תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
קיים צורך במערכת אמינה במבחנה שיכולה לשחזר במדויק את הסביבה הפיזיולוגית של הלב לצורך בדיקת תרופות. הזמינות המוגבלת של מערכות לתרבית רקמת לב אנושית הובילה לפרשנויות לא מדויקות של השפעות התרופות על הלב. כאן, פיתחנו מודל לתרבית רקמת לב (CTCM) שמגרה באופן אלקטרומכני פרוסות לב ועובר מתיחה פיזיולוגית במהלך השלבים הסיסטוליים והדיאסטוליים של מחזור הלב. לאחר 12 ימי תרבית, גישה זו שיפרה חלקית את הכדאיות של פרוסות הלב, אך לא שימרה באופן מלא את שלמותן המבנית. לכן, לאחר סינון מולקולות קטנות, מצאנו כי תוספת של 100 ננומטר טריודוטירונין (T3) ו-1 מיקרומטר דקסמתזון (Dex) למדיום שלנו שמרה על המיקרו-מבנה של הפרוסות למשך 12 ימים. בשילוב עם טיפול ב-T3/Dex, מערכת CTCM שמרה על פרופילי תעתוק, כדאיות, פעילות מטבולית ושלמות מבנית באותה רמה כמו רקמת לב טרייה למשך 12 ימים. בנוסף, מתיחה מוגזמת של רקמת הלב בתרבית גורמת לאיתות לבבי היפרטרופי, מה שמספק ראיות ליכולתו של CTCM לחקות מצבים היפרטרופיים הנגרמים על ידי מתיחה לבבית. לסיכום, CTCM יכול למדל את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלב בתרבית לאורך תקופות זמן ארוכות, מה שמאפשר סינון תרופות אמין.
לפני מחקר קליני, יש צורך במערכות אמינות במבחנה (in vitro) שיכולות לשחזר במדויק את הסביבה הפיזיולוגית של הלב האנושי. מערכות כאלה צריכות לחקות שינויים במתיחה מכנית, קצב לב ותכונות אלקטרופיזיולוגיות. מודלים של בעלי חיים משמשים בדרך כלל כפלטפורמת סינון לפיזיולוגיה של הלב, עם אמינות מוגבלת בשיקוף השפעות התרופות בלב האדם. בסופו של דבר, מודל הניסוי האידיאלי של תרבית רקמת לב (CTCM) הוא מודל רגיש וספציפי ביותר להתערבויות טיפוליות ופרמקולוגיות שונות, ומשחזר במדויק את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלב האנושי. היעדר מערכת כזו מגביל את גילוי טיפולים חדשים לאי ספיקת לב והוביל לרעילות קרדיומטית של תרופות כסיבה עיקרית ליציאה מהשוק.
במהלך העשור האחרון, שמונה תרופות שאינן קרדיווסקולריות הוצאו משימוש קליני משום שהן גורמות להארכת מרווח QT המובילה להפרעות קצב חדריות ומוות פתאומי 7. לפיכך, קיים צורך גובר באסטרטגיות סינון פרה-קליניות אמינות להערכת יעילות ורעילות קרדיווסקולרית. השימוש האחרון בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (hiPS-CM) בסינון תרופות ובדיקת רעילות מספק פתרון חלקי לבעיה זו. עם זאת, האופי הבלתי בשל של hiPS-CM וחוסר המורכבות הרב-תאית של רקמת הלב הן מגבלות עיקריות של שיטה זו. מחקרים אחרונים הראו כי ניתן להתגבר חלקית על מגבלה זו על ידי שימוש מוקדם ב-hiPS-CM ליצירת הידרוג'לים של רקמת הלב זמן קצר לאחר תחילת התכווצויות ספונטניות והגברה הדרגתית של גירוי חשמלי לאורך זמן. עם זאת, למיקרו-רקמות hiPS-CM אלו חסרות התכונות האלקטרופיזיולוגיות והכווצות הבוגרות של שריר הלב של בוגר. בנוסף, לרקמת לב אנושית מבנה מורכב יותר, המורכב מתערובת הטרוגנית של סוגי תאים שונים, כולל תאי אנדותל, נוירונים ופיברובלסטים סטרומליים, המחוברים זה לזה באמצעות קבוצות ספציפיות של חלבוני מטריצה ​​חוץ-תאית. הטרוגניות זו של אוכלוסיות שאינן קרדיומיוציטים בלב יונקים בוגרים מהווה מכשול עיקרי למידול רקמת לב באמצעות סוגי תאים בודדים. מגבלות עיקריות אלו מדגישות את החשיבות של פיתוח שיטות לתרבית רקמת שריר הלב שלמה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
חתכים דקים (300 מיקרומטר) של לב אנושי בתרבית הוכחו כמודל מבטיח של שריר לב אנושי שלם. שיטה זו מספקת גישה למערכת תלת-ממדית רב-תאית שלמה הדומה לרקמת לב אנושית. עם זאת, עד 2019, השימוש בחתכי לב בתרבית הוגבל על ידי הישרדות קצרה (24 שעות) של התרבית. זאת בשל מספר גורמים, כולל היעדר מתיחה פיזיקלית-מכנית, ממשק אוויר-נוזל ושימוש במדיום פשוט שאינו תומך בצרכים של רקמת הלב. בשנת 2019, מספר קבוצות מחקר הדגימו כי שילוב גורמים מכניים במערכות תרביות רקמת לב יכול להאריך את חיי התרבית, לשפר את ביטוי הלב ולחקות פתולוגיה לבבית. שני מחקרים אלגנטיים 17 ו-18 מראים כי לעומס מכני חד-צירי יש השפעה חיובית על הפנוטיפ הלבבי במהלך התרבית. עם זאת, מחקרים אלה לא השתמשו בעומס פיזיקלי-מכני תלת-ממדי דינמי של מחזור הלב, מכיוון שחתכי הלב הועמסו בכוחות מתיחה איזומטריים 17 או בעומס אוקסוטוני ליניארי 18. שיטות אלו של מתיחת רקמות הביאו לדיכוי של גנים רבים של הלב או לביטוי יתר של גנים הקשורים לתגובות מתיחה חריגות. ראוי לציין כי פיטוליס ועמיתיו פיתחו אמבט תרבית דינמי של פרוסות לב לשחזור מחזור הלב באמצעות משוב מתמר כוח והנעת מתח. למרות שמערכת זו מאפשרת מידול מדויק יותר של מחזור הלב במבחנה, המורכבות והתפוקה הנמוכה של השיטה מגבילות את יישום מערכת זו. המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה מערכת תרבית פשוטה באמצעות גירוי חשמלי ותמיסה אופטימלית לשמירה על הכדאיות של חתכים של רקמת לב חזירית ואנושית עד 6 ימים.
בכתב היד הנוכחי, אנו מתארים מודל תרבית רקמת לב (CTCM) המשתמש בחתכים של לב חזיר המשלב רמזים הומורליים כדי לשחזר פיזיולוגיה תלת-ממדית של הלב והתנפחות פתופיזיולוגית במהלך מחזור הלב. CTCM זה יכול להגביר את דיוק חיזוי התרופות הפרה-קליני לרמה שלא הושגה מעולם, על ידי מתן מערכת לב חסכונית ובתפוקה בינונית המחקה את הפיזיולוגיה/פתופיזיולוגיה של לב יונקים לצורך בדיקות תרופות פרה-קליניות.
אותות מכניים המודינמיים ממלאים תפקיד קריטי בשמירה על תפקוד שריר הלב במבחנה 22,23,24. בכתב היד הנוכחי, פיתחנו CTCM (איור 1א) ​​שיכול לחקות את סביבת הלב של מבוגרים על ידי גרימת גירוי חשמלי ומכני בתדרים פיזיולוגיים (1.2 הרץ, 72 פעימות לדקה). כדי למנוע מתיחה מוגזמת של הרקמה במהלך הדיאסטולה, נעשה שימוש במכשיר הדפסה תלת-ממדי כדי להגדיל את גודל הרקמה ב-25% (איור 1ב). קיצוב חשמלי המושרה על ידי מערכת C-PACE תוזמן להתחיל 100 מילישניות לפני סיסטולה באמצעות מערכת רכישת נתונים כדי לשחזר באופן מלא את מחזור הלב. מערכת תרבית הרקמה משתמשת במפעיל פנאומטי הניתן לתכנות (LB Engineering, גרמניה) כדי להרחיב באופן מחזורי קרום סיליקון גמיש כדי לגרום להתרחבות של פרוסות הלב בתא העליון. המערכת חוברה לקו אוויר חיצוני דרך מתמר לחץ, מה שאפשר להתאים במדויק את הלחץ (± 1 מ"מ כספית) ואת הזמן (± 1 מילישניות) (איור 1ג).
א. חברו את חתך הרקמה לטבעת התמיכה בקוטר 7 מ"מ, המוצגת בכחול, בתוך תא התרבית של המכשיר. תא התרבית מופרד מתא האוויר על ידי קרום סיליקון דק וגמיש. הניחו אטם בין כל תא כדי למנוע דליפות. מכסה המכשיר מכיל אלקטרודות גרפיט המספקות גירוי חשמלי. ב. ייצוג סכמטי של מכשיר הרקמה הגדול, טבעת ההדרכה וטבעת התמיכה. חתכי הרקמה (חום) ממוקמים על המכשיר הגדול במיוחד כאשר טבעת ההדרכה ממוקמת בחריץ בקצה החיצוני של המכשיר. בעזרת ההדרכה, הניחו בזהירות את טבעת התמיכה המצופה בדבק אקרילי לרקמות מעל חתך רקמת הלב. ג. גרף המציג את זמן הגירוי החשמלי כפונקציה של לחץ תא האוויר הנשלט על ידי מפעיל פנאומטי הניתן לתכנות (PPD). נעשה שימוש במכשיר רכישת נתונים לסנכרון הגירוי החשמלי באמצעות חיישני לחץ. כאשר הלחץ בתא התרבית מגיע לסף שנקבע, נשלח אות דופק ל-C-PACE-EM כדי להפעיל גירוי חשמלי. ד. תמונה של ארבעה CTCMs המונחים על מדף אינקובטור. ארבעה מכשירים מחוברים ל-PPD אחד באמצעות מעגל פנאומטי, וחיישני לחץ מוכנסים לשסתום ההמוסטט כדי לנטר את הלחץ במעגל הפנאומטי. כל מכשיר מכיל שישה מקטעי רקמה.
