תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
יש צורך במערכת מבחנה אמינה שיכולה לשחזר במדויק את הסביבה הפיזיולוגית של הלב לצורך בדיקות סמים.הזמינות המוגבלת של מערכות תרבית רקמת לב אנושיות הובילה לפרשנויות לא מדויקות של השפעות תרופות לבביות.כאן, פיתחנו מודל תרבית רקמות לב (CTCM) הממריץ אלקטרומכנית פרוסות לב ועובר מתיחה פיזיולוגית במהלך השלב הסיסטולי והדיאסטולי של מחזור הלב.לאחר 12 ימי תרבות, גישה זו שיפרה חלקית את הכדאיות של קטעי לב, אך לא שימרה באופן מלא את שלמותם המבנית.לכן, לאחר בדיקת מולקולות קטנות, מצאנו שתוספת של 100 ננומטר טרייודותירונין (T3) ו-1 מיקרומטר דקסמתזון (Dex) למדיום שלנו שמרה על מבנה המיקרו של המקטעים למשך 12 ימים.בשילוב עם טיפול T3/Dex, מערכת ה-CTCM שמרה על פרופילי שעתוק, כדאיות, פעילות מטבולית ושלמות מבנית באותה רמה כמו רקמת לב טרי במשך 12 ימים.בנוסף, מתיחה מוגזמת של רקמת לב בתרבית גורמת לאיתות לב היפרטרופי, מה שמספק עדות ליכולת של CTCM לחקות מצבים היפרטרופיים המושרים על ידי מתיחה לבבית.לסיכום, CTCM יכול לדגמן את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלב בתרבית על פני תקופות זמן ארוכות, מה שמאפשר בדיקת תרופות אמינה.
לפני מחקר קליני, יש צורך במערכות אמינות במבחנה שיכולות לשחזר במדויק את הסביבה הפיזיולוגית של הלב האנושי.מערכות כאלה צריכות לחקות מתיחה מכנית, קצב לב ותכונות אלקטרופיזיולוגיות.מודלים של בעלי חיים משמשים בדרך כלל כפלטפורמת סקר לפיזיולוגיה לבבית עם מהימנות מוגבלת במשקף את ההשפעות של תרופות בלב האדם1,2.בסופו של דבר, המודל הניסיוני של תרבות רקמות הלב האידיאלית (CTCM) הוא מודל בעל רגישות גבוהה וספציפית להתערבויות טיפוליות ותרופתיות שונות, המשחזר במדויק את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלב האנושי3.היעדר מערכת כזו מגביל את הגילוי של טיפולים חדשים לאי ספיקת לב4,5 והוביל לרעילות קרדיות של תרופות כסיבה מרכזית ליציאה מהשוק6.
במהלך העשור האחרון, שמונה תרופות שאינן קרדיווסקולריות הוצאו משימוש קליני מכיוון שהן גורמות להארכת מרווחי QT המובילה להפרעות קצב חדריות ולמוות פתאומי7.לפיכך, יש צורך הולך וגובר באסטרטגיות סקר פרה-קליניות אמינות להערכת יעילות קרדיווסקולרית ורעילות.השימוש האחרון בקרדיומיוציטים (hiPS-CM) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPS-CM) בבדיקת תרופות ובדיקות רעילות מספק פתרון חלקי לבעיה זו.עם זאת, האופי הבוסרי של hiPS-CMs והיעדר המורכבות הרב-תאית של רקמת הלב הם המגבלות העיקריות של שיטה זו.מחקרים אחרונים הראו שניתן להתגבר חלקית על מגבלה זו על ידי שימוש מוקדם ב-hiPS-CM ליצירת הידרוג'לים של רקמת לב זמן קצר לאחר תחילת ההתכווצויות הספונטניות והגברת הגירוי החשמלי בהדרגה לאורך זמן.עם זאת, למיקרורקמות HiPS-CM אלה חסרות התכונות האלקטרופיזיולוגיות וההתכווצות הבשלות של שריר הלב הבוגר.בנוסף, לרקמת הלב האנושית יש מבנה מורכב יותר, המורכב מתערובת הטרוגנית של סוגי תאים שונים, כולל תאי אנדותל, נוירונים ופיברובלסטים סטרומליים, המחוברים ביניהם על ידי קבוצות ספציפיות של חלבוני מטריקס חוץ-תאיים.הטרוגניות זו של אוכלוסיות שאינן קרדיומיוציטים11,12,13 בלב היונקים הבוגרים מהווה מחסום עיקרי ליצירת מודלים של רקמת לב באמצעות סוגי תאים בודדים.מגבלות עיקריות אלו מדגישות את החשיבות של פיתוח שיטות לטיפוח רקמת שריר הלב שלמה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
חלקים דקים (300 מיקרומטר) מתורבתים של הלב האנושי הוכחו כמודל מבטיח של שריר הלב האנושי שלם.שיטה זו מספקת גישה למערכת רב-תאית תלת-ממדית שלמה הדומה לרקמת לב אנושית.עם זאת, עד 2019, השימוש בקטעי לב מתורבת הוגבל על ידי הישרדות התרבות הקצרה (24 שעות).זה נובע ממספר גורמים כולל היעדר מתיחה פיזית-מכנית, ממשק אוויר-נוזל ושימוש במדיה פשוטה שאינה תומכת בצרכים של רקמת הלב.בשנת 2019, מספר קבוצות מחקר הדגימו ששילוב גורמים מכניים במערכות תרבית רקמת לב יכול להאריך את חיי התרבית, לשפר את הביטוי הלבבי ולחקות פתולוגיה לבבית.שני מחקרים אלגנטיים 17 ו-18 מראים שלטעינה מכנית חד-צירית יש השפעה חיובית על הפנוטיפ הלבבי במהלך התרבות.עם זאת, מחקרים אלה לא השתמשו בעומס פיזי-מכני דינמי תלת מימדי של מחזור הלב, מכיוון שקטעי לב הועמסו בכוחות מתיחה איזומטריים 17 או בעומס אוזוטוני ליניארי 18 .שיטות אלו של מתיחת רקמות הביאו לדיכוי של גנים לבביים רבים או לביטוי יתר של גנים הקשורים לתגובות מתיחה חריגות.יש לציין, Pitoulis et al.19 פיתחה אמבט תרבית פרוסות לב דינמי לשחזור מחזור הלב באמצעות משוב של מתמר כוח והנעות מתח.למרות שמערכת זו מאפשרת מודלים מדויקים יותר של מחזור הלב במבחנה, המורכבות והתפוקה הנמוכה של השיטה מגבילה את היישום של מערכת זו.המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה מערכת תרבית פשוטה המשתמשת בגירוי חשמלי ובמדיום אופטימלי לשמירה על הכדאיות של קטעים של רקמת לב חזירים ושל אדם למשך עד 6 ימים20,21.
בכתב היד הנוכחי, אנו מתארים מודל של תרבית רקמת לב (CTCM) באמצעות קטעים של לב החזיר המשלבים רמזים הומוראליים כדי לשחזר את הפיזיולוגיה התלת מימדית של הלב והתרחבות פתופיזיולוגית במהלך מחזור הלב.CTCM זה יכול להגביר את הדיוק של חיזוי תרופה פרה-קלינית לרמה שלא הושגה קודם לכן על ידי אספקת מערכת לבבית חסכונית, תפוקה בינונית, המחקה את הפיזיולוגיה/פתופיזיולוגיה של לב היונק לצורך בדיקות תרופות פרה-קליניות.
לאותות מכניים המודינמיים יש תפקיד קריטי בשמירה על תפקוד הקרדיומיוציטים במבחנה 22,23,24.בכתב היד הנוכחי, פיתחנו CTCM (איור 1a) שיכול לחקות את סביבת הלב של מבוגרים על ידי השראת גירוי חשמלי ומכני בתדרים פיזיולוגיים (1.2 הרץ, 72 פעימות לדקה).כדי למנוע מתיחת רקמות מוגזמת במהלך הדיאסטולה, נעשה שימוש במכשיר הדפסה תלת מימדית להגדלת גודל הרקמה ב-25% (איור 1ב).הקיצוב החשמלי המושרה על ידי מערכת C-PACE תוזמן להתחיל 100 שניות לפני הסיסטולה באמצעות מערכת רכישת נתונים לשחזור מלא של מחזור הלב.מערכת תרבית הרקמה משתמשת במפעיל פנאומטי הניתן לתכנות (LB Engineering, גרמניה) כדי להרחיב באופן מחזורי קרום סיליקון גמיש כדי לגרום להתרחבות של פרוסות הלב בחדר העליון.המערכת חוברה לקו אוויר חיצוני באמצעות מתמר לחץ, מה שאפשר לכוון במדויק את הלחץ (± 1 מ"מ כספית) ואת הזמן (± 1 אלפיות השנייה) (איור 1c).
a חבר את קטע הרקמה לטבעת התמיכה בגודל 7 מ"מ, המוצגת בכחול, בתוך תא התרבית של המכשיר.תא התרבית מופרד מתא האוויר על ידי קרום סיליקון דק וגמיש.הנח אטם בין כל תא כדי למנוע דליפות.מכסה המכשיר מכיל אלקטרודות גרפיט המספקות גירוי חשמלי.ב ייצוג סכמטי של התקן הרקמה הגדולה, טבעת המנחה וטבעת התמיכה.קטעי הרקמה (חומים) מונחים על המכשיר הגדול עם טבעת המנחה ממוקמת בחריץ בקצה החיצוני של המכשיר.בעזרת המדריך, הנח בזהירות את טבעת התמיכה המצופה בדבק אקרילי רקמות על קטע רקמת הלב.ג גרף המציג את זמן הגירוי החשמלי כפונקציה של לחץ תא האוויר הנשלט על ידי מפעיל פנאומטי הניתן לתכנות (PPD).מכשיר רכישת נתונים שימש לסנכרון גירוי חשמלי באמצעות חיישני לחץ.כאשר הלחץ בתא התרבית מגיע לסף שנקבע, אות דופק נשלח ל-C-PACE-EM כדי להפעיל גירוי חשמלי.ד תמונה של ארבעה CTCMs המונחים על מדף אינקובטור.ארבעה מכשירים מחוברים ל-PPD אחד באמצעות מעגל פנאומטי, וחיישני לחץ מוכנסים לשסתום ההמוסטטי כדי לנטר את הלחץ במעגל הפנאומטי.כל מכשיר מכיל שישה חלקי רקמה.
