאזה הנייחת הנוכחית גבוה יותר בפאזה התחנה הסטיונלית של החנקן-מימיל-מייל-S. s של מוצרים (4) ו-(5) היו 2.7% ו-2.9%, בהתאמה, בעוד שעומס הפחמן של המוצר הסופי (6) היה 6.35%, כפי שמוצג בטבלה 2. הירידה במשקל נבדקה עם שלב נייח של PMP, ועקומת ה-TGA מוצגת באיור 4. עקומת ה-TGA מראה את הירידה במשקל של 8 ב-6% בלבד, כיוון שהירידה במשקל היא טובה של 8 ב-6% פחמן בלבד. אלא גם N, O ו-H.
הליגנד phenylmaleimide-methylvinylisocyanate נבחר לשינוי פני השטח של חלקיקי סיליקה מכיוון שיש לו קבוצות פנילמאלימיד קוטביות וקבוצות vinylisocyanate. קבוצות ויניל איזוציאנאט יכולות להגיב עוד יותר עם סטירן על ידי פילמור רדיקלי חי. הסיבה השנייה היא החדרת קבוצה שיש לה אינטראקציה מתונה וללא אינטראקציה בין התחנה האנליטית והאנליטית החזקה עם התחנה האנליטית והאנליטית. לחלק ylmaleimide אין מטען וירטואלי ב-pH נורמלי. ניתן לשלוט בקוטביות של השלב הנייח על ידי הכמות האופטימלית של סטירן וזמן התגובה של פילמור רדיקלים חופשיים. השלב האחרון של התגובה (פילמור רדיקלים חופשיים) הוא קריטי ויכול לשנות את הקוטביות של הפאזה הנייחת. בוצע ניתוח יסודי כדי לבדוק את העמסת הפחמן של כמות הפחמן של הפאזה הנייחת הנצפית וכמות הפחמן המוגברת של השלבים הנייחים וה-vi של התגובה הפחמן מוגברת של השלבים הנייחים. versa.SPs שהוכנו עם ריכוזים שונים של סטירן הם בעלי עומסי פחמן שונים. שוב, טען את השלבים הנייחים הללו לתוך עמודי נירוסטה ובדקו את הביצועים הכרומטוגרפיים שלהם (סלקטיביות, רזולוציה, ערך N וכו'). בהתבסס על ניסויים אלו, נבחר פורמולציה אופטימלית להכנת השלב הנייח של PMP כדי להבטיח קוטביות מבוקרת ואמור אנליט טוב.
חמש תערובות פפטידים (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) הוערכו גם הן באמצעות עמודת PMP באמצעות פאזה ניידת;60/40 (v/v) acetonitrile/מים (0.1% TFA) בקצב זרימה של 80 μL/min. בתנאי elution אופטימליים, מספר הלוח התיאורטי (N) לכל עמודה (100 × 1.8 מ"מ id) הוא 20,000 ± 100 (200,000 צלחות MP וערכי ה-MP לשלושה עמודים) כרומטוגרמות מוצגות באיור 5A. אנליזה מהירה על עמודת PMP בקצב זרימה גבוה (700 μL/דקה), חמישה פפטידים נפלטו תוך דקה אחת, ערכי N היו טובים מאוד, 13,500 ± 330 לכל עמודה (100 × 1.8 מ"מ id), תואמות לגודל 0 ל-03 מ"מ, זהה ל-0 ל-03 מ"ר. (100 × 1.8 מ"מ id) היו ארוזים בשלושה קבוצות שונות של PMP נייח פאזה כדי לבדוק את יכולת השחזור. ריכוז האנליטים עבור כל עמודה נרשם באמצעות תנאי הגלישה האופטימליים ומספר הלוחות התיאורטיים N וזמן השמירה להפרדה של אותה תערובת בדיקה בכל עמודה. נתוני השחזור של עמודות PMP מוצגים בטבלה 4. הערך הנמוך ביותר של TRS ניתן לשחזר היטב בעמודה 4. .
הפרדה של תערובת פפטידים על עמודת PMP (B) ועמודת Ascentis Express RP-Amide (A);שלב נייד 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), מידות עמודה PMP (מזהה 100 × 1.8 מ"מ);אנליטי סדר החלוקה של התרכובות: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ו-5 (לאוצין) חומצה אנקפלין)).
