細胞培養インサートを備えたガットオンチップまたはハイブリッドオンチップにおけるヒト腸上皮の 3D in vitro 形態形成

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ヒトの腸の形態形成は、3D 上皮微細構造と空間構成の陰窩-絨毛の特徴を確立します。このユニークな構造は、基底陰窩の幹細胞ニッチを外因性微生物抗原とその代謝産物から保護することで腸の恒常性を維持するために必要です。さらに、腸絨毛と分泌粘液は、腸粘膜表面に保護バリアを備えた機能的に分化した上皮細胞を示します。したがって、recre 3D 上皮構造を解析することは、in vitro 腸モデルの構築に重要です。特に、有機模倣ガット オン チップは、生理学的機能と生体力学が強化された腸上皮の自発的な 3D 形態形成を誘導できます。ここでは、マイクロ流体チップおよびトランズウェル埋め込みハイブリッド チップ上で腸内で腸の形態形成を強力に誘導するための再現可能なプロトコルを提供します。デバイス ファブリックの詳細な方法について説明します。従来の設定およびマイクロ流体プラットフォームでの Caco-2 または腸オルガノイド上皮細胞の培養、3D 形態形成の誘導、および複数のイメージングモダリティを使用した確立された 3D 上皮の特性評価。このプロトコルは、側底液の流れを 5 日間制御することによって機能的な腸マイクロアーキテクチャの再生を達成します。私たちの in vitro 形態形成法は、生理学的に関連するせん断応力と機械的運動を採用しており、複雑な細胞工学や操作を必要としません。私たちは、私たちが提案したプロトコルが生物医学研究コミュニティに広範な影響を及ぼし、生物医学、臨床、薬学用途向けに in vitro で 3D 腸上皮層を再生する方法を提供できると考えています。
実験では、ガット・オン・チップ1、2、3、4、5または二層マイクロ流体デバイス6、7で培養された腸上皮Caco-2細胞が、根底にあるメカニズムが明確に理解されていなくても、in vitroで自発的に3D形態形成を起こすことができることを示しています。私たちの最近の研究では、培養デバイスから側底側に分泌されたモルフォゲンアンタゴニストを除去することが、in vitroで3D上皮形態形成を誘導するのに必要かつ十分であることを発見しました。これは、Caco-2 および患者由来の腸オルガノイドによって証明されています。上皮細胞が検証されました。この研究では、「ハイブリッドチップ」と呼ばれる、トランスウェルインサートを含むガットオンチップおよび改変マイクロ流体デバイスにおける強力なWntアンタゴニストであるDickkopf-1(DKK-1)の細胞生成と濃度分布に特に焦点を当てました。外因性Wntアンタゴニスト(DKK-1、Wntリプレッサー1、分泌フリズル関連タンパク質など)の添加が実証されました。 1、または Soggy-1) をオンチップ腸に導入すると、形態形成が阻害されるか、事前に構造化された 3D 上皮層が破壊され、培養中の拮抗ストレスが in vitro での腸の形態形成の原因であることが示唆されます。 したがって、上皮界面で堅牢な形態形成を達成するための実際的なアプローチは、積極的なフラッシング (例: ガット オンチップまたはハイブリッドオンチッププラットフォーム)または拡散。側底培地(例えば、ウェル内の大きな側底リザーバーへのトランスウェルインサートから)。
このプロトコルでは、ポリジメチルシロキサン (PDMS) ベースの多孔質膜 (ステップ 6A、7A、8、9) またはトランスウェル インサートのポリエステル膜 (ステップ 6B、7B、8、9) および誘導 3D モーフ上で腸上皮細胞を培養するガット オン チップ マイクロデバイスとトランズウェル挿入可能なハイブリッド チップ (ステップ 1 ~ 5) を製造するための詳細な方法を提供します。また、複数のイメージングモダリティを適用することで、組織特異的な組織形成と系統依存的な細胞分化を示す細胞および分子の特徴も特定しました(ステップ 11 ~ 24)。Caco-2 または腸オルガノイドなどのヒト腸上皮細胞を使用し、多孔質膜の表面修飾、2D 単層の作成、および2D 上皮単層から 3D 形態形成を誘導するために、培地を培養基底側区画に流すことにより、両方の培養形態のモルフォゲン アンタゴニストを除去しました。最後に、モルフォゲン依存性の上皮成長、縦方向のモデル化に使用できる再生可能な 3D 上皮層の有用性を示します。宿主とマイクロバイオームの共培養、病原体感染、炎症性損傷、上皮バリア機能不全、およびプロバイオティクスに基づく治療の例。
私たちのプロトコルは、基礎(腸粘膜生物学、幹細胞生物学、発生生物学など)および応用研究(前臨床薬物試験、疾患モデリング、組織工学、消化器病学など)の幅広い科学者に役立つ可能性があります。in vitroで腸上皮の3D形態形成を誘導するための私たちのプロトコルの再現性と堅牢性により、私たちの技術戦略が視聴者に普及できると想定しています。さらに、私たちのプロトコルは、ノロウイルス 8、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2)、クロストリジウム ディフィシル、ネズミチフス菌 9 またはコレラ菌などのさまざまな感染因子による感染を調べるのに役立ちます。疾患の病理学および病因の聴衆も有用です。オンチップ腸微小生理学システムの使用により、縦方向の共培養 10 とその後の胃腸 (GI) 管における宿主防御、免疫応答および病原体関連損傷修復の評価 11 が可能になる可能性があります。リーキーガット症候群、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸嚢炎、または過敏性腸症候群に関連する他の消化器疾患をシミュレートできます。患者の 3D 腸上皮層を使用して 3D 腸上皮層を調製する場合、これらの疾患には、絨毛萎縮、陰窩短縮、粘膜損傷、または上皮バリアの障害が含まれます。生検または幹細胞由来の腸オルガノイド 12,13。より複雑な疾患環境をより適切にモデル化するために、読者は患者の末梢血単核球などの疾患関連細胞タイプを追加することを検討できます。 PBMC)を、3D 腸絨毛陰窩マイクロアーキテクチャを含むモデルに変換します。組織特異的免疫細胞、5.