באמצעות מפעיל פנאומטי יחיד, הצלחנו לשלוט ב-4 מכשירי CTCM, שכל אחד מהם יכול להכיל 6 קטעי רקמה (איור 1ד).ב-CTCM, לחץ האוויר בתא האוויר מומר ללחץ סינכרוני בתא הנוזל וגורם להתרחבות פיזיולוגית של פרוסת הלב (איור 2א וסרט משלים 1).הערכת מתיחה של רקמות ב-80 מ"מ כספית.אומנות.הראה מתיחה של קטעי רקמה ב-25% (איור 2b).הוכח כי אחוז מתיחה זה תואם לאורך סרקומר פיזיולוגי של 2.2-2.3 מיקרומטר עבור התכווצות תקינה של קטע הלב17,19,25.תנועת הרקמות הוערכה באמצעות הגדרות מצלמה מותאמות אישית (איור משלים 1).משרעת ומהירות תנועת הרקמה (איור 2c, d) תאמו למתיחה במהלך מחזור הלב ולזמן במהלך הסיסטולה והדיאסטולה (איור 2b).המתיחה והמהירות של רקמת הלב במהלך התכווצות והרפיה נשארו קבועים במשך 12 ימים בתרבית (איור 2f).כדי להעריך את השפעת הגירוי החשמלי על התכווצות במהלך התרבות, פיתחנו שיטה לקביעת עיוות פעיל באמצעות אלגוריתם הצללה (איור משלים. 2a,b) והצלחנו להבחין בין עיוותים עם ובלי גירוי חשמלי.אותו קטע של הלב (איור 2f).באזור הנייד של החתך (R6-9), המתח בזמן גירוי חשמלי היה גבוה ב-20% מאשר בהיעדר גירוי חשמלי, מה שמעיד על תרומתו של גירוי חשמלי לתפקוד ההתכווצות.
עקבות מייצגים של לחץ תא האוויר, לחץ תא הנוזל ומדידות תנועת הרקמה מאשרים כי לחץ תא משנה את לחץ תא הנוזל, וגורם לתנועה מתאימה של פרוסת הרקמה.ב עקבות מייצגים של אחוז מתיחה (כחול) של חתכי רקמה המקבילים לאחוז מתיחה (כתום).ג התנועה הנמדדת של פרוסת הלב תואמת את מהירות התנועה הנמדדת.(ד) מסלולים מייצגים של תנועה מחזורית (קו כחול) ומהירות (קו מקווקו כתום) בפרוסת הלב.ה כימות של זמן המחזור (n = 19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), זמן התכווצות (n = 19 פרוסות לקבוצה), זמן הרפיה (n = 19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), תנועת רקמות (n = 25).פרוסות)/קבוצה מחזירים שונים), שיא המהירות הסיסטולית (n = 24(D0), 25(D12) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים) וקצב הרפיה שיא (n=24(D0), 25(D12) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים).מבחן t של סטודנט דו-זנב לא הראה הבדל משמעותי באף פרמטר.ו עקבות ניתוח זנים מייצגים של קטעי רקמה עם (אדום) וללא (כחול) גירוי חשמלי, עשרה אזורים אזוריים של קטעי רקמה מאותו קטע.הלוחות התחתונים מציגים את כימות ההפרש באחוזים במתח במקטעי רקמה עם וללא גירוי חשמלי בעשרה אזורים ממקטעים שונים. (n = 8 פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת תלמיד דו-זנב; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת תלמיד דו-זנב; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 ש"ח/חג של שוויון, ביטוח לאומי t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, *p<0,01,**p<0,01,**). (n = 8 מקטעים/קבוצה מחזירים שונים, מבחן t של סטודנט דו-זנב; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 מקטעים/קבוצה, מחזירים שונים, מבחן t של סטודנט דו-זנב; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).פסי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
במערכת תרבית פרוסות לב ביומימטית סטטית קודמת שלנו [20, 21], שמרנו על הכדאיות, התפקוד והשלמות המבנית של פרוסות הלב במשך 6 ימים על ידי הפעלת גירוי חשמלי ואופטימיזציה של הרכב הבינוני.עם זאת, לאחר 10 ימים, הנתונים הללו ירדו בחדות.נתייחס לקטעים שתורבתו במערכת התרבות הביומימטית הסטטית הקודמת שלנו 20, 21 תנאי בקרה (Ctrl) ונשתמש במדיום שעבר אופטימיזציה שלנו כתנאי MC ותרבות בגירוי מכני וחשמלי סימולטני (CTCM).שקוראים לו .ראשית, קבענו שגירוי מכני ללא גירוי חשמלי אינו מספיק כדי לשמור על כדאיות רקמות למשך 6 ימים (איור משלים. 3a,b).מעניין, עם כניסת גירוי פיזיו-מכני וחשמלי באמצעות STCM, הכדאיות של קטעי לב של 12 יום נשארה זהה לזה של קטעי לב טרי בתנאי טרשת נפוצה, אך לא בתנאי Ctrl, כפי שמוצג על ידי ניתוח MTT (איור 1).3א).זה מצביע על כך שגירוי מכני וסימולציה של מחזור הלב יכולים לשמור על קטעי רקמה ברי קיימא למשך כפול מזה שדווח במערכת התרבית הסטטית הקודמת שלנו.עם זאת, הערכה של השלמות המבנית של קטעי רקמה על ידי סימון אימונול של טרופונין T וקונקסין 43 הראתה שביטוי קונקסין 43 היה גבוה משמעותית ברקמות MC ביום 12 מאשר בביקורות באותו יום.עם זאת, ביטוי אחיד של connexin 43 ויצירת Z-disc לא נשמרו במלואם (איור 3b).אנו משתמשים במסגרת של בינה מלאכותית (AI) כדי לכמת שלמות מבנית רקמות26, צינור למידה עמוקה מבוסס תמונה המבוססת על טרופונין-T וצביעת קונקסין43 כדי לכמת אוטומטית את השלמות המבנית והקרינה של פרוסות הלב במונחים של חוזק לוקליזציה.שיטה זו משתמשת ברשת עצבית Convolutional Neural (CNN) ובמסגרת למידה עמוקה כדי לכמת באופן אמין את השלמות המבנית של רקמת הלב באופן אוטומטי וחסר פניות, כמתואר בהפניה.26. רקמת MC הראתה דמיון מבני משופר ליום 0 בהשוואה לקטעי בקרה סטטיים.בנוסף, צביעת הטריכרום של מאסון גילתה אחוז נמוך משמעותית של פיברוזיס בתנאי טרשת נפוצה בהשוואה לתנאי הביקורת ביום 12 של התרבית (איור 3c).בעוד ש-CTCM העלה את הכדאיות של קטעי רקמת לב ביום 12 לרמה דומה לזו של רקמת לב טריה, הוא לא שיפר משמעותית את השלמות המבנית של קטעי הלב.