באמצעות מפעיל פנאומטי יחיד, הצלחנו לשלוט ב-4 מכשירי CTCM, שכל אחד מהם יכול להכיל 6 חתכי רקמה (איור 1ד). ב-CTCM, לחץ האוויר בתא האוויר מומר ללחץ סינכרוני בתא הנוזל ומשרה התפשטות פיזיולוגית של פרוסת הלב (איור 2א' וסרטון משלים 1). הערכה של מתיחת הרקמה ב-80 מ"מ כספית. Art. הראתה מתיחה של חתכי רקמה ב-25% (איור 2ב'). אחוז מתיחה זה הוכח כמתאים לאורך סרקומרים פיזיולוגי של 2.2-2.3 מיקרומטר עבור התכווצות תקינה של חתך לבבי17,19,25. תנועת הרקמה הוערכה באמצעות הגדרות מצלמה מותאמות אישית (איור משלים 1). משרעת ומהירות תנועת הרקמה (איור 2ג', ד') תאמו למתיחה במהלך מחזור הלב ולזמן במהלך סיסטולה ודיאסטולה (איור 2ב'). מתיחה ומהירות רקמת הלב במהלך התכווצות והרפיה נותרו קבועות במשך 12 ימים בתרבית (איור 2ו'). כדי להעריך את השפעת הגירוי החשמלי על התכווצות במהלך התרבית, פיתחנו שיטה לקביעת עיוות פעיל באמצעות אלגוריתם הצללה (איור משלים 2א', ב') והצללנו להבחין בין עיוותים עם ובלי גירוי חשמלי. אותו קטע של הלב (איור 2ו'). באזור הניתן להזזה של החתך (R6-9), המתח במהלך הגירוי החשמלי היה גבוה ב-20% מאשר בהיעדר גירוי חשמלי, דבר המצביע על תרומת הגירוי החשמלי לתפקוד ההתכווצות.
עקבות מייצגות של לחץ תא האוויר, לחץ תא הנוזלים ומדידות תנועת רקמה מאשרות שלחץ התא משנה את לחץ תא הנוזלים, וגורם לתנועה מקבילה של פרוסת הרקמה. ב עקבות מייצגות של אחוז מתיחה (כחול) של חתכי רקמה התואמים לאחוז מתיחה (כתום). ג התנועה הנמדדת של פרוסת הלב עולה בקנה אחד עם מהירות התנועה הנמדדת. (ד) מסלולים מייצגים של תנועה מחזורית (קו כחול) ומהירות (קו מקווקו כתום) בפרוסת לב. ה כימות זמן מחזור (n = 19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), זמן התכווצות (n = 19 פרוסות לקבוצה), זמן הרפיה (n = 19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), תנועת רקמה (n = 25 פרוסות)/קבוצה מחזירים שונים), שיא מהירות סיסטולית (n = 24(D0), 25(D12) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים) ושיא קצב הרפיה (n=24(D0), 25(D12) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים). מבחן t דו-צדדי של סטודנט לא הראה הבדל משמעותי באף פרמטר. ‏עקבות ניתוח מאמץ מייצגות של חתכי רקמה עם (אדום) ובלי (כחול) גירוי חשמלי, עשרה אזורים אזוריים של חתכי רקמה מאותו חתך. הפאנלים התחתונים מציגים את כימות ההבדל באחוזים במאמץ בחתכי רקמה עם ובלי גירוי חשמלי בעשרה אזורים מחתכים שונים. (n = 8 פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן t דו-צדדי של סטודנט; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן t דו-צדדי של סטודנט; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 ש"ח/חג של שוויון, ביטוח לאומי t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, *p<0,01,**p<0,01,**). (n = 8 חתכים/קבוצה מחזירים שונים, מבחן t דו-צדדי של סטודנט; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 חתכים/קבוצה, מחזירים שונים, מבחן t דו-צדדי של סטודנט; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).סרגלי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
במערכת התרבית הביומימטית הסטטית הקודמת שלנו [20, 21], שמרנו על הכדאיות, התפקוד והשלמות המבנית של פרוסות הלב במשך 6 ימים על ידי הפעלת גירוי חשמלי ואופטימיזציה של הרכב המדיום. עם זאת, לאחר 10 ימים, נתונים אלה ירדו בחדות. נתייחס לחתכים שגודלו במערכת התרבית הביומימטית הסטטית הקודמת שלנו 20, 21 בתנאי בקרה (Ctrl) ונשתמש במדיום האופטימלי שלנו בעבר כתנאי MC ותרבית תחת גירוי מכני וחשמלי סימולטני (CTCM). הנקרא . ראשית, קבענו שגירוי מכני ללא גירוי חשמלי אינו מספיק כדי לשמור על כדאיות הרקמה למשך 6 ימים (איור משלים 3a,b). מעניין לציין, שעם הכנסת הגירוי הפיזי-מכני והחשמלי באמצעות STCM, הכדאיות של חתכי לב בני 12 יום נותרה זהה לזו בחתכי לב טריים בתנאי MS, אך לא בתנאי Ctrl, כפי שמוצג על ידי ניתוח MTT (איור 1). 3a). זה מצביע על כך שגירוי מכני וסימולציה של מחזור הלב יכולים לשמור על חתכי רקמה בני קיימא למשך זמן כפול ממה שדווח במערכת התרבית הסטטית הקודמת שלנו. עם זאת, הערכת השלמות המבנית של חתכי רקמה על ידי סימון אימונו של טרופונין T וקונקסין 43 לבבי הראתה כי ביטוי קונקסין 43 היה גבוה משמעותית ברקמות MC ביום 12 מאשר בקבוצת הביקורת באותו יום. עם זאת, ביטוי אחיד של קונקסין 43 ויצירת דיסק Z לא נשמרו במלואם (איור 3b). אנו משתמשים במסגרת בינה מלאכותית (AI) כדי לכמת את השלמות המבנית של הרקמה26, צינור למידה עמוקה מבוסס תמונה המבוסס על צביעת טרופונין-T וקונקסין43 כדי לכמת באופן אוטומטי את השלמות המבנית והפלואורסצנציה של פרוסות לב מבחינת חוזק הלוקליזציה. שיטה זו משתמשת ברשת נוירונים קונבולוציונית (CNN) ובמסגרת למידה עמוקה כדי לכמת באופן אמין את השלמות המבנית של רקמת הלב באופן אוטומטי ובלתי מוטה, כמתואר במקור.26. רקמת MC הראתה דמיון מבני משופר ליום 0 בהשוואה לחתכי בקרה סטטיים. בנוסף, צביעת הטריכרומה של מאסון גילתה אחוז נמוך משמעותית של פיברוזיס בתנאי MS בהשוואה לתנאי בקרה ביום 12 של התרבית (איור 3c). בעוד ש-CTCM הגביר את הכדאיות של מקטעי רקמת הלב ביום 12 לרמה דומה לזו של רקמת לב טרייה, הוא לא שיפר באופן משמעותי את השלמות המבנית של מקטעי הלב.
