תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
שיטות חדשות של ספקטרומטריית מסות ואימונולוגיה לניתוח מורכב של אוליגוסכרידים עמידים בעצי תירס שטופלו מראש ב-AFEX. ביומסה ליגנוצלולוזית היא אלטרנטיבה בת קיימא לדלקים מאובנים ונמצאת בשימוש נרחב לפיתוח ביוטכנולוגיות לייצור מוצרים כגון מזון, מזון לבעלי חיים, דלקים וכימיקלים. המפתח לטכנולוגיות אלו הוא פיתוח תהליכים תחרותיים מבחינת עלות להמרת פחמימות מורכבות הקיימות בדפנות תאי צמחים לסוכרים פשוטים כגון גלוקוז, קסילוז וארבינוז. מכיוון שביומסה ליגנוצלולוזית עקשנית מאוד, יש לעבור עליה טיפולים תרמוכימיים (למשל, קילוף סיבי אמוניה (AFEX), חומצות מדוללות (DA), נוזלים יוניים (IL)) וטיפולים ביולוגיים (למשל, הידרוליזה אנזימטית ותסיסה מיקרוביאלית) בשילוב כדי להשיג את המוצר הרצוי. עם זאת, כאשר משתמשים באנזימי פטריות מסחריים בתהליך ההידרוליזה, רק 75-85% מהסוכרים המסיסים הנוצרים הם חד-סוכרים, ו-15-25% הנותרים הם אוליגוסכרידים מסיסים וקשים לטיפול, שאינם תמיד זמינים למיקרואורגניזמים. בעבר, בודדנו וטיהרנו בהצלחה אוליגוסכרידים עקשניים מסיסים באמצעות שילוב של הפרדת פחמן ואדמה דיאטומית וכרומטוגרפיית אי-גודל, וגם חקרנו את תכונותיהם המעכבות אנזימים. מצאנו שאוליגוסכרידים המכילים תחליפי חומצה אורונית מתילציה בדרגת פילמור גבוהה יותר (DP) קשים יותר לעיבוד עם תערובות אנזימים מסחריות מאשר אוליגוסכרידים DP נמוך ואוליגוסכרידים ניטרליים. כאן אנו מדווחים על שימוש במספר שיטות נוספות, כולל יצירת פרופיל גליקן באמצעות נוגדנים חד שבטיים (mAbs) ספציפיים לגליקנים מביומסה צמחית כדי לאפיין קשרי גליקן בדפנות תאי צמחים ובהידרוליזטים אנזימטיים, יינון דסורפציה בלייזר בסיוע מטריקס, וספקטרומטריית מסה בזמן-טיסה. MALDI-TOF-MS) משתמש בשיאים אבחנתיים אינפורמטיביים של מבנה המתקבלים על ידי ספקטרוסקופיה לאחר דעיכה משנית של יונים שליליים, כרומטוגרפיית גז וספקטרומטריית מסה (GC-MS) כדי לאפיין קשרי אוליגוסכרידים עם ובלי נגזרות. בשל גודלם הקטן של אוליגוסכרידים (DP 4-20), מולקולות אלו קשות לשימוש לקשירה ואפיון של mAb. כדי להתגבר על בעיה זו, יישמנו שיטת קיבוע חדשה מבוססת צימוד ביוטין, אשר סימנה בהצלחה את רוב האוליגוסכרידים המסיסים בעלי DP נמוך על פני המיקרו-פלטה, אשר שימשו לאחר מכן במערכת mAb בעלת תפוקה גבוהה לניתוח ליגציה ספציפי. שיטה חדשה זו תקל על פיתוח מבחני גליקום מתקדמים יותר בתפוקה גבוהה בעתיד, בהם ניתן להשתמש לבידוד ואפיון אוליגוסכרידים הקיימים בסמנים ביולוגיים למטרות אבחון.
ביומסה ליגנוצלולוזית, המורכבת מחומרים חקלאיים, ייעוריים, דשא ועץ, היא חומר גלם פוטנציאלי לייצור מוצרים ביולוגיים, כולל מזון, מזון לבעלי חיים, דלק וחומרים כימיים, לייצור מוצרים בעלי ערך גבוה יותר. פחמימות (כגון תאית והמיצלולוז) הקיימות בדפנות תאי צמחים עוברות דה-פולימריזציה למונוסכרידים על ידי עיבוד כימי וטרנספורמציה ביולוגית (כגון הידרוליזה אנזימטית ותסיסה מיקרוביאלית). טיפולים מקדימים נפוצים כוללים הרחבת סיבי אמוניה (AFEX), חומצה מדוללת (DA), נוזל יוני (IL) ופיצוץ קיטור (SE), המשתמשים בשילוב של כימיקלים וחום כדי להפחית את ייצור הליגנוצלולוזה על ידי פתיחת דפנות תאי צמחים. עקשנות החומר, 5. הידרוליזה אנזימטית מתבצעת בעומס מוצקים גבוה באמצעות אנזימים מסחריים פעילים המכילים פחמימות (CAZymes) ותסיסה מיקרוביאלית באמצעות שמרים או חיידקים טרנסגניים לייצור דלקים וכימיקלים ביולוגיים.