גרף עמודות מראה כימות של כדאיות ה-MTT של פרוסות לב טרי (D0) או תרבית פרוסות לב למשך 12 ימים או בתרבית סטטית (D12 Ctrl) או ב-CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) פרוסות בכיוון אחד ANOpig/group,# is one way pig/group; 01 בהשוואה ל-D0 ו-**p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl). גרף עמודות מראה כימות של כדאיות ה-MTT של פרוסות לב טרי (D0) או תרבית פרוסות לב למשך 12 ימים בתרבית סטטית (D12 Ctrl) או ב-CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) מבוצעת בכיוון אחד מנתחי ANO/# pig. 001 בהשוואה ל-D0 ו-**p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl).ההיסטוגרמה מראה את כימות הכדאיות של קטעי לב טריים של MTT (D0) או תרבית של קטעי לב למשך 12 ימים בתרבית סטטית (בקרת D12) או ב-CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (ביקורת D12). ) , 12 (D12 MC) מקטעים/קבוצה שונה של חזיר מבדיקה אחת-ANO;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-**p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切牄切切版(D2)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测与缌测踎D#0p#0p#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏別片(D0脏別片) 片(D0 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**pהיסטוגרמה המראה את כימות הכדאיות של MTT בקטעי לב טריים (D0) או בקטעי לב שתורבתו במשך 12 ימים בתרבית סטטית (בקרת D12) או ב-CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (ביקורת D12)), 12 (D12 MC) קטעים/קבוצה של ANOVA בכיוון אחד;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0, **p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl).ב טרופונין-T (ירוק), קונקסין 43 (אדום) ו-DAPI (כחול) בקטעי לב מבודדים טריים (D0) או בקטעי לב שתורבתו בתנאים סטטיים (Ctrl) או CTCM (MC) למשך 12 ימים) של תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות (סקאלה ריקה = 100 מיקרומטר). כימות אינטליגנציה מלאכותית של שלמות המבנית של רקמת הלב (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) פרוסות/קבוצה כל אחת מחזיר שונה, מבוצעת בדיקת ANOVA חד כיוונית; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו- D100 < 1 בהשוואה ל-0. כימות בינה מלאכותית של שלמות המבנית של רקמת הלב (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) פרוסות/קבוצה כל אחת מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד כיוונית; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו- D100p <10 בהשוואה ל-D10****p < Ctrl. Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 сдров) (D12 празов) зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 ו ****p < 0,0001 по D12ю сравни). כימות השלמות המבנית של רקמת הלב על ידי אינטליגנציה מלאכותית (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) מקטעים/קבוצות מחזירים שונים, בדיקת ANOVA חד כיוונית שבוצעה; ####p < 0.0001 לעומת D0 ו-D****0p <Ctrl בהשוואה ל-D0 ו-D****01).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) פרוסות/קבוצה של כל אחד מהחזירים השונים, מבחן ANOVA בכיוון אחד .#0#0 甎;# ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) פרוסות/קבוצה של כל אחד מחזירים שונים, מבחן ANO-כיווני .#0#0D 与 בכיוון אחד.#0#0D; ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl/MC) (D512 Ctrl) аждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнини). בינה מלאכותית כדי לכמת את השלמות המבנית של רקמת הלב (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) קטעים/קבוצה של כל אחד מחזירים שונים, בדיקת ANOVA חד כיוונית; ####p<0.0001 לעומת .D0 < השוואה ל-D****0201 להשוואה ל-D****0201. ג תמונות מייצגות (משמאל) וכימות (מימין) עבור פרוסות לב מוכתמות בכתם טריכרום של מאסון (סקאלה חשופה = 500 מיקרומטר) (n = 10 פרוסות/קבוצה כל אחת מחזיר שונה, מבוצעת בדיקת ANOVA חד-כיוונית; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-D***Ctrl לעומת D0). ג תמונות מייצגות (משמאל) וכימות (מימין) לפרוסות לב מוכתמות בכתם טריכרום של מאסון (סקאלה חשופה = 500 מיקרומטר) (n = 10 פרוסות/קבוצה כל אחת מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד כיוונית; #### p < 0.0001 בהשוואה ל-D0.0001***p < D0 ו-D Ctrl***1). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримхром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностороюний pодностороюний pовносторонний p #тест#0 ANOVA; D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ג תמונות מייצגות (משמאל) וכימות (מימין) של קטעי לב מוכתמים בכתם טריכרום של מאסון (קנה מידה לא מצופה = 500 מיקרומטר) (n = 10 קטעים/קבוצה מחזירים שונים, בדיקת ANOVA חד כיוונית שבוצעה; #### p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-102p Ctrl בהשוואה ל-D0 ו-102p Ctrl). ג.切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 与D0 相比，02 Ctrl 相比，01 . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庰 帺壸庰度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 与 单向 #0 #0D相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных тримкрича я шкала = 500 מ"ק) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью одногонфагно ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ג תמונות מייצגות (משמאל) וכמות (מימין) של קטעי לב מוכתמים בכתם הטריכרום של מאסון (ריק = 500 מיקרומטר) (n = 10 קטעים/קבוצה, כל אחד מחזיר אחר, נבדק על ידי ניתוח חד-כיווני של שונות ;### # p < 0.0001 בהשוואה ל-D0.10***1 בהשוואה ל-D0, Ctrl***1).פסי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
שיערנו כי על ידי הוספת מולקולות קטנות למדיום התרבות, ניתן לשפר את שלמות הקרדיומיוציטים ולהפחית את התפתחות הפיברוזיס במהלך תרבית CTCM.לכן בדקנו מולקולות קטנות באמצעות תרביות הבקרה הסטטית שלנו20,21 בגלל המספר הקטן של גורמים מבלבלים.למסך זה נבחרו Dexamethasone (Dex), Triiodothyronine (T3) ו-SB431542 (SB).מולקולות קטנות אלו שימשו בעבר בתרביות hiPSC-CM כדי לגרום להבשלה של קרדיומיוציטים על ידי הגדלת אורך הסרקומרים, צינוריות T ומהירות ההולכה.בנוסף, גם Dex (גלוקוקורטיקואיד) וגם SB ידועים כמדכאים דלקת29,30.לכן, בדקנו אם הכללה של מולקולות קטנות או שילוב של מולקולות קטנות אלה ישפר את השלמות המבנית של חלקי הלב.להקרנה ראשונית, המינון של כל תרכובת נבחר על סמך הריכוזים הנפוצים במודלים של תרבית תאים (1 מיקרומטר Dex27, 100 ננומטר T327 ו-2.5 מיקרומטר SB31).לאחר 12 ימי תרבית, השילוב של T3 ודקס הביא לשלמות מבנית אופטימלית של קרדיומיוציטים ועיצוב סיבי מינימלי (איורים משלימים 4 ו-5).בנוסף, שימוש בריכוזים כפולים או כפולים אלו של T3 ודקס יצר השפעות מזיקות בהשוואה לריכוזים רגילים (איור משלים. 6a,b).
לאחר ההקרנה הראשונית, ביצענו השוואה ראש בראש של 4 תנאי תרבית (איור 4א): Ctrl: קטעי לב שתורבתו בתרבות הסטטית שתוארה קודם לכן באמצעות המדיום המותאם שלנו;20.21 TD: T3 ו-Ctrl s נוספו Dex ביום רביעי;MC: קטעי לב שתורבתו ב-CTCM באמצעות המדיום שעבר אופטימיזציה בעבר שלנו;ו-MT: CTCM עם T3 ודקס מתווספים למדיום.לאחר 12 ימי טיפוח, הכדאיות של רקמות טרשת נפוצה ו-MT נשארה זהה לזו של רקמות טריות שהוערכו על ידי בדיקת MTT (איור 4b).מעניין לציין שהתוספת של T3 ו-Dex לתרביות transwell (TD) לא הביאה לשיפור משמעותי בכדאיות בהשוואה לתנאי Ctrl, מה שמעיד על תפקיד חשוב של גירוי מכני בשמירה על הכדאיות של קטעי לב.
תרשים עיצוב ניסיוני המתאר את ארבעת תנאי התרבית המשמשים להערכת ההשפעות של גירוי מכני ותוספי T3/Dex על מדיום למשך 12 ימים. b גרף עמודות מראה כימות של כדאיות 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (Ctrl, TD, MC ו-MT) בהשוואה לפרוסות לב טרי (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MT), 12 (D12 MC) בוצעה פרוסות אחת-Ap-0,# מ-NOp-0; 001, ###p < 0.001 בהשוואה ל-D0 ו-**p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl). b גרף עמודות מראה כימות של כדאיות 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (Ctrl, TD, MC ו-MT) בהשוואה לפרוסות לב טרי (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MT), 12 (D12 MC) בוצעה פרוסות אחת-Ap-0,# מ-NOp-0; 001, ###p < 0.001 בהשוואה ל-D0 ו-**p < 0.01 בהשוואה ל-D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивированих воливированих ования (контроль, TD, MC ו MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו- D12 TD ו-D12 сров (D12) пуров (D0) т разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01сн).Ctrl ב גרף העמודות מציג את כימות הכדאיות ב-12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (בקרה, TD, MC ו-MT) בהשוואה לקטעי לב טרי (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ו-D12 MT), 12 (D12 MC) מקטעים שונים ANO-#0; 001, ###p < 0.001 לעומת D0 ו-**p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl). B 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 ≠ ctrl 、 td 、 mc 和 mt）） 与 新鲜 心脏 切片 (d0) (n = 18 (d0) 、 15 (d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mt) und ### p <0.001 与 d0 相比 ， ** p <0.01 与 d12 控制）。。。。。。。。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ו-MT) по сравнению со свежезц (8) (1) D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; #с###p <0,#0#0p <0,#0#0па с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). ב היסטוגרמה המציגה את כל 4 תנאי התרבית (בקרה, TD, MC ו-MT) בהשוואה לקטעי לב טרי (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MT), מקטעים/קבוצה של חזירים שונים 12 (D12 MC), חד כיווני ANOVAp1, #0#0 בדיקת D#0#0, #0##0 , **p<0.01 לעומת שליטה D12). c גרף עמודות מציג את הכימות של שטף הגלוקוז 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (Ctrl, TD, MC ו-MT) בהשוואה לפרוסות לב טרי (D0) (n = 6 פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד-כיוונית; ###p < 0.001, בהשוואה ל-D0.10***p < D0 ו-DCtrl***). c גרף עמודות מציג את הכימות של שטף הגלוקוז 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (Ctrl, TD, MC ו-MT) בהשוואה לפרוסות לב טרי (D0) (n = 6 פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד-כיוונית; ###p < 0.001, בהשוואה ל-D0.10***p < D0 ו-DCtrl***). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис во4висовис ания (контроль, TD, MC ו MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разноных свиних, ся тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c היסטוגרמה מראה כימות של שטף הגלוקוז 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (ביקורת, TD, MC ו-MT) בהשוואה לקטעי לב טרי (D0) (n = 6 מקטעים/קבוצה מחזירים שונים, בדיקת ANOVA חד-כיוונית שבוצעה; ###p < 0.001 בהשוואה ל-D0.***01 בהשוואה ל-D0 ו-***01). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 蛸毹牄嚑喹牄嚑嚑毅缳嚑通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与***D0 盌，与***D0 盌，与***D0 盌相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切 片 切 片 切 片 切养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивировивий культививис рования (контроль, TD, MC ו MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групста, от развиных, развиных роведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c היסטוגרמה המציגה כימות של שטף הגלוקוז ב-12 ימים לאחר התרבית עבור כל 4 תנאי התרבית (ביקורת, TD, MC ו-MT) בהשוואה לקטעי לב טרי (D0) (n = 6 מקטעים/קבוצה, מחזירים שונים, חד צדדיים האם בוצעו בדיקות ANOVA, ###p < 0.001p < 0.001p <0.001 בהשוואה ל-D***01 לעומת D<0.001).ד חלקות ניתוח זנים של רקמות טריות (כחול), יום 12 MC (ירוק) ויום 12 MT (אדום) בעשר נקודות חתך רקמות אזוריות (n = 4 פרוסות/קבוצה, מבחן ANOVA חד כיווני; לא היה הבדל משמעותי בין הקבוצות).עלילת הר געש המציגה גנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית במקטעי לב טרי (D0) בהשוואה למקטעי לב שתורבתו בתנאים סטטיים (Ctrl) או בתנאי MT (MT) למשך 10-12 ימים.מפת חום של גנים של סרקומרים עבור קטעי לב שתורבתו בכל אחד מתנאי התרבות.פסי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
תלות מטבולית במעבר מחמצון חומצות שומן לגליקוליזה היא סימן היכר של דה-דיפרנציאציה של קרדיומיוציטים.קרדיומיוציטים לא בשלים משתמשים בעיקר בגלוקוז לייצור ATP ויש להם מיטוכונדריה היפופלסטית עם מעט cristae5,32.ניתוחי ניצול הגלוקוז הראו שבתנאי MC ו-MT, ניצול הגלוקוז היה דומה לזה שברקמות היום 0 (איור 4c).עם זאת, דגימות Ctrl הראו עלייה משמעותית בניצול הגלוקוז בהשוואה לרקמה טרייה.זה מצביע על כך שהשילוב של CTCM ו-T3/Dex משפר את כדאיות הרקמה ומשמר את הפנוטיפ המטבולי של קטעי לב מתורבתים של 12 ימים.בנוסף, ניתוח הזנים הראה שרמות הענק נשארו זהות לרמות המתח ברקמת לב טרי במשך 12 ימים בתנאי MT ו-MS (איור 4ד).