עמודת PMP (100 × 1.8 מ"מ id) הוערכה להפרדה של מעכלים טריפטיים של אלבומין בסרום אנושי בכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים. הכרומטוגרמה באיור 6 מראה שהדגימה מופרדת היטב והרזולוציה טובה מאוד. עיכולי HSA נותחו באמצעות קצב זרימה של 100 µL/70min של מים ניידים ו- T µL/70min. כפי שמוצג בכרומטוגרמה (איור 6), עיכול ה-HSA פוצל ל-17 פסגות המקבילות ל-17 פפטידים. יעילות ההפרדה של כל פסגה בעיכול HSA חושבה והערכים ניתנים בטבלה 5.
עיכול טריפטי של HSA (100 × 1.8 מ"מ id) הופרד על עמודת PMP;קצב זרימה (100 μL/דקה), פאזה ניידת 60/40 אצטוניטריל/מים עם 0.1% TFA.
כאשר L הוא אורך העמודה, η היא הצמיגות של השלב הנייד, ΔP הוא לחץ העמוד האחורי, ו-u היא המהירות הליניארית של הפאזה הניידת. החדירות של עמודת ה-PMP הייתה 2.5 × 10-14 מ"ר, קצב הזרימה היה 25 μL/min, ו-60/40 v/v של עמודת mm0/1me הייתה בשימוש של 60/40 v/v. היה דומה לזו של המחקר הקודם שלנו Ref.34. החדירות של העמוד הדחוס בחלקיקים בעלי נקבוביות שטחית היא: 1.7 × 10-15 עבור חלקיקים של 1.3 מיקרומטר, 3.1 × 10-15 עבור חלקיקים בגודל 1.7 מיקרומטר, 5.2 × 10-15 × 102 מ"ר עבור חלקיקים 6-102. חלקיקי מיקרומטר 43. לכן, החדירות של שלב ה-PMP דומה לזו של חלקיקי ליבה-קליפה בגודל 5 מיקרומטר.
כאשר Wx הוא משקל העמודה ארוז עם כלורופורם, Wy הוא משקל העמודה העמוסה במתנול, ו-ρ היא צפיפות הממס. צפיפות של מתנול (ρ = 0.7866) וכלורופורם (ρ = 1.484). הנקבוביות הכוללת של עמודות SILICA PARTICLES-C1008 × 1008 מ"מ ועמודות C31-C31. s 31 שחקרנו בעבר היו 0.63 ו-0.55, בהתאמה. משמעות הדבר היא שנוכחותם של ליגני אוריאה מפחיתה את החדירות של השלב הנייח. מצד שני, הנקבוביות הכוללת של עמודת ה-PMP (100 × 1.8 מ"מ id) היא 0.60. החדירות של עמודות C1-קשורות זו נמוכה יותר מ-PMP-עמודות-C1-packed עם עמודות C1. פאזות אריות הליגנדים C18 מחוברים לחלקיקי הסיליקה כשרשראות ליניאריות, בעוד שבשלבים נייחים מסוג פוליסטירן נוצרת סביבו שכבת פולימר עבה יחסית. בניסוי טיפוסי, נקבוביות העמודה מחושבת כך:
איור 7A,B מציגים את עמודת ה-PMP (100 × 1.8 מ"מ מזהה) ואת העמודה Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 מ"מ מזהה) תוך שימוש באותם תנאי elution (כלומר, 60/40 ACN/H2O ו-0.1% TFA).) של עלילת ואן דימטר.תערובות פפטידים נבחרות (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) הוכנו ב-20 µL/ קצב הזרימה המינימלי לשני העמודות הוא 800 µL/min. עמודת ה-Express RP-Amide היו 2.6 מיקרומטר ו-3.9 מיקרומטר, בהתאמה. ערכי HETP מצביעים על כך שיעילות ההפרדה של עמודת ה-PMP (100 × 1.8 מ"מ id) טובה בהרבה מעמודת Ascentis Express RP-Amide הזמינה מסחרית (100 × 1.8 מ"מ יד א) לעומת ירידה משמעותית בזרימת ה-N ב-N. למחקר הקודם שלנו. יעילות ההפרדה הגבוהה יותר של עמודת PMP (100 × 1.8 מ"מ מזהה) בהשוואה לעמודת Ascentis Express RP-Amide מבוססת על שיפורים בצורת החלקיקים, בגודל ובנהלי אריזה מורכבים של העמודים המשמשים בעבודה הנוכחית34.