אנזימים מורכבים של פחמימות-סוכר באנזימים מסחריים מורכבים מתערובת מורכבת של אנזימים אשר מפרקים באופן סינרגטי קשרים מורכבים בין פחמימה לסוכר ליצירת חד-סוכרים 2,7. כפי שדיווחנו קודם לכן, הרשת המורכבת של פולימרים ארומטיים של ליגנין עם פחמימות הופכת אותם לעקשיים ביותר לטיפול, מה שמוביל להמרת סוכר לא שלמה, וצובר 15-25% של אוליגוסכרידים מסוגים שונים שאינם מיוצרים במהלך הידרוליזה אנזימטית של הביומסה שטופלה מראש. זוהי בעיה נפוצה בשיטות טיפול מקדים שונות בביומסה. חלק מהסיבות לצוואר בקבוק זה כוללות עיכוב אנזימים במהלך הידרוליזה, או היעדר או רמות נמוכות של אנזימים חיוניים הנדרשים לפירוק קשרי סוכר בביומסה צמחית. הבנת ההרכב והמאפיינים המבניים של סוכרים, כגון קשרי הסוכר באוליגוסכרידים, תעזור לנו לשפר את המרת הסוכר במהלך הידרוליזה, מה שיהפוך תהליכים ביוטכנולוגיים לתחרותיים מבחינת עלות עם מוצרים שמקורם בנפט.
קביעת מבנה הפחמימות היא מאתגרת ודורשת שילוב של שיטות כגון כרומטוגרפיית נוזלים (LC)11,12, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR)13, אלקטרופורזה קפילרית (CE)14,15,16 וספקטרומטריית מסות (MS)17. ,שמונה עשרה. שיטות MS כגון ספקטרומטריית מסות בזמן-טיסה עם דסורפציה ויוניזציה בלייזר באמצעות מטריצה ​​(MALDI-TOF-MS) הן שיטה רב-תכליתית לזיהוי מבני פחמימות. לאחרונה, MS טנדם מושרה על ידי התנגשות (CID) של תוצרי יוני נתרן נמצא בשימוש נרחב ביותר לזיהוי טביעות אצבע התואמות למיקומי חיבור אוליגוסכרידים, תצורות אנומריות, רצפים ומיקומי הסתעפות 20, 21.
אנליזת גליקנים היא כלי מצוין לזיהוי מעמיק של קשרי פחמימות22. שיטה זו משתמשת בנוגדנים חד שבטיים (mAbs) המכוונים לגליקן בדופן תא הצמח כגששים להבנת קשרי פחמימות מורכבים. יותר מ-250 mAbs זמינים ברחבי העולם, שתוכננו כנגד אוליגוסכרידים ליניאריים ומסועפים שונים באמצעות סכרידים שונים24. מספר mAbs נמצאים בשימוש נרחב לאפיון המבנה, ההרכב והשינויים של דופן תא הצמח, שכן ישנם הבדלים משמעותיים בהתאם לסוג תא הצמח, איבר, גיל, שלב התפתחותי וסביבת גדילה25,26. לאחרונה, שיטה זו שימשה להבנת אוכלוסיות שלפוחיות במערכות צמחים ובעלי חיים ותפקידיהן בהתאמה בהובלת גליקנים כפי שנקבע על ידי סמנים תת-תאיים, שלבי התפתחות או גירויים סביבתיים, ולקביעת פעילות אנזימטית. חלק מהמבנים השונים של גליקנים וקסילנים שזוהו כוללים פקטין (P), קסילן (X), מנן (M), קסילוגלוקנים (XylG), גלוקנים בעלי קשרים מעורבים (MLG), אראבינוקסילן (ArbX), גלקטומנן (GalG), חומצה גלוקורונית-אראבינוקסילן (GArbX) וארבינו-גלקטן (ArbG)29.
עם זאת, למרות כל מאמצי המחקר הללו, רק מחקרים מעטים התמקדו באופי הצטברות אוליגוסכרידים במהלך הידרוליזה של עומס מוצקים גבוה (HSL), כולל שחרור אוליגוסכרידים, שינויים באורך שרשרת אוליגומרי במהלך הידרוליזה, פולימרים שונים בעלי עומס מוצקים נמוך, ועקומותיהם. 30,31,32. בינתיים, למרות שניתוח גליקנים הוכח ככלי שימושי לניתוח מקיף של מבנה גליקנים, קשה להעריך אוליגוסכרידים מסיסים במים בעלי עומס מוצקים נמוך באמצעות שיטות נוגדנים. אוליגוסכרידים קטנים יותר בעלי עומס מוצקים נמוך מ-5-10 kDa אינם נקשרים לצלחות ELISA 33, 34 ונשטפים לפני הוספת הנוגדנים.
כאן, לראשונה, אנו מדגימים בדיקת ELISA על פלטות מצופות אבידין באמצעות נוגדנים חד שבטיים, המשלבת הליך ביוטינילציה חד-שלבי עבור אוליגוסכרידים עמידים מסיסים עם ניתוח גליקום. הגישה שלנו לניתוח גליקום אומתה על ידי ניתוח מבוסס MALDI-TOF-MS ו-GC-MS של קשרי אוליגוסכרידים משלימים באמצעות נגזרת טרימתילסיליל (TMS) של קומפוזיציות סוכר שעברו הידרוליזה. גישה חדשנית זו ניתנת לפיתוח כשיטה בעלת תפוקה גבוהה בעתיד ולמצוא יישום רחב יותר במחקר ביו-רפואי.
שינויים פוסט-טרנסלציוניים של אנזימים ונוגדנים, כגון גליקוזילציה,36 משפיעים על פעילותם הביולוגית. לדוגמה, שינויים בגליקוזילציה של חלבוני סרום ממלאים תפקיד חשוב בדלקת פרקים דלקתית, ושינויים בגליקוזילציה משמשים כסמנים אבחנתיים37. גליקנים שונים דווחו בספרות כמופיעים בקלות במגוון מחלות, כולל מחלות דלקתיות כרוניות של מערכת העיכול והכבד, זיהומים ויראליים, סרטן שחלות, סרטן השד וסרטן הערמונית38,39,40. הבנת מבנה הגליקנים באמצעות שיטות ELISA מבוססות נוגדנים של גליקנים תספק ביטחון נוסף באבחון מחלות ללא שימוש בשיטות טרשת נפוצה מורכבות.