גרף עמודות מציג כימות של כדאיות MTT של פרוסות לב טריות (D0) או תרבית פרוסות לב במשך 12 ימים בתרבית סטטית (D12 Ctrl) או ב-CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בדיקת ANOVA חד כיוונית מבוצעת; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו- **p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl). גרף עמודות מציג כימות של כדאיות MTT של פרוסות לב טריות (D0) או תרבית פרוסות לב במשך 12 ימים בתרבית סטטית (D12 Ctrl) או ב-CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בדיקת ANOVA חד כיוונית מבוצעת; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו- **p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl).ההיסטוגרמה מציגה את כימות הכדאיות של חתכי לב טריים מ-MTT (D0) או תרבית של חתכי לב במשך 12 ימים בתרבית סטטית (ביקורת D12) או CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (ביקורת D12). ) ), 12 (D12 MC) חתכים/קבוצה מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד-כיוונית;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו- **p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/畐臑卌AN，进测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，##与##p < 0.0001Ctrl相比，**p.)היסטוגרמה המציגה את כימות הכדאיות של MTT בחתכי לב טריים (D0) או חתכי לב שגודלו במשך 12 ימים בתרבית סטטית (בקרת D12) או CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (בקרת D12)), 12 (D12 MC) חתכים/קבוצה מחזירים שונים, מבחן ANOVA חד-כיווני;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0, **p < 0.01 בהשוואה ל-D12 (Ctrl).ב' טרופונין-T (ירוק), קונקסין 43 (אדום) ו-DAPI (כחול) בחתכי לב מבודדים טריים (D0) או חתכי לב שגודלו בתנאים סטטיים (Ctrl) או תנאי CTCM (MC) למשך 12 ימים) של תמונות אימונופלואורסצנציה מייצגות (קנה מידה ריק = 100 מיקרומטר). כימות בינה מלאכותית של שלמות מבנית רקמת הלב (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) פרוסות/קבוצה מכל אחת מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד-כיוונית; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). כימות בינה מלאכותית של שלמות מבנית רקמת הלב (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) פרוסות/קבוצה מכל אחת מחזירים שונים, מבוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 сD пгов) (D12 пгр) от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ; כימות שלמות מבנית של רקמת לב באמצעות בינה מלאכותית (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) חתכים/קבוצות מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001 לעומת D0 ו- ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) פרוסות/קבוצה של כל אחד מחזירים שונים, מבחן ANOVA בכיוון אחד .##0D .#0D#0;#相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) פרוסות/קבוצה של כל אחד מהחזירים השונים, מבחן ANO-כיווני.#0#0p <0#0p בכיוון אחד;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7) (D512 Ctrl), срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. Ctrl). בינה מלאכותית לכמת את השלמות המבנית של רקמת הלב (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) חתכים/קבוצה מכל אחד מחזירים שונים, מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p<0.0001 לעומת .D0 להשוואה ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). c תמונות מייצגות (שמאל) וכימות (מימין) עבור פרוסות לב צבועות בצביעת טריכרום של מאסון (קנה מידה חשוף = 500 מיקרומטר) (n = 10 פרוסות/קבוצה מכל אחת מחזיר שונה, מבוצעת בדיקת ANOVA חד-כיוונית; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-***p < 0.001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). c תמונות מייצגות (שמאל) וכימות (מימין) עבור פרוסות לב צבועות בצביעת טריכרום של מאסון (קנה מידה חשוף = 500 מיקרומטר) (n = 10 פרוסות/קבוצה מכל אחת מחזירים שונים, מבוצעת בדיקת ANOVA חד-כיוונית; #### p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו- ***p < 0.001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихмных (מכסה ללא תשלום = 500 מ"ק) (n = 10 ש"ח/גמרא על בסיס שוויון, אופציה לאומית בתאריך 0,0,0 תאריך תאריך 0,#0 נו"ש; сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c תמונות מייצגות (שמאל) וכימות (מימין) של חתכי לב צבועים בצביעת טריכרום של מאסון (קנה מידה ללא ציפוי = 500 מיקרומטר) (n = 10 חתכים/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; #### p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-***p < 0.001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺0）（裸=尺0）（裸=尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比1p <0 ．0***1p Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庣 帺壸庣 庰裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单# 向 单# 向0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихмных (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощогруппа дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c תמונות מייצגות (שמאל) וכימות (מימין) של חתכי לב צבועים בצביעת טריכרום של מאסון (ריק = 500 מיקרומטר) (n = 10 חתכים/קבוצה, כל אחד מחזיר שונה, נבדקו על ידי ניתוח שונות חד כיווני ;### # p < 0.0001 בהשוואה ל-D0, ***p < 0.001 בהשוואה ל-D12 Ctrl).סרגלי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
שיערנו שעל ידי הוספת מולקולות קטנות למצע התרבית, ניתן לשפר את שלמות הקרדיומיוציטים ולהפחית את התפתחות הפיברוזיס במהלך תרבית CTCM. לכן, ביצענו בדיקות לגילוי מולקולות קטנות באמצעות תרביות הבקרה הסטטיות שלנו20,21 עקב מספרם הקטן של גורמים מבלבלים. דקסמתזון (Dex), טריודוטירונין (T3) ו-SB431542 (SB) נבחרו לסריקה זו. מולקולות קטנות אלו שימשו בעבר בתרביות hiPSC-CM כדי לגרום להבשלה של קרדיומיוציטים על ידי הגדלת אורך הסרקומרים, צינורות ה-T ומהירות ההולכה. בנוסף, ידוע כי גם Dex (גלוקוקורטיקואיד) וגם SB מדכאים דלקת29,30. לכן, בדקנו האם הכללת אחת מהמולקולות הקטנות הללו או שילוב שלהן תשפר את השלמות המבנית של חלקי לב. לסריקה ראשונית, המינון של כל תרכובת נבחר על סמך הריכוזים הנפוצים במודלים של תרבית תאים (1 מיקרומולר Dex27, 100 ננומולר T327 ו-2.5 מיקרומולר SB31). לאחר 12 ימי תרבית, השילוב של T3 ו-Dex הביא לשלמות מבנית אופטימלית של שרירי הלב ולעיצוב מחדש מינימלי של הסיבים (איורים משלימים 4 ו-5). בנוסף, שימוש בריכוזים כפולים או כפולים מאלה של T3 ו-Dex יצר השפעות מזיקות בהשוואה לריכוזים רגילים (איור משלים 6א',ב').
לאחר סינון ראשוני, ביצענו השוואה ראש בראש של 4 תנאי תרבית (איור 4א'): Ctrl: חתכי לב שגודלו בתרבית הסטטית שתוארה קודם לכן באמצעות המדיום האופטימלי שלנו; 20.21 TD: T3 ו-Ctrl נוספו Dex ביום רביעי; MC: חתכי לב שגודלו ב-CTCM באמצעות המדיום האופטימלי שלנו; ו-MT: CTCM עם T3 ו-Dex שנוספו למדיום. לאחר 12 ימי תרבית, הכדאיות של רקמות MS ו-MT נותרה זהה לזו של רקמות טריות שהוערכו על ידי בדיקת MTT (איור 4ב'). מעניין לציין, כי הוספת T3 ו-Dex לתרביות טרנסוול (TD) לא הביאה לשיפור משמעותי בכדאיות בהשוואה לתנאי Ctrl, דבר המצביע על תפקיד חשוב של גירוי מכני בשמירה על הכדאיות של חתכי לב.
דיאגרמת עיצוב ניסויית המתארת ​​את ארבעת תנאי התרבית ששימשו להערכת השפעות הגירוי המכני ותוסף T3/Dex על המדיום במשך 12 ימים. ב' גרף עמודות מציג כימות של הכדאיות 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (Ctrl, TD, MC ו-MT) בהשוואה לפרוסות לב טריות (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MT), 12 (D12 MC) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 בהשוואה ל-D0 ו- **p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl). ב' גרף עמודות מציג כימות של הכדאיות 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (Ctrl, TD, MC ו-MT) בהשוואה לפרוסות לב טריות (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MT), 12 (D12 MC) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 בהשוואה ל-D0 ו- **p < 0.01 בהשוואה ל-D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования воценку культивирования (контроль, TD, MC ו-MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD, D12) CT, D12) MT, D12) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравни; с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ב. גרף העמודות מציג את כימות הכדאיות 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (ביקורת, TD, MC ו-MT) בהשוואה לחתכי לב טריים (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MT), 12 (D12 MC) חתכים/קבוצה מחזירים שונים, מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 לעומת D0 ו- **p < 0.01 בהשוואה ל-D12 Ctrl). b.和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001， .0#1， .0#1，相比，**p < 0.01 与D12控制）.ב 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ו-MT) по сравнению со свежезц (0) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0 ##0п.#0p, ##00#0p; сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). ב' היסטוגרמה המציגה את כל 4 תנאי התרבית (ביקורת, TD, MC ו-MT) בהשוואה לחתכי לב טריים (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MT), מחזירים שונים 12 (D12 MC) חתכים/קבוצה, מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p<0.0001, ###p<0.001 לעומת D0, **p<0.01 לעומת ביקורת D12). ג' גרף עמודות מציג את כימות שטף הגלוקוז 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (Ctrl, TD, MC ו-MT) בהשוואה לפרוסות לב טריות (D0) (n = 6 פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ###p < 0.001, בהשוואה ל-D0 ו-***p < 0.001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). ג' גרף עמודות מציג את כימות שטף הגלוקוז 12 ימים לאחר התרבית בכל 4 תנאי התרבית (Ctrl, TD, MC ו-MT) בהשוואה לפרוסות לב טריות (D0) (n = 6 פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ###p < 0.001, בהשוואה ל-D0 ו-***p < 0.001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4висованис культивирования (контроль, TD, MC ו-MT) על ידי שימוש ב- сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групзиот, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c היסטוגרמה מציגה כימות של שטף גלוקוז 12 ימים לאחר התרבית תחת כל 4 תנאי התרבית (ביקורת, TD, MC ו-MT) בהשוואה לחתכי לב טריים (D0) (n = 6 חתכים/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ###p < 0.001 בהשוואה ל-D0 ו-***p < 0.001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹养吐和弌吐天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0#p < 0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切 片 切 片 切 片 切培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования культивирования (контроль, TD, MC ו- MT) בעבור התקדמות ב- свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групрапс, срезов, срезовирования односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c היסטוגרמה המציגה כימות של שטף גלוקוז 12 ימים לאחר התרבית עבור כל 4 תנאי התרבית (ביקורת, TD, MC ו-MT) בהשוואה לחתכי לב טריים (D0) (n = 6 חתכים/קבוצה, מחזירים שונים, חד-צדדיים שבהם בוצעו בדיקות ANOVA, ###p < 0.001 בהשוואה ל-D0, ***p < 0.001 בהשוואה ל-D12 (ביקורת).ד. עלילות ניתוח זנים של רקמות טריות (כחול), רקמות מיום 12 MC (ירוק) ורקמות מיום 12 MT (אדום) בעשר נקודות חתך רקמה אזוריות (n = 4 פרוסות/קבוצה, מבחן ANOVA חד-כיווני; לא היה הבדל משמעותי בין הקבוצות). ה. עלילת געש המציגה גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי בחתכי לב טריים (D0) בהשוואה לחתכי לב שגודלו בתנאים סטטיים (Ctrl) או בתנאי MT (MT) למשך 10-12 ימים. ו. מפת חום של גנים של סרקומרים עבור חתכי לב שגודלו בכל אחד מתנאי התרבית. סרגלי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
תלות מטבולית במעבר מחמצון חומצות שומן לגליקוליזה היא סימן היכר של דה-דיפרנציאציה של קרדיומיוציטים. קרדיומיוציטים לא בוגרים משתמשים בעיקר בגלוקוז לייצור ATP ויש להם מיטוכונדריה היפופלסטית עם מעט קריסטאות 5,32. ניתוחי ניצול גלוקוז הראו שבתנאי MC ו-MT, ניצול הגלוקוז היה דומה לזו ברקמות ביום 0 (איור 4c). עם זאת, דגימות Ctrl הראו עלייה משמעותית בניצול גלוקוז בהשוואה לרקמה טרייה. זה מצביע על כך שהשילוב של CTCM ו-T3/Dex משפר את כדאיות הרקמה ומשמר את הפנוטיפ המטבולי של חתכי לב שעברו תרבית במשך 12 ימים. בנוסף, ניתוח עקה הראה שרמות העיכול נותרו זהות לאלו ברקמת לב טרייה במשך 12 ימים בתנאי MT ו-MS (איור 4d).