3D 上皮微細構造は切片化プロセスなしで固定および視覚化できるため、空間トランスクリプトミクスや高解像度または超解像度イメージングに取り組んでいる視聴者は、上皮ニッチ上の遺伝子とタンパク質の時空間ダイナミクスのマッピングに興味を持つかもしれません。テクノロジーに興味があります。微生物または免疫刺激への反応。さらに、腸の恒常性を調整する縦方向の宿主マイクロバイオームクロストーク 10, 14 は、特にガットオンチップでさまざまな微生物種、微生物群集、または糞便微生物叢を共培養することによって 3D 腸粘膜層に確立できます。このアプローチは、粘膜免疫学、胃腸病学、ヒトマイクロバイオーム、培養学および臨床微生物学を研究し、これまで培養されていなかった腸内微生物叢を研究室で培養しようとしている聴衆にとって特に魅力的です。当社の in vitro 形態形成プロトコルを、基底外側コンパートメントを継続的に補充する 24、96、または 384 ウェルプレートのマルチウェルインサートなどの拡張可能な培養形式に適合させることができれば、このプロトコルを製薬、バイオの開発者にも広めることができます。食品業界向けの医療またはハイスループットのスクリーニングまたは検証プラットフォーム。原理の実証として、当社は最近、24 ウェル プレート形式に拡張可能なマルチプレックス ハイスループット形態形成システムの実現可能性を実証しました。さらに、複数のオルガン オン チップ製品も商品化されています 16、17、18。したがって、当社の in vitro 形態形成法の検証は加速され、多くの研究機関、業界、または企業で採用される可能性があります。政府および規制当局は、薬物または生物療法を試験するために、トランスクリプトームレベルでの in vitro 腸形態形成の細胞再プログラミングを理解することができます。薬物候補の吸収と輸送は、3D 腸代用物を使用するか、カスタムまたは市販のチップ上の臓器モデルを使用して評価され、腸形態形成プロセスの再現性が評価されます。
腸上皮の形態形成を研究するために使用されているヒト関連実験モデルの数は限られています。これは主に、in vitro で 3D 形態形成を誘導するための実装可能なプロトコルが不足しているためです。実際、腸の形態形成に関する現在の知識の多くは動物研究 (例、ゼブラフィッシュ 20、マウス 21 またはニワトリ 22) に基づいています。しかし、それらは労力とコストがかかり、倫理的に疑問が残る可能性があり、最も重要なことに、人間の発達過程を正確に決定します。これらのモデルは、多方向にスケーラブルな方法でテストする能力も非常に限られています。したがって、インビトロで 3D 組織構造を再生するための私たちのプロトコルは、生体内動物モデルや他の従来の静的 2D 細胞培養モデルよりも優れています。前述したように、3D 上皮構造を利用することで、さまざまな粘膜または免疫刺激に応答する陰窩-絨毛軸における分化した細胞の空間的局在を調べることができました。上皮層は、微生物細胞が空間的ニッチを形成するためにどのように競合するのか、また宿主要因(例、粘液層の内層と外層、IgAや抗菌ペプチドの分泌)に応答して生態学的進化を形成することを研究するためのスペースを提供することができます。さらに、3D上皮形態学により、腸内細菌叢がそのコミュニティをどのように構築し、細胞組織や幹細胞ニッチを形成する微生物代謝物(例、短鎖脂肪酸)を相乗的に生成するかを理解することができます。これらの特徴は、3D 上皮層が in vitro で確立された場合にのみ実証されます。
3D 腸上皮構造を作成する私たちの方法に加えて、いくつかの in vitro 方法があります。腸オルガノイド培養は、特定のモルフォゲン条件下での腸幹細胞の培養に基づいた最先端の組織工学技術です 23,24,25。しかし、輸送解析や宿主とマイクロバイオームの共培養のための 3D オルガノイド モデルの使用は、腸内腔がオルガノイド内に囲まれているため、しばしば困難を伴います。微生物細胞や外因性抗原などの管腔成分の量は限られています。オルガノイド内腔へのアクセスは、マイクロインジェクターを使用して改善できます 26,27 が、この方法は侵襲的で労働集約的であり、実行には専門知識が必要です。さらに、静的条件下でヒドロゲル足場内に維持される従来のオルガノイド培養は、活発な生体内生体力学を正確に反映していません。
いくつかの研究グループが採用している他のアプローチでは、事前に構造化された3Dヒドロゲル足場を利用して、ゲル表面上で単離されたヒト腸細胞を培養することによって腸上皮構造を模倣しています。3Dプリント、マイクロミル加工、またはリソグラフィーで作製された型を使用してヒドロゲル足場を作製します。この方法は、生理学的に適切なモルフォゲン勾配を備えたin vitroでの単離上皮細胞の自己組織化配置を示し、高アスペクト比の上皮構造と間質を確立します。 -足場に間質細胞を含めることによる上皮クロストーク。ただし、事前に構造化された足場の性質により、自発的な形態形成プロセス自体の表示が妨げられる可能性があります。また、これらのモデルは動的な管腔または間質の流れを提供せず、腸細胞が形態形成を受けて生理学的機能を獲得するために必要な流体せん断応力が不足しています。