המחקר הקודם שלנו הראה שאוליגו-סוכרים עקשניים נותרו ללא הידרוליזה לאחר טיפול מקדים והידרוליזה אנזימטית (איור 1). בעבודתנו שפורסמה בעבר, פיתחנו שיטת מיצוי בפאזה מוצקה באמצעות פחם פעיל לבידוד אוליגו-סוכרים מהידרוליזה של סטובר תירס שטופלה מראש ב-AFEX (ACSH). לאחר המיצוי וההפרדה הראשוניים, האוליגוסכרידים פוצלו עוד יותר על ידי כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC) ונאספו לפי סדר משקל מולקולרי. מונומרים ואוליגומרים של סוכר ששוחררו מטיפולים מקדימים שונים נותחו על ידי ניתוח הרכב הסוכר. כאשר משווים את תכולת האוליגומרים של סוכר שהתקבלו בשיטות טיפול מקדים שונות, נוכחותם של אוליגו-סוכרים עקשניים היא בעיה נפוצה בהמרת ביומסה למונוסכרידים ויכולה להוביל לירידה בתפוקת הסוכר של לפחות 10-15% ואף עד 18%. שיטה זו משמשת לייצור נוסף בקנה מידה גדול של מקטעי אוליגו-סוכר. ה-ACH המתקבל והמקטעים הבאים שלו עם משקלים מולקולריים שונים שימשו כחומר ניסיוני לאפיון אוליגו-סוכרים בעבודה זו.
לאחר טיפול מקדים והידרוליזה אנזימטית, אוליגוסכרידים נותרו ללא הידרוליזה. להלן (א) שיטת הפרדת אוליגוסכרידים שבה אוליגוסכרידים מבודדים מהידרוליזט של תירס שטופל מראש ב-AFEX (ACSH) באמצעות מצע דחוס של פחמן פעיל ואדמה דיאטומית; (ב) שיטה להפרדת אוליגוסכרידים. האוליגוסכרידים הופרדו עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC); (ג) מונומרים ואוליגומרים של סכריד ששוחררו מטיפולים מקדימים שונים (חומצה מדוללת: DA, נוזל יוני: IL ו-AFEX). תנאי הידרוליזה אנזימטית: טעינת מוצקים גבוהה של 25% (משקל/משקל) (טעינת גלוקן של כ-8%), הידרוליזה של 96 שעות, טעינת אנזים מסחרית של 20 מ"ג/גרם (יחס Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ו-(ד) מונומרים ואוליגומרים של סוכר של גלוקוז, קסילוז וארבינוז ששוחררו מתירס שטופל מראש ב-AFEX (ACS).
אנליזת גליקנים הוכחה ככלי שימושי לניתוח מבני מקיף של גליקנים בתמציות שבודדו משאריות ביומסה מוצקות. עם זאת, סוכרים מסיסים במים אינם מיוצגים מספיק בשיטה מסורתית זו41 מכיוון שאוליגו-סוכרים בעלי משקל מולקולרי נמוך קשים לקיבוע על פלטות ELISA והם נשטפים לפני הוספת נוגדנים. לכן, לצורך קישור ואפיון נוגדנים, נעשה שימוש בשיטת ביוטינילציה בשלב אחד לציפוי אוליגו-סוכרים מסיסים ולא תואמים על פלטות ELISA מצופות אבידין. שיטה זו נבדקה באמצעות ACSH שיוצר בעבר שלנו ושבר המבוסס על משקלו המולקולרי (או דרגת הפולימריזציה, DP). ביוטינילציה בשלב אחד שימשה להגברת זיקת קישור האוליגוסכרידים על ידי הוספת ביוטין-LC-הידראזיד לקצה המפחית של הפחמימה (איור 2). בתמיסה, קבוצת ההמיאצטל בקצה המפחית מגיבה עם קבוצת ההידראזיד של ביוטין-LC-הידראזיד ליצירת קשר הידראזון. בנוכחות חומר המפחית NaCNBH3, קשר ההידראזון מצטמצם לתוצר סופי ביוטיניל יציב. עם השינוי של הקצה המחזר סוכר, קשירה של אוליגוסכרידים בעלי DP נמוך לפלטות ELISA התאפשרה, ובמחקר שלנו זה בוצע על פלטות מצופות אבידין תוך שימוש בנובמברילטורים (mAbs) המכוונים לגליקן.
סינון נוגדנים חד שבטיים המבוסס על ELISA לאוליגוסכרידים שעברו ביוטינילציה. כאן (א) שילוב של ביוטינילציה של אוליגוסכרידים וסינון ELISA לאחר מכן עם נוגדנים חד שבטיים המכוונים לגליקן על פלטות מצופות NeutrAvidin ו-(ב) מציג הליך חד-שלבי לביוטינילציה של תוצרי תגובה.
פלטות מצופות אבידין עם נוגדנים מצומדים לאולוגוסכריד נוספו לאחר מכן לנוגדנים ראשוניים ומשניים ונשטפו במדיום רגיש לאור ולזמן. לאחר השלמת קישור הנוגדנים, הוסיפו סובסטרט TMB כדי לדגור את הפלטה. התגובה הופסקה לבסוף באמצעות חומצה גופרתית. הפלטות המודגרות נותחו באמצעות קורא ELISA כדי לקבוע את חוזק הקישור של כל נוגדן ולזהות קישור צולב ספציפי לנוגדנים. לפרטים ופרמטרים של הניסוי, עיינו בסעיף המתאים "חומרים ושיטות".