כדי לנתח את ההשפעה הכוללת של CTCM ו-T3/Dex על נוף התעתוק הגלובלי של רקמת פרוסת לב, ביצענו RNAseq על פרוסות לב מכל ארבעת תנאי התרבית השונים (נתונים משלימים 1). מעניין לציין, שחתכי MT הראו דמיון תעתוקי גבוה לרקמת לב טרייה, כאשר רק 16 גנים באו לידי ביטוי דיפרנציאלי מתוך 13,642 גנים. עם זאת, כפי שהראינו קודם לכן, פרוסות Ctrl הציגו 1229 גנים באו לידי ביטוי דיפרנציאלי לאחר 10-12 ימים בתרבית (איור 4e). נתונים אלה אושרו על ידי qRT-PCR של גנים של לב ופיברובלסטים (איור משלים 7a-c). מעניין לציין, שחתכי Ctrl הראו ירידה בוויסות של גנים של הלב ומחזור התא והפעלה של תוכניות גנים דלקתיות. נתונים אלה מצביעים על כך שדה-דיפרנציאציה, המתרחשת בדרך כלל לאחר תרבית ארוכת טווח, נחלשת לחלוטין בתנאי MT (איור משלים 8a,b). מחקר מדוקדק של גנים של סרקומרים הראה שרק בתנאי MT נשמרים הגנים המקודדים את הסרקומר (איור 4f) ואת תעלת היונים (איור משלים 9), ומגנים עליהם מפני דיכוי בתנאי Ctrl, TD ו-MC. נתונים אלה מראים שעם שילוב של גירוי מכני והומורלי (T3/Dex), הטרנסקריפטום של פרוסת הלב יכול להישאר דומה לפרוסות לב טריות לאחר 12 ימים בתרבית.
ממצאים תעתוקיים אלה נתמכים על ידי העובדה ששלמותם המבנית של קרדיומיוציטים בחתכי לב נשמרת בצורה הטובה ביותר בתנאי MT למשך 12 ימים, כפי שמוצג על ידי קונקסין 43 שלם ומקומי (איור 5א'). בנוסף, הפיברוזיס בחתכי לב בתנאי MT הופחת משמעותית בהשוואה ל-Ctrl ובדומה לחתכי לב טריים (איור 5ב'). נתונים אלה מראים כי השילוב של גירוי מכני וטיפול ב-T3/Dex משמר ביעילות את מבנה הלב בחתכי לב בתרבית.
תמונות אימונופלואורסצנציה מייצגות של טרופונין-T (ירוק), קונקסין 43 (אדום) ו-DAPI (כחול) בחתכי לב מבודדים טריים (D0) או שגודלו במשך 12 ימים בכל ארבעת תנאי התרבית של חתכי הלב (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). כימות בינה מלאכותית של שלמות מבנית רקמת הלב (n = 7 (D0 ו-D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ו-D12 MT) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-*p < 0.05, או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). כימות בינה מלאכותית של שלמות מבנית רקמת הלב (n = 7 (D0 ו-D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ו-D12 MT) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, מבוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; #### p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-*p < 0.05, או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 Ctrl), (D = 7 (D12, Ctrl) MC ו D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). כימות שלמות מבנית של רקמת לב באמצעות בינה מלאכותית (n = 7 (D0 ו-D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ו-D12 MT) חתכים/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; #### p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-*p < 0.05 או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 希0*p <0.0*p <0.****p <0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 t12 mc 廒 d12 mc 廒人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与新 和*p****p < 0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.כימות שלמות מבנית של רקמת לב באמצעות בינה מלאכותית בחזירים שונים (n = 7 (D0 ו-D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ו-D12 MT) חתכים/קבוצה) באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו-*p < 0.05 או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 (Ctrl). ב' תמונות מייצגות וכימות עבור פרוסות לב צבועות בצביעת טריכרום של מאסון (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ו-D12 MC), 9 (D12 MT) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו- ***p < 0.001, או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). ב' תמונות מייצגות וכימות עבור פרוסות לב צבועות בצביעת טריכרום של מאסון (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ו-D12 MC), 9 (D12 MT) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0 ו- ***p < 0.001, או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем ( линейка = 500 מ"ק) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выдонсолня ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ב' תמונות מייצגות וכימות של חתכי לב צבועים בצביעת טריכרום של מאסון (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 (D12 MT) חתכים/קבוצה מחזירים שונים, בוצעו ANOVA חד-כיווני; ####p < 0.0001 לעומת D0 ו- ***p < 0.001 או ****p < 0.0001 לעומת D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm = 010！D = 010（D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方垐分#0与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ0（n = 0（0（n 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；1.0##D相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона = масная мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ; #0п,#000 с D0, ***p < 0,001 או ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ב' תמונות מייצגות וכימות של חתכי לב צבועים בטריכרום של מאסון (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ו-D12 MC), 9 חתכים (D12 MT) מחזירים/קבוצה שונים, שיטת ANOVA אחת; ####p < 0.0001 בהשוואה ל-D0, ***p < 0.001 או ****p < 0.0001 בהשוואה ל-D12 Ctrl).סרגלי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
לבסוף, היכולת של CTCM לחקות היפרטרופיה לבבית הוערכה על ידי הגברת מתיחה של רקמת הלב. ב-CTCM, לחץ האוויר השיא בתא עלה מ-80 מ"מ כספית ל-80 מ"מ כספית (מתיחה רגילה) עד 140 מ"מ כספית (איור 6א'). נתון זה מתאים לעלייה של 32% במתיחה (איור 6ב'), אשר הוצגה בעבר כאחוז המתיחה המתאים הנדרש עבור מקטעי לב כדי להשיג אורך סרקומרים דומה לזה שנראה בהיפרטרופיה. המתיחה ומהירות רקמת הלב במהלך התכווצות והרפיה נותרו קבועות במהלך שישה ימי תרבית (איור 6ג'). רקמת לב מתנאי MT נותרה נתונה לתנאי מתיחה רגילים (MT (רגיל)) או מתיחה יתר (MT (OS)) במשך שישה ימים. כבר לאחר ארבעה ימים בתרבית, הסמן ההיפרטרופי NT-ProBNP היה גבוה משמעותית במדיום בתנאי MT (OS) בהשוואה לתנאי MT (רגילים) (איור 7א'). בנוסף, לאחר שישה ימים של גידול, גודל התאים ב-MT (OS) (איור 7b) גדל משמעותית בהשוואה לחתכים של לב MT (תקין). בנוסף, טרנסלוקציה גרעינית של NFATC4 גדלה משמעותית ברקמות מתוחות יתר על המידה (איור 7c). תוצאות אלו מראות את ההתפתחות ההדרגתית של שיפוץ פתולוגי לאחר היפר-דיסטנזיה ותומכות ברעיון שניתן להשתמש במכשיר CTCM כפלטפורמה לחקר איתות היפרטרופיה לבבית המושרה על ידי מתיחה.
עקבות מייצגות של לחץ תא האוויר, לחץ תא הנוזל ומדידות תנועת רקמה מאשרות שלחץ התא משנה את לחץ תא הנוזל, וגורם לתנועה מקבילה של פרוסת הרקמה. ב. עקומות אחוז מתיחה וקצב מתיחה מייצגות עבור חתכי רקמה מתוחים בדרך כלל (כתומים) ומתוחים יתר על המידה (כחולים). ג. גרף עמודות המציג את זמן המחזור (n = 19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), זמן התכווצות (n = 18-19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), זמן הרפיה (n = 19 פרוסות לקבוצה, מחזירים שונים), משרעת תנועת הרקמה (n = 14 פרוסות/קבוצה, מחזירים שונים), מהירות סיסטולית שיא (n = 14 פרוסות/קבוצה, מחזירים שונים) וקצב הרפיה שיא (n = 14 (D0), 15 (D6)) חתכים/קבוצות) מחזירים שונים), מבחן t דו-צדדי של סטודנט לא הראה הבדל משמעותי באף פרמטר, דבר המצביע על כך שפרמטרים אלה נותרו קבועים במהלך 6 ימי תרבית עם מתח יתר. סרגלי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.
