תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
תורמוס Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) הוא צמח קטניות המשמש לייצור מזון והשבחת קרקע.ההתרחבות העולמית של NLL כגידול משכה פטריות פתוגניות רבות, כולל אנתרקנוז תורמוס, הגורם למחלת האנתרקנוז ההרסנית.שני אללים, Lanr1 ו-AnMan, המקנים עמידות מוגברת, שימשו בגידול NLL, אך המנגנונים המולקולריים הבסיסיים נותרו לא ידועים.במחקר זה, סמני Lanr1 ו-AnMan שימשו לבדיקת דגימות NLL אירופאיות.בדיקת החיסון בסביבה מבוקרת אישרה את היעילות של שני התורמים העמידים.פרופיל ביטוי גנים דיפרנציאלי בוצע על קווים עמידים ורגישים מייצגים.עמידות לאנתרקנוזה הייתה קשורה לביטוי יתר של המונחים האונטולוגיים של הגנים "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" ו-"GO:0015979 Photosynthesis".בנוסף, קו LANR1 (83A: 476) הראה תכנות מחדש של טרנסקריפטום משמעותי במהירות לאחר החיסון, בעוד שהקווים האחרים הראו עיכוב בתגובה זו בכ- 42 שעות.תגובות הגנה קשורות לגנים TIR-NBS, CC-NBS-LRR ו-NBS-LRR, 10 חלבונים המעורבים בפתוגנזה, חלבוני העברת שומנים, אנדוגלוקן-1,3-β-גלוקוזידאז, חלבוני דופן תא עשירים בגליצין וגנים ממסלול תגובתי של חמצן.תגובות מוקדמות ל-83A:476, כולל דיכוי קפדני של גנים הקשורים לפוטוסינתזה, עלו בקנה אחד עם הגנה מוצלחת בשלב הצמיחה הווגטטיבית של הביולוגיה הפטרייתית, מה שמצביע על כך שאפקטור מפעיל חסינות.תגובת מנדלופ מואטת, וכך גם הגרר האופקי הכולל.
תורמוס צר-עלים (NLL, Lupinus angustifolius L.) הוא דגן עתיר חלבון שמקורו במערב אזור הים התיכון1,2.כיום הוא גדל כגידול מזון לבעלי חיים ולבני אדם.הוא נחשב גם לזבל ירוק במערכות מחזור יבולים עקב קיבוע חנקן על ידי חיידקים סימביוטיים מקבעי חנקן ושיפור כולל של מבנה הקרקע.NLL עבר תהליך מהיר של ביות במאה האחרונה ועדיין נמצא בלחץ רבייה גבוה3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.עם הגידול הנרחב של NLL, רצף הפטריות הפתוגניות פיתחה נישות חקלאיות חדשות וגרמה למחלות חדשות להרס יבולים. הדבר המדהים ביותר עבור חקלאים ומגדלי תורמוס היה הופעתו של אנתרקנוז, שנגרם על ידי הפטרייה הפתוגנית, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. הדבר המדהים ביותר עבור חקלאים ומגדלי תורמוס היה הופעתו של אנתרקנוז, שנגרם על ידי הפטרייה הפתוגנית, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогногонго Наиболее , Feiler & Hagedorn13. הבולטים ביותר לחקלאים ומגדלי התורמוסים הייתה הופעתו של אנתרקנוז שנגרם על ידי הפטרייה הפתוגנית Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県它是由県它是由県, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眵它是由眵שיער. 1 (Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патоговаемого павляется ) נירנברג, פיילר והגדורן13. המכה ביותר לחקלאים ומגדלים לופין הוא הופעתם של אנתרקנוזה הנגרמת על ידי הפטרייה הפתוגנית Colletotrichum Lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.הדיווחים המוקדמים ביותר על המחלה הגיעו מברזיל ומארצות הברית, עם תסמינים אופייניים שהופיעו ב-1912 וב-1929 בהתאמה.עם זאת, לאחר כ-30 שנה, הפתוגן הוגדר כ- Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., טלאומורף של Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (סטונמן) ספולד. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (סטונמן) ספולד. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld במורפולוגיה ממוקדת. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.וה' שרנק. & H.施伦克，. & H.施伦克，.וה' שלנק,.פנוטייפ ראשוני של מחלות שנעשה באמצע המאה ה-20 הראה עמידות מסוימת בהצטרפות של NLL ותורמוס צהוב (L. luteus L.), אך כל ההצטרפות של תורמוס לבן (L. albus L.) שנבדקו היו רגישות מאוד15,16.מחקרים הראו שהתפתחות אנתרקנוז קשורה לעלייה במשקעים (לחות אוויר) וטמפרטורה (בטווח של 12-28 מעלות צלזיוס), מה שמוביל להפרת התנגדות בטמפרטורות גבוהות יותר 17, 18. למעשה, הזמן שנדרש לנביטה של ​​קונידיות ולהתחלת המחלה, היה קצר פי 4 ב-24 מעלות צלזיוס (12 שעות) בתנאי לחות גבוהים (16) מעלות לחות (4 שעות).לפיכך, ההתחממות הגלובלית המתמשכת הובילה להתפשטות האנתרקנוז.עם זאת, המחלה נצפתה בצרפת (1982) ובאוקראינה (1983) כמבשר על איום מתקרב, אך ככל הנראה התעלמה על ידי תעשיית התורמוסים באותה עת20,21.כמה שנים לאחר מכן, המחלה ההרסנית הזו התפשטה ברחבי העולם ופגעה גם במדינות גדולות המייצרות תורמוסים כמו אוסטרליה, פולין וגרמניה22,23,24.לאחר התפרצות אנתרקנוזה באמצע שנות ה-90, בדיקה מקיפה הביאה לזיהוי של מספר תורמים עמידים בדגימות NLL19.עמידות NLL לאנתרקנוזה נשלטת על ידי שני אללים דומיננטיים נפרדים המצויים במקורות נבט שונים: Lanr1 בזן Tanjil ו-Wonga ו-AnMan בזן.Mandalay 25, 26. אללים אלה משלימים את הסמנים המולקולריים התומכים בבחירה של germplasm עמיד בתוכניות רבייה25,26,27,28,29,30.קו הרבייה העמיד 83A:476 הנושא את האלל Lanr1 הוחצה עם הקו הפראי הרגיש P27255 כדי להשיג אוכלוסיית RIL המפרידה עבור עמידות לאנתרקנוזה, מה שאיפשר להקצות את הלוקוס Lanr1 לכרומוזום NLL-1131, 32, 33. Alignic annthracnose LL חשף את מיקומם של כל שלושת האללים על אותו כרומוזום (NLL-11), אך במיקומים שונים29,34,35.עם זאת, בשל המספר הקטן של RILs והמרחק הגנטי הגדול בין סמנים לאללים תואמים, לא ניתן להסיק מסקנות מהימנות לגבי הגנים הבסיסיים שלהם.מצד שני, השימוש בגנטיקה הפוכה בתורמוסים קשה בגלל פוטנציאל ההתחדשות הנמוך מאוד שלהם, מה שהופך את המניפולציה הגנטית למסורבלת37.
התפתחותה של נבט מזון מבוית הנושאת את האלל הרצוי במדינה ההומוזיגוזית, כמו 83 א: 476 (LANR1) ומנדלופ (אנמן), פתחה את הדלת לחקר התנגדות לאנתרקנוזה לנוכח נוכחותם של שילובים מנוגדים של אללים באוכלוסיות פראיות.אפשרויות של מנגנונים מולקולריים.השווה תגובות הגנה שנוצרו על ידי גנוטיפים ספציפיים.מחקר זה העריך את תגובת התעתיק המוקדמת של NLL לחיסון C. lupini.ראשית, פאנל נבט אירופאי NLL המכיל 215 שורות נבדק באמצעות סמנים מולקולריים המסמנים את האללים Lanr1 ו-AnMan.לאחר מכן בוצע פנוטייפ אנתרקנוז על 50 קווים NLL, שנבחרו בעבר עבור סמנים מולקולריים, בתנאים מבוקרים.בהתבסס על ניסויים אלה, נבחרו ארבע שורות השונות בהתנגדות לאנתרקנוזה והרכב אלליות LANR1/ANMAN נבחרו לצורך פרופיל ביטוי גנים הגנה דיפרנציאלי באמצעות שתי גישות משלימות: רצף RNA בעל תפוקה גבוהה וכימות PCR בזמן אמת.