כדי לנתח את ההשפעה הכוללת של CTCM ו-T3/Dex על נוף התעתיק העולמי של רקמת פרוסות לב, ביצענו RNAseq על פרוסות לב מכל ארבעת תנאי התרבות השונים (נתונים משלימים 1).מעניין לציין שקטעי MT הראו דמיון תעתיק גבוה לרקמת לב טריה, כאשר רק 16 בוטאו בצורה דיפרנציאלית מתוך 13,642 גנים.עם זאת, כפי שהראינו קודם לכן, פרוסות Ctrl הציגו 1229 גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי לאחר 10-12 ימים בתרבית (איור 4ה).נתונים אלה אושרו על ידי qRT-PCR של גנים של לב ופיברובלסט (איור משלים. 7a-c).מעניין לציין שקטעי ה-Ctrl הראו הורדת ויסות של גנים של מחזור הלב והתאים והפעלה של תוכניות גנים דלקתיים.נתונים אלה מצביעים על כך שהדיפרנציאציה, המתרחשת בדרך כלל לאחר תרבות ארוכת טווח, מוחלשת לחלוטין בתנאי MT (איור משלים. 8a,b).מחקר מדוקדק של גנים של סרקומרים הראה שרק בתנאי MT נשמרים הגנים המקודדים לסרקומר (איור 4f) ולתעלת היונים (איור משלים 9), ומגנים עליהם מפני דיכוי בתנאי Ctrl, TD ו-MC.נתונים אלה מוכיחים שעם שילוב של גירוי מכני והומורלי (T3/Dex), תעתיק פרוסת הלב יכול להישאר דומה לפרוסות לב טריות לאחר 12 ימים בתרבית.
ממצאי שעתוק אלה נתמכים על ידי העובדה שהשלמות המבנית של קרדיומיוציטים בקטעי לב נשמרת בצורה הטובה ביותר בתנאי MT למשך 12 ימים, כפי שמוצג על ידי קונקסין 43 שלם ומקומי (איור 5a).בנוסף, פיברוזיס בקטעי לב בתנאי MT הופחת משמעותית בהשוואה ל-Ctrl ובדומה לקטעי לב טריים (איור 5b).נתונים אלו מוכיחים כי השילוב של גירוי מכני וטיפול T3/Dex משמר ביעילות את מבנה הלב בקטעי לב בתרבית.
תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של טרופונין-T (ירוק), קונקסין 43 (אדום) ו-DAPI (כחול) במקטעי לב מבודדים טריים (D0) או בתרבית במשך 12 ימים בכל ארבעת תנאי התרבות של סעיף הלב (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר).). כימות אינטליגנציה מלאכותית של שלמות המבנית של רקמת הלב (n = 7 (D0 ו-D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ו-D12 MT) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד כיוונית; ####p < 0.00001 בהשוואה ל-D0.005 ו-D0. 12 Ctrl). כימות אינטליגנציה מלאכותית של שלמות המבנית של רקמת הלב (n = 7 (D0 ו-D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ו-D12 MT) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד כיוונית; #### p < 0.00001 בהשוואה ל-D0.0.0 ו-<p < או 0.0001 D0. 12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D121 Ctrl) 2 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению сравнению сравнению сравнению срил 0 и ****p <0 и0,0p ****p <0 и 0p**** внению с D12 Ctrl). כימות של השלמות המבנית של רקמת הלב באמצעות אינטליגנציה מלאכותית (n = 7 (D0 ו-D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ו-D12 MT) קטעים/קבוצה מחזירים שונים, בדיקת ANOVA חד כיוונית שבוצעה; #### p < 0.00001 בהשוואה ל-D0.01 ו-****0 <p<0.0001 בהשוואה ל-D****0. Ctrl).Y与 D12 Ctrl 相比）。。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 td12 mc 庄 缌 ד12 康智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 与 0.05 斔**** 缌斔 0.0****相比）.כימות השלמות המבנית של רקמת הלב באמצעות אינטליגנציה מלאכותית בחזירים שונים (n = 7 (D0 ו-D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ו-D12 MT) מקטעים/קבוצה) עם בדיקת ANOVA חד כיוונית;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-*p < 0.05 או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). ב תמונות מייצגות וכימות עבור פרוסות לב מוכתמות בכתם טריכרום של מאסון (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 (D12 MT) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בדיקה חד-כיוונית A***0## ל-D1NO. p < 0.001, או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). ב תמונות מייצגות וכימות עבור פרוסות לב מוכתמות בכתם טריכרום של מאסון (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 (D12 MT) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בדיקה חד-כיוונית A***0## ל-D1NO. p < 0.001, או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным краснашлем ( = 500 מק"מ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одни0,#0; 1 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ב תמונות מייצגות וכימות של קטעי לב מוכתמים בכתם טריכרום של מאסון (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 (D12 MT) קטעים/קבוצה מחזירים שונים, שבוצעו בכיוון אחד <1.#0pVA ו-#0pVA; #***0pVA; #***0pVA; 01 או ****p < 0.0001 לעומת D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（10！D = 10！D和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分丐；渔；缛缛0#***#0p 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µd = 0,0（ד trl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差刔４．0#析#0； ***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. B рגותзезнтативные зображения иоличесенная ценка срезов сацац т т т והים (о б т т тוהים (о б тוהים (ора б б тוהים (о б тוהים т т ыхוהים т тf (кlшn =lшn =lшn =nоnоnо =о ых м) (n = 10 (d0, d12 ctrl, d12 td и d12 mc), 9 (d12 mt) срезов р рlзных синей / гру, оmи с# или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ב תמונות מייצגות וכימות של קטעי לב מוכתמים בטריכרום של מאסון (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 (D12 MT) קטעים מחזירים/קבוצה שונים, שיטת ANOVA אחת; #0.001, 0,00, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 או 0. p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl).פסי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
לבסוף, יכולתו של CTCM לחקות היפרטרופיה לבבית הוערכה על ידי הגברת מתיחה של רקמת הלב.ב-CTCM, שיא לחץ תא האוויר עלה מ-80 מ"מ כספית ל-80 מ"מ כספית.אומנות.(מתיחה רגילה) עד 140 מ"מ כספית אמנות.(איור 6א).זה תואם לעלייה של 32% במתיחה (איור 6b), שהוצגה בעבר כאחוז המתיחה המקביל הנדרש לקטעי לב כדי להשיג אורך סרקומר דומה לזה הנראה בהיפרטרופיה.המתיחה והמהירות של רקמת הלב במהלך התכווצות והרפיה נשארו קבועים במהלך שישה ימי תרבית (איור 6c).רקמת הלב ממצבי MT הייתה נתונה למתיחה רגילה (MT (רגיל)) או לתנאי מתיחת יתר (MT (OS)) במשך שישה ימים.כבר לאחר ארבעה ימים בתרבית, הסמן הביולוגי ההיפרטרופי NT-ProBNP עלה משמעותית במדיום בתנאי MT (OS) בהשוואה למצבי MT (רגיל) (איור 7a).בנוסף, לאחר שישה ימים של תרבית, גודל התא ב-MT (OS) (איור 7b) גדל באופן משמעותי בהשוואה לקטעים של לב MT (נורמלי).בנוסף, טרנסלוקציה גרעינית של NFATC4 גדלה באופן משמעותי ברקמות נמתחות מדי (איור 7c).תוצאות אלו מראות את ההתפתחות המתקדמת של שיפוץ פתולוגי לאחר היפר-דסטנסציה ותומכות בתפיסה לפיה מכשיר ה-CTCM יכול לשמש כפלטפורמה לחקר איתות היפרטרופיה לבבית הנגרמת על ידי מתיחה.