別の最近の研究では、マイクロ流体プラットフォームでヒドロゲル足場を使用し、レーザーエッチングを使用して腸上皮構造をパターン化しました。マウスの腸オルガノイドはエッチングされたパターンに従って腸管構造を形成し、管腔内の流体の流れはマイクロ流体モジュールを使用して再現できます。ただし、このモデルは自発的な形態形成プロセスを示さず、腸の機械生物学的運動も含まれていません。同じグループの 3D プリンティング技術により、自発的な形態形成プロセスを備えた小型腸管を作成することができました。管内でさまざまな腸セグメントが複雑に製造されているにもかかわらず、このモデルには管腔液の流れも欠如しています。さらに、モデルの操作性は、特にバイオプリンティングプロセスが完了した後、実験条件や細胞間相互作用を混乱させて制限される可能性があります。代わりに、私たちが提案したプロトコルは、自発的な腸の形態形成、生理学的に関連するせん断応力、腸の運動性を模倣する生体力学、独立した頂端および側底コンパートメントのアクセス可能性、およびモジュール性の複雑な生物学的微小環境の再作成を提供します。したがって、私たちの in vitro 3D 形態形成プロトコルは、既存の方法の課題を克服するための補完的なアプローチ。
私たちのプロトコルは、培養上皮細胞のみを使用し、間葉細胞、内皮細胞、免疫細胞などの他の種類の周囲細胞を含まない3D上皮形態形成に完全に焦点を当てています。前述したように、私たちのプロトコルの核心は、導入された培地の側底側に分泌されるモルフォゲン阻害剤を除去することによる上皮形態形成の誘導です。一方、ガットオンチップおよびハイブリッドオンチップの堅牢なモジュール性は、これにより、波状の 3D 上皮層、上皮間葉相互作用 33,34、細胞外マトリックス (ECM) の沈着 35 などの追加の生物学的複雑性、および私たちのモデルでは、基底陰窩の幹細胞ニッチを伝える陰窩絨毛の特徴などを再現することができます。間葉系の間質細胞 (例、線維芽細胞) は、ECM タンパク質の産生と腸管の調節において重要な役割を果たしています。生体内での形態形成35,37,38。我々のモデルに間葉細胞を追加すると、形態形成プロセスと細胞接着効率が向上しました。内皮層(すなわち、毛細血管またはリンパ管)は、腸微小環境における分子輸送39と免疫細胞動員40の調節に重要な役割を果たしています。さらに、組織モデル間を接続できる血管系コンポーネントは、組織モデルが多臓器相互作用を実証するように設計される場合の前提条件です。したがって、器官レベルの解像度でより正確な生理的特徴をモデル化するには、内皮細胞を含める必要がある可能性があります。患者由来の免疫細胞は、腸疾患を模倣するという状況で自然免疫応答、抗原提示、自然適応免疫クロストーク、および組織特異的免疫を表示するためにも不可欠です。
ハイブリッドチップの使用は、デバイスのセットアップが簡単で、トランズウェルインサートの使用により腸上皮の拡張性のある培養が可能になるため、ガットオンチップよりも簡単です。ただし、ポリエステル膜を備えた市販のトランズウェルインサートは弾性がなく、蠕動のような動きをシミュレートできません。さらに、ハイブリッドチップに配置されたトランズウェルインサートの頂端コンパートメントは、頂端側にせん断応力がなく静止したままでした。明らかに、頂端コンパートメントの静的特性はハイブリッド チップで長期の細菌の共培養が可能になることはほとんどありません。ハイブリッド チップを使用すると、トランスウェル インサートで 3D 形態形成を確実に誘導できますが、生理学的に関連する生体力学と頂端流体の流れの不足により、潜在的なアプリケーションに対するハイブリッド チップ プラットフォームの実現可能性が制限される可能性があります。
ガット・オン・チップおよびハイブリッド・オン・チップ培養におけるヒト陰窩-絨毛軸の本格的な再構成は完全には確立されていない。形態形成は上皮単層から始まるため、3D マイクロアーキテクチャは生体内陰窩との形態学的類似性を必ずしも提供するとは限らない。マイクロエンジニアリングされた 3D 上皮の基底陰窩ドメイン付近の増殖細胞集団を特徴付けたが、陰窩および絨毛領域は解析されなかった。チップ上の上部チャネルが高くなるほど微細加工上皮の高さは増加しますが、最大高さは依然として ~300 ~ 400 µm に制限されています。小腸と大腸におけるヒトの腸陰窩の実際の深さはそれぞれ ~135 µm と ~400 µm で、小腸絨毛の高さは ~600 µm です 41。
イメージングの観点から見ると、対物レンズから上皮層までの必要な作動距離は数ミリメートルのオーダーであるため、3D マイクロアーキテクチャのその場超解像度イメージングは​​、チップ上の消化管に限定される可能性があります。この問題を克服するには、遠方の対物レンズが必要になる場合があります。さらに、PDMS の弾性が高いため、イメージング標本調製用の薄切片を作成することは困難です。さらに、消化管の層ごとの微細加工のため、チップは各層間に永久的な接着が含まれているため、上皮層の表面構造を調べるために上層を開けたり除去したりすることは非常に困難です。たとえば、走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用します。