הקרנת קבוצה של נבט NLL (n = 215) עם סמנים LANR1 (ANSEQ3 ו- ANSEQ4) ו- ANMAN (ANSEQ4) ו- ANMAN (ANMANM1) הראו שרק קו אחד (95726, כמעט סלמנקה-B) מגדיל את "ההתנגדות" של כל הסימון ל"התנגדות ".13 קווים יצרו שני אללים "עמידים" של סמן Lanr1, ו-8 שורות יצרו אללים "עמידים" של Lanr1.סַמָן.אלל ה"התנגדות" של סמן AnMan (טבלה משלימה S1).שני קווים היו הטרוזיגוטיים לסמן Anseq3 ואחד הטרוזיגוטי לסמן AnManM1.42 שורות (19.5%) נשאו פאזות מנוגדות של האללים Anseq3 ו-Anseq4, מה שמצביע על תדירות גבוהה של ריקומבינציה בין שני לוקוסים אלה.פנוטיפים של אנתרקנוזה בתנאים מבוקרים (טבלה משלימה S2) חשפו שונות בעמידות של הגנוטיפים שנבדקו, אשר באה לידי ביטוי בחומרת האנתרקנוז.הבדלים בממוצע הציונים נעו בין 1.8 (עמיד בינוני) ל-6.9 (רגיש) והפרשי משקל הצמחים נעו בין 0.62 (רגישים) ל-4.45 גרם (עמידים). נמצא קשר משמעותי בין ערכים שנצפו בשני שכפול של הניסוי (0.51 לציוני חומרת המחלה, p = 0.00017 ו- 0.61 למשקל הצמח, P <0.0001) וכן בין שני הפרמטרים הללו ( - 0.59 ו- - 0.77, p <0.0001). נמצא קשר משמעותי בין ערכים שנצפו בשני שכפול של הניסוי (0.51 לציוני חומרת המחלה, p = 0.00017 ו- 0.61 למשקל הצמח, P <0.0001) וכן בין שני הפרמטרים הללו ( - 0.59 ו- - 0.77, p <0.0001). Ы ыена досоверная кדיר лезни, p = 0,00017 и 0,61 д мéа р расения, p <0,0001), аéаеж м э эимим01717, пéаежежеж э эим1717. מתאם משמעותי נמצא בין הערכים שנצפו בשתי חזרות על הניסוי (0.51 לציוני חומרת המחלה, p = 0.00017 ו- 0.61 למשקל הצמח, P <0.0001), כמו גם בין שני הפרמטרים הללו ( - 0.59 ו- -0.77, p <0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分.0.0.7物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈帆 诟 5. 1 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（， 5.9.和– 0.59 和- 0.77，P < 0.0001). Нlюалас значителная корелия меж значенияופים, набаеаеи в х х х х х , 00017 и маса расения 0,61, p <0,0001), и межж эими д у параметрамלוח (-0,59 и0,0001) 0,77, p <0,0001. נמצא קשר משמעותי בין הערכים שנצפו בשכפול (ציון חומרת המחלה 0.51, p = 0.00017 לבין משקל הצמח 0.61, p <0.0001) ובין שני הפרמטרים הללו (-0.59 ו- -0 .0001) 0.77, p <0.0001. ).תסמינים אופייניים שנראו בצמחים רגישים כוללים קינקינג ופיתול של הגבעול הדומה למבנה "קשת רועה", ואחריו נגעים סגלגלים עם ספורוזויטים כתומים/ורודים (איור 1 משלים).ההצטרפות האוסטרלית הנושאות את הגנים Lanr1 (83A:476 ו-Tanjil) ו-AnMan (Mandelup) הינן עמידות בינונית, 0.0331 ו-0.0036.כמה קווים הנושאים גם אללים "עמידים" של Lanr1 ו/או AnMan מראים תסמינים של המחלה.
Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеляст, покасусаливыки антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 או AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для пречение), 0,0001 לשירותים ו-0,001 למוצרי עבודה) ושירותים B-549/79b (זמינים P <0,0001 לשירותים וניזרים). מעניין לציין כי מספר קווי NLL חסרי אלל סמן 'עמיד' הראו רמה גבוהה של עמידות לאנתרקנוזה (דומה או יותר או גבוה יותר מאשר עבור גנוטיפים של LANR1 או ANMAN), כמו בורגין (P ערך <0.0001 עבור שני הפרמטרים), BOJAR (P ערך <0.0001 עבור הערכה ו- 0.001 משקל) ואוכלוסייה).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的瀅疽1.基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值逼高.0.0.0.0.0 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）. מעניין שכמה מערכות NLL שאין להן סמנים "אנטיגניים" מציגות עמידות אופקית גבוהה (שווה ערך לגנים Lanr1 או AnMan ומעלה), כמו Boregine (שני הפרמטרים P < 0.0001), Bojar (ערך P < 0.0001, משקל הצמח 0.001) וערך B-509/70.0P0 משמעותי של זן < 10.0P0 (משקל משמעותי). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показаличо антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (זנתה P обоих параметров <0,000счение <0,000с1), (p. а растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). מעניין לציין שחלק מהשורות של NLL חסרות כל אללים של סמן 'התנגדות' הראו רמות גבוהות של עמידות לאנתרקנוז (בהשוואה לגנוטיפים של Lanr1 או AnMan או גבוהים ממנה), כגון Boregine (ערך P עבור שני הפרמטרים <0.0001), Bojar (ערך P < 0.0001, משקל צמח < 0.00b 0.051)/0.00b 9. 1, משקל לא משמעותי).תופעה זו מציעה אפשרות של מקור גנטי חדש לעמידות, ומסבירה את היעדר המתאם הנצפה בין גנוטיפים של סמן ופנוטיפים של מחלות (ערכי P מ-0.42 ל-0.98 ~).לפיכך, בדיקת Kolmogorov-Smirnov הראתה שהנתונים על עמידות לאנתרקנוז היו מופצים באופן נורמאלי לציונים (ערכי P 0.25 ו-0.11) ומסת צמחים (ערכי P 0.47 ו-0.55), מה שמרמז על כך שאני משער שיותר אללים מאשר Lanr1 ו-AnMan מעורבים.
בהתבסס על תוצאות בדיקת העמידות לאנתרקנוזה, נבחרו 4 קווים לניתוח תעתיקים: 83A:476, Boregine, Mandelup ואוכלוסיית 22660. קווים אלו נבדקו מחדש לאיתור עמידות לאנתרקס בניסויי חיסון על ידי רצף RNA, בתנאי שהם היו זהים לבדיקה הקודמת.ערכי הציון היו כדלקמן: בורגין (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), מנדלופ (3.82 ± 1.42) ואוכלוסייה 22660 (6.11 ± 1.29).
פרוטוקול Illumina NovaSeq 6000 השיג ממוצע של 40.5 זוגות Mread לדגימה (29.7 עד 54.4 Mreads) (טבלה משלימה S3).ציוני היישור ברצף הייחוס נעו בין 75.5% ל-88.6%.המתאם הממוצע של נתוני ספירת קריאה בין וריאנטים ניסיוניים בין שכפולים ביולוגיים נע בין 0.812 ל-0.997 (ממוצע 0.959). מתוך 35,170 הגנים שנותחו, 2917 לא חשפו ביטוי, ושאר 4785 הגנים באו לידי ביטוי ברמה זניחה (ממוצע בסיס < 5). מתוך 35,170 הגנים שנותחו, 2917 לא חשפו ביטוי, ושאר 4785 הגנים באו לידי ביטוי ברמה זניחה (ממוצע בסיס < 5). בערך 35 170 רווחים 2917 לא רווחים, ממוצע של 4785 רווחים зовое среднее <5). מתוך 35,170 הגנים שנותחו, 2917 לא הראו ביטוי, ו-4785 הגנים הנותרים באו לידי ביטוי ברמה זניחה (ממוצע בסיס <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达叟忽值<5）.35,170 בערך 35 170 רווחים 2917 נראים לא מובנים, יש 4785 רובל נכסים нее значение <5). מתוך 35,170 הגנים שנותחו, 2917 לא באו לידי ביטוי ושאר 4785 הגנים היו בעלי ביטוי זניח (ממוצע בסיס <5).לפיכך, מספר הגנים שנחשבו לבטא (ממוצע בסיס ≥ 5) במהלך הניסוי היה 27,468 (78.1%) (טבלה משלימה S4).