כימות גרף עמודות של ריכוז NT-ProBNP במצע תרבית מפרוסות לב שגודלו בתנאי מתיחה רגילה (Norm) או מתיחה יתר (OS) של MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ו-D4 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצעה ANOVA דו-כיווני; **p < 0.01 בהשוואה למתיחה רגילה). כימות גרף עמודות של ריכוז NT-ProBNP במצע תרבית מפרוסות לב שגודלו בתנאי מתיחה רגילה (Norm) או מתיחה יתר (OS) של MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ו-D4 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצעה ANOVA דו-כיווני; **p < 0.01 בהשוואה למתיחה רגילה).היסטוגרמה כמותית של ריכוז NT-ProBNP במדיום תרבית מפרוסות לב שגודלו בתנאים של מתיחה תקינה של MT (נורמה) או מתיחה יתר (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ו-D4).MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע ניתוח שונות דו-גורמי;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 בהשוואה למתיחה רגילה). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01）. כימות של ריכוז NT-ProBNP בפרוסות לב תרבותיות בתנאי מתיחה רגילה של MT (נורמה) או מתיחת יתר (OS) (n=4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ממגוון猪的切片/组，可以双向方方发发动 **בהשוואה למתיחה רגילה, p <0.01).היסטוגרמה כימות ריכוזי NT-ProBNP בפרוסות לב שגודלו בתנאים של מתיחה MT תקינה (נורמה) או מתיחה יתר (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ו-D4 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, ניתוח שונות דו-כיווני;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 בהשוואה למתיחה רגילה). ב' תמונות מייצגות של פרוסות לב צבועות בטרופונין-T ו-WGA (משמאל) וכימות גודל תאים (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) תאים/קבוצה מ-10 פרוסות שונות מחזירים שונים, בוצע מבחן t דו-צדדי של סטודנט; ****p < 0.0001 בהשוואה למתיחה תקינה). ב' תמונות מייצגות של פרוסות לב צבועות בטרופונין-T ו-WGA (שמאל) וכימות גודל תאים (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) תאים/קבוצה מ-10 פרוסות שונות מחזירים שונים, בוצע מבחן t דו-צדדי של סטודנט; ****p < 0.0001 בהשוואה למתיחה תקינה). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количествениногого клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, двх-из t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). ב' תמונות מייצגות של חתכי לב צבועים בטרופונין-T ו-AZP (משמאל) וכימות גודל תאים (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) תאים/קבוצה מ-10 חתכים שונים מחזירים שונים, בוצע מבחן t דו-צדדי של סטודנט; ****p < 0.0001 בהשוואה למאמץ תקין). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表怃MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尟学甌检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）. ב' תמונות מייצגות של פרוסות לב צבועות בקלקרין-T ו-WGA (שמאל) וגודל תאים (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 מ-10 פרוסות שונות (D6 MTNorm)) תאים/תאים, מבחן t של המערכת החיסונית; בהשוואה למתיחה רגילה, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная количественная (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/групэпа, Справа, Справа; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). ב' תמונות מייצגות של חתכי לב צבועים בטרופונין-T ו-AZP (משמאל) וכימות גודל התאים (מימין) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) מ-10 חתכים שונים מחזירים שונים) תאים/קבוצה, קריטריון דו-צדדי סטודנט'ס t; ****p < 0.0001 בהשוואה לעומס תקין). ג' תמונות מייצגות עבור פרוסות לב של MTOS ביום 0 ויום 6, מסומנות באימונו עבור טרופונין-T ו-NFATC4 וכימות הטרנסלוקציה של NFATC4 לגרעיני CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן t דו-צדדי של סטודנט; *p < 0.05). ג. תמונות מייצגות עבור פרוסות לב של MTOS ביום 0 ויום 6, מסומנות באימונו לטרופונין-T ו-NFATC4 וכימות הטרנסלוקציה של NFATC4 לגרעיני CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים, בוצע מבחן t דו-צדדי של סטודנט; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 ו- 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и ковленич транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиняней , выпусян t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). ג. תמונות מייצגות של חתכי לב ב-MTOS של 0 ו-6 ימים, עם סימון אימונו של טרופונין-T ו-NFATC4, וכימות טרנסלוקציה של NFATC4 בגרעין של תאים כבדיים (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) פרוסות/קבוצה מחזירים שונים) שבוצעו באמצעות מבחן t דו-צדדי של סטודנט; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量匀4（n) ㌀4（n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c תמונות מייצגות של calcanin-T ו-NFATC4 אימונולוויוג 第0天和第6天MTOS פרוסות לב, ו-NFATC4 מכמות גרעין תאי NFATC4 易位至CM שונים (n = 4 (D0), 缇 , 3, MTOS, 3 (D6 )时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 ו 6 день для иммуномаркировки тропонинстином-Т и NFATC4 транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критеритер,0). c תמונות מייצגות של פרוסות לב MTOS ביום 0 ו-6 עבור סימון אימונו של טרופונין-T ו-NFATC4 וכימות טרנסלוקציה של NFATC4 בגרעין CM מחזירים שונים (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) פרוסות/קבוצה, קריטריון t דו-זנבי של סטודנט; *p < 0.05).סרגלי שגיאה מייצגים ממוצע ± סטיית תקן.
מחקר קרדיווסקולרי טרנסלציוני דורש מודלים תאיים המשחזרים במדויק את סביבת הלב. במחקר זה פותח ואופיין מכשיר CTCM שיכול לעורר מקטעים דקים במיוחד של הלב. מערכת ה-CTCM כוללת גירוי אלקטרומכני מסונכרן פיזיולוגית והעשרת נוזלי T3 ו-Dex. כאשר מקטעי לב חזיר נחשפו לגורמים אלה, הכדאיות שלהם, השלמות המבנית, הפעילות המטבולית והביטוי התעתוקי שלהם נותרו זהים לאלה שברקמת לב טרייה לאחר 12 ימי תרבית. בנוסף, מתיחה מוגזמת של רקמת הלב עלולה לגרום להיפרטרופיה של הלב הנגרמת כתוצאה מהיפר-אקסטנציה. בסך הכל, תוצאות אלו תומכות בתפקיד הקריטי של תנאי תרבית פיזיולוגיים בשמירה על פנוטיפ לבבי תקין ומספקות פלטפורמה לסינון תרופות.
גורמים רבים תורמים ליצירת סביבה אופטימלית לתפקודם והישרדותם של שרירי לב. הגורמים הבולטים ביותר קשורים ל-(1) אינטראקציות בין-תאיות, (2) גירוי אלקטרומכני, (3) גורמים הומורליים, ו-(4) מצעים מטבוליים. אינטראקציות פיזיולוגיות בין תאים דורשות רשתות תלת-ממדיות מורכבות של סוגי תאים מרובים הנתמכות על ידי מטריצה ​​חוץ-תאית. אינטראקציות תאיות מורכבות כאלה קשות לשחזור במבחנה על ידי תרבית משותפת של סוגי תאים בודדים, אך ניתן להשיגן בקלות באמצעות האופי האורגנוטיפי של מקטעי לב.
מתיחה מכנית וגירוי חשמלי של שרירי לב הם קריטיים לשמירה על פנוטיפ לבבי33,34,35. בעוד שגירוי מכני נמצא בשימוש נרחב להתניה והבשלה של hiPSC-CM, מספר מחקרים אלגנטיים ניסו לאחרונה גירוי מכני של פרוסות לב בתרבית באמצעות טעינה חד-צירית. מחקרים אלה מראים כי טעינה מכנית חד-צירית דו-ממדית משפיעה לטובה על הפנוטיפ של הלב במהלך התרבית. במחקרים אלה, מקטעי הלב הועמסו בכוחות מתיחה איזומטריים17, טעינה אוקסוטונית ליניארית18, או שמחזור הלב שוחזר באמצעות משוב מתמר כוח ומניעי מתח. עם זאת, שיטות אלה משתמשות במתיחת רקמה חד-צירית ללא אופטימיזציה סביבתית, וכתוצאה מכך דיכוי של גנים לבביים רבים או ביטוי יתר של גנים הקשורים לתגובות מתיחה חריגות. CTCM המתואר כאן מספק גירוי אלקטרומכני תלת-ממדי המחקה את מחזור הלב הטבעי מבחינת זמן מחזור ומתיחה פיזיולוגית (25% מתיחה, 40% סיסטולה, 60% דיאסטולה ו-72 פעימות לדקה). למרות שגירוי מכני תלת-ממדי זה לבדו אינו מספיק לשמירה על שלמות הרקמה, שילוב של גירוי הומורלי ומכני באמצעות T3/Dex נדרש כדי לשמור כראוי על כדאיות, תפקוד ושלמות הרקמה.
גורמים הומורליים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות פנוטיפ הלב של אדם בוגר. ממצא זה הודגש במחקרי HiPS-CM בהם נוספו T3 ו-Dex למצע תרבית כדי להאיץ את התבגרות התאים. T3 עשוי להשפיע על הובלת חומצות אמינו, סוכרים וסידן על פני קרומי התאים36. בנוסף, T3 מקדם ביטוי של MHC-α וירידה ב-MHC-β, ומקדם את היווצרותם של מיופיברילים מהירים בקרדיומיוציטים בוגרים בהשוואה למיופיברילים איטיים בקרדיומיוציטים עובריים. מחסור ב-T3 אצל חולי תת פעילות של בלוטת התריס גורם לאובדן רצועות מיופיברילריות ולקצב התפתחות מופחת של טונוס שריר הלב37. Dex פועל על קולטני גלוקוקורטיקואידים והוכח כמגביר את התכווצות שריר הלב בלבבות מבודדים שעברו פרפוזיה;38 שיפור זה נחשב קשור להשפעה על כניסת סידן מונעת משקעי סידן (SOCE)39,40. בנוסף, Dex נקשר לקולטנים שלו, וגורם לתגובה תוך תאית רחבה המדכאת את תפקוד המערכת החיסונית ואת הדלקת30.