עקבות מייצגים של לחץ תא האוויר, לחץ תא הנוזל ומדידות תנועת הרקמה מאשרים כי לחץ תא משנה את לחץ תא הנוזל, וגורם לתנועה מתאימה של פרוסת הרקמה.b עקומות אחוז מתיחה וקצב מתיחה מייצגות עבור חלקי רקמה נמתחים (כתומים) ונמתחים מדי (כחול).c גרף עמודות המציג את זמן המחזור (n = 19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), זמן התכווצות (n = 18-19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), זמן הרפיה (n = 19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), משרעת תנועת הרקמה (n = 14 פרוסות/קבוצה מהירות, מ-14 פרוסות/קבוצה מהירות, מ-14 פרוסות/קבוצה שונה), חזירים שונים) וקצב הרפיה שיא (n = 14 (D0), 15 (D6) ) מקטעים/קבוצות) מחזירים שונים), מבחן t Student's דו-זנבי לא הראה הבדל משמעותי באף פרמטר, מה שמעיד על כך שהפרמטרים הללו נשארו קבועים במהלך 6 ימי התרבות עם מתח יתר.פסי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
כימת גרף עמודות של ריכוז NT-ProBNP במדיית תרבית מפרוסות לב שתורבתו בתנאי מתיחה רגילה של MT (נורמה) או מתיחת יתר (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ו-D4 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, < 0pVA בהשוואה ל-2 כיוונים. כימות של גרף עמודות של ריכוז NT-ProBNP במדיית תרבית מפרוסות לב שתורבתו בתנאי מתיחה רגילה של MT (נורמה) או מתיחת יתר (OS) (n=4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ו-D4 MTOS) פרוסות/קבוצה מ-A**NOpVA שונים, בהשוואה ל-2 כיוונים.היסטוגרמה כמותית של ריכוז NT-ProBNP במצע תרבית מפרוסות לב תרבותיות בתנאים של מתיחה רגילה של MT (נורמה) או מתיחת יתר (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ו-D4). MTOS) פרוסות / קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת ניתוח שני גורמים של שונות;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 בהשוואה למתיחה רגילה). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 絢度n (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方与缛**析，p < 0.01）. כימות של ריכוז NT-ProBNP בפרוסות לב תרבותיות בתנאי מתיחה רגילה של MT (נורמה) או מתיחת יתר (OS) (n=4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ממדינות שונות动; **בהשוואה למתיחה רגילה, p < 0.01).היסטוגרמה כימות של ריכוזי NT-ProBNP בפרוסות לב בתרבית בתנאים של מתיחת MT רגילה (נורמה) או מתיחת יתר (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ו-D4 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, ניתוח דו-כיווני של שונות;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 בהשוואה למתיחה רגילה). בתמונות מייצגות לפרוסות לב מוכתמות בטרופונין-T ו-WGA (משמאל) וכימות גודל תא (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) תאים/קבוצה מ-10 פרוסות שונות מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת t Student Two-tailed t 0. ****0p <br>רגילה. ב תמונות מייצגות עבור פרוסות לב מוכתמות בטרופונין-T ו-WGA (משמאל) וכימות גודל תא (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) תאים/קבוצה מ-10 פרוסות שונות מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת מתיחה דו-זנבת לסטודנט t-normal ל-01 ****0p. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количестоленногос права) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- провохтид ента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). ב תמונות מייצגות של קטעי לב מוכתמים בטרופונין-T ו-AZP (משמאל) וכימות גודל תא (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) תאים/קבוצה מ-10 קטעים שונים מחזירים שונים, בוצעה מבחן t-t-t-1 של סטודנט דו-זנבתי ל- ****0p0 < 0; b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有鰾季生有鰾季生比，****p < 0.0001）. בתמונות מייצגות של פרוסות לב מוכתמות ב-calcarein-T ו-WGA (משמאל) וגודל תא (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 מ-10 פרוסות שונות (D6 MTNorm)) תאים/组，两方法有埾学 בדיקה רגילה 埾学 0. 1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная (крашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная (крашенных (крашенных) n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двустороСние крить,0p0; сравнению с нормальным растяжением). ב תמונות מייצגות של קטעי לב מוכתמים בטרופונין-T ו-AZP (משמאל) וכימות של גודל תא (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) מ-10 קטעים שונים מחזירים שונים) תאים/קבוצה, קריטריון דו-זנב תלמיד t;****p < 0.0001 בהשוואה לזן רגיל). ג תמונות מייצגות עבור יום 0 ויום 6 פרוסות לב MTOS עם אימונולאמן עבור troponin-T ו- NFATC4 וכימות של הטרנסלוקציה של NFATC4 לגרעינים של CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת סטודנט דו-זנבתי; 5-p < מבחן סטודנט; 5-p. ג תמונות מייצגות עבור יום 0 ויום 6 פרוסות לב MTOS מסומנות אימונו עבור troponin-T ו- NFATC4 וכימות של הטרנסלוקציה של NFATC4 לגרעינים של CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבחן דו-זנב .0p הוא תלמיד .0p). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 ו-6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и коколнач ции NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выюполняется та; *p < 0,05). ג תמונות מייצגות עבור קטעי לב ב-0 ו-6 ימים MTOS, מסומנים אימונו עבור טרופונין-T ו-NFATC4, וכימות של טרנסלוקציה של NFATC4 בגרעין של תאי מערות (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים) ביצעו בדיקת סטודנט דו-זנבית';*p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性，第的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟「t 棂0)「t 棂5) ג תמונות מייצגות של calcanin-T ו-NFATC4 אימונולוגים 第0天和第6天MTOS פרוסות לב, ו-NFATC4 מכמות גרעין תאים מסוג NFATC4 易位至CM שונים (n = 4 (D0), 缇 刄, 缇, 缇, 缇, 缇, 缌 , 缌 , 缌 , 缌 ,尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 ו- 6 день для иммуномаркировки тропонинством-Т и NFATC4 שיטות ции NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий t-критерий <Стьююд 0,5). ג תמונות מייצגות של פרוסות לב של MTOS ביום 0 ו-6 עבור סימון אימונוליות בטרופונין-T ו-NFATC4 וכימות של טרנסלוקציה של NFATC4 בגרעין של CM מחזירים שונים (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) פרוסות/קבוצה, דו-זנב <'t -criterion * t-criterion תלמיד).פסי שגיאה מייצגים ממוצע ± סטיית תקן.
מחקר קרדיווסקולרי תרגום מצריך מודלים סלולריים המשחזרים במדויק את סביבת הלב.במחקר זה פותח ואופיין מכשיר CTCM שיכול לעורר חלקים דקים במיוחד של הלב.מערכת ה-CTCM כוללת גירוי אלקטרומכני מסונכרן פיזיולוגית והעשרת נוזלי T3 ודקס.כאשר חלקי לב חזירים נחשפו לגורמים אלו, הכדאיות, השלמות המבנית, הפעילות המטבולית והביטוי התעתיק שלהם נשארו זהים לרקמת לב טרי לאחר 12 ימי תרבית.בנוסף, מתיחה מוגזמת של רקמת הלב עלולה לגרום להיפרטרופיה של הלב הנגרמת על ידי מתיחת יתר.בסך הכל, תוצאות אלו תומכות בתפקיד הקריטי של תנאי תרבות פיזיולוגיים בשמירה על פנוטיפ לב תקין ומספקות פלטפורמה לבדיקת תרופות.
גורמים רבים תורמים ליצירת סביבה מיטבית לתפקוד והישרדות של קרדיומיוציטים.הברור ביותר מבין הגורמים הללו קשור ל(1) אינטראקציות בין-תאיות, (2) גירוי אלקטרומכני, (3) גורמים הומוראליים ו-(4) מצעים מטבוליים.אינטראקציות פיזיולוגיות בין תא לתא דורשות רשתות תלת מימדיות מורכבות של מספר סוגי תאים הנתמכים על ידי מטריצה ​​חוץ תאית.קשה לשחזר אינטראקציות תאיות מורכבות כאלה במבחנה על ידי תרבית משותפת של סוגי תאים בודדים, אך ניתן להשיג אותן בקלות באמצעות האופי האורגנוטיפי של קטעי לב.
מתיחה מכנית וגירוי חשמלי של קרדיומיוציטים הם קריטיים לשמירה על פנוטיפ לב 33,34,35.בעוד שגירוי מכני נמצא בשימוש נרחב עבור מיזוג והתבגרות hiPSC-CM, מספר מחקרים אלגנטיים ניסו לאחרונה גירוי מכני של פרוסות לב בתרבית באמצעות העמסה חד-צירית.מחקרים אלו מראים שלטעינה מכנית חד-צירית דו מימדית יש השפעה חיובית על הפנוטיפ של הלב במהלך התרבות.במחקרים אלה, חלקים של הלב הועמסו בכוחות מתיחה איזומטריים17, העמסה אוזוטונית ליניארית18, או שהמחזור הלבבי נוצר מחדש באמצעות משוב של מתמר כוח והנעות מתח.עם זאת, שיטות אלה משתמשות במתיחה של רקמות חד-ציריות ללא אופטימיזציה סביבתית, וכתוצאה מכך לדיכוי גנים לבביים רבים או ביטוי יתר של גנים הקשורים לתגובות מתיחה חריגות.ה-CTCM המתואר כאן מספק גירוי אלקטרומכני תלת מימדי המחקה את מחזור הלב הטבעי מבחינת זמן מחזור ומתיחה פיזיולוגית (25% מתיחה, 40% סיסטולה, 60% דיאסטולה ו-72 פעימות לדקה).למרות שגירוי מכני תלת מימדי זה לבדו אינו מספיק כדי לשמור על שלמות הרקמה, נדרש שילוב של גירוי הומורלי ומכני באמצעות T3/Dex כדי לשמור על קיימות, תפקוד ושלמות הרקמה בצורה נאותה.
גורמים הומוראליים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות פנוטיפ הלב הבוגר.זה הודגש במחקרי HiPS-CM שבהם T3 ו-Dex נוספו למדית התרבות כדי להאיץ את התבגרות התאים.T3 עשוי להשפיע על הובלת חומצות אמינו, סוכרים וסידן על פני ממברנות התא36.בנוסף, T3 מקדם ביטוי MHC-α וויסות מטה של ​​MHC-β, מקדם היווצרות של מיופיברילים מהירים של עוויתות בקרדיומיוציטים בוגרים בהשוואה למיופיברילים איטיים של עוויתות ב-CM עוברי.מחסור ב-T3 בחולי תת פעילות של בלוטת התריס גורם לאובדן של פסים מיופיברילריים ולירידה בקצב התפתחות הטונוס37.Dex פועל על קולטני גלוקוקורטיקואידים והוכח כמגביר את התכווצות שריר הלב בלבבות מבודדים מבודדים;38 שיפור זה נחשב קשור להשפעה על כניסה מונעת פיקדונות סידן (SOCE) 39,40.בנוסף, דקס נקשר לקולטנים שלו, מה שגורם לתגובה תוך תאית רחבה המדכאת את תפקוד מערכת החיסון ודלקת30.