מנקודת הזמן הראשונה, כל קווי ה-NLL הגיבו לחיסון של C. lupini (זן Col-08) על ידי תכנות מחדש של התעתיק (טבלה 1), עם זאת, נצפו הבדלים משמעותיים בין השורות.לפיכך, קו ההתנגדות 83A:476 (הנושא את הגן Lanr1) הראה תכנות מחדש של תעתיק משמעותי בנקודת הזמן הראשונה (6 hpi) עם עלייה של פי 31-69 במספר הגנים המבודדים למעלה ולמטה בהשוואה לנקודות זמן אחרות בנקודת זמן זו.בנוסף, שיא זה היה קצר מועד, שכן הביטוי של גנים בודדים בלבד נותר שונה באופן משמעותי בנקודת הזמן השנייה (12 hpi).מעניין לציין ש-Boregine, שגם הראתה רמת עמידות גבוהה בבדיקת השתל, לא עברה תכנות כה מסיבי של תמלול במהלך הניסוי.עם זאת, מספר הגנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית (DEG) היה זהה עבור Boregine ו-83A:476 ב-12 HPI.גם מנדלופ וגם אוכלוסיית 22660 הראו שיאי DEG בנקודת הזמן האחרונה (48 ליטר לשנייה), מה שמצביע על עיכוב יחסי בתגובות ההגנה.
מכיוון ש-83A:476 עבר תכנות מחדש של תעתיק מסיבי בתגובה ל-C. lupini ב-6 HPI בהשוואה לכל הקווים האחרים, ~91% מה-DEG שנצפו בנקודת זמן זו היו ספציפיים לשושלת (איור 1).עם זאת, הייתה חפיפה מסוימת בתגובות המוקדמות בין קווי המחקר, שכן 68.5%, 50.9% ו-52.6% DEG ב-Boregine, Mandelup ואוכלוסיית 22660, בהתאמה, חפפו לאלה שנמצאו ב-83A:476 בנקודות זמן מסוימות.עם זאת, DEGs אלה היוו רק חלק קטן (0.97-1.70%) מכל ה-DEGs שזוהו כעת באמצעות 83A:476.בנוסף, 11 DEG מכל הקווים היו קוהרנטיים בשלב זה (טבלאות משלימות S4-S6), כולל מרכיבים נפוצים של תגובות הגנת הצמח: חלבון העברת שומנים (TanjilG_32225), אנזים אנדוגלוקן-1,3-β-glucoside (TanjilG_23382) (TanjilG_23382) חלבון stress-in-Tanjil8 ו-TanjilG_23382 (33824) G_31531), חלבון לטקס בסיסי (TanjilG_32352), ושני חלבונים מבני דופן תא עשירים בגליצין (TanjilG_19701 ו-TanjilG_19702).הייתה גם חפיפה גבוהה יחסית בתגובות התעתיק בין 83A:476 ל-Boregine ב-24 HPI (סה"כ 16-38% DEG) ובין Mandelup ואוכלוסיית 22660 ב-48 HPI (סה"כ 14-20% DEG).
דיאגרמת Venn המציגה את מספר הגנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית (DEG) בקווי תורמוס צר-עלים (NLL) שחוסנו עם Colletotrichum lupini (זן Col-08 שהתקבל משדות תורמוסים ב-Wierzhenice, פולין, 1999).קווי ה-NLL שנותחו היו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל Lanr1), בורג'ין (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), מנדלופ (עמיד בינוני, נושא את האלל AnMan) ואוכלוסייה 22660 (רגישים מאוד).הקיצור hpi עומד על שעות לאחר החיסון.ערכי אפס הוסרו כדי לפשט את הגרף.
קבוצת הגנים המובעים יתר על המידה ב-6 hpi נותחה עבור נוכחותם של תחומי גן R קנוניים (טבלה משלימה S7).מחקר זה חשף אינדוקציה של תעתיק של גנים קלאסיים של עמידות למחלה עם תחומי NBS-LRR רק ב-83A:476.קבוצה זו כללה גן TIR-NBS-LRR אחד (tanjilg_05042), חמישה גנים CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, ו-tanjilg_16162), ו-FourNjilg_16162, Tanjilg_16162, ו-FourNjilg_161BS, 16162) וכן Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) ו- Four NBS-LRR (TANJILG_16162).לכל הגנים הללו יש תחומים קנוניים המסודרים ברצפים משומרים.בנוסף לגנים של תחום ה-NBS-LRR, כמה קינאזות RLL הופעלו ב-6 hpi, כלומר אחד ב-Boregine (TanjilG_19877), שניים ב-Mandelup (TanjilG_07141 ו-TanjilG_19877) ובאוכלוסיה 22660 (TanjilG_07A 1 ב-361G_07 ו-1 ב-TanjilG_07) :476.
גנים עם שינוי משמעותי בביטוי בתגובה לחיסון עם C. lupini (זן Col-08) עברו ניתוח העשרה של Gene Ontology (GO) (טבלה משלימה S8). מונח התהליך הביולוגי הנפוץ ביותר היה "GO:0006952 תגובת הגנה" שהופיע ב-6 מתוך 16 (זמן × קו) שילובים בעלי מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (איור 2). מונח התהליך הביולוגי הנפוץ ביותר היה "GO:0006952 תגובת הגנה" שהופיע ב-6 מתוך 16 (זמן × קו) שילובים בעלי מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (איור 2). כל הזכויות שמורות из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). מונח התהליך הביולוגי הנפוץ ביותר היה 'GO:0006952 תגובת הגנה', שהופיע ב-6 מתוך 16 שילובים (זמן × שושלת) עם מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (איור 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现圴圴在16 丿缉组庐纗缉终个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. מונח התהליך הביולוגי המייצג ביותר הוא "GO:0006952 תגובת הגנה", המופיע ב-6 מתוך 16 השילובים (时间×线), עם מובהקות גבוהה (ערך P <0.001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», колсторвыв16 инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). מונח התהליך הביולוגי המוצג בתדירות יתר היה 'GO:0006952 Defense Response', שהופיע ב-6 מתוך 16 שילובים (זמן × קו) עם מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (איור 2).מונח זה היה מיוצג יתר על המידה בשתי נקודות זמן ב-83A: 476 ו-Boregine (6 ו-24 כ"ס) ובנקודת זמן אחת במנדלופ ואוכלוסיית 22660 (12 ו-6 כ"ס, בהתאמה).זוהי תוצאה צפויה, המדגישה את התגובה האנטי-פטרייתית של הקווים העמידים.בנוסף, 83A:476 הגיב ל-C. lupini בהשראת גנים הקשורים לפרץ החמצוני המיוצג על ידי המונח "תהליך חיזור GO:0055114", המצביע על תגובת הגנה ספציפית, בעוד שבורג'ין חשף תגובות הגנה ספציפיות, הקשורות למונח 'GO'.:0006950 תגובת לחץ".אוכלוסיה 22660 הפעילה את תגובת העמידות האופקית הכוללת מטבוליטים משניים, והדגישה את מספר המונחים המוגזם "GO:0016104 תהליך של ביוסינתזה של טריטרפן" ו-"GO:0006722 תהליך של מטבוליזם של טריטרפן" (שני המונחים שייכים לאותה קבוצה של גנים), תוך התחשבות בתוצאות העשרת תגובת האדם של ה-GO6 לבין יציבות ה-man22 של תגובת ה-6. 0. בנוסף, תגובה מוקדמת 83A:476 (6 hpi) ותגובה מושהית Mandelup ואוכלוסיית 22660 כוללים את המונח GO:0015979 'פוטוסינתזה' ועוד תהליכים ביולוגיים הקשורים.
המונחים האונטולוגיים של הגנים הביו-פרוססים שנבחרו בביאור של גנים המובעים בצורה דיפרנציאלית במהלך תגובות תעתיק של תורמוס צר-עלים (NLL) שחוסנו בתורמוס אנתרקס (זן Col-08 שהתקבל משדות תורמוס ב-Wierzhenice, פולין, בשנת 1999) מוגזמים מאוד.קווי ה-NLL שנותחו היו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), בורג'ין (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), מנדלופ (עמיד בינוני, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan) ואוכלוסייה 22660 (רגישים).
מכיוון שמחקר זה נועד לזהות גנים התורמים לעמידות לאנתרקנוזה, הגנים שהוקצו למונחים GO "GO: 0006952 תגובות הגנה" ו-"GO: 0055114 תהליכי חיזור" נותחו עם חתכים מכיוון שהבסיס אומר ≥ 30 עם קו אחד לפחות.× נקודת זמן בשילוב ערכים מובהקים סטטיסטית של log2 (שינוי קיפול).מספר הגנים העומדים בקריטריונים אלה היה 65 עבור GO:0006952 ו-524 עבור GO:0055114.