אנו מדגימים את התועלת של שיטה חדשה זו עבור יישומים ספציפיים על ידי אפיון האוליגוסכרידים המסיסים הקיימים ב-ACSH וכן בשברים אוליגוסכרידיים גולמיים ומטוהרים שבודדו מהידרוליזטים ליגנוצלולוזיים. כפי שמוצג באיור 3, הקסילן הנפוצים ביותר שהוחלפו באפיטופים שזוהו ב-ACSH באמצעות שיטות בדיקת גליקום ביואצילטיות הם בדרך כלל אורוניים (U) או מתילורוניים (MeU) ופקטיים. רובם נמצאו גם במחקר הקודם שלנו על ניתוח גליקנים של מוצקים שלא עברו הידרוליזה (UHS)43.
גילוי אפיטופים אוליגוסכרידיים עקשניים באמצעות נוגדן חד שבטי המכוון לגליקן בדופן התא. השבר ה"נייטרלי" הוא שבר ה-ACN והשבר ה"חומצי" הוא שבר ה-FA. אדומים בהירים יותר במפת החום מצביעים על תכולת אפיטופים גבוהה יותר, וכחולים בהירים יותר מצביעים על רקע ריק. ערכי הצבע בסולם מבוססים על ערכי OD גולמיים עבור פורמולציות N=2. האפיטופים העיקריים המזוהים על ידי הנוגדנים מוצגים מימין.
מבנים שאינם תאית לא יכלו להתפרק על ידי הצלולאזות וההמיצלולאזות הנפוצות ביותר בתערובת האנזימים המסחרית שנבדקה, הכוללת את האנזימים המסחריים הנפוצים ביותר. לכן, נדרשים אנזימי עזר חדשים להידרוליזה שלהם. ללא האנזימים הנלווים שאינם תאית הדרושים, קשרים שאינם תאית מונעים המרה מלאה לחד-סוכרים, גם אם פולימרי הסוכר המקוריים שלהם עוברים הידרוליזה נרחבת לשברים קצרים יותר ומומסים באמצעות תערובות אנזימים מסחריות.
מחקר נוסף של התפלגות האות ועוצמת הקישור שלו הראה כי אפיטופים של קישור היו נמוכים יותר בשברי סוכר בעלי DP גבוה (A, B, C, DP עד 20+) מאשר בשברי DP נמוכים (D, E, F, DP) בדיימרים (איור 1). שברי חומצה שכיחים יותר באפיטופים שאינם תאית מאשר בשברי חומצה ניטרליים. תופעות אלו עולות בקנה אחד עם הדפוס שנצפה במחקר הקודם שלנו, שבו קבוצות DP גבוהות וחומצה היו עמידות יותר להידרוליזה אנזימטית. לכן, נוכחות של אפיטופים גליקניים שאינם תאית ותחליפים של U ו-MeU יכולה לתרום רבות ליציבות האוליגוסכרידים. יש לציין כי יעילות הקישור והגילוי יכולה להיות בעייתית עבור אוליגוסכרידים בעלי DP נמוך, במיוחד אם האפיטופ הוא אוליגוסכריד דימרי או טרימרי. ניתן לבדוק זאת באמצעות אוליגוסכרידים מסחריים באורכים שונים, שכל אחד מהם מכיל רק אפיטופ אחד הנקשר ל-mAb ספציפי.
לפיכך, השימוש בנוגדנים ספציפיים למבנה גילה סוגים מסוימים של קשרים עקשניים. בהתאם לסוג הנוגדן בו נעשה שימוש, דפוס הקשירה המתאים ועוצמת האות שהוא מייצר (הכי ופחות שופע), ניתן לזהות אנזימים חדשים ולהוסיף אותם באופן חצי-כמותי לתערובת האנזימים לצורך גליקומרה מלאה יותר. אם ניקח לדוגמה את ניתוח אוליגוסכרידים של ACSH, נוכל ליצור מסד נתונים של קשרי גליקן עבור כל חומר ביומסה. יש לציין כאן כי יש לקחת בחשבון את הזיקה השונה של נוגדנים, ואם הזיקה שלהם אינה ידועה, הדבר ייצור קשיים מסוימים בעת השוואת האותות של נוגדנים שונים. בנוסף, השוואה של קשרי גליקן עשויה לעבוד בצורה הטובה ביותר בין דגימות עבור אותו נוגדן. לאחר מכן ניתן לקשר קשרים עקשניים אלה למסד הנתונים של CAZyme, שממנו נוכל לזהות אנזימים, לבחור אנזימים מועמדים ולבדוק אנזימים שוברים קשרים, או לפתח מערכות מיקרוביאליות לביטוי אנזימים אלה לשימוש בבתי זיקוק ביולוגיים.
כדי להעריך כיצד שיטות אימונולוגיות משלימות שיטות חלופיות לאפיון אוליגוסכרידים בעלי משקל מולקולרי נמוך הקיימים בהידרוליזטים של ליגנוצלולוזה, ביצענו MALDI (איור 4, S1-S8) וניתוח של סכרידים שמקורם ב-TMS על סמך GC-MS על אותו פאנל (איור 5) של חלק האוליגוסכריד. MALDI משמש להשוואה האם התפלגות המסה של מולקולות האוליגוסכריד תואמת את המבנה המיועד. באיור 4 מוצגת MS של הרכיבים הניטרליים ACN-A ו-ACN-B. ניתוח ACN-A אישר טווח של סוכרי פנטוז שנע בין DP 4-8 (איור 4) ל-DP 22 (איור S1), שמשקליהם תואמים לאוליגוסכרידים של MeU-קסילן. ניתוח ACN-B אישר את סדרת הפנטוז והגלוקוקסילן עם DP 8-15. בחומר משלים כגון איור S3, מפות פיזור מסת קבוצת חומצות FA-C מציגות מגוון של סוכרי פנטוז שהוחלפו על ידי (Me)U עם DP של 8-15, התואמים את הקסילנים שהוחלפו שנמצאו בסריקת mAb מבוססת ELISA. האפיטופים עקביים.