(א) עלילת van Deemter (HETP לעומת מהירות ליניארית פאזה ניידת) שהושגה באמצעות עמודת PMP (100 × 1.8 מ"מ id) ב-60/40 ACN/H2O עם 0.1% TFA.(B) עלילת van Deemter (HETP לעומת מהירות לינארית פאזה ניידת) שהושגה באמצעות עמודת Ascentis Express RP-00 מ"מ/4 בעמודה 000 מ"מ 2/4 של Ascentis (Acentis Express RP-Amid 4/00 מ"2). עם 0.1% TFA.
שלב נייח משובץ פוליסטירן הוכן והוערך להפרדה של תערובות פפטידים סינתטיים ועיכול טריפסין של אלבומין בסרום אנושי (HAS) בכרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים. הביצועים הכרומטוגרפיים של עמודות PMP עבור תערובות פפטידים מצוינים ביעילות ההפרדה וברזולוציית ההפרדה. חלקיקים, סינתזה מבוקרת של השלב הנייח ואריזת עמודות מורכבת. בנוסף ליעילות הפרדה גבוהה, לחץ אחורי נמוך בקצבי זרימה גבוהים הוא יתרון נוסף של שלב נייח זה. עמודות PMP מפגינות שחזור טוב וניתן להשתמש בהן לניתוח תערובות פפטידים ועיכול טריפסין של חלבונים שונים. אנו מתכוונים להשתמש בעמודה זו להפרדה של תרכובות טבעיות מצמחים וביו-אקטיביים של תרכובות טבעיות מצמחים עתידיים וביו-אקטיביים של תרכובות צמחיות ונוזליות בעתיד. עמודות PMP יוערכו גם להפרדה של חלבונים ונוגדנים חד שבטיים.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Systems Separation Peptide by Reversed Phase Chromatography Part I: Development of a Column Characterization Protocol.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. משופרים פפטידים פעילים המיועדים לטיפול במחלות זיהומיות.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and the market.drug discovery.15 (1-2) today, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (120.09).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. כרומטוגרפיית מסה נוזלית מתקדמת מאפשרת שילוב של מטבולומיקה ממוקדת רחבה ופרוטאומיקה.אנוס.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ תפקידה של UHPLC בפיתוח תרופות.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM היבטים יסודיים ומעשיים של כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה במיוחד להפרדות מהירות.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. יישום של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בפיתוח תרופות.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.הידרוג'לים מאקרו-פוריים מונוליטיים שהוכנו מתחליב שלב פנימי גבוה של שמן במים לטיהור יעיל של enteroviruses.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA תפקידה של כרומטוגרפיה נוזלית בפרוטאומיקה.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. מגמות מתעוררות בהפרדות כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה של פפטידים וחלבונים טיפוליים: תיאוריה ויישומים.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC הפרדה דו-ממדית של פפטידים באמצעות מערכת RP-RP-HPLC באמצעות ערכי pH שונים בממד ההפרדה הראשון והשני.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. נחקרו מאפייני העברת המסה והביצועים הקינטיים של עמודות כרומטוגרפיות בעלות יעילות גבוהה עמוסות עם C18 תת-2 מיקרומטר חלקיקים נקבוביים באופן שטחי ושטחי.ספטמבר Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. מגמות ואתגרים אנליטיים אחרונים בבידוד, זיהוי ואימות של פפטידים ביו-אקטיביים של צמחים.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-0218-x00218-(28216-0218).
Mueller, JB et al.הנוף הפרוטאומי של ממלכת החיים.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. וחב'. עיבוד במורד הזרם של פפטידים טיפוליים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית הכנה. מולקולה (באזל, שוויץ) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography ויישומה על ביופולימרים.J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands for mixed-mode protein chromatography: עיקרון, אפיון ועיצוב.J.ביוטכנולוגיה.144(1), 3-11 (2009).