PDMS は疎水性小分子を非特異的に吸着する可能性があるため、PDMS の疎水性は、疎水性小分子を扱うマイクロ流体ベースの研究における制限要因となっています。PDMS の代替として、他のポリマー材料を検討することもできます。あるいは、疎水性分子の吸着を最小限に抑えるために、PDMS の表面修飾(親油性材料 42 またはポリ(エチレングリコール) 43 など)を考慮することもできます。
最後に、私たちの方法は、ハイスループットスクリーニングや「フリーサイズ」の使いやすい実験プラットフォームを提供するという点で十分な特徴がありません。現在のプロトコルでは、マイクロデバイスごとにシリンジポンプが必要ですが、これがCO2インキュベーター内のスペースを占有し、大規模な実験を妨げます。この制限は、革新的な培養形式(例、バソの継続的な補充と除去を可能にする24ウェル、96ウェル、または384ウェルの多孔質インサートなど)の拡張性によって大幅に改善できます。側面メディア)。
in vitro でヒト腸上皮の 3D 形態形成を誘導するために、我々は、2 つの平行なマイクロチャネルと、その間に管腔毛細管界面を作成するための弾性多孔質膜を含むマイクロ流体チップ腸デバイスを使用しました。また、トランスウェルインサート上で成長した分極上皮層の下に連続的な基底側流を提供するシングルチャネルマイクロ流体デバイス (ハイブリッドチップ) の使用も実証しました。両方のプラットフォームで、さまざまなヒトの形態形成が可能です。腸上皮細胞は、流れの方向性操作を適用して基底外側コンパートメントからモルフォゲンアンタゴニストを除去することによって実証できます。実験手順全体 (図 1) は 5 つの部分で構成されます: (i) 腸チップまたは Transwell 挿入可能なハイブリッド チップの微細加工 (ステップ 1 ~ 5; ボックス 1)、(ii) 腸上皮細胞 (Caco-2 細胞) またはヒト腸オルガノイドの調製。ボックス 2 ~ 5)、(iii) 腸チップまたはハイブリッド チップでの腸上皮細胞の培養 (ステップ 6 ~ 9)、(iv) in vitro での 3D 形態形成の誘導 (ステップ 10)、および (v) ) の 3D 上皮微細構造の特徴付け (ステップ 11 ~ 24)。最後に、適切な対照群 (以下でさらに説明) を設計して、in vitro の有効性を検証しました。上皮の形態形成を空間的、時間的、条件的、または手順的な対照と比較することによる形態形成。
私たちは 2 つの異なる培養プラットフォームを使用しました。直線チャネルまたは非線形複雑なチャネルを備えたガットオンチップ、またはボックス 1 とステップ 1 ~ 5 で説明したように製造されたマイクロ流体デバイスにトランスウェル (TW) インサートを含むハイブリッドチップです。「デバイスの製造」では、単一チップまたはハイブリッドチップを作成する主なステップを示します。「ヒト腸上皮細胞の培養」では、細胞ソース (Caco-2 またはヒト腸オルガノイド) について説明します。 「インビトロ形態形成」は、Caco-2 またはオルガノイド由来の上皮細胞が腸チップまたはハイブリッド チップのトランスウェル インサート上で培養され、その後 3D 形態形成の誘導と特徴付けられた上皮構造の形成が行われる全体的なステップを示します。プログラムのステップ番号またはボックス番号は各矢印の下に表示されます。このアプリケーションでは、確立された腸上皮層の使用方法の例が提供されます。 「細胞分化」の免疫蛍光画像は、腸チップ上に生成された 3D Caco-2 上皮層で発現する核、F-アクチン、および MUC2 を示しています。MUC2 シグナル伝達は、杯細胞および粘膜表面から分泌される粘液に存在します。腸生理学の蛍光画像は、染色によって生成された粘液を示しています。蛍光小麦胚芽凝集素を使用したシアル酸および N-アセチルグルコサミン残基。「宿主微生物共培養」の 2 つの重複画像は、チップ上の腸内の代表的な宿主微生物共培養を示しています。左のパネルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) を発現する大腸菌と微細加工された 3D Caco-2 上皮細胞との共培養を示しています。右のパネルは、3D Caco-2 上皮細胞と共培養した GFP の局在を示しています。 D Caco-2 上皮細胞、その後の F-アクチン (赤) と核 (青) による免疫蛍光染色。疾患モデリングは、細菌抗原 (例、リポ多糖、LPS) および免疫細胞 (例、PBMC;緑)。Caco-2 細胞を培養して 3D 上皮層を確立しました。スケール バー、50 μm。下段の画像:「細胞の分化」は参考文献の許可を得て改変しました。2.オックスフォード大学出版局;Ref.5 の許可を得て転載。NAS;「宿主微生物共培養」は参考文献 3 の許可を得て改変したものです。NAS;「疾患モデリング」は参考文献の許可を得て改変したものです。5.NAS。