83A:476 חשף שני פסגות של DEG המצוינות במונח GO:0006952, הראשון ב-6 גנים לאינץ' (64 גנים, ויסות מעלה ומטה) והשני ב-24 גנים לאינץ' (15 גנים, ויסות עלייה בלבד).בורג'ין גם הראה ש-GO:0006952 הגיע לשיא באותה נקודת זמן, אך עם פחות DEG (11 ו-8) והפעלה מועדפת.Mandeloop הראה שני שיאים של GO:0006952 ב-12 ו-48 HPI, שניהם נושאים 12 גנים (הראשון עם גנים מפעילים, והשני עם גנים מדכאים בלבד), בעוד שלאוכלוסיית 22660 ב-6 HPI (13 גנים) הייתה דומיננטיות גדולה יותר של שיא העלייה.תַקָנָה.יש לציין של-96.4% מ-GO:0006952 DEG בפסגות אלו היה אותו סוג של תגובה (למעלה או למטה), מה שמצביע על חפיפה משמעותית בתגובות ההגנה למרות הבדלים במספר הגנים המעורבים.הקבוצה הגדולה ביותר של רצפים הקשורים למונח GO:0006952 מקודדת ל-Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (דומה ל-SAM22), השייך לחלבון חלבון הקשור ל-Pathogenesis (PR-10) ולטקס חלבון הליבה.חלבון דומה (דמוי MLP) חלבון (איור 3).שתי הקבוצות נבדלו באופי הביטוי ובכיוון התגובה.הגנים המקודדים לחלבונים דמויי SAM22 הראו אינדוקציה עקבית ומשמעותית בנקודות זמן מוקדמות (6 או 12 hpi) ובדרך כלל לא הגיבו בסוף הניסוי (48 hpi), בעוד שחלבונים דמויי MLP הראו תיאום ב-6 hpi.hpi.83A:476 ומנדלופ ב-48 כ"ס/אינץ', כמעט כל שאר נקודות הנתונים לא הגיבו.בנוסף, הבדלים בפרופילי הביטוי של גנים חלבוניים דמויי SAM22 עקבו אחר השונות הנצפית בעמידות לאנתרקנוזה, שכן לקווים עמידים יותר היו יותר נקודות זמן שגרמו לגנים אלה באופן משמעותי מאשר לגנים רגישים יותר.גן PR-10 דמוי LlR18A/B הראה דפוס ביטוי דומה מאוד לגן החלבון דמוי SAM22.
זוהו המרכיבים העיקריים של מונח התהליך הביולוגי "GO:0006952 Defense Response" ודפוסי הביטוי של גנים מועמדים של אלל Lanr1 ו-AnMan.סולם Log2 מייצג ערכי log2 (שינוי קיפול) בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, המתקבל משדות תורמוס, Wizhenica, פולין, 1999) וצמחי בקרה (מחוסנים בדמה) באותה נקודת זמן.נותחו קווי התורמוס צר העלים הבאים: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), בורג'ין (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), מנדלופ (עמיד בינוני, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan) ואוכלוסיה 22660 (רגישים).
בנוסף, פרופילי הביטוי של הגנים המועמדים ל-RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) ו-AnMan (TanjilG_12861) הוערכו (איור 3).הגן TanjilG_05042 הראה תגובה משמעותית (הפעלה) ב-83A:476 רק בנקודת הזמן הראשונה (6 hpi), בעוד TanjilG_12861 היה משמעותי ב-Mandeloop רק בשתי נקודות זמן: 6 hpi (ויסות מטה) ו-24 hpi (6 hpi).עם.).מתכוונן) ).
הגנים המבוטאים ביותר במונח GO:0055114 "תהליך חיזור" היו גנים המקודדים לחלבוני ציטוכרום P450 ופרוקסידאז (איור 4).עבור דגימות שבודדו מ-83A:476 ב-6 HPI, ערכי log2 מקסימום או מינימלי (שינוי פי שניים) (עבור 86.6% מהגנים) נצפו בדרך כלל בין צמחים מחוסנים ובקרה, מה שמדגיש את התגובה הגבוהה של גנוטיפ זה למין חיסון.83A:476 הראה את ה-GO המשמעותי ביותר: 0055114 DEG ב-6 hpi (503 גנים), בעוד ששאר הקווים ב-48 hpi (Boregine, 31 גנים; Mandelup, 85 גנים; ואוכלוסייה 22660, 78 גנים)).ברוב הגנים ממשפחת GO:0055114 נצפו שני סוגים של תגובות לחיסון (הפעלה ועיכוב).מעניין לציין כי עד 97.6% מה- DEGs שזוהו למונח GO: 0055114 במנדלופה ב 48 כ"ס תצפיות אלה מרמזות כי למרות הסולם הקטן משמעותית (כלומר, מספר הגנים של redox מוטציה, 85 לעומת 503), דפוס התגובות המעוכבות של מנדלופ לאנטרקנוזה הוא דומה לתגובה של 83A.ב-Boregine ובאוכלוסיית 22660, התכנסות זו נמוכה יותר ב-51.6% ו-75.6%, בהתאמה.
נחשפו דפוסי הביטוי של המרכיבים העיקריים של המונח של התהליך הביולוגי "GO:0055114 תהליך חיזור".סולם Log2 מייצג ערכי log2 (שינוי קיפול) בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, המתקבל משדות תורמוס, Wizhenica, פולין, 1999) וצמחי בקרה (מחוסנים בדמה) באותה נקודת זמן.נותחו קווי התורמוס צר העלים הבאים: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), בורג'ין (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), מנדלופ (עמיד בינוני, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan) ואוכלוסיה 22660 (רגישים).
83A:476 תגובות טרנסקריפטומיות לחיסון עם C. lupini (זן Col-08) כללו גם השתקה מתואמת של גנים המיוחסים למונח GO:0015979 "פוטוסינתזה" ותהליכים ביולוגיים קשורים אחרים (איור 5).סט GO:0015979 DEG הזה הכיל 105 גנים שהודחקו באופן משמעותי ב-6 hpi ב-83A:476.בתת-קבוצה זו, 37 גנים היו גם מווסתים מטה ב-Mandelup ב-48 HPI ו-35 באותה נקודת זמן באוכלוסיית 22660, כולל 19 DEG משותפים לשני הגנוטיפים.אין DEGs הקשורים למונח GO: 0015979 הופעלו באופן משמעותי בכל שילוב (שורה x זמן).
נחשפו דפוסי הביטוי של המרכיבים העיקריים של המונח של התהליך הביולוגי "GO:0015979 פוטוסינתזה".סולם Log2 מייצג ערכי log2 (שינוי קיפול) בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, המתקבל משדות תורמוס, Wizhenica, פולין, 1999) וצמחי בקרה (מחוסנים בדמה) באותה נקודת זמן.נותחו קווי התורמוס צר העלים הבאים: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), בורג'ין (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), מנדלופ (עמיד בינוני, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan) ואוכלוסיה 22660 (רגישים).
בהתבסס על תוצאות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וככל הנראה מעורב בתגובות הגנה מפני פטריות פתוגניות, קבוצה זו של שבעה גנים נבחרה לכימות פרופילי ביטוי על ידי PCR בזמן אמת (טבלה משלימה S9).