ספקטרום MALDI-MS של אוליגוסכרידים מסיסים שאינם תואמים הנמצאים ב-ACS. כאן, (א) מקטעים בטווח משקל נמוך של ACN-A המכילים חומצה אורונית מתילתית (DP 4-8) הוחלפו באוליגוסכרידים של גלוקורוקסילן ו-(ב) אוליגוסכרידים של קסילן ואוליגוסכרידים של חומצה אורונית מתילתית של ACN-B שהוחלפו בגלוקורוקסילן (DP 8-15).
ניתוח הרכב שארית הגליקן של אוליגוסכרידים עמידים. כאן (א) הרכב סוכרי TMS של מקטעי אוליגוסכריד שונים שהתקבלו באמצעות ניתוח GC-MS. (ב) מבנים של סוכרים שונים שמקורם ב-TMS הנמצאים באוליגוסכרידים. ACN - מקטע אצטוניטריל המכיל אוליגוסכרידים ניטרליים ו-FA - מקטע חומצה פרולית המכיל אוליגוסכרידים חומציים.
מסקנה מעניינת נוספת נגזרה מניתוח LC-MS של מקטע האוליגוסכריד, כפי שמוצג באיור S9 (ניתן לראות שיטות בחומר המשלים האלקטרוני). שברי קבוצות הקסוס ו- -OAc נצפו שוב ושוב במהלך קשירת מקטע ACN-B. ממצא זה לא רק מאשר את הפרגמנטציה שנצפו בניתוח גליקום ו- MALDI-TOF, אלא גם מספק מידע חדש על נגזרות פחמימות פוטנציאליות בביומסה ליגנוצלולוזית שטופלה מראש.
ביצענו גם ניתוח הרכב גליקנים של מקטעי אוליגוסכרידים באמצעות נגזרת גליקנים TMS. באמצעות GC-MS, קבענו את הרכב הסוכרים העצביים (לא נגזרים) והחומציים (GluA ו-GalA) במקטע האוליגוסכריד (איור 5). חומצה גלוקורונית נמצאת ברכיבים החומציים C ו-D, בעוד שחומצה גלקטורונית נמצאת ברכיבים החומציים A ו-B, שניהם רכיבים בעלי DP גבוה של סוכרים חומציים. תוצאות אלו לא רק מאשרות את נתוני ה-ELISA וה-MALDI שלנו, אלא גם עולות בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו על הצטברות אוליגוסכרידים. לכן, אנו מאמינים ששיטות אימונולוגיות מודרניות המשתמשות בביוטינילציה של אוליגוסכרידים ובדיקת ELISA שלאחר מכן מספיקות כדי לזהות אוליגוסכרידים עקשנים מסיסים בדגימות ביולוגיות שונות.
מאחר ששיטות סינון נוגדנים חד-חמצני (mAb) מבוססות ELISA אושרו על ידי מספר שיטות שונות, רצינו לחקור לעומק את הפוטנציאל של שיטה כמותית חדשה זו. שני אוליגוסכרידים מסחריים, אוליגוסכריד קסילוהקסאסכריד (XHE) ו-23-α-L-ארבינופוראנוסיל-קסילוטריוז (A2XX), נרכשו ונבדקו באמצעות גישת mAb חדשה המכוונה לגליקן בדופן התא. איור 6 מציג מתאם ליניארי בין אות הקישור הביוטינילציה לבין ריכוז הלוגריתם של ריכוז האוליגוסכריד, דבר המצביע על מודל ספיחה אפשרי של Langmuir. מבין הנוגדנים החמצני, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ו-CCRC-M151 היו בקורלציה עם XHE, ו-CCRC-M108, CCRC-M109 ו-LM11 היו בקורלציה עם A2XX בטווח של 1 ננומטר עד 100 ננומטר. עקב הזמינות המוגבלת של נוגדנים במהלך הניסוי, בוצעו ניסויים מוגבלים עם כל ריכוז אוליגוסכריד. יש לציין כאן כי חלק מהנוגדנים מגיבים בצורה שונה מאוד לאותו אוליגוסכריד כסובסטרט, ככל הנראה משום שהם נקשרים לאפיטופים שונים במקצת ויכולים להיות בעלי זיקות קשירה שונות מאוד. המנגנונים וההשלכות של זיהוי אפיטופים מדויק יהיו מורכבים הרבה יותר כאשר גישת ה-mAb החדשה תיושם על דגימות אמיתיות.
שני אוליגוסכרידים מסחריים שימשו לקביעת טווח הגילוי של נוגדנים חד-חמצניים (mAbs) שונים המכוונים לגליקנים. כאן, קורלציות ליניאריות עם ריכוז log של ריכוז אוליגוסכריד מצביעות על דפוסי ספיחה של Langmuir עבור (A) XHE עם mAb ו-(B) A2XX עם mAb. האפיטופים המתאימים מצביעים על המבנים של האוליגוסכרידים המסחריים ששימשו כסובסטרטים בבדיקה.
השימוש בנוגדנים חד שבטיים המכוונים לגליקנים (ניתוח גליקוקומי או סינון mAb מבוסס ELISA) הוא כלי רב עוצמה לאפיון מעמיק של רוב הגליקנים העיקריים בדופן התא המרכיבים ביומסה צמחית. עם זאת, ניתוח גליקנים קלאסי מאפיין רק גליקנים גדולים יותר בדופן התא, מכיוון שרוב האוליגוסכרידים אינם מקובעים ביעילות על פלטות ELISA. במחקר זה, אשלגן תירס שטופל מראש ב-AFEX עבר הידרוליזה אנזימטית בתכולת מוצקים גבוהה. ניתוח סוכר שימש לקביעת הרכב הפחמימות העקשניות בדופן התא בהידרוליזה. עם זאת, ניתוח mAb של אוליגוסכרידים קטנים יותר בהידרוליזטים אינו מוערך כראוי, ונדרשים כלים נוספים כדי לקבוע ביעילות אוליגוסכרידים על פלטות ELISA.