ガットオンチップとハイブリッドチップは両方とも、ソフトリソグラフィーによってシリコンモールドから型外され 1,44 、SU-8 でパターン化された PDMS レプリカを使用して製造されました。各チップのマイクロチャネルの設計は、せん断応力や流体力学圧力などの流体力学を考慮して決定されます 1,4,12。 2 つの並置された平行な直線マイクロチャネルで構成される元のガットオンチップ設計 (拡張データ図 1a) は、流体滞留時間の増加、非線形流動パターン、および培養細胞の多軸変形を誘導する一対の湾曲したマイクロチャネルを含む複雑なガットオンチップ(拡張データ図1b)に進化しました(図2a〜f)。培養細胞の種類に関係なく、元のGut-Chipと比較して同様の程度の上皮成長で、同様の時間枠で発生が起こります。したがって、3D形態形成を誘導するには、線形および複雑なオンチップ腸設計が交換可能です。SU-8パターンを備えたシリコンモールド上で硬化したPDMSレプリカは、脱型後にネガティブな特徴を提供しました(図1)。チップ上にガットを作製するために、準備した上部PDMS層を多孔質PDMSフィルムに順次接合し、コロナ処理装置を使用した不可逆接合によって下部PDMS層と位置合わせしました(図2b〜f)。ハイブリッドチップを作製するには、硬化したPDMSレプリカをスライドガラスに接合して、トランズウェルインサートに対応できるシングルチャネルマイクロ流体デバイスを作成しました(図2hおよび拡張データ図2a)。 2).接着プロセスは、酸素プラズマまたはコロナ処理でPDMSレプリカとガラスの表面を処理することによって実行されます。シリコンチューブに取り付けられた微細加工デバイスの滅菌後、デバイスのセットアップは腸上皮の3D形態形成を実行する準備が整いました(図2g)。
a、SU-8 パターンのシリコン型からの PDMS 部品の準備の概略図。未硬化の PDMS 溶液をシリコン型 (左) に注ぎ、60 °C で硬化 (中央) し、型から取り出しました (右)。型から取り出した PDMS を小片に切断し、さらに使用するために洗浄しました。b、PDMS 上層の準備に使用したシリコン型の写真。c、PDMS 多孔質膜の製造に使用したシリコン型の写真。d、A上部および下部 PDMS コンポーネントと組み立てられたオンチップ腸管デバイスの一連の写真。e、上部、膜、および下部 PDMS コンポーネントの配置の概略図。各層はプラズマまたはコロナ処理によって不可逆的に結合されます。f、複雑なマイクロチャネルと真空チャンバーを重ね合わせた作製されたガット・オン・チップ・デバイスの概略図。g、マイクロ流体細胞培養用のガット・オン・チップのセットアップ。作製された腸シリコーンチューブで組み立てられたチップ上にシリンジがカバースリップ上に置かれました。チップデバイスは処理のために150 mmペトリ皿の蓋の上に置かれました。バインダーはシリコーンチューブを閉じるために使用されます。h、ハイブリッドチップ製造とハイブリッドチップを使用した3D形態形成の視覚的なスナップショット。腸上皮細胞の2D単層を培養するために独自に調製されたトランスウェルインサートがハイブリッドチップに挿入され、腸の3D形態形成を誘導しました。培地は、Transwell インサート上に確立された細胞層の下のマイクロチャネルを通して灌流されます。スケール バー、1 cm.h 参考文献から許可を得て転載。4.エルゼビア。
このプロトコルでは、Caco-2 細胞株と腸オルガノイドを上皮ソースとして使用しました (図 3a)。両方のタイプの細胞を独立して培養し (ボックス 2 およびボックス 5)、オンチップ腸またはトランスウェル インサートの ECM コーティングされたマイクロチャネルに播種するために使用しました。細胞がコンフルエントになったら (フラスコ内のカバー率 > 95%)、Caco-2 細胞 (継代 10 と 50 の間) を定期的に培養しました。 T フラスコを回収し、トリプシン処理液による解離細胞懸濁液を調製します (ボックス 2)。腸生検または外科的切除からのヒト腸オルガノイドを、構造微小環境をサポートするために 24 ウェル プレートのマトリゲル足場ドームで培養しました。必須モルフォゲン (Wnt、R-スポンジン、ノギンなど) とボックス 3 で調製した成長因子を含む培地を、ボックス 3 で説明したように調製するまで 1 日おきに補充しました。オルガノイドは直径約 500 μm まで成長しました。完全に成長したオルガノイドは収集され、腸またはチップ上のトランズウェル インサートに播種するために単一細胞に解離されます (ボックス 5)。以前に報告したように、疾患タイプ 12、13 (例: 潰瘍性大腸炎、クローン病、結腸直腸がん、または正常ドナー)、病変部位 (例: 病変対非病変領域)、および胃腸の位置に応じて区別できます。ボックス 5 では、通常、小腸オルガノイドよりも高濃度のモルフォゲンを必要とする結腸オルガノイド (コロイド) を培養するための最適化されたプロトコルを提供します。