התוצאות שלנו מצביעות על כך שגירוי מכני פיזי (MS) שיפר את ביצועי התרבית הכוללים בהשוואה ל-Ctrl, אך לא הצליח לשמור על כדאיות, שלמות מבנית והבעה לבבית במשך 12 ימים בתרבית.בהשוואה ל-Ctrl, הוספת תרביות T3 ו-Dex ל-CTCM (MT) שיפרה את הכדאיות ושמרה על פרופילי שעתוק דומים, שלמות מבנית ופעילות מטבולית עם רקמת לב טריה למשך 12 ימים.בנוסף, על ידי שליטה במידת מתיחת הרקמות, נוצר מודל היפרטרופיה לבבית המושרה על ידי היפר-אקסטנציה באמצעות STCM, הממחיש את הרבגוניות של מערכת STCM.יש לציין שלמרות ששיפוץ לב ופיברוזיס כרוכים בדרך כלל באיברים שלמים שתאי מחזור הדם שלהם יכולים לספק את הציטוקינים המתאימים, כמו גם פגוציטוזיס וגורמים מחודשים אחרים, חלקים של הלב עדיין יכולים לחקות את התהליך הפיברוטי בתגובה ללחץ וטראומה.לתוך myofibroblasts.זה הוערך בעבר במודל פרוסות לב זה.יש לציין כי ניתן לשנות את פרמטרי ה-CTCM על ידי שינוי לחץ/משרעת חשמלית ותדירות כדי לדמות מצבים רבים כגון טכיקרדיה, ברדיקרדיה ותמיכה מכנית במחזור הדם (לב לא טעון מכני).זה הופך את המערכת לתפוקה בינונית לבדיקות סמים.היכולת של CTCM לדגמן היפרטרופיה לבבית הנגרמת ממאמץ יתר סוללת את הדרך לבדיקת מערכת זו לטיפול מותאם אישית.לסיכום, המחקר הנוכחי מדגים שמתיחה מכנית וגירוי הומורלי הם קריטיים לשמירה על התרבות של קטעי רקמת לב.
למרות שהנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך ש-CTCM היא פלטפורמה מבטיחה מאוד למידול שריר הלב שלם, לשיטת התרבות הזו יש כמה מגבלות.המגבלה העיקרית של תרבית CTCM היא שהיא מטילה מתחים מכניים דינמיים מתמשכים על הפרוסות, מה שמונע את היכולת לנטר באופן פעיל את התכווצויות פרוסות הלב במהלך כל מחזור.בנוסף, בשל הגודל הקטן של קטעי הלב (7 מ"מ), היכולת להעריך את התפקוד הסיסטולי מחוץ למערכות התרבות באמצעות חיישני כוח מסורתיים מוגבלת.בכתב היד הנוכחי, אנו מתגברים חלקית על מגבלה זו על ידי הערכת מתח אופטי כאינדיקטור לתפקוד התכווצות.עם זאת, מגבלה זו תדרוש עבודה נוספת וייתכן שיטופלו בעתיד על ידי הצגת שיטות לניטור אופטי של תפקוד פרוסות הלב בתרבות, כגון מיפוי אופטי באמצעות סידן וצבעים רגישים למתח.מגבלה נוספת של CTCM היא שמודל העבודה אינו מתמרן מתח פיזיולוגי (טעינה מוקדמת ואחרי עומס).ב-CTCM הושרה לחץ בכיוונים מנוגדים כדי לשחזר 25% מתיחה פיזיולוגית בדיאסטולה (מתיחה מלאה) ובסיסטולה (אורך התכווצות במהלך גירוי חשמלי) ברקמות גדולות מאוד.יש להסיר מגבלה זו בתכנוני CTCM עתידיים על ידי לחץ נאות על רקמת הלב משני הצדדים ועל ידי הפעלת יחסי לחץ-נפח מדויקים המתרחשים בחדרי הלב.
השיפוץ המושרה על מתיחת יתר המדווח בכתב יד זה מוגבל לחיקוי אותות היפר-מתיחה היפרטרופיים.לפיכך, מודל זה יכול לסייע במחקר של איתות היפרטרופי המושרה במתיחה ללא צורך בגורמים הומוראליים או עצביים (שאינם קיימים במערכת זו).דרושים מחקרים נוספים כדי להגביר את ריבוי ה-CTCM, למשל, תרבות משותפת עם תאי חיסון, גורמים הומוראליים בפלזמה במחזור, ועצבנות כאשר תרבות משותפת עם תאים עצביים ישפרו את האפשרויות של מודל מחלות עם CTCM.
13 חזירים שימשו במחקר זה.כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת לואיוויל.קשת אבי העורקים הוצמדה והלב הוזרם ב-1 ליטר של קרדיופלגיה סטרילית (110 מ"מ NaCl, 1.2 מ"מ CaCl2, 16 מ"מ KCl, 16 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ NaHCO3, 5 U/mL הפרין, pH עד 7.4); הלבבות נשמרו בתמיסה קרדיופלגית קרה כקרח עד להובלה למעבדה על קרח שהיא בדרך כלל <10 דקות. הלבבות נשמרו בתמיסה קרדיופלגית קרה כקרח עד להובלה למעבדה על קרח שהיא בדרך כלל <10 דקות. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10мно. הלבבות אוחסנו בתמיסה קרדיופלגית קרה כקרח עד להובלה למעבדה על קרח, שלרוב לוקח פחות מ-10 דקות.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 דקות. שמור לבבות על קרדיופלגיה עד להובלה למעבדה על קרח, בדרך כלל <10 דקות.
מכשיר ה-CTCM פותח בתוכנת SolidWorks עיצוב בעזרת מחשב (CAD).תאי התרבות, המחיצות ותאי האוויר עשויים מפלסטיק אקרילי שקוף CNC.טבעת הגיבוי בקוטר 7 מ"מ עשויה מפוליאתילן בצפיפות גבוהה (HDPE) במרכזה ובעלת חריץ O-ring כדי להכיל את טבעת ה-O סיליקון המשמשת לאיטום המדיה שמתחתיה.קרום סיליקה דק מפריד בין תא התרבות לצלחת ההפרדה.קרום הסיליקון נחתך בלייזר מיריעת סיליקון בעובי 0.02 אינץ' ובעל קשיות של 35A.אטמי הסיליקון התחתונים והעליונים נחתכים בלייזר מיריעת סיליקון בעובי 1/16 אינץ' ובעלי קשיות של 50A.ברגי נירוסטה 316L ואומי כנף משמשים לחיזוק הבלוק וליצירת אטימה אטומה.
לוח מעגלים מודפס ייעודי (PCB) מיועד להשתלב עם מערכת C-PACE-EM.שקעי מחברי המכונה השוויצרית על ה-PCB מחוברים לאלקטרודות גרפיט על ידי חוטי נחושת מצופים כסף וברגים ברונזה 0-60 המוברגים לתוך האלקטרודות.המעגל המודפס ממוקם במכסה של מדפסת התלת מימד.
מכשיר ה-CTCM נשלט על ידי מפעיל פנאומטי (PPD) הניתן לתכנות היוצר לחץ מחזורי מבוקר בדומה למחזור לב.ככל שהלחץ בתוך תא האוויר גדל, קרום הסיליקון הגמיש מתרחב כלפי מעלה, ומאלץ את המדיום מתחת לאתר הרקמה.אזור הרקמה יימתח על ידי הוצאת נוזלים זו, תוך חיקוי ההתרחבות הפיזיולוגית של הלב במהלך הדיאסטולה.בשיא ההרפיה הופעל גירוי חשמלי באמצעות אלקטרודות גרפיט, שהפחיתו את הלחץ בתא האוויר וגרמו להתכווצות של חתכי רקמה.בתוך הצינור נמצא שסתום המוסטטי עם חיישן לחץ לזיהוי הלחץ במערכת האוויר.הלחץ המורגש על ידי חיישן הלחץ מופעל על אספן נתונים המחובר למחשב הנייד.זה מאפשר ניטור רציף של הלחץ בתוך תא הגזים.כאשר הלחץ המרבי הושג (80 מ"מ כספית סטנדרטי, 140 מ"מ כספית), התקן רכישת הנתונים הורה לשלוח אות למערכת C-PACE-EM ליצור אות מתח דו-פאזי למשך 2 אלפיות השנייה, המוגדר ל-4 וולט.