אנו מדווחים כאן על שיטת קיבוע חדשה ויעילה של אוליגוסכרידים לסינון נוגדנים חד שבטיים (mAb) על ידי שילוב של ביוטינילציה של אוליגוסכרידים ולאחר מכן סינון ELISA על פלטות מצופות NeutrAvidin™. האוליגוסכרידים המקובעים הביוטינילציה הראו זיקה מספקת לנוגדן כדי לאפשר זיהוי מהיר ויעיל של אוליגוסכרידים עקשנים. ניתוח הרכב האוליגוסכרידים העקשנים הללו, המבוסס על ספקטרומטריית מסות, אישר את תוצאות הגישה החדשה הזו לסינון אימונוגני. לפיכך, מחקרים אלה מראים כי השילוב של ביוטינילציה של אוליגוסכרידים וסינון ELISA עם נוגדנים חד שבטיים המכוונים לגליקן יכול לשמש לזיהוי קשרי צילוב באוליגוסכרידים וניתן ליישם אותו באופן נרחב במחקרים ביוכימיים אחרים המאפיינים את מבנה האוליגוסכרידים.
שיטת פרופילציה גליקנים זו, המבוססת על ביוטין, היא הדו"ח הראשון המסוגל לחקור את קשרי הפחמימות העקשניים של אוליגוסכרידים מסיסים בביומסה צמחית. זה עוזר להבין מדוע חלקים מסוימים של ביומסה כה עקשנים בכל הנוגע לייצור דלק ביולוגי. שיטה זו ממלאת פער חשוב בשיטות ניתוח גליקומים ומרחיבה את יישומה למגוון רחב יותר של מצעים מעבר לאוליגוסכרידים צמחיים. בעתיד, ייתכן שנשתמש ברובוטיקה לביוטין ונשתמש בשיטה שפיתחנו לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות באמצעות ELISA.
קש תירס (CS) שגודל מזרעי היבריד Pioneer 33A14 נקצר בשנת 2010 בחוות קרמר בריי, קולורדו. באישור בעל הקרקע, ניתן להשתמש בביומסה זו למחקר. הדגימות אוחסנו יבשים < 6% לחות בשקיות סגורות זיפ בטמפרטורת החדר. הדגימות אוחסנו יבשים < 6% לחות בשקיות סגורות זיפ בטמפרטורת החדר. הורד את מערכות ההפעלה בטווח של < 6% בשירותים של המשרדים. הדגימות אוחסנו יבשים בלחץ של <6% בשקיות עם רוכסן בטמפרטורת החדר.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% התקנות מובילות בשירותים של < 6%. הדגימות מאוחסנות בשקיות עם רוכסן בטמפרטורת החדר עם לחות של פחות מ-6%.המחקר עמד בהנחיות המקומיות והארציות. ניתוח הרכב בוצע באמצעות פרוטוקול NREL. נמצא כי הרכב מכיל 31.4% גלוקן, 18.7% קסילן, 3.3% ארבינן, 1.2% גלקטן, 2.2% אצטיל, 14.3% ליגנין, 1.7% חלבון ו-13.4% אפר.
Cellic® CTec2 (138 מ"ג חלבון/מ"ל, אצווה VCNI 0001) הוא תערובת מורכבת של צלולאז, β-גלוקוזידאז ו-Cellic® HTec2 (157 מ"ג חלבון/מ"ל, אצווה VHN00001) מחברת Novozymes (פרנקליןטון, צפון קרוליינה, ארה"ב)). Multifect Pectinase® (72 מ"ג חלבון/מ"ל), תערובת מורכבת של אנזימים המפרקים פקטין, נתרמה על ידי DuPont Industrial Biosciences (פאלו אלטו, קליפורניה, ארה"ב). ריכוזי חלבון האנזים נקבעו על ידי הערכת תכולת החלבון (והפחתת תרומת החנקן שאינו חלבוני) באמצעות אנליזת חנקן Kjeldahl (שיטת AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., איתקה, ניו יורק, ארה"ב). אדמה דיאטומית 545 נרכשה מחברת EMD Millipore (בילריקה, מסצ'וסטס). פחם פעיל (DARCO, גרגירים של 100 רשת), Avicel (PH-101), קסילן אשור וכל שאר הכימיקלים נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, מיזורי).
טיפול מקדים ב-AFEX בוצע ב-GLBRC (מעבדת המחקר להמרת ביומסה, MSU, לנסינג, מישיגן, ארה"ב). הטיפול המקדים בוצע בטמפרטורה של 140°C למשך 15 דקות. זמן שהייה של 46 מעלות צלזיוס ביחס של 1:1 של אמוניה נטולת מים לביומסה בטעינה של 60% (w/w) בכור אצווה שולחני מפלדת אל-חלד (Parr Instruments Company). התהליך ארך 30 דקות. הכור חמם ל-140°C והאמוניה שוחררה במהירות, מה שאפשר לביומסה לחזור במהירות לטמפרטורת החדר. הרכב תירס שטופל מראש (ACS) ב-AFEX היה דומה לזה של תירס לא מטופל (UT-CS).