a、腸チップにおける腸形態形成の誘導のためのワークフロー。Caco-2ヒト腸上皮および腸オルガノイドは、3D形態形成を実証するためにこのプロトコルで使用されます。単離された上皮細胞は、準備されたガットオンチップデバイス(チップ準備)に播種されました。細胞が播種(播種)され、0日目(D0)にPDMS多孔質膜に付着(付着)されると、頂端(AP) 流動が開始され、最初の 2 日間維持されます (流動、AP、D0 ~ D2)。完全な 2D 単層が形成されると、周期的なストレッチ動作 (ストレッチ、流動、AP、BL) とともに側底 (BL) 流動も開始されます。腸の 3D 形態形成は、5 日間のマイクロ流体培養後に自発的に発生しました (形態形成、D5)。位相差画像は、それぞれの Caco-2 細胞の代表的な形態を示しています。実験ステップまたは時点(棒グラフ、100 μm)。腸形態形成の対応するカスケードを示す 4 つの模式図(右上)。模式図内の破線の矢印は、流体の流れの方向を表します。b、確立された 3D Caco-2 上皮の表面トポロジーを示す SEM 画像(左)。拡大領域を強調表示した挿入図(白い点線のボックス)は、3D Caco-2 層上の再生された微絨毛を示します(右) ).c、確立された Caco-2 3D、クローディン (ZO-1、赤)、および F-アクチン (緑) と核 (青) で標識された連続刷子縁膜の水平正面図。腸チップ上の上皮細胞の免疫蛍光共焦点視覚化。中央の概略図を指す矢印は、各共焦点ビューの焦点面の位置を示します。d、位相差顕微鏡によって得られたチップ上で培養されたオルガノイドの形態学的変化の時間経過挿入図(右上)は、提供された画像の高倍率を示しています。e、7日目に撮影されたスライス上の腸内に確立されたオルガノイド3D上皮のDIC顕微鏡写真。f、幹細胞のマーカーを示す重ね合わせた免疫蛍光画像(LGR5;マゼンタ)、杯細胞(MUC2; 緑)、F-アクチン(灰色)および核(シアン)をそれぞれ腸チップ上で 3 日間増殖させた上皮層上のオルガノイド(左)および 13 日間(中央)です。MUC2 シグナル伝達を含まない LGR5 シグナル伝達を強調した拡張データ図 3 も参照してください。培養 13 日目に CellMask 色素 (右) で原形質膜を染色して、チップ上の腸を観察します。特に明記しない限り、スケール バーは 50 μm です。b 参考文献から許可を得て転載。2.オックスフォード大学出版局;c Reference.2 の許可を得て改変。オックスフォード大学出版局;e および f は参照による許可を得て改変されています。12 クリエイティブ コモンズ ライセンス CC BY 4.0 に基づきます。
チップ上の腸では、ECM コーティングを成功させるために PDMS 多孔質膜の疎水性表面を修飾する必要があります。このプロトコルでは、PDMS 膜の疎水性を修飾する 2 つの異なる方法を適用します。Caco-2 細胞を培養する場合、PDMS 表面の疎水性を低下させ、ECM をコーティングし、Caco-2 細胞を PDMS 膜に付着させるには、UV/オゾン処理による表面活性化だけで十分でした。ただし、オルガノイド上皮のマイクロ流体培養には、ポリエチレンイミン (PEI) とグルタルアルデヒドを PDMS マイクロチャネルに順次適用することで、ECM タンパク質の効率的な堆積を達成するための化学ベースの表面官能化。表面修飾後、機能化された PDMS 表面を覆うように ECM タンパク質が堆積され、次に単離された器官上皮に導入されました。細胞が付着した後、マイクロ流体細胞培養は、細胞が完全な単層を形成するまで上部マイクロチャネルに培地のみを灌流することから始まり、下部マイクロチャネルは静的状態を維持します。この最適化された方法は、表面活性化と ECM コーティングにより、オルガノイド上皮の付着が可能になり、PDMS 表面上で 3D 形態形成を誘導できます。
トランスウェル培養では、細胞播種前に ECM コーティングも必要です。ただし、トランスウェル培養では、多孔質インサートの表面を活性化するための複雑な前処理ステップは必要ありません。トランスウェルインサート上で Caco-2 細胞を増殖させる場合、多孔質インサート上の ECM コーティングにより、解離した Caco-2 細胞の付着 (<1 時間) とタイトジャンクションバリアの形成 (<1 ~ 2 日) が促進されます。トランスウェルインサート上でオルガノイドを培養するには、単離されたオルガノイドを ECM コーティングされたインサート上に播種し、膜表面に付着させ (<3 時間)、オルガノイドが形成されるまで維持します。バリア完全性を備えた完全な単層。トランスウェル培養は、ハイブリッド チップを使用せずに 24 ウェル プレートで実行されます。
in vitro 3D形態形成は、確立された上皮層の側底側面に流体の流れを適用することによって開始できます。チップ上の腸では、培地が上部および下部のマイクロチャネルに灌流されたときに上皮の形態形成が始まりました(図3a)。前述したように、指向性分泌モルフォゲン阻害剤を継続的に除去するには、下部(側底)コンパートメントに流体の流れを導入することが重要です。ポートに結合した細胞に十分な栄養素と血清を提供するには、ハイブリッドチップでは、上皮単層を含むトランスウェルインサートがハイブリッドチップに挿入されました。次に、培地がマイクロチャネルを通して多孔質トランスウェルインサートの側底側の下に適用されました。腸の形態形成は、両方の培養プラットフォームで側底側流動の開始から3〜5日後に起こりました。