גן החלבון המשוער TanjilG_10657 הושרה באופן משמעותי בכל הקווים ונקודות הזמן שנחקרו בהשוואה לצמחי בקרה (מחקים) (טבלאות משלימות S10, S11).בנוסף, פרופיל הביטוי של TanjilG_10657 הראה מגמת עלייה במהלך הניסוי עבור כל הקווים.אוכלוסייה 22660 הראתה את הרגישות הגבוהה ביותר של TanjilG_10657 לחיסון עם הפעלה פי 114 ואת רמת הביטוי היחסית הגבוהה ביותר (4.4 ± 0.4) ב-24 HPI (איור 6א).גן החלבון PR10 LlR18A TanjilG_27015 גם הראה הפעלה על פני כל הקווים ונקודות הזמן, עם מובהקות סטטיסטית ברוב נקודות הנתונים (איור 6b).בדומה ל-TanjilG_10657, רמת הביטוי היחסית הגבוהה ביותר של TanjilG_27015 נצפתה באוכלוסיית 22660 מחוסנים ב-24 HPI (19.5 ± 2.4).הגן החומצתי אנדוציטינאז TanjilG_04706 היה מווסת באופן משמעותי בכל הקווים ובכל נקודות הזמן מלבד Boregine 6 hpi (איור 6c).הוא הושרה חזק בנקודת הזמן הראשונה (6 HPI) ב-83A:476 (פי 10.5) ועלה מתונה בקווים אחרים (פי 6.6-7.5).במהלך הניסוי, הביטוי של TanjilG_04706 נשאר ברמות דומות ב-83A:476 וב-Boregine, בעוד שבמנדלופ ובאוכלוסיית 22660 הוא גדל באופן משמעותי, והגיע לערכים גבוהים יחסית (5.9 ± 1.5 ו-6.2 ± 1.5, בהתאמה).הגן דמוי ה-endoglucan-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 הראה הפעלה גבוהה בשתי נקודות הזמן הראשונות (6 ו-12 hpi) בכל השורות למעט אוכלוסיה 22660 (איור 6ד).רמות הביטוי היחסיות הגבוהות ביותר של TanjilG_23384 נצפו בנקודת הזמן השנייה (12 hpi) במנדלופ (2.7 ± 0.3) וב-83A:476 (1.5 ± 0.1).ב-24 HPI, ביטוי TanjilG_23384 היה נמוך יחסית בכל הקווים שנחקרו (מ-0.04 ± 0.009 ל-0.44 ± 0.12).
פרופילי ביטוי של גנים נבחרים (ag) שנחשפו על ידי PCR כמותי.המספרים 6, 12 ו-24 מייצגים שעות לאחר החיסון.הגנים LanDExH7 ו- LanTUB6 שימשו לנורמליזציה ו- LanTUB6 שימש לכיול בין-סדרות.פסי שגיאה מייצגים את סטיית התקן המבוססת על שלושה שכפולים ביולוגיים, שכל אחד מהם הוא הממוצע של שלושה שכפולים טכניים. המובהקות הסטטיסטית של הבדלים ברמות הביטוי בין הצמחים המחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהתקבלו בשנת 1999 משדה התורמוסים ב-Wierzenica, פולין) וצמחי הבקרה (מחוסנים) מסומנים מעל נקודות הנתונים (*ערך P < 0.05, ערך **P.0 ≤ .0 .0). המובהקות הסטטיסטית של הבדלים ברמות הביטוי בין הצמחים המחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהתקבלו בשנת 1999 משדה התורמוסים ב-Wierzenica, פולין) וצמחי הבקרה (מחוסנים) מסומנים מעל נקודות הנתונים (*ערך P < 0.05, ערך **P.0 ≤ .0 .0). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 9 пгв Col-08, 9 пг. юпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данными (5,*0,0,0 ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). הבדלים מובהקים סטטיסטית ברמות הביטוי בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושגו בשנת 1999 משדה תורמוסים ב-Wierzhenice, פולין) לבין צמחי בקרה (מחוסנים בדמה) מצוינים מעל נקודות הנתונים (*ערך P < 0.05, **P-value ≤, *** 0.0.0 P ≤ .*** 0).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（騡种缉接（模种羽扇水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值)≤ 0.0)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤秉 种平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤。01)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, пулню Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точными <-*0, P.** начение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). הבדלים מובהקים סטטיסטית ברמות הביטוי בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהתקבלו משדות תורמוסים ב-Verzhenice, פולין, בשנת 1999) לבין צמחי ביקורת (מחוסנים בדמה) מצוינים מעל נקודות הנתונים (*ערך P < 0.05 , **P-value ≤ .***0.קווי ה-NLL שנותחו היו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), Mandelup (עמיד בינוני, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan), Boregine (עמיד, רקע גנטי לא ידוע) ואוכלוסייה 22660 (רגישים).
הגן המועמד TanjilG_05042 במיקום Lanr1 הראה דפוס ביטוי שונה בולט מהפרופילים שהתקבלו ממחקרי RNA-seq (איור 6ה).הפעלה משמעותית של גן זה נצפתה במנדלופ ובאוכלוסיית 22660 (עד פי 39.7 ו-11.7 בהתאמה), וכתוצאה מכך רמות ביטוי גבוהות יחסית (עד 1.4 ± 0.14 ו-7.2 ± 1.3, בהתאמה).83A:476 גילה גם וויסות-על מסוים של הגן TanjilG_05042 (עד פי 3.8), עם זאת, רמות הביטוי היחסיות שהושגו (0.044 ± 0.002) היו נמוכות ביותר מפי 30 מאלה שנצפו במנדלופ ובאוכלוסיית 22660.נותח על ידי qPCR הראה הבדלים משמעותיים ברמות הביטוי בין הגנוטיפים בווריאציות מחוסנות מדומה (ביקורת), והגיעו להפרש של פי 58 בין אוכלוסיות 22660 ו-83A:476, כמו גם בין אוכלוסיות 22660 ו-22660. הושג הבדל פי שניים בין בורג'ין למנדלאפ.
הגן המועמד בלוקוס של AnMan, TanjilG_12861, הופעל בתגובה לחיסון ב-83A:476 ומנדלופ, היה ניטרלי באוכלוסיית 22660, והוחל ב-Boregine (איור 6f).הביטוי היחסי של הגן TanjilG_12861 היה הגבוה ביותר ב-83A מחוסן: 476 (0.14±0.01).גן חלבון הלם חום 17.4 kDa Class I TanjilG_05080 HSP17.4 הראה רמות ביטוי יחסיות נמוכות יותר בכל הזנים ונקודות הזמן שנחקרו (איור 6g).הערך הגבוה ביותר נצפה ב-24 HPI באוכלוסיית 22660 (0.14 ± 0.02, עלייה של פי שמונה בתגובה לחיסון).
השוואה של פרופילי ביטוי גנים (איור 7) גילתה מתאם גבוה בין TanjilG_10657 לארבעה גנים אחרים: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) (4 = 0.80).תוצאות כאלה עשויות להצביע על שיתוף-וויסות של גנים אלה במהלך תגובות הגנה.הגנים TanjilG_12861 ו-TanjilG_23384 הראו פרופילי ביטוי שונים עם ערכי מקדם מתאם פירסון נמוכים יותר (מ-0.08 עד 0.43 ו-0.19 עד 0.28, בהתאמה) בהשוואה לגנים אחרים.
מתאמים בין פרופילי ביטוי גנים זוהו באמצעות PCR כמותי.נותחו קווי התורמוס הצר-עלים הבאים: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), Mandelup (עמיד בינוני, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan), בורג'ין (עמיד, רקע גנטי לא ידוע) ואוכלוסייה 22660 (רגישה).חושבו שלוש נקודות זמן (6, 12 ו-24 שעות לאחר החיסון), כולל צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהתקבל משדות תורמוסים ב-Wierzhenice, פולין, בשנת 1999) וצמחי בקרה (מחוסנים מדומה).הסולם מציג את הערך של מקדם המתאם של פירסון.