התקבלו קטעי לב ותנאי תרבית ב-6 בארות בוצעו באופן הבא: העבירו את הלבבות שנקטפו מכלי ההעברה למגש המכיל קרדיופלגיה קרה (4 מעלות צלזיוס).החדר השמאלי בודד בעזרת להב סטרילי ונחתך לחתיכות של 1-2 סמ"ק.גושי רקמה אלו הוצמדו לתומכי רקמות בעזרת דבק רקמות והונחו באמבט רקמות מיקרוטומי רוטט המכיל את תמיסה של Tyrode וחומצנו באופן רציף (3 גרם/ליטר 2,3-בוטנדיון מונווקסים (BDM), 140 מ"מ NaCl (8.18 גרם) . ), 6 מ"מ KCl (0.447 מ"ל) (0.447 מ"ל) (0.447 מ"ל DEP), (0.447 מ"ל) .38 גרם), 1 מ"ל MgCl2 (1 מ"ל 1 M תמיסה), 1.8 מ"מ CaCl2 (1.8 מ"ל 1 M תמיסה), עד 1 ליטר ddH2O).המיקרוטום הרוטט נקבע לחתוך פרוסות בעובי של 300 מיקרומטר בתדר של 80 הרץ, משרעת רטט אופקית של 2 מ"מ וקצב התקדמות של 0.03 מ"מ לשנייה.אמבט הרקמות היה מוקף בקרח כדי לשמור על התמיסה קרירה והטמפרטורה נשמרה על 4 מעלות צלזיוס.העברת קטעי רקמה מאמבט המיקרוטומים לאמבט דגירה המכילה תמיסת Tyrode מחומצנת ברציפות על קרח עד שמתקבלים מספיק קטעים לצלחת תרבות אחת.עבור תרביות טרנסוול, חלקי רקמה הוצמדו לתומכי פוליאוריטן סטריליים ברוחב 6 מ"מ והונחו ב-6 מ"ל של מדיום אופטימלי (199 מדיום, 1x תוסף ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline ו-2X אנטיביוטיקה אנטי פטרייתי).גירוי חשמלי (10 וולט, תדר 1.2 הרץ) הופעל על קטעי הרקמה דרך ה-C-Pace.עבור תנאי TD, T3 ו-Dex טריים נוספו ב-100 ננומטר ו-1 מיקרומטר בכל שינוי בינוני.המדיום רווי בחמצן לפני החלפה 3 פעמים ביום.קטעי רקמות תורבו באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
עבור תרביות CTCM, קטעי רקמה הונחו במדפסת תלת מימד מותאמת אישית בצלחת פטרי המכילה תמיסה שונה של Tyrode.המכשיר נועד להגדיל את גודל פרוסת הלב ב-25% משטח טבעת התמיכה.זה נעשה כדי שקטעי הלב לא יימתחו לאחר העברתם מהתמיסה של Tyrode למדיום ובמהלך הדיאסטולה.באמצעות דבק היסטואקרילי, קטעים בעובי 300 מיקרומטר נקבעו על טבעת תמיכה בקוטר 7 מ"מ.לאחר הצמדת חלקי הרקמה לטבעת התמיכה, חתוך את חלקי הרקמה העודפים והנח את חלקי הרקמה המצורפים בחזרה לתוך האמבט של תמיסת Tyrode על קרח (4 מעלות צלזיוס) עד שהוכנו מספיק חלקים עבור מכשיר אחד.זמן העיבוד הכולל של כל המכשירים לא יעלה על שעתיים.לאחר חיבור 6 קטעי רקמה לטבעות התמיכה שלהם, הורכב מכשיר ה-CTCM.תא התרבות של CTCM מלא מראש במדיום 21 מ"ל מחומצן מראש.העבירו את חלקי הרקמה לתא התרבות והסר בזהירות את כל בועות האוויר בעזרת פיפטה.קטע הרקמה מונחה לתוך החור ונלחץ בעדינות למקומו.לבסוף, הניחו את מכסה האלקטרודה על המכשיר והעבירו את המכשיר לאינקובטור.לאחר מכן חבר את ה-CTCM לצינור האוויר ולמערכת C-PACE-EM.המפעיל הפנאומטי נפתח ושסתום האוויר פותח את ה-CTCM.מערכת C-PACE-EM הוגדרה לספק 4 וולט ב-1.2 הרץ במהלך קצב דו-פאזי למשך 2 אלפיות השנייה.המדיום הוחלף פעמיים ביום והאלקטרודות הוחלפו פעם ביום כדי למנוע הצטברות של גרפיט על האלקטרודות.במידת הצורך, ניתן להסיר חלקי רקמה מבארות התרבות שלהם כדי להוציא בועות אוויר שאולי נפלו תחתיהם.עבור תנאי טיפול ב-MT, T3/Dex נוסף טרי עם כל שינוי בינוני עם 100 ננומטר T3 ו-1 מיקרומטר Dex.מכשירי ה-CTCM תורבו באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
כדי להשיג מסלולים מתוחים של פרוסות לב פותחה מערכת מצלמות מיוחדת.מצלמת SLR (Canon Rebel T7i, Canon, טוקיו, יפן) שימשה עם עדשת מאקרו Navitar Zoom 7000 18-108 מ"מ (Navitar, San Francisco, CA).הדמיה בוצעה בטמפרטורת החדר לאחר החלפת המדיום במדיום טרי.המצלמה ממוקמת בזווית של 51° והוידאו מוקלט במהירות של 30 פריימים לשנייה.ראשית, תוכנת קוד פתוח (MUSCLEMOTION43) שימשה עם Image-J כדי לכמת את התנועה של פרוסות לב.המסכה נוצרה באמצעות MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ארה"ב) כדי להגדיר אזורים מעניינים עבור פרוסות לב פועם כדי למנוע רעש.מסכות מפולחות ידנית מוחלות על כל התמונות ברצף פריימים ולאחר מכן מועברות לפלאגין MUSCLEMOTION.Muscle Motion משתמש בעוצמה הממוצעת של הפיקסלים בכל פריים כדי לכמת את התנועה שלו ביחס למסגרת הייחוס.הנתונים נרשמו, סוננו ושימשו לכימות זמן המחזור ולהערכת מתיחת רקמות במהלך מחזור הלב.הסרטון המוקלט עבר עיבוד לאחר באמצעות מסנן דיגיטלי אפס פאזה מסדר ראשון.כדי לכמת מתיחה של רקמות (שיא לשיא), בוצע ניתוח שיא לשיא כדי להבחין בין פסגות לשפל באות המוקלט.בנוסף, דהטרנדינג מתבצע באמצעות פולינום מסדר 6 כדי לבטל סחיפה של האות.קוד התוכנית פותח ב-MATLAB כדי לקבוע תנועת רקמות גלובלית, זמן מחזור, זמן הרפיה וזמן התכווצות (קוד תוכנית משלים 44).
לצורך ניתוח מתח, תוך שימוש באותם סרטונים שנוצרו להערכת מתיחה מכנית, עקבנו תחילה אחרי שתי תמונות המייצגות את פסגות התנועה (נקודות התנועה הגבוהות (העליונות) והנמוכות ביותר (התחתונות) לפי תוכנת MUSCLEMOTION.לאחר מכן פילחנו את אזורי הרקמה והחלנו צורה של אלגוריתם הצללה על הרקמה המפולחת (איור משלים. 2a).הרקמה המפולחת חולקה לאחר מכן לעשרה תת-משטחים, והמתח על כל משטח חושב באמצעות המשוואה הבאה: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, כאשר Sup ו-Sdown הם המרחקים של הצורה מהצללים העליונים והתחתונים של הבד, בהתאמה (איור משלים. 2b).
קטעי לב תובעו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 48 שעות.רקמות מקובעות התייבשו ב-10% ו-20% סוכרוז למשך שעה אחת, ולאחר מכן ב-30% סוכרוז למשך הלילה.הקטעים הוטמעו לאחר מכן בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (תרכובת OCT) והוקפאו בהדרגה באמבט איזופנטן/קרח יבש.אחסן בלוקים של הטבעת OCT ב-80 מעלות צלזיוס עד להפרדה.השקופיות הוכנו כמקטעים בעובי של 8 מיקרומטר.
כדי להסיר את OCT מחלקי הלב, חממו את השקופיות על בלוק חימום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.הוסף 1 מ"ל PBS לכל שקופית ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז לחלחל לקטעים על ידי הגדרת 0.1% Triton-X ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.כדי למנוע מנוגדנים לא ספציפיים להיקשר לדגימה, הוסף 1 מ"ל של תמיסת BSA 3% לשקופיות ודגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן ה-BSA הוסר והשקופיות נשטפו עם PBS.סמן כל דוגמה בעיפרון.נוגדנים ראשוניים (מדולל 1:200 ב-1% BSA) (קונקסין 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) וטרופונין-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) נוספו במשך 90 דקות נגד Flubodies (200% משני) נגד Flubodies (200 משני) או 488 (Thermo Scientific; #A16079), נגד ארנבת Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) למשך 90 דקות נוספות נשטפה 3 פעמים עם PBS כדי להבחין בין צביעת מטרה לרקע, השתמשנו רק בנוגדן המשני כביקורת. לבסוף, הוספו DAPI ו-Slideshield גרעיניים (Lactoras) עם לק. הגדלה -x) ומיקרוסקופ Keyence עם הגדלה של 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ב-5 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS שימש לצביעת WGA והוחל על מקטעים קבועים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, השקופיות נשטפו עם PBS וסודאן שחור הוסיפו לכל שקף והודגרו במשך 30 דקות.השקופיות נשטפו לאחר מכן עם PBS ונוספה מדיום להטמעת vectashield.השקופיות הוצגו במיקרוסקופ Keyence בהגדלה של פי 40.
OCT הוסר מהדגימות כמתואר לעיל.לאחר הסרת ה-OCT, טבלו את השקופיות בתמיסה של Bouin למשך הלילה.לאחר מכן, השקופיות נשטפו במים מזוקקים למשך שעה אחת ולאחר מכן הוכנסו לתמיסת פוקסין חומצת אלוורה של Bibrich למשך 10 דקות.לאחר מכן, השקופיות נשטפו במים מזוקקים והונחו בתמיסה של 5% פוספומוליבדן/5% חומצה פוספוטונגסטית למשך 10 דקות.מבלי לשטוף, העבירו את השקופיות ישירות לתמיסת הכחול אנילין למשך 15 דקות.לאחר מכן, השקופיות נשטפו במים מזוקקים והונחו בתמיסת חומצה אצטית 1% למשך 2 דקות.השקופיות יובשו באתנול 200 N והועברו לקסילן.שקופיות מוכתמות הוצגו באמצעות מיקרוסקופ Keyence עם מטרה פי 10.אחוז שטח הפיברוזיס הוכמת באמצעות תוכנת Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), מספר קטלוגי V13154, לפי פרוטוקול היצרן עם כמה שינויים.בפרט, אגרוף כירורגי בקוטר של 6 מ"מ שימש כדי להבטיח גודל רקמה אחיד במהלך ניתוח MTT.רקמות צופו בנפרד לתוך בארות של צלחת 12 באר המכילה מצע MTT על פי פרוטוקול היצרן.החתכים מודגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות והרקמה החיה מבצעת חילוף חומרים של מצע MTT ליצירת תרכובת פורמזן סגולה.החלף את תמיסת MTT עם 1 מ"ל DMSO ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לחלץ פורמזן סגול מקטעי לב.דגימות דוללו 1:10 ב-DMSO בצלחות תחתונות שקופות עם 96 בארים ועוצמת צבע סגול נמדדה ב-570 ננומטר באמצעות קורא לוחיות Cytation (BioTek).הקריאות נורמלו למשקל של כל פרוסת לב.