マイクロエンジニアリングされた 3D 上皮層の形態的特徴は、位相差顕微鏡、微分干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡、SEM、免疫蛍光共焦点顕微鏡などのさまざまなイメージング手法を適用することで分析できます (図 3 および 4)。位相コントラストまたは DIC イメージングは​​、培養中いつでも簡単に実行して、3D 上皮層の形状と突出をモニタリングできます。PDMS とポリエステル フィルムは両方とも光透過性があるため、ガットオンチップおよびハイブリッドチッププラットフォームは、デバイスの切片化や分解を必要とせずに、リアルタイムの in situ イメージングを提供できます。免疫蛍光イメージング (図 1、3c、f、および 4b、c) を実行する場合、細胞は通常、4% (wt/vol) パラホルムアルデヒド (PFA)、続いて Triton X-100、2% (wt/vol) ) ウシ血清アルブミン (BSA) で順に固定されます。細胞タイプ、さまざまな固定剤、透過化剤、およびブロッキング剤を使用できます。系統依存性の細胞または領域マーカーをターゲットとする一次抗体を使用して、チップ上の in situ に固定化された細胞を強調表示し、続いて二次抗体と対比染色色素を使用して、核(例:4',6-ジアミジノ-2-フェニレン)インドール、DAPI)または F-アクチン(例:蛍光標識ファロイジン)のいずれかをターゲットにします。蛍光ベースのライブイメージングも可能です。粘液生成を検出するためにその場で実行されます(図)。1、「細胞分化」および「腸生理学」)、微生物細胞のランダムコロニー形成(図 1、「宿主微生物の共培養」)、免疫細胞の動員(図 1、「疾患モデリング」)、または 3D 上皮形態の輪郭(図 3c、f および 4b、c)。チップ上の腸を変更して上部層を下部マイクロチャネル層から分離する場合、参考文献に記載されています。図2に示すように、3D上皮形態および頂端刷子縁の微絨毛はSEMによって視覚化できます(図3b)。分化マーカーの発現は、定量的PCR5または単一細胞RNAシーケンスを実行することによって評価できます。この場合、腸チップまたはハイブリッドチップで増殖させた上皮細胞の3D層はトリプシン処理によって収集され、分子分析または遺伝子分析に使用されます。
a、ハイブリッド チップで腸の形態形成を誘導するためのワークフロー。Caco-2 と腸オルガノイドは、ハイブリッド チップ プラットフォームで 3D 形態形成を実証するためにこのプロトコルで使用されます。解離した上皮細胞を、準備された Transwell インサート (TW プレップ; 以下の図を参照) に播種しました。細胞が播種 (播種) され、Transwell インサートのポリエステル膜に付着したら、すべての細胞を静的条件下で培養しました (TW 培養)。数日間、上皮細胞の 2D 単層を含む単一の Transwell インサートがハイブリッド チップに統合され、基底側流 (Flow、BL) が導入され、最終的に 3D 上皮層の生成 (形態形成) につながりました。各実験ステップまたは時点での正常ドナー (C103 系統) 上行結腸由来のヒト臓器上皮細胞の形態的特徴を示す位相差顕微鏡写真。上の層の概略図は、各ステップの実験構成を示しています。 , ハイブリッド チップ (左の図式) は、異なる Z 位置 (上部、中央、下部;右の回路図と対応する点線を参照してください)。明らかな形態学的特徴を示した。F-アクチン(シアン)、核(灰色)。c、静的トランスウェルで培養したオルガノイド由来上皮細胞の蛍光共焦点顕微鏡写真(3D斜視図)(TW、白い破線ボックス内の挿入図)対ハイブリッドチップ(最大のフルショット)で、それぞれ2Dと3Dの形態を比較。一対の2D垂直断面図(右上隅の挿入図、「XZ」) 2D および 3D の特徴も表示します。スケール バー、100 μm。c 参考文献から許可を得て転載。4。エルゼビア。
コントロールは、同じ細胞(Caco-2 または腸オルガノイド上皮細胞)を従来の静置培養条件下で二次元単層に培養することによって調製できます。特に、マイクロチャネルの体積容量が限られているため(つまり、元の腸チップ設計の上部チャネルでは約 4 μL)、栄養素の枯渇が生じる可能性があります。したがって、側底流の適用前後の上皮形態も比較できます。
ソフトリソグラフィープロセスはクリーンルームで実行する必要があります。チップ上の各層(上部層、下部層、メンブレン)とハイブリッドチップでは、マイクロチャネルの高さが異なるため、異なるフォトマスクが使用され、別個のシリコンウェーハ上に製造されました。チップ上のガットの上部および下部マイクロチャネルの目標高さは、それぞれ500μmと200μmです。ハイブリッドチップのチャネル目標高さは200μmです。