בהתבסס על נתונים שהתקבלו ב-6 כוחות סוס לאינץ', WGCNA בוצע ב-9981 DEG שזוהה על ידי השוואת מפעלי חיסון ובקרה כדי להתמקד בתגובות הגנה מוקדמות (טבלה משלימה S12).נמצאו 22 מודולי גנים (אשכולות) עם פרופילי ביטוי מתואמים (חיוביים או שליליים) בין גנוטיפים וגרסאות ניסוי. בממוצע, רמות ביטוי הגנים היו יורדות בסדר 83A:476 > Mandelup > Boregine > אוכלוסייה 22660 (בשתי הגרסאות, לעומת זאת, מגמה זו הייתה חזקה יותר בצמחי בקרה). בממוצע, רמות ביטוי הגנים היו יורדות בסדר 83A:476 > Mandelup > Boregine > אוכלוסייה 22660 (בשתי הגרסאות, לעומת זאת, מגמה זו הייתה חזקה יותר בצמחי בקרה). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > מנדלופ > בורג'ין > אוכלוסייה 22660 ла сильнее у контрольных растений). בממוצע, רמות ביטוי הגנים ירדו בסדר 83A:476 > Mandelup > Boregine > אוכלוסייה 22660 (בשתי הגרסאות, לעומת זאת, מגמה זו הייתה חזקה יותר בצמחי בקרה).平均而言，基因表达水平按83A:476 > מנדלופ > בורג'ין > אוכלוסייה 22660在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> אוכלוסייה 22660 的 顺序 下降 （， 県 圿在 植物 中 更）。。。。。。。。。…… В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > מנדלופ > בורג'ין > אוכלוסייה 22660 ильнее у контрольных растений). בממוצע, רמות ביטוי הגנים ירדו בסדרה 83A:476 > Mandelup > Boregine > אוכלוסייה 22660 (עם זאת, בשתי הגרסאות, מגמה זו הייתה חזקה יותר בצמחי בקרה).חיסון הביא להגברת ויסות ביטוי הגנים, במיוחד במודולים 18, 19, 14, 6 ו-1 (בסדר יורד של השפעה), ויסות שלילי (למשל מודולים 9 ו-20) או עם השפעות ניטרליות (למשל מודולים 11, 22, 8 ו-13).ניתוח העשרה של מונחי GO (טבלה משלימה S13) גילה "GO: 0006952 תגובות הגנה" למודול המחוסן (18) עם הפעלה מקסימלית, כולל גנים שנותחו על ידי qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_23384, TanjilG_775, כמו גם רבים Incul2G_1055) מודולי פוטוסינתזה (9).רכז מודול 18 (איור 8) זוהה כגן TanjilG_26536 המקודד לחלבון LlR18B דמוי PR-10, ומרכז מודול 9 זוהה כגן TanjilG_28955 המקודד לחלבון photosystem II PsbQ.גן מועמד לעמידות לאנתרקנוז Lanr1, TanjilG_05042, נמצא במודול 22 (איור 9) והוא קשור למונחים "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" ו-"GO:0006355 Transcriptional Regulation, DNA templating" הנושא את ה-Tanjil212G_hub.
ניתוח רשת משוקלל של ביטוי משותף של גנים של מודולים עם מונחי תהליך ביולוגי מיוצגים יתר על המידה "GO: 0006952 תגובות הגנה".הקשירה הייתה פשוטה כדי להדגיש את ארבעת הגנים שנותחו על ידי qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ו-TanjilG_27015).
ניתוח רשת משוקלל של ביטוי משותף של גנים של מודול עם מונח תהליך ביולוגי מיוצג יתר על המידה "GO: 0006355: תעתיק תעתיק, תבנית DNA" ונושאת גן מועמד לעמידות לאנתרקנוז Lanr1 TanjilG_05042.
Kalya, Coromup ומנדלופ תוארו כעמידים במידה בינונית, בעוד Wonga, Tanjil ו-83A:476 תוארו כעמידים מאוד26,27,31.היה לו את אותו אלל התנגדות, המיועד ל-Lanr1, ול-Coromup ול-Mandelup היה אלל שונה, שכותרתו AnMan10, 26, 39, בעוד Kalya העבירה אלל אחר., לאנר2.בדיקת עמידות לאנתרקנוזה בגרמניה הביאה לזיהוי של קו עמיד Bo7212 עם אלל מועמד אחר מלבד Lanr1, המכונה LanrBo36.
תצפית זו עולה בקנה אחד עם התוצאות של סקר נבט במזרח אירופה באמצעות סמני Anseq3 ו-Anseq4, אשר הראו שהאלל Lanr1 קיים רק בשני קווים בלארוסיים.זה מצביע על כך שהאלל Lanr1 עדיין לא נמצא בשימוש נרחב בתוכניות רבייה מקומיות, שלא כמו באוסטרליה, שם הוא אחד האללים המרכזיים לגידול בסיוע סמן.בנוסף, מחקרים של אנתרקנוז באזורי גשם גבוהים באוסטרליה הראו שתגובות עמידות המתווכות על ידי אלל Lanr1 עשויות להיות לא יעילות בתנאי מזג אוויר המעדיפים צמיחה והתפתחות מהירה של הפתוגן19,42.למעשה, במחקר הנוכחי, כמה תסמינים של אנתרקנוזה נצפו גם בגנוטיפים הנושאים את האלל Lanr1, מה שמצביע על כך שעמידות עשויה להיעלם בתנאים אופטימליים להתפתחות של C. lupini.בנוסף, פרשנויות חיוביות כוזבות של נוכחותם של סמני Anseq3 ו-Anseq4, שהם כ-1 ס"מ מהלוקוס של Lanr1, אפשריות 28,30,43.
המחקר שלנו הראה ש-83A:476, הנושא את האלל Lanr1, הגיב לחיסון C. lupini עם תכנות מחדש של תעתיקים בקנה מידה גדול בנקודת הזמן המנותחת הראשונה (6 hpi), בעוד שבמנדלופ, הנושא את האלל AnMan, נצפו תגובות תעתיקים הרבה יותר מאוחר.(מ-24 עד 48 כ"ס).שינויים זמניים אלה בתגובות ההגנה קשורות להבדלים בתסמיני המחלה, מה שמדגיש את החשיבות של זיהוי מוקדם של פתוגנים לתגובה מוצלחת לעמידות.כדי להדביק רקמת צמחית, נבגי אנתרקס חייבים לעבור מספר שלבי התפתחות על פני המארח, כולל נביטה, חלוקת תאים ויצירת אפרסוריום.נספח הוא מבנה זיהומי שמתחבר אל פני המארח ומאפשר חדירה לרקמות המארחות.לפיכך, נבגים של C. gloeosporioides בתמצית אפונה הראו את החלוקה הראשונה של הגרעין לאחר 75-90 דקות של דגירה, היווצרות של צינור נבט לאחר 90-120 דקות ודיכוי לאחר 4 שעות 45 .Mango C. gloeosporioides הראה יותר מ-40% נביטה קונידיאלית לאחר 3 שעות דגירה וכ-20% היווצרות אפרסורים לאחר 4 שעות.הגן CAP20 הקשור לארסיות של C. gloeosporioides הראה פעילות שעתוק בקונידיות יוצרות אפיפיט לאחר דגירה של 3.5 שעות בשעווה משטח אבוקדו עם ריכוז גבוה של חלבון CAP20 לאחר 4 שעות ו-46 דקות.באופן דומה, הפעילות של גנים ביוסינתזה של מלנין ב-C. trifolii נגרמה במהלך דגירה של שעתיים ולאחריה היווצרות אפרסוריום לאחר שעה.מחקרים על רקמות עלים הראו כי לתותים שחוסנו ב-C. acutatum יש דיכוי ראשון ב-8 hpi, בעוד שלעגבניות שחוסנו ב-C. coccodes יש דיכוי ראשון ב-4 hpi48,49.תואם במידה רבה את סולם הזמן של Colletotrichum spp.תהליך זיהומי.תגובות הגנה מהירות ל-83A:476 מצביעות על מעורבות של גנים של עמידות צמחית וגנים מופעלים בחסינות (ETI) בשורה זו, בעוד שהתגובות המושהות של מנדלופ תומכות בהשערת חסינות מופעלת על ידי תבנית מולקולרית (MTI) 50. תגובות מוקדמות ל-83A: 476 ומנדלאפ.החפיפה החלקית בין גנים מווסתים מעלה או מטה בתגובה מושהית תומכת גם בתפיסה זו, שכן ETI נחשבת לעתים קרובות לתגובת MTI מואצת ומשופרת שמגיעה לשיאה במוות תאי מתוכנת באתר הזיהום, המכונה הלם אנפילקטי 51,52.
רוב הגנים המיוחסים למונח מיוצג יתר על המידה Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" הם 11 ההומולוגיות של חלבון הצום 22 (בדומה ל-SAM22) ושבעת הדמויות העיקריות של חלבון לטקס (MLP).חלבונים דמויי 31, 34, 43 ו- 423 הראו דמיון ברצף.גנים דמויי SAM22 הראו הפעלה משמעותית שנמשכה זמן רב יותר, והראו רמות מוגברות של עמידות לאנתרקנוזה (83A: 476 ובורגין).עם זאת, גנים דמויי MLP היו מווסתים רק בקווים הנושאים את אלל ההתנגדות המועמד (83A:476/Lanr1 ב-6 hpi ומנדלופ/AnMan ב-24 hpi).יש לציין כי כל ההומולוגים דמויי SAM22 שזוהו מקורם בצביר גנים המשתרע על פני כ-105 kb, בעוד שגנים דמויי MLP מקורם באזורים נפרדים של הגנום.הפעלה מתואמת של גנים דמויי SAM22 כאלה נמצאה גם במחקר הקודם שלנו על עמידות NLL לחיסון Diaporthettoxica, מה שמרמז שהם מעורבים במרכיבים האופקיים של תגובת ההגנה.מסקנה זו נתמכת גם על ידי דיווחים על תגובה חיובית של גנים דמויי SAM22 לפציעה או טיפול בחומצה סליצילית, מעוררי פטריות או מי חמצן.