תמיסת ACSH עתירת מוצקים 25% (משקל/משקל) (כ-8% דקסטרן) הוכנה כחומר מוצא לייצור בקנה מידה גדול של אוליגוסכרידים. הידרוליזה אנזימטית של ACS בוצעה באמצעות תערובת אנזימים מסחרית הכוללת Cellic® Ctec2 10 מ"ג חלבון/גרם גלוקן (בביומסה שטופלה מראש), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 מ"ג חלבון/גרם גלוקן, ו-Multifect Pectinase (Genencor Inc, ארה"ב). ), 5 מ"ג חלבון/גרם דקסטרן. הידרוליזה אנזימטית בוצעה בביו-ריאקטור של 5 ליטר עם נפח עבודה של 3 ליטר, pH 4.8, 50°C ו-250 סל"ד. לאחר הידרוליזה במשך 96 שעות, ההידרוליזה נאספה על ידי צנטריפוגה ב-6000 סל"ד למשך 30 דקות ולאחר מכן ב-14000 סל"ד למשך 30 דקות כדי להסיר מוצקים שלא עברו הידרוליזה. לאחר מכן ההידרוליזט עבר סינון סטרילי דרך כוס סינון בקוטר 0.22 מ"מ. ההידרוליזט המסונן אוחסן בבקבוקים סטריליים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן פורק על פחמן.
ניתוח הרכב דגימות ביומסה מבוססות תמצית לפי נהלי ניתוח מעבדה של NREL: הכנת דגימות לניתוח הרכב (NREL/TP-510-42620) וקביעת פחמימות מבניות וליגנין בביומסה (NREL/TP-510 – 42618)47.
אנליזת אוליגוסכרידים של זרם ההידרוליזה בוצעה בקנה מידה של 2 מ"ל באמצעות שיטת הידרוליזה חומצית מבוססת אוטוקלאב. ערבבו את דגימת ההידרוליזה עם 69.7 מיקרוליטר של חומצה גופרתית 72% במבחנה תרבית עם מכסה הברגה של 10 מ"ל ודגרו במשך שעה אחת על משטח עבודה בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס, קררו על קרח וסננו לתוך בקבוקון כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). ריכוז האוליגוסכרידים נקבע על ידי הפחתת ריכוז המונוסכרידים בדגימה שלא עברה הידרוליזה מריכוז הסוכר הכולל בדגימה שעברה הידרוליזה חומצית.
ריכוזי גלוקוז, קסילוז וערבינוז בביומסה שעברה הידרוליזה חומצית נותחו באמצעות מערכת HPLC של Shimadzu המצוידת בדוגם אוטומטי, גוף חימום לעמודה, משאבה איזוקרטית וגלאי מקדם שבירה על עמודה מדגם Bio-Rad Aminex HPX-87H. העמודה נשמרה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס ונאלצה עם 0.6 מ"ל/דקה של 5 mM H2SO4 במים בזרימה.
הנוזל העליון של ההידרוליזה דולל ונותח עבור תכולת מונומרים ואוליגוסכרידים. סוכרים מונומריים שהתקבלו לאחר הידרוליזה אנזימטית נותחו באמצעות HPLC המצויד בעמודה Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ובעמודה Ash Guard. טמפרטורת העמודה נשמרה על 80 מעלות צלזיוס, מים שימשו כפאזה ניידת עם קצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה. אוליגוסכרידים נקבעו על ידי הידרוליזה בחומצה מדוללת ב-121 מעלות צלזיוס בהתאם לשיטות המתוארות במקורות 41, 48, 49.
אנליזת סכריד בוצעה על שאריות ביומסה גולמיות, שטופלו מראש ב-AFEX וכל שאריות הביומסה שלא עברו הידרוליזה (כולל ייצור של תמציות דופן תא סדרתיות וסינון mAb שלהן) תוך שימוש בהליכים שתוארו קודם לכן 27, 43, 50, 51. לצורך ניתוח גליקום, שאריות בלתי מסיסות באלכוהול של חומר דופן תא צמחי מוכנות משאריות ביומסה ועוברות מיצוי סדרתי עם ריאגנטים אגרסיביים יותר ויותר כגון אמוניום אוקסלט (50 mM), נתרן פחמתי (50 mM ו-0.5% w/v), CON. (1M ו-4M, שניהם עם 1% w/v נתרן בורוהידריד) וחומצה כלוריט כפי שתואר קודם לכן 52,53. לאחר מכן התמציות עברו ELISA כנגד פאנל מורכב של mAb50s המכוונים לגליקן דופן התא, ותגובות הקישור של mAb הוצגו כמפת חום. mAbs המכוונים לגליקן דופן תא צמחי נרכשו ממלאי מעבדה (סדרות CCRC, JIM ו-MAC).
ביוטינילציה חד-שלבית של אוליגוסכרידים. הצמידה של פחמימות עם ביוטין-LC-הידראזיד בוצעה באמצעות ההליך הבא. ביוטין-LC-הידראזיד (4.6 מ"ג/12 מיקרומול) הומס בדימתיל סולפוקסיד (DMSO, 70 מיקרוליטר) על ידי ערבוב נמרץ וחימום ב-65°C למשך דקה אחת. חומצה אצטית קרחונית (30 מיקרוליטר) נוספה והתערובת נמזגה על נתרן ציאנובורוהידריד (6.4 מ"ג/100 מיקרומול) והומסה לחלוטין לאחר חימום ב-65°C למשך כדקה אחת. לאחר מכן, 5 עד 8 מיקרוליטר מתערובת התגובה נוספו לאוליגוסכריד המיובש (1-100 ננומול) כדי להשיג עודף מולרי פי 10 או יותר של התווית על פני הקצה המחזר. התגובה בוצעה ב-65°C למשך שעתיים, ולאחר מכן הדגימות טוהרו מיד. לא נעשה שימוש בנתרן ציאנובורוהידריד בניסויי הסימון ללא חיזור, והדגימות הגיבו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות.