תוצאותינו מצביעות על כך שגירוי מכני פיזי (MS) שיפר את ביצועי התרבית הכוללים בהשוואה ל-Ctrl, אך לא הצליח לשמור על הכדאיות, השלמות המבנית וביטוי הלב במשך 12 ימים בתרבית. בהשוואה ל-Ctrl, הוספת T3 ו-Dex לתרביות CTCM (MT) שיפרה את הכדאיות ושמרה על פרופילי שעתוק, שלמות מבנית ופעילות מטבולית דומים עם רקמת לב טרייה במשך 12 ימים. בנוסף, על ידי שליטה במידת מתיחת הרקמה, נוצר מודל היפרטרופיה לבבית המושרה על ידי היפר-אקסטנשן באמצעות STCM, הממחיש את הרבגוניות של מערכת STCM. יש לציין שלמרות ששיפוץ לבבי ופיברוזיס כוללים בדרך כלל איברים שלמים שתאי המחזור שלהם יכולים לספק את הציטוקינים המתאימים כמו גם פגוציטוזה וגורמי שיפוץ אחרים, חלקים מהלב עדיין יכולים לחקות את התהליך הפיברוטי בתגובה ללחץ וטראומה לתוך מיופיברובלסטים. זה הוערך בעבר במודל פרוסת לב זה. יש לציין שניתן לווסת את פרמטרי CTCM על ידי שינוי לחץ/אמפליטודה חשמלית ותדירות כדי לדמות מצבים רבים כגון טכיקרדיה, ברדיקרדיה ותמיכה מכנית במחזור הדם (לב ללא פריקה מכנית). זה הופך את המערכת לתפוקה בינונית לבדיקת תרופות. היכולת של CTCM לדמות היפרטרופיה לבבית הנגרמת על ידי מאמץ יתר סוללת את הדרך לבדיקת מערכת זו לטיפול מותאם אישית. לסיכום, המחקר הנוכחי מדגים כי מתיחה מכנית וגירוי הומורלי הם קריטיים לשמירה על תרבית של חתכי רקמת לב.
למרות שהנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך ש-CTCM היא פלטפורמה מבטיחה מאוד למידול שריר הלב שלם, לשיטת תרבית זו יש כמה מגבלות. המגבלה העיקרית של תרבית CTCM היא שהיא מטילה מאמצים מכניים דינמיים מתמשכים על הפרוסות, דבר המונע את היכולת לנטר באופן פעיל את התכווצויות פרוסות הלב במהלך כל מחזור. בנוסף, בשל גודלם הקטן של חתכי הלב (7 מ"מ), היכולת להעריך את התפקוד הסיסטולי מחוץ למערכות תרבית באמצעות חיישני כוח מסורתיים מוגבלת. בכתב היד הנוכחי, התגברנו חלקית על מגבלה זו על ידי הערכת מתח אופטי כאינדיקטור לתפקוד התכווצות. עם זאת, מגבלה זו תדרוש עבודה נוספת וייתכן שתטופל בעתיד על ידי הכנסת שיטות לניטור אופטי של תפקוד פרוסות הלב בתרבית, כגון מיפוי אופטי באמצעות סידן וצבעים רגישים למתח. מגבלה נוספת של CTCM היא שהמודל העובד אינו מתמרן את הלחץ הפיזיולוגי (עומס מקדים ועומס לאחר). ב-CTCM, הושרה לחץ בכיוונים מנוגדים כדי לשחזר מתיחה פיזיולוגית של 25% בדיאסטולה (מתיחה מלאה) ובסיסטולה (אורך ההתכווצות במהלך גירוי חשמלי) ברקמות גדולות מאוד. יש להסיר מגבלה זו בעיצובים עתידיים של CTCM על ידי לחץ מספק על רקמת הלב משני הצדדים ועל ידי יישום יחסי לחץ-נפח מדויקים המתרחשים בתאי הלב.
השיפוץ המושרה על ידי מתיחה יתר המדווח בכתב יד זה מוגבל לחיקוי אותות היפר-מתיחה היפרטרופיים. לכן, מודל זה יכול לסייע בחקר איתות היפרטרופי המושרה על ידי מתיחה ללא צורך בגורמים הומורליים או עצביים (שאינם קיימים במערכת זו). יש צורך במחקרים נוספים כדי להגדיל את ריבוי ה-CTCM, לדוגמה, גידול משותף עם תאי חיסון, גורמים הומורליים בפלזמה במחזור הדם, ועצבוב כאשר גידול משותף עם תאי עצב ישפר את האפשרויות של מידול מחלות עם CTCM.
במחקר זה נעשה שימוש בשלושה עשר חזירים. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת לואיוויל. קשת אבי העורקים נסגרה והלב הוזרק עם ליטר אחד של קרדיופלגיה סטרילית (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 יחידות/מ"ל הפרין, pH עד 7.4); הלבבות נשמרו בתמיסה קרדיופלוגית קרה כקרח עד להובלתם למעבדה על קרח, שבדרך כלל נמשך <10 דקות. הלבבות נשמרו בתמיסה קרדיופלוגית קרה כקרח עד להובלתם למעבדה על קרח, שבדרך כלל נמשך <10 דקות. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10мно. הלבבות אוחסנו בתמיסה קרדיופלוגית קרה כקרח עד להובלתם למעבדה על קרח, שלרוב אורכת פחות מ-10 דקות.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 דקות. שמור את הלבבות על קרח cardioplegia עד להובלה למעבדה על קרח, בדרך כלל <10 דקות.
מכשיר ה-CTCM פותח בתוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD) של SolidWorks. תאי התרבית, המחיצות ותאי האוויר עשויים מפלסטיק אקרילי שקוף CNC. טבעת הגיבוי בקוטר 7 מ"מ עשויה מפוליאתילן בצפיפות גבוהה (HDPE) במרכז וכוללת חריץ טבעת O לאחסון טבעת ה-O מסיליקון המשמשת לאיטום המדיום שמתחת. קרום סיליקה דק מפריד את תא התרבית מלוח ההפרדה. קרום הסיליקון חתוך בלייזר מיריעת סיליקון בעובי 0.02 אינץ' ובעל קשיות של 35A. אטמי הסיליקון התחתונים והעליונים חתוכים בלייזר מיריעת סיליקון בעובי 1/16 אינץ' ובעלי קשיות של 50A. ברגים ואומים מפלדת אל-חלד 316L משמשים להידוק הבלוק וליצירת אטימה אטומה.
לוח מעגל מודפס (PCB) ייעודי נועד להשתלב עם מערכת C-PACE-EM. שקעי מחבר המכונה השוויצרית על ה-PCB מחוברים לאלקטרודות גרפיט באמצעות חוטי נחושת מצופים כסף וברגים מברונזה 0-60 המוברגים לתוך האלקטרודות. לוח המעגל המודפס ממוקם במכסה המדפסת התלת-ממדית.
מכשיר ה-CTCM נשלט על ידי מפעיל פנאומטי מתוכנת (PPD) היוצר לחץ דם מבוקר בדומה למחזור לב. ככל שהלחץ בתוך תא האוויר עולה, קרום הסיליקון הגמיש מתרחב כלפי מעלה, וכפה על המדיום להיכנס מתחת לרקמה. אזור הרקמה יימתח על ידי פליטת הנוזל, ובכך מחקה את ההתפשטות הפיזיולוגית של הלב במהלך הדיאסטולה. בשיא ההרפיה, הוחלף גירוי חשמלי באמצעות אלקטרודות גרפיט, אשר הפחיתו את הלחץ בתא האוויר וגרמו להתכווצות של מקטעי הרקמה. בתוך הצינור נמצא שסתום המוסטטי עם חיישן לחץ לגילוי הלחץ במערכת האוויר. הלחץ הנקלט על ידי חיישן הלחץ מופעל על אספן נתונים המחובר למחשב הנייד. זה מאפשר ניטור רציף של הלחץ בתוך תא הגזים. כאשר הלחץ המרבי בתא הושג (80 מ"מ כספית סטנדרטית, 140 מ"מ כספית הפעלה), מכשיר איסוף הנתונים קיבל הוראה לשלוח אות למערכת C-PACE-EM כדי לייצר אות מתח דו-פאזי למשך 2 מילישניות, מוגדר ל-4 וולט.
נלקחו חתכי לב ותנאי התרבית ב-6 בארות בוצעו כדלקמן: הלבבות שנקטפו הועברו מכלי ההעברה למגש המכיל קרדיופלוגיה קרה (4°C). החדר השמאלי בודד באמצעות להב סטרילי ונחתך לחתיכות של 1-2 סמ"ק. גושי רקמה אלה חוברו לתומכי רקמה בעזרת דבק רקמה והונחו באמבט רקמה מיקרוטום רוטט המכיל תמיסת טירוד וחומצו באופן רציף (3 גרם/ליטר 2,3-בוטנדיון מונואוקסים (BDM), 140 mM NaCl (8.18 גרם), 6 mM KCl (0.447 גרם), 10 mM D-גלוקוז (1.86 גרם), 10 mM HEPES (2.38 גרם), 1 mM MgCl2 (1 מ"ל תמיסה 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 מ"ל תמיסה 1 M), עד 1 ליטר ddH2O). המיקרוטום הרוטט כוון לחתוך פרוסות בעובי 300 מיקרומטר בתדר של 80 הרץ, משרעת רטט אופקית של 2 מ"מ וקצב התקדמות של 0.03 מ"מ/שנייה. אמבט הרקמה הוקף בקרח כדי לשמור על התמיסה קרירה והטמפרטורה נשמרה על 4 מעלות צלזיוס. העבירו חתכי רקמה מאמבט המיקרוטום לאמבט דגירה המכיל תמיסת טירוד מחומצנת באופן רציף על קרח עד לקבלת מספיק חתכים לצלחת תרבית אחת. עבור תרביות טרנסוול, חתכי הרקמה חוברו לתומכי פוליאוריטן סטריליים ברוחב 6 מ"מ והונחו ב-6 מ"ל של מצע אופטימלי (מצע 199, תוסף ITS אחד, 10% FBS, 5 ננוגרם/מ"ל VEGF, 10 ננוגרם/מ"ל FGF-אלקליין ו-2 אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתית). גירוי חשמלי (10 וולט, תדר 1.2 הרץ) יושם על חתכי הרקמה דרך C-Pace. עבור תנאי TD, נוספו T3 ו-Dex טריים ב-100 ננומטר ו-1 מיקרומטר בכל החלפת מצע. המדיום רווי בחמצן לפני החלפתו 3 פעמים ביום. חתכי רקמה גודלו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
עבור תרביות CTCM, חתכי רקמה הונחו על מדפסת תלת-ממד בהתאמה אישית בצלחת פטרי המכילה תמיסת טירוד שעברה שינוי. המכשיר נועד להגדיל את גודל פרוסת הלב ב-25% משטח טבעת התמיכה. הדבר נעשה כדי שחתכי הלב לא יימתחו לאחר העברתם מתמיסת טירוד למדיום ובמהלך הדיאסטולה. באמצעות דבק היסטו-אקרילי, חתכו חתכים בעובי 300 מיקרומטר לטבעת תמיכה בקוטר 7 מ"מ. לאחר חיבור חתכי הרקמה לטבעת התמיכה, חתכו את חתכי הרקמה העודפים והחזירו את חתכי הרקמה המחוברים לאמבט תמיסת טירוד על קרח (4°C) עד להכנת מספיק חתכים עבור מכשיר אחד. זמן העיבוד הכולל עבור כל המכשירים לא יעלה על שעתיים. לאחר חיבור 6 חתכי רקמה לטבעות התמיכה שלהם, הורכב מכשיר ה-CTCM. תא התרבית של CTCM מולא מראש ב-21 מ"ל של מדיום מחומצן מראש. העבירו את חתכי הרקמה לתא התרבית והסירו בזהירות בועות אוויר בעזרת פיפטה. לאחר מכן, חתך הרקמה מובל לתוך החור ונלחץ בעדינות למקומו. לבסוף, הניחו את מכסה האלקטרודה על המכשיר והעבירו את המכשיר לאינקובטור. לאחר מכן, חברו את ה-CTCM לצינור האוויר ולמערכת C-PACE-EM. המפעיל הפנאומטי נפתח ושסתום האוויר פותח את ה-CTCM. מערכת C-PACE-EM הוגדרה לספק 4 וולט בתדר של 1.2 הרץ במהלך קיצוב דו-פאזי למשך 2 מילישניות. המדיום הוחלף פעמיים ביום והאלקטרודות הוחלפו פעם ביום כדי למנוע הצטברות גרפיט על האלקטרודות. במידת הצורך, ניתן להוציא את חתכי הרקמה מבארות התרבית שלהם כדי להוציא בועות אוויר שייתכן שנפלו מתחתן. עבור תנאי טיפול ב-MT, T3/Dex נוספו טריים עם כל החלפת מדיום עם 100 nM T3 ו-1 μM Dex. התקני ה-CTCM גודלו באינקובטור ב-37°C ו-5% CO2.