גנים דמויי MLP הוכחו כמגיבים ללחצים אביוטיים וביוטיים שונים, כולל זיהומים פטרייתיים חיידקיים, ויראליים ופתוגניים במיני צמחים רבים55.כיווני התגובה לאינטראקציות מסוימות בין צמחים ופתוגנים נעו בין עלייה חזקה (כלומר, במהלך הדבקה של כותנה ב-Verticillium dahliae) לירידה משמעותית (כלומר, לאחר הדבקה של עץ התפוח ב-Alternaria spp.)56,57.הורדת ויסות משמעותית של הגן דמוי MLP 423 נצפתה במהלך הגנות אבוקדו מפני זיהום F. niger ובמהלך הדבקה של עץ התפוח Botryosphaeria berengeriana f.cn.Piricola ו- Alternaria alternata הם Apple Pathotypes58,59.בנוסף, calli תפוחים המבטאים יתר על המידה את הגן דמוי MLP 423 היו בעלי ביטוי נמוך יותר של גנים הקשורים להתנגדות והיו רגישים יותר לזיהום פטרייתי59.בעקבות Fusarium oxysporum f, הגן דמוי MLP 423 דוכא גם בחיידקי שעועית נפוצה עמידה.cn.זיהום שעועית 60.
חברים נוספים ממשפחת PR-10 שזוהו במחקר ה-RNA-seq שלנו היו הגנים LlR18A ו-LlR18B בתגובה לוויסות מעלה, כמו גם הגן המווסת למעלה (גן אחד) או מווסת (3 גנים) עבור חלבון העברת השומנים DIR1..בנוסף, WGCNA מדגישה את הגן LlR18B כמרכז במודול זה, שהוא רגיש מאוד לחיסון ונושא מספר גנים של תגובה מגן.הגנים LlR18A ו-LlR18B נגרו בעלי תורמוס צהובים בתגובה לחיידקים פתוגניים, כמו גם בגבעולים של NLL לאחר חיסון D. toxica, בעוד שההומלוג של האורז של גנים אלה, RSOsPR10, נגרה במהירות על ידי זיהום פטרייתי המעורב ככל הנראה בנתיב ה-Jasmonic acid encoded,61, ה-Jasmonic non-specific. חלבוני תחבורה מזהים הדרושים להופעת עמידות נרכשת מערכתית (SAR).עם התפתחות תגובות הגנה, החלבון DIR1 מועבר ממוקד הזיהום דרך הפלואם כדי לגרום ל-SAR באיברים מרוחקים.מעניין לציין שהגן TanjilG_02313 DIR1 הושרה משמעותית בנקודת הזמן הראשונה בקווים 84A:476 ובאוכלוסיה 22660, אך עמידות לאנתרקנוזה התפתחה בהצלחה רק בשורה 84A:476.זה עשוי להצביע על תת-פונקציונליזציה מסוימת של הגן DIR1 ב-NLL, מאחר ששלושת ההומולוגים הנותרים הגיבו לחיסון רק בקו 83A:476 ב-6 hpi, והתגובה הזו הופנתה כלפי מטה.
במחקר שלנו, הרכיבים הנפוצים ביותר התואמים לתהליך הביולוגי שנקרא "תהליך חיזור GO:0055114" היו חלבון ציטוכרום P450, פרוקסידאז, חומצה לינולאית 9S-/13S-lipoxygenase ו-1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase.בנוסף, ה-WGCNA שלנו מגדיר את ההומלוג HSFA4a כמרכז הנושא מודולים כגון המועמד לגן העמידות ל-Lanr1 TanjilG_05042.
חלבוני ציטוכרום P450 הם oxidoreductases המזרזים תגובות הידרוקסילציה תלויות NADPH ו/או O2 במטבוליזם ראשוני ומשני, כולל חילוף החומרים של קסנוביוטיקה, כמו גם הורמונים, חומצות שומן, סטרולים, רכיבי דופן התא, ביו-פולימרים, והביוסינתזה של תרכובות הגנה במחקר, ה-Log-Chrome Inability של הצמח היה מופחת במחקר 69. 2 (שינוי קיפול) ל-5.7 עקב מספר רב של הומולוגיות שהשתנו (37) והבדלים בדפוסי תגובה בין גנים ספציפיים, המשקפים עדכון כלפי מעלה..שימוש רק בנתוני RNA-seq כדי להבהיר את התפקוד הביולוגי המשוער של גנים NLL במשפחת חלבונים כה גדולה יהיה ספקולטיבי ביותר.עם זאת, ראוי לציין שחלק מהגנים של ציטוכרום P450 קשורים לעמידות מוגברת לפטריות או חיידקים פתוגניים, כולל תרומה לתגובות אלרגיות69,70,71.
פרוקסידאזים Class III הם אנזימים צמחיים רב-תכליתיים המעורבים במגוון רחב של תהליכים מטבוליים במהלך צמיחה והתפתחות צמחים, כמו גם בתגובה ללחצים סביבתיים כגון מליחות, בצורת, עוצמת אור גבוהה והתקפת פתוגנים72.פרוקסידאזות מעורבות באינטראקציה של מספר מיני צמחים עם Anthracis, כולל Stylosanthes humilis ו-C. gloeosporioides, Lens culinaris ו-C. truncatum, Phaseolus vulgaris ו-C. lindemuthianum, Cucumis sativus ו-C. lagenarium73,74,75,76.בנוסף לתפקידיהם האופייניים לווסת התפרצות חמצונית או ביטול עקה חמצונית, פרוקסידאזות עלולות להפריע לצמיחת הפתוגנים על ידי יצירת מחסומים פיזיים המבוססים על חיזוק דופן התא במהלך ליגניפיקציה, תת-יחידה או קישור צולב של תרכובות ספציפיות.ניתן לייחס פונקציה זו בסיליקו לגן TanjilG_03329 המקודד לאניון פרוקסידאז יוצר ליגנין משוער שהוסרה באופן משמעותי במחקר שלנו בקו העמיד 83A:476 ב-6 HPI, אך לא בזנים ונקודות זמן אחרות שלא הגיבו.
לתוצרים של מסלול זה יש פונקציות מרובות בהגנה על הצמח, כולל חיזוק דופן התא באמצעות היווצרות משקעי קלוז ופקטין, וויסות עקה חמצונית באמצעות ייצור מיני חמצן תגובתיים79,80,81,82,83.במחקר הנוכחי, הביטוי של חומצה לינולאית 9S-/13S-lipoxygenase השתנה בכל הזנים, אך באוכלוסיה הרגישה 22660, שררה העלאת ויסות בנקודות זמן שונות, בעוד שבזנים הנושאים Lanr1 עמיד ואלל AnMan, הוא מדגיש את הגיוון של שכבת ה-oxythlipin גנוטרקס מגינים בין הגנוטרקסים הללו.
ההומולוג 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) היה מווסת באופן משמעותי (9 גנים) או הורדה (2 גנים) כאשר חוסן עם תורמוס.ב-83A:476.אינדוקציה של שעתוק ACO והפעלה של מסלול האות אתילן מעורבים בהגברת העמידות של אורז לפטרייה ההמיביוטרופית oryzae oryzae על ידי ויסות הייצור של מיני חמצן תגובתיים ופיטואלקסינים.תהליך זיהום בעלים דומה מאוד שנמצא בין M. oryzae ו-C. lupini88,89, על רקע וויסות עלייה משמעותי של הומולוגיות ACO בקו 83A:476 שדווח במחקר זה, משנה את האפשרות להקנות עמידות ל-NLL anthracnose Etylene כשלב מרכזי איתות במסלולים מולקולריים.
במחקר הנוכחי, דיכוי בקנה מידה גדול של גנים רבים הקשורים לפוטוסינתזה נצפה ב-6 hpi ב-83A:476 וב-48 hpi ב-Mandeloop ובאוכלוסיית 22660.בניסוי זה נצפתה עמידות לאנתרקנוזה.לאחרונה, דיכוי חזק ומוקדם של תמלולים הקשורים לפוטוסינתזה דווח במספר מודלים של אינטראקציות בין צמחים לפתוגנים, כולל חיידקים ופטריות פתוגניים.חיפזון (מ-2 HPI באינטראקציות מסוימות) ודיכוי גלובלי של גנים הקשורים לפוטוסינתזה בתגובה לזיהום יכולים לעורר חסינות צמחית המבוססת על פריסת מיני חמצן תגובתיים והאינטראקציה שלהם עם מסלול החומצה הסליצילית לתווך תגובות אלרגיות 90,94.