מדיית פרוסת לב הוחלפה במדיה המכילה 1 μCi/ml [5-3H]-גלוקוז (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ארה"ב) לבדיקת ניצול גלוקוז כפי שתואר קודם לכן.לאחר 4 שעות של דגירה, הוסף 100 μl של מדיום לצינור מיקרוצנטריפוגה פתוח המכילה 100 μl של 0.2 N HCl.לאחר מכן, הצינור הונח בצינור נצנוץ שהכיל 500 μl של dH2O כדי לאדות [3H]2O למשך 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן הסר את צינור המיקרוצנטריפוגה מצינור ההנצנץ והוסף 10 מ"ל של נוזל הנצנץ.ספירת ניצוץ בוצעה באמצעות מנתח ניצוץ נוזלי Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ארה"ב).לאחר מכן, ניצול הגלוקוז חושב תוך התחשבות בפעילות ספציפית של [5-3H]-גלוקוז, שיווי משקל ורקע לא מלאים, דילול של [5-3H]-לגלוקוז ללא תווית ויעילות נגד ניצוץ.הנתונים מנורמלים למסה של חלקי הלב.
לאחר הומוגניזציה של רקמות ב-Trizol, RNA בודד מקטעי לב באמצעות Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 לפי פרוטוקול היצרן.הכנת ספריית RNAsec, רצף וניתוח נתונים בוצעו כדלקמן:
1 מיקרוגרם של RNA לדגימה שימש כחומר מוצא להכנת ספריית ה-RNA.ספריות רצף נוצרו באמצעות NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit עבור Illumina (NEB, ארה"ב) בהתאם להמלצות היצרן, ונוספו קודי אינדקס לרצפי התכונות של כל דגימה.בקצרה, mRNA טוהר מ-RNA הכולל באמצעות חרוזים מגנטיים המחוברים באוליגונוקלאוטידים פולי-T.פיצול מתבצע באמצעות קטיונים דו ערכיים בטמפרטורה גבוהה ב-NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).cDNA של גדיל ראשון סונתז באמצעות פריימרים אקראיים של הקסאמר ו-M-MuLV transcriptase הפוכה (RNase H-).לאחר מכן מסונתז ה-cDNA של הגדיל השני באמצעות DNA פולימראז I ו-RNase H. שאר התולים מומרים לקצוות קהים על ידי פעילות אקסונוקלאז/פולימראז.לאחר אדנילציה של קצה 3' של קטע ה-DNA, מחברים אליו מתאם NEBNext עם מבנה לולאת סיכת ראש כדי להכין אותו להכלאה.לבחירה של שברי cDNA באורך מועדף 150-200 bp.שברי ספרייה טוהרו באמצעות מערכת AMPure XP (בקמן קולטר, בוורלי, ארה"ב).לאחר מכן, 3 μl USER Enzyme (NEB, ארה"ב) עם cDNA שנבחר בגודל קשור עם מתאם שימש במשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן במשך 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס לפני PCR.לאחר מכן בוצע PCR באמצעות Phusion High-Fidelity DNA פולימראז, פריימרים אוניברסליים PCR ופריימרים אינדקס (X).לבסוף, מוצרי PCR טוהרו (מערכת AMPure XP) ואיכות הספרייה הוערכה במערכת Agilent Bioanalyzer 2100.לאחר מכן בוצע רצף של ספריית cDNA באמצעות רצף Novaseq.קובצי תמונה גולמיים מ- Illumina הומרו לקריאה גולמית באמצעות CASAVA Base Calling.נתונים גולמיים מאוחסנים בקבצים בפורמט FASTQ(fq) המכילים רצפי קריאה ואיכויות בסיס מתאימות.בחר HISAT2 כדי להתאים קריאות רצף מסונן לגנום הייחוס Sscrofa11.1.באופן כללי, HISAT2 תומך בגנומים בכל גודל, כולל גנומים גדולים מ-4 מיליארד בסיסים, וערכי ברירת מחדל נקבעים עבור רוב הפרמטרים.ניתן ליישר ביעילות קריאות חיבור מנתוני RNA Seq באמצעות HISAT2, המערכת המהירה ביותר שקיימת כיום, עם דיוק זהה או טוב יותר מכל שיטה אחרת.
שפע התמלילים משקף ישירות את רמת ביטוי הגנים.רמות ביטוי הגנים מוערכות לפי שפע התמלילים (ספירת רצף) הקשורים לגנום או לאקסונים.מספר הקריאות הוא פרופורציונלי לרמות ביטוי הגנים, אורך הגן ועומק הרצף.FPKM (פרגמנטים לאלף זוגות בסיסים של תמליל ברצף למיליון זוגות בסיסים) חושבו וערכי P של ביטוי דיפרנציאלי נקבעו באמצעות חבילת DESeq2.לאחר מכן חישבנו את שיעור הגילוי הכוזב (FDR) עבור כל ערך P באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg9 בהתבסס על פונקציית R המובנית "p.adjust".
RNA שבודד מקטעי לב הומר ל-cDNA בריכוז של 200 ng/μl באמצעות תערובת SuperScript IV Vilo Master מבית Thermo (Thermo, מס' קטגוריה 11756050).RT-PCR כמותי בוצע באמצעות צלחת תגובה שקופה של Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, cat. no. 4483319) ו-microamp אופטי (Thermo, cat. no. 4311971).תערובת התגובה כללה 5 µl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer ו-3.5 µl H2O מעורבב לכל באר.מחזורי qPCR סטנדרטיים הופעלו וערכי CT נמדדו באמצעות מכשיר Applied Biosystems Quantstudio 5 בזמן אמת PCR (מודול 384 בארות; מוצר # A28135).פריימרים של טקמן נרכשו מ-Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (8906_08m1), RGL1 (Ss01068m1) (890608m1) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) ערכי השמירה של הגן היו נורמליים ל-GDHAP.
פרסום מדיה של NT-ProBNP הוערך באמצעות ערכת NT-ProBNP (חזיר) (מספר קטגוריה MBS2086979, MyBioSource) לפי פרוטוקול היצרן.בקצרה, 250 μl מכל דגימה ותקן נוספו בשני עותקים לכל באר.מיד לאחר הוספת הדגימה, הוסף 50 μl של ריאגנט Assay A לכל באר.נער בעדינות את הצלחת ואטום עם איטום.לאחר מכן הטבליות הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.לאחר מכן שאפו את התמיסה ושטפו את הבארות 4 פעמים עם 350 μl של תמיסת כביסה 1X, תוך דגירה של תמיסת הכביסה למשך 1-2 דקות בכל פעם.לאחר מכן הוסף 100 μl של ריאגנט Assay B לבאר ואטום עם חומר איטום לצלחת.הטבליה נוערה בעדינות והודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.שאפו את התמיסה ושטפו את הבארות 5 פעמים עם 350 μl של תמיסת כביסה 1X.הוסף 90 μl של תמיסת מצע לכל באר ואטום את הצלחת.דגירה על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות.הוסף 50 µl Stop Solution לכל באר.הצלחת נמדדה מיד באמצעות קורא לוחות Cytation (BioTek) שהוגדר ל-450 ננומטר.
בוצעו ניתוחי הספק כדי לבחור את גדלי הקבוצה אשר יספקו> 80% הספק כדי לזהות שינוי מוחלט של 10% בפרמטר עם שיעור שגיאה של 5% מסוג I. בוצעו ניתוחי הספק כדי לבחור את גדלי הקבוצה אשר יספקו> 80% הספק כדי לזהות שינוי מוחלט של 10% בפרמטר עם שיעור שגיאה של 5% מסוג I. אנליזה מונוסטית בנויה למשחקי אופניים, קצבאות אופטימליות > 80% מונוסטיות לאופן הבטחה 10% тра с 5% частотой ошибок типа I. ניתוח הספק בוצע כדי לבחור גדלי קבוצות שיספקו מעל 80% הספק כדי לזהות 10% שינוי פרמטר אבסולוטי עם שיעור שגיאה של 5% מסוג I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄嚰嚄嚽进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄嚰嚄嚽 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения обнаружения параметров и 5% частоты ошибок типа I. בוצע ניתוח כוח לבחירת גודל קבוצה שיספק מעל 80% הספק כדי לזהות 10% שינוי פרמטר אבסולוטי ושיעור שגיאות מסוג I של 5%.חלקי רקמות נבחרו באקראי לפני הניסוי.כל הניתוחים היו עיוורי מצב ודגימות פוענחו רק לאחר ניתוח כל הנתונים.תוכנת GraphPad Prism (San Diego, CA) שימשה לביצוע כל הניתוחים הסטטיסטיים. עבור כל הנתונים הסטטיסטיים, ערכי p נחשבו משמעותיים בערכים <0.05. עבור כל הסטטיסטיקה, ערכי p נחשבו משמעותיים בערכים <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. עבור כל הסטטיסטיקה, ערכי p נחשבו משמעותיים בערכים <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. עבור כל הסטטיסטיקה, ערכי p נחשבו משמעותיים בערכים <0.05.מבחן t Student's Two-tailed בוצע על הנתונים עם 2 השוואות בלבד.ANOVA חד כיווני או דו כיווני שימש לקביעת מובהקות בין מספר קבוצות.בעת ביצוע בדיקות פוסט-הוק, התיקון של Tukey הוחל כדי לתת מענה להשוואות מרובות.לנתוני RNAsec יש שיקולים סטטיסטיים מיוחדים בעת חישוב FDR ו-p.adjust כמתואר בסעיף שיטות.
למידע נוסף על עיצוב מחקר, עיין בתקציר דוח מחקר הטבע המקושר למאמר זה.