כדי להשיג מסלולים מתוחים של פרוסות לב, פותחה מערכת מצלמה מיוחדת. מצלמת SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) שימשה עם עדשת מאקרו Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). ההדמיה בוצעה בטמפרטורת החדר לאחר החלפת המדיום במדיום חדש. המצלמה ממוקמת בזווית של 51° והווידאו מוקלט בקצב של 30 פריימים לשנייה. ראשית, נעשה שימוש בתוכנת קוד פתוח (MUSCLEMOTION43) עם Image-J כדי לכמת את תנועת פרוסות הלב. המסכה נוצרה באמצעות MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) כדי להגדיר אזורים מעניינים עבור פרוסות לב פועמות כדי למנוע רעש. מסכות מפולחות ידנית מוחלות על כל התמונות ברצף פריימים ולאחר מכן מועברות לתוסף MUSCLEMOTION. Muscle Motion משתמשת בעוצמה הממוצעת של הפיקסלים בכל פריים כדי לכמת את תנועתו ביחס לפריים הייחוס. הנתונים נרשמו, סוננו ושימשו לכמת את זמן המחזור ולהערכת מתיחת הרקמה במהלך מחזור הלב. הסרטון המוקלט עבר עיבוד לאחר מכן באמצעות מסנן דיגיטלי אפס-פאזה מסדר ראשון. כדי לכמת את מתיחת הרקמה (משיא לשיא), בוצע ניתוח משיא לשיא כדי להבחין בין שיאים לשפלים באות המוקלט. בנוסף, ניתוק מגמות מבוצע באמצעות פולינום מסדר שישי כדי למנוע סחיפה של האות. קוד תוכנה פותח ב-MATLAB כדי לקבוע את תנועת הרקמה הכללית, זמן המחזור, זמן הרלקסציה וזמן ההתכווצות (קוד תוכנה משלים 44).
לצורך ניתוח מאמץ, תוך שימוש באותם סרטונים שנוצרו להערכת מתיחה מכנית, ראשית עקבנו אחר שתי תמונות המייצגות שיאי תנועה (נקודות התנועה הגבוהות ביותר (העליונות) והנמוכות ביותר (התחתונות)) בהתאם לתוכנת MUSCLEMOTION. לאחר מכן פילחנו את אזורי הרקמה והחלתנו סוג של אלגוריתם הצללה על הרקמה המפולחת (איור משלים 2א'). הרקמה המפולחת חולקה לאחר מכן לעשרה תת-משטחים, והמאמץ על כל משטח חושב באמצעות המשוואה הבאה: מאמץ = (Sup-Sdown)/Sdown, כאשר Sup ו-Sdown הם המרחקים של הצורה מהצללים העליונים והתחתונים של הבד, בהתאמה (איור משלים 2ב').
חתכי לב קובעו בפאראפורמלדהיד 4% למשך 48 שעות. רקמות מקובעות יובשו ב-10% ו-20% סוכרוז למשך שעה אחת, ולאחר מכן ב-30% סוכרוז למשך הלילה. לאחר מכן, החתכים הוטמעו בתרכובת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (תרכובת OCT) והוקפאו בהדרגה באמבט איזופנטן/קרח יבש. אחסנו את בלוקי הטמעת OCT ב-80°C- עד להפרדה. השקופיות הוכנו כחתכים בעובי של 8 מיקרומטר.
כדי להסיר OCT ממקטעי לב, חממו את השקופיות על בלוק חימום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסיפו 1 מ"ל PBS לכל שקופית ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן חלחלו לחתכים על ידי הכנסת 0.1% Triton-X ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כדי למנוע נקשרים של נוגדנים לא ספציפיים לדגימה, הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת BSA 3% לשקופיות ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסרה ה-BSA והשקופיות נשטפו עם PBS. סמנו כל דגימה בעיפרון. נוגדנים ראשוניים (מדוללים 1:200 ב-1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) וטרופונין-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) נוספו במשך 90 דקות, לאחר מכן נוספו נוגדנים משניים (מדוללים 1:200 ב-1% BSA) כנגד Alexa Fluor 488 של עכבר (Thermo Scientific; #A16079), כנגד Alexa Fluor 594 של ארנבת (Thermo Scientific; #T6391) למשך 90 דקות נוספות. נשטפו 3 פעמים עם PBS. כדי להבחין בין צביעת המטרה לרקע, השתמשנו רק בנוגדן המשני כביקורת. לבסוף, נוספה צביעה גרעינית DAPI והשקופיות הונחו ב-vectashield (Vector Laboratories) ונאטמו בלק. הגדלה פי-40) ובמיקרוסקופ Keyence בהגדלה פי 40.
צבע ה-WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS שימש לצביעת WGA והוחדר על חתכים קבועים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השקופיות נשטפו עם PBS ולכל שקופית הוסיפו סוכר שחור סודן והם הודגרו במשך 30 דקות. לאחר מכן, השקופיות נשטפו עם PBS והוסיפו מצע הטמעה vectashield. השקופיות נצפו במיקרוסקופ Keyence בהגדלה של פי 40.
OCT הוסר מהדגימות כמתואר לעיל. לאחר הסרת ה-OCT, טבלו את השקופיות בתמיסת בוין למשך הלילה. לאחר מכן, השקופיות נשטפו במים מזוקקים למשך שעה ולאחר מכן הוכנסו לתמיסת פוקסין חומצת אלוורה של Bibrich למשך 10 דקות. לאחר מכן, השקופיות נשטפו במים מזוקקים והוכנסו לתמיסה של 5% פוספומוליבדן/5% חומצה פוספטונגסטית למשך 10 דקות. ללא שטיפה, העבירו את השקופיות ישירות לתמיסת כחול אנילין למשך 15 דקות. לאחר מכן, השקופיות נשטפו במים מזוקקים והוכנסו לתמיסת חומצה אצטית 1% למשך 2 דקות. השקופיות יובשו באתנול 200 N והועברו לקסילן. השקופיות הצבועות נצפו באמצעות מיקרוסקופ Keyence עם מטרה 10x. אחוז שטח הפיברוזיס נמדד כמותית באמצעות תוכנת Keyence Analyzer.
בדיקת הכדאיות של תאי MTT CyQUANT™ (Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה), מספר קטלוגי V13154, בהתאם לפרוטוקול היצרן עם כמה שינויים. בפרט, נעשה שימוש באגרוף כירורגי בקוטר 6 מ"מ כדי להבטיח גודל רקמה אחיד במהלך ניתוח MTT. הרקמות צולמו בנפרד לתוך בארות של צלחת בת 12 בארות המכילה מצע MTT בהתאם לפרוטוקול היצרן. החתכים הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות והרקמה החיה מפרקת את מצע ה-MTT ליצירת תרכובת פורמזן סגולה. החליפו את תמיסת ה-MTT ב-1 מ"ל DMSO ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לחלץ פורמזן סגול מחתכי לב. הדגימות דוללו 1:10 ב-DMSO בצלחות תחתונות שקופות עם 96 בארות ועוצמת הצבע הסגול נמדדה ב-570 ננומטר באמצעות קורא לוחות Cytation (BioTek). הקריאות מנורמלות למשקל של כל פרוסה של הלב.