לסיכום, מנגנוני תגובת הגנה שהוצעו לשושלת העמידה ביותר (83A:476) כוללים זיהוי מהיר של פתוגנים על ידי הגן R (ככל הנראה TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ואיתת חומצה סליצילית ואתילן בתגובה אלרגית, ולאחר מכן הקמת SAR לטווח ארוך.הפעולה נתמכת על ידי חלבון DIR-1.יש לציין כי התקופה הביוטרופית לזיהום ב- C. lupini קצרה מאוד (בערך יומיים), ואחריה צמיחה נמקית 95.המעבר בין שלבים אלה עשוי להיות קשור לנמק וביטוי של חלבונים הניתנים להשראת אתילן הפועלים כטריגרים לתגובות רגישות יתר בצמחים מארח.לפיכך, חלון הזמן לכידה מוצלחת של C. lupini בשלב הביוטרופי הוא צר מאוד.תכנות מחדש של גנים הקשורים לחמצון ולפוטוסינתזה שנצפה ב-83A:476 ב-6 hpi תואם את ההתקדמות של היפאות פטרייתיות ומבשר על התפתחות תגובת הגנה מוצלחת בשלב הביוטרופי.התגובות הטרנסקריפטומיות של מנדלופ ואוכלוסיית 22660 עשויות להתעכב מכדי ללכוד את הפטרייה לפני המעבר לצמיחה נמקית, עם זאת, מנדלאפ עשוי להיות יעיל יותר מאוכלוסיית 22660 מכיוון שהוויסות המהיר יחסית של חלבון PR-10 מקדם עמידות אופקית.
ETI, המונע על ידי הגן R הקנוני, נראה כמנגנון נפוץ להתנגדות שעועית לאנתרקנוזה.לפיכך, בדגם הקטניות Medicago truncatula, עמידות לאנתרקנוזה ניתנת על ידי הגן RCT1, חבר במחלקת הגן R של הצמח TIR-NBS-LRR97.גן זה מעניק גם עמידות לאנתרקנוזה רחבה-ספקטרום באלפלפה כאשר הוא מועבר לצמחים רגישים.בשעועית הנפוצה (P. vulgaris), זוהו עד כה יותר משני תריסר גנים עמידים לאנתרקנוזה.חלק מהגנים הללו נמצאים באזורים החסרים כל גנים R קנוניים, אולם רבים אחרים ממוקמים בקצוות של כרומוזומים הנושאים את צביר הגנים NBS-LRR, כולל TIR-NBS-LRRs99.מחקר SSR רחב הגנום אישר גם את הקשר של הגן NBS-LRR עם עמידות לאנתרקנוזה בשעועית הנפוצה.הגן R הקנוני נמצא גם באזור הגנומי הנושא את לוקוס ההתנגדות העיקרי לאנתרקנוזה בלופין לבן 101.
העבודה שלנו מראה שתגובת עמידות מיידית, המופעלת בשלב מוקדם של הדבקה בצמח (רצוי לא יאוחר מ-12 hpi), מגנה ביעילות על תורמוס צר-עלים מפני אנתרקנוז הנגרם על ידי הפטרייה הפתוגנית Collelotrichum lupini.באמצעות רצף תפוקה גבוהה, הדגמנו פרופילי ביטוי דיפרנציאליים של גנים עמידות לאנתרקנוזה בצמחי NLL בתיווך הגנים העמידות של Lanr1 ו-AnMan.הגנה מוצלחת כרוכה בתכנון קפדני של הגנים לחלבונים המעורבים בחיזור, פוטוסינתזה ופתוגנזה בתוך שעות מהמגע הראשון של הצמח עם פתוגן.עמידות לאנתרקס המתווכת על ידי הגן Lanr1 מזכירה את התגובה המהירה האופיינית של גן R (חסינות מופעלת על ידי אפקטור), בעוד שהגן AnMan מספק ככל הנראה תגובה אופקית (חסינות מופעלת על ידי דפוס מולקולרי הקשור לחיידק), ומספק רמה מתונה של קיימות.
215 קווי ה-NLL ששימשו לסינון סמני אנתרקנוזה כללו 74 זנים, 60 קווים שהושגו על ידי הצלבה או רבייה, 5 מוטנטים ו-76 חיידקים פראיים או מקוריים.הקווים הגיעו מ-17 מדינות, בעיקר מפולין (58), ספרד (47), גרמניה (27), אוסטרליה (26), רוסיה (19), בלארוס (7), איטליה (5) וקווים נוספים.מ-10 מדינות.הסט כולל גם קווים עמידים בפנייה: 83A: 476, טנג'יל, וונגה הנושאת את האלל LANR1, ומנדלופ הנושא את אלל אנמן.השורות התקבלו ממאגר הנתונים הגנטיים של תורמוסים האירופי המנוהל על ידי Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, פולין (טבלה משלימה S1).
שני שכפולים ביולוגיים נותחו.האיכות והריכוז של ה-DNA המבודד הוערכו בשיטות ספקטרופוטומטריות (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב).סמן AnManM1 המסמן את הגן העמידות לאנתרקנוז AnMan (שמקורו ב-cv. Mandelup) והסמנים Anseq3 ו-Anseq4 שמאגפים את הגן Lanr1 (שמקורו ב-cv. Tanjil) נותחו 11,26,28.הומוזיגוטות לאלל העמיד נקבעו כ" -1 1 ", רגישות - כ-" 0 "והטרוזיגוטות - כ- 0.5.
בהתבסס על תוצאות ההקרנה לסמנים AnManM1, AnSeq3 ו-AnSeq4 והזמינות של זרעים לניסויי מעקב אחרונים, נבחרו 50 שורות NLL עבור פנוטייפ עמידות לאנתרקנוזה.הניתוח בוצע בשני עותקים בחממה מבוקרת מחשב עם צילום פרקי זמן של 14 שעות עם טווח טמפרטורות של 22 מעלות צלזיוס ביום ו-19 מעלות צלזיוס בלילה.זרעים נשרטים (חותכים את קליפת הזרעים בצד הנגדי של העובר בעזרת להב חד) לפני הזריעה כדי למנוע תרדמת זרעים עקב קשיחה מדי של קליפת הזרעים ולהבטחת נביטה אחידה.צמחים גודלו בעציצים (11 × 11 × 21 ס"מ) עם אדמה סטרילית (TS-1 Rec 085 בינוני בסיסי, קלסמן-דיילמן פולסקה, ורשה, פולין).החיסון בוצע עם זן Colletotrichum lupini Col-08, שגדל בשנת 1999 מגבעולים של צמחי תורמוס צרי-עלים שגדלו בשדה ב-Verzhenitsa, פולין רבתי (52° 27′ 42″ N 17° 04′ E 05″).קבל אזור.המבודדים היו מתורבתים במדיום SNA ב 20 מעלות צלזיוס תחת אור שחור במשך 21 יום כדי לגרום לספורולציה.ארבעה שבועות לאחר הזריעה, כשהצמחים הגיעו לשלב 4-6 עלים, בוצע חיסון באמצעות ריסוס עם תרחיף קונידיות בריכוז של 0.5 על 106 קונידיות למ"ל.לאחר החיסון הוחזקו הצמחים בחושך למשך 24 שעות בלחות של כ-98% ובטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להקל על הנביטה של ​​קונידיות ותהליך ההדבקה.הצמחים גודלו לאחר מכן בתקופת צילום של 14 שעות ב-22 מעלות צלזיוס ביום/19 מעלות צלזיוס בלילה ו-70% לחות.ציון המחלה נעשה 22 ימים לאחר החיסון ונע בין 0 (אימוני) ל-9 (רגיש מאוד) בהתאם לנוכחות או היעדר נגעים נמקיים על גבעולים ועלים.בנוסף, לאחר הניקוד נמדד משקל הצמחים.היחסים בין גנוטיפים של סמנים ופנוטיפים של מחלות חושבו כמתאמים נקודתיים דו-רצפים (היעדר סמנים הטרוזיגוטיים במערך הקווים לניתוח הפנוטיפ של עמידות לאנתרקנוז).