ציפוי ELISA ושטיפה של דגימות של אוליגוסכרידים שעברו ביוטינילציה. 25 מיקרוליטר של דגימות שעברו ביוטינילציה (100 מיקרוליטר מכל דגימה מרוכזת מדוללת ב-5 מ"ל של תמיסת בופר טריס (TBS) 0.1 M) נוספו לכל באר בצלחת המצופה באווידין. בארות הבקרה צופו ב-50 מיקרוליטר של ביוטין בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-TBS 0.1 M. מים מזוקקים שימשו כציפוי למדידות ריקות. הטבליה הודגרה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את הצלחת 3 פעמים עם חלב רזה 0.1% ב-TBS 0.1 M באמצעות תוכנית מספר 11 עבור גרנייה פלאט 3A.
הוספה ושטיפה של נוגדנים ראשוניים. הוסיפו 40 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני לכל באר. דגרו את המיקרופלטה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן נשטפו הפלטות 3 פעמים עם 0.1% חלב ב-0.1M TBS באמצעות תוכנית שטיפה מס' 11 עבור Grenier Flat 3A.
הוסיפו נוגדן משני ושטפו. הוסיפו 50 מיקרוליטר של נוגדן משני עכבר/חולדה (מדולל 1:5000 ב-0.1% חלב ב-0.1 M TBS) לכל באר. דגרו את המיקרו-פלטה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן המיקרו-פלטות נשטפו 5 פעמים עם 0.1% חלב ב-0.1 M TBS באמצעות תוכנית שטיפת פלטות Grenier Flat 5A #12.
הוספת מצע. הוסיפו 50 מיקרוליטר של 3,3′,5,5′-טטראמתילבנזידין (TMB) למצע הבסיס (על ידי הוספת 2 טיפות של בופר, 3 טיפות של TMB, ו-2 טיפות של מי חמצן ל-15 מ"ל של מים מזוקקים). הכינו את מצע ה-TMB וערבבו במערבל לפני השימוש). דגרו את המיקרופלטה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בחושך.
השלם את השלב וקרא את הטבליה. הוסף 50 מיקרוליטר של חומצה גופרתית 1 N לכל באר ורשם את הבליעה מ-450 עד 655 ננומטר באמצעות מכשיר ELISA.
הכינו תמיסות של 1 מ"ג/מ"ל של אנליטים אלה במים מזוקקים: אראבינוז, רמנוז, פוקוז, קסילוז, חומצה גלקטורונית (GalA), חומצה גלוקורונית (GlcA), מנוז, גלוקוז, גלקטוז, לקטוז, N-אצטילמנוזאמין (manNAc), N-אצטילגלוקוזאמין (glcNAc), N-אצטילגלקטוזאמין (galNAc), אינוזיטול (סטנדרט פנימי). הוכנו שני סטנדרטים על ידי הוספת תמיסות הסוכר של 1 מ"ג/מ"ל המוצגות בטבלה 1. הדגימות הוקפאו ועוברות ליופיליזציה ב-80°C- עד להסרת כל המים (בדרך כלל כ-12-18 שעות).
הוסיפו 100-500 מיקרוגרם של דגימה למבחנות עם מכסה הברגה על משקל אנליטי. רשמו את הכמות שנוספה. עדיף להמיס את הדגימה בריכוז מסוים של ממס ולהוסיפה למבחנה כחלק נוזלי. השתמשו ב-20 מיקרוליטר של אינוזיטול בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל כסטנדרט פנימי לכל מבחנה. כמות הסטנדרט הפנימי שנוספה לדגימה חייבת להיות זהה לכמות הסטנדרט הפנימי שנוספה למבחנה.
הוסיפו 8 מ"ל של מתנול נטול מים לבקבוקון עם מכסה הברגה. לאחר מכן, הוסיפו 4 מ"ל של תמיסת HCl מתנולית 3 N, סגרו את המכסה ומנערים. תהליך זה אינו משתמש במים.
הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת מתנול HCl 1 M לדגימות האוליגוסכריד ולמבחנות TMS סטנדרטיות. הדגימות הודגרו למשך הלילה (168 שעות) בטמפרטורה של 80°C בבלוק תרמי. ייבשו את תוצר המתנוליזה בטמפרטורת החדר באמצעות סעפת ייבוש. הוסיפו 200 מיקרוליטר MeOH ייבשו שוב. תהליך זה חוזר על עצמו פעמיים. הוסיפו 200 מיקרוליטר מתנול, 100 מיקרוליטר פירידין ו-100 מיקרוליטר אנהידריד אצטית לדגימה וערבבו היטב. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות וייבשו. הוסיפו 200 מיקרוליטר מתנול ייבשו שוב.
הוסיפו 200 מיקרוליטר של טרי-סיל וחממו את המבחנה עם מכסה למשך 20 דקות. 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קררו לטמפרטורת החדר. השתמשו בסעפת ייבוש כדי לייבש עוד יותר את הדגימה לנפח של כ-50 מיקרוליטר. חשוב לציין שלא אפשרנו לדגימות להתייבש לחלוטין.
הוסיפו 2 מ"ל של הקסאן וערבבו היטב באמצעות מערבולת. מלאו את קצות פיפטות פסטר (5-8 מ"מ) בחתיכת צמר זכוכית על ידי הכנסת צמר הזכוכית מעל פיפטה בקוטר 5-3/4 אינץ'. הדגימות עברו צנטריפוגה ב-3000 גרם למשך 2 דקות. שאריות בלתי מסיסות שוקעות. יבשו את הדגימה ל-100-150 מיקרוליטר. נפח של כ-1 מיקרוליטר הוזרק למכשיר GC-MS בטמפרטורה התחלתית של 80 מעלות צלזיוס ובזמן התחלתי של 2.0 דקות (טבלה 2).