מצע פרוסת הלב הוחלף במצע המכיל 1 מיקרו-סילידרון/מ"ל [5-3H]-גלוקוז (Moravek Biochemicals, בריאה, קליפורניה, ארה"ב) לצורך בדיקת ניצול גלוקוז כפי שתואר קודם לכן. לאחר 4 שעות של דגירה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מצע למבחנה פתוחה המכילה 100 מיקרוליטר של 0.2 N HCl. לאחר מכן, המבחנה הונחה במבחנה נצנוץ המכילה 500 מיקרוליטר של dH2O כדי לאדות [3H]2O למשך 72 שעות ב-37°C. לאחר מכן, הוציאו את מבחנה המיקרו-צנטריפוגה ממבחנה הנצנוץ והוסיפו 10 מ"ל של נוזל נצנוץ. ספירות נצנוץ בוצעו באמצעות מנתח נצנוץ נוזלי Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, מרידן, קונטיקט, ארה"ב). לאחר מכן חושבה ניצול הגלוקוז תוך התחשבות בפעילות ספציפית של גלוקוז [5-3H], שיווי משקל לא מלא ורקע, דילול של [5-3H] לגלוקוז לא מסומן, ויעילות מונה הנצנוץ. הנתונים מנורמלים למסה של חלקי הלב.
לאחר הומוגניזציה של רקמות ב-Trizol, בודד RNA מחתכי לב באמצעות ערכת Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 בהתאם לפרוטוקול של היצרן. הכנת ספריית RNAsec, ריצוף וניתוח נתונים בוצעו כדלקמן:
1 מיקרוגרם של RNA לכל דגימה שימש כחומר מוצא להכנת ספריית ה-RNA. ספריות ריצוף נוצרו באמצעות ערכת הכנת ספריית NEBNext UltraTM RNA עבור Illumina (NEB, ארה"ב) בהתאם להמלצות היצרן, וקודי אינדקס נוספו לרצפי המאפיינים עבור כל דגימה. בקצרה, mRNA טוהר מ-RNA כולל באמצעות חרוזים מגנטיים המחוברים עם אוליגונוקלאוטידים של poly-T. הפרגמנטציה מתבצעת באמצעות קטיונים דו-ערכיים בטמפרטורה גבוהה ב-NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). cDNA של הגדיל הראשון סונתז באמצעות פריימרים הקסאמריים אקראיים ו-M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). לאחר מכן, cDNA של הגדיל השני סונתז באמצעות DNA פולימראז I ו-RNase H. הקצוות הנותרים מומרים לקצוות קהים על ידי פעילות אקסונוקלאז/פולימראז. לאחר אדנילציה של קצה 3' של מקטע ה-DNA, מחובר אליו מתאם NEBNext עם מבנה לולאת סיכה כדי להכין אותו להכלאה. לבחירת מקטעי cDNA באורך מועדף של 150-200 bp. מקטעי ספרייה טוהרו באמצעות מערכת AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). לאחר מכן, נעשה שימוש ב-3 מיקרוליטר של אנזים USER (NEB, USA) עם cDNA שנבחר בגודל, המחובר למתאם, למשך 15 דקות ב-37°C ולאחר מכן למשך 5 דקות ב-95°C לפני ה-PCR. ה-PCR בוצע לאחר מכן באמצעות פולימראז DNA Phusion High-Fidelity, פריימרים אוניברסליים של PCR ופריימרים של Index (X). לבסוף, תוצרי ה-PCR טוהרו (מערכת AMPure XP) ואיכות הספרייה הוערכה במערכת Agilent Bioanalyzer 2100. לאחר מכן, ספריית ה-cDNA רוצפה באמצעות מרצפות Novaseq. קבצי תמונה גולמיים מ-Illumina הומרו לקריאות גולמיות באמצעות CASAVA Base Calling. הנתונים הגולמיים מאוחסנים בקבצי פורמט FASTQ(fq) המכילים רצפי קריאה ואיכויות בסיס מתאימות. בחר HISAT2 כדי להתאים קריאות ריצוף מסוננות לגנום הייחוס Sscrofa11.1. באופן כללי, HISAT2 תומך בגנומים בכל גודל, כולל גנומים גדולים מ-4 מיליארד בסיסים, וערכי ברירת מחדל נקבעים עבור רוב הפרמטרים. ניתן ליישר ביעילות קריאות שחבור מנתוני RNA Seq באמצעות HISAT2, המערכת המהירה ביותר הזמינה כיום, עם דיוק זהה או טוב יותר מכל שיטה אחרת.
שפע התעתיקים משקף ישירות את רמת ביטוי הגנים. רמות ביטוי הגנים מוערכות על ידי שפע התעתיקים (ספירת ריצוף) הקשורים לגנום או לאקסונים. מספר הקריאות פרופורציונלי לרמות ביטוי הגנים, אורך הגן ועומק הריצוף. חושבו FPKM (פרגמנטים לכל אלף זוגות בסיסים של תעתיק שרוצף לכל מיליון זוגות בסיסים) וערכי P של ביטוי דיפרנציאלי נקבעו באמצעות חבילת DESeq2. לאחר מכן חישבנו את שיעור הגילוי השקרי (FDR) עבור כל ערך P באמצעות שיטת בנג'מיני-הוכברג9 בהתבסס על פונקציית ה-R המובנית "p.adjust".
RNA שבודד מחתכי לב הומר ל-cDNA בריכוז של 200 ng/μl באמצעות תערובת SuperScript IV Vilo Master של Thermo (Thermo, מס' קטלוגי 11756050). RT-PCR כמותי בוצע באמצעות צלחת תגובה שקופה בעלת 384 בארות מבית Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, מס' קטלוגי 4483319) ודבק אופטי למיקרו-אמפ (Thermo, מס' קטלוגי 4311971). תערובת התגובה הורכבה מ-5 מיקרוליטר של תערובת Taqman Fast Advanced Master (Thermo, מס' קטלוגי 4444557), 0.5 מיקרוליטר פריימר Taqman ו-3.5 מיקרוליטר H2O מעורבבים לכל באר. בוצעו מחזורי qPCR סטנדרטיים וערכי CT נמדדו באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת מדגם Quantstudio 5 של Applied Biosystems (מודול 384 בארות; מס' מוצר A28135). פריימרים של טאקמן נרכשו מ-Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). ערכי ה-CT של כל הדגימות מנורמלים לגן הניקיון GAPDH.
הוערכת שחרור המדיה של NT-ProBNP באמצעות ערכת NT-ProBNP (חזיר) (מס' קטלוגי MBS2086979, MyBioSource) בהתאם לפרוטוקול של היצרן. בקצרה, 250 מיקרוליטר מכל דגימה וסטנדרט נוספו בשני עותקים לכל באר. מיד לאחר הוספת הדגימה, הוסיפו 50 מיקרוליטר של מגיב לבדיקה A לכל באר. נערו בעדינות את הצלחת ואטמו בחומר איטום. לאחר מכן הטבליות הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן, שאבו את התמיסה ושטפו את הבארות 4 פעמים עם 350 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה חד פעמית, תוך דגירה של תמיסת השטיפה במשך 1-2 דקות בכל פעם. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מגיב לבדיקה B לכל באר ואטמו בחומר איטום. הטבליה נוערה בעדינות והודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שאבו את התמיסה ושטפו את הבארות 5 פעמים עם 350 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה חד פעמית. הוסיפו 90 מיקרוליטר של תמיסת סובסטרט לכל באר וסגרו את הצלחת. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר. הצלחת נמדדה מיד באמצעות קורא צלחות Cytation (BioTek) מכוון ל-450 ננומטר.
בוצעו ניתוחי עוצמה כדי לבחור את גדלי הקבוצות שיספקו עוצמה של >80% לזיהוי שינוי מוחלט של 10% בפרמטר עם שיעור שגיאה מסוג I של 5%. בוצעו ניתוחי עוצמה כדי לבחור את גדלי הקבוצות שיספקו עוצמה של >80% לזיהוי שינוי מוחלט של 10% בפרמטר עם שיעור שגיאה מסוג I של 5%. אנליזה מונוסטית בנויה למשחקי אופניים, אופטימיזציה של מעל 80% מנוסה לאופן אובטחה 10% параметра с 5% частотой ошибок типа I. ניתוח עוצמה בוצע כדי לבחור גדלי קבוצות שיספקו עוצמה של >80% לזיהוי שינוי מוחלט בפרמטרים של 10% עם שיעור שגיאה מסוג I של 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения обнаружения изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. בוצע ניתוח עוצמה כדי לבחור גודל קבוצה שיספק עוצמה של >80% לזיהוי שינוי מוחלט בפרמטרים של 10% ושיעור שגיאה מסוג I של 5%.חתכי רקמה נבחרו באופן אקראי לפני הניסוי. כל הניתוחים בוצעו ללא תנאי בדיקה והדגימות פוענחו רק לאחר ניתוח כל הנתונים. תוכנת GraphPad Prism (סן דייגו, קליפורניה) שימשה לביצוע כל הניתוחים הסטטיסטיים. עבור כל הסטטיסטיקות, ערכי p נחשבו מובהקים בערכים <0.05. עבור כל הסטטיסטיקות, ערכי p נחשבו מובהקים בערכים <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. עבור כל הסטטיסטיקות, ערכי p נחשבו מובהקים בערכים <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. עבור כל הסטטיסטיקות, ערכי p נחשבו מובהקים בערכים <0.05.מבחן t דו-צדדי של סטודנט בוצע על הנתונים עם שתי השוואות בלבד. ניתוח אנובה חד-כיווני או דו-כיווני שימש לקביעת מובהקות בין קבוצות מרובות. בעת ביצוע מבחני פוסט-הוק, יושם תיקון טוקי כדי להתחשב בהשוואות מרובות. לנתוני RNAsec יש שיקולים סטטיסטיים מיוחדים בעת חישוב FDR ו-p.adjust כמתואר בפרק השיטות.
למידע נוסף על תכנון המחקר, עיינו בתקציר של דוח המחקר של Nature המקושר למאמר זה.