アセトンの入った皿に 3 インチのシリコンウェハを置きます。プレートを 30 秒間ゆっくりと回転させ、ウェハを風乾します。ウェハを IPA の入ったプレートに移し、プレートを 30 秒回転させて洗浄します。
シリコンウェーハ表面からの有機残留物の除去を最大限にするために、ピラニア溶液 (過酸化水素と濃硫酸の混合物、1:3 (体積/体積)) を任意で使用できます。
ピラニア溶液は非常に腐食性が高く、熱を発生します。追加の安全対策が必要です。廃棄物を処分する場合は、溶液を冷まして清潔で乾燥した廃棄物容器に移してください。二次容器を使用し、廃棄物容器に適切にラベルを付けてください。詳細な手順については、施設の安全ガイドラインに従ってください。
200 °C のホット プレート上にウェーハを 10 分間置いて脱水します。脱水後、ウェーハを空気中で 5 回振盪して冷却します。
洗浄したシリコン ウェーハの中心に約 10 g のフォトレジスト SU-8 2100 を注ぎます。ピンセットを使用して、ウェーハ上にフォトレジストを均等に広げます。時々、ウェーハを 65°C のホット プレート上に置き、フォトレジストの粘着性を減らし、広げやすくします。ウェーハをホット プレート上に直接置かないでください。
スピン コーティングを実行することにより、SU-8 をウェーハ上に均一に分散させました。SU-8 の回転を 5 ~ 10 秒間、100 rpm/s の加速度で 500 rpm で伝播するようにプログラムしました。厚さ 200 μm のパターニングのメイン スピンを 1,500 rpm に設定するか、厚さ 250 μm を達成します (チップ上のガットの上層の高さを 500 μm にします。「重要な手順」を参照)。 」(以下))加速度 300 rpm/s、1,200 rpm で 30 秒に設定。
メインスピン速度は、シリコンウェーハ上のSU-8パターンの目標厚さに応じて調整できます。
チップ上のガットの上層に高さ 500 μm の SU-8 パターンを作製するために、このボックスのスピン コーティングとソフト ベークのステップ (ステップ 7 および 8) を連続して繰り返して (ステップ 9 を参照)、250 μm の厚い SU-8 層を 2 つ作成しました。この層は、このボックスのステップ 12 で UV 露光によって積層および接合することができ、高さ 500 μm の層を作成します。
ウェーハを65℃のホットプレート上に5分間注意深く置いて、SU-8コーティングされたウェーハをソフトベークし、設定を95℃に切り替えてさらに40分間インキュベートします。
上部マイクロチャネルの SU-8 パターンの高さ 500 μm を達成するには、手順 7 と 8 を繰り返して、厚さ 250 μm の SU-8 層を 2 つ生成します。
UV マスク アライナーを使用して、メーカーの指示に従ってランプ テストを実行し、ウェハの露光時間を計算します。(露光時間、ms) = (露光量、mJ/cm2)/(ランプ出力、mW/cm2)。
露光時間を決定した後、フォトマスクを UV マスク アライナーのマスク ホルダーに置き、フォトマスクを SU-8 コーティングされたウェーハ上に置きます。
UV 散乱を最小限に抑えるために、フォトマスクの印刷面をシリコン ウェーハの SU-8 コーティング面に直接配置します。
SU-8 コーティングされたウェーハとフォトマスクを 260 mJ/cm2 の UV 光に所定の露光時間垂直に露光します (このボックスのステップ 10 を参照)。
UV露光後、SU-8でコーティングされたシリコンウェハを各ホットプレート上で65℃で5分間および95℃で15分間ベークして、高さ200μmのパターンを作製した。95℃でのポストベーク時間を30分間に延長して、高さ500μmのパターンを作製した。
現像液をガラス皿に注ぎ、ベークしたウエハをその中に置きます。SU-8 現像液の量はガラスプレートのサイズによって異なります。未露光の SU-8 を完全に除去するのに十分な量の SU-8 現像液を使用してください。たとえば、直径 150 mm、容量 1 L のガラス皿を使用する場合、約 300 mL の SU-8 現像液を使用します。モールドを時々穏やかに回転させながら 25 分間現像します。
開発されたモールドを約 10 mL の新しい現像液で洗浄し、続いてピペットを使用して溶液をスプレーして IPA を洗浄します。
ウェーハをプラズマクリーナーに置き、酸素プラズマ(大気ガス、ターゲット圧力1×10−5 Torr、電力125 W)に1.5分間さらします。
スライドガラスを入れた真空デシケーターにウェーハを置きます。ウェーハとスライドは並べて置くことができます。真空デシケーターがプレートでいくつかの層に分かれている場合は、スライドを下のチャンバーに、ウェーハを上のチャンバーに置きます。トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン溶液100μLをスライドガラス上に滴下し、シラン化のために真空を適用します。
凍結した Caco-2 細胞のバイアルを 37°C のウォーターバスで解凍し、解凍した細胞を 15 mL の 37°C に予熱した Caco-2 培地を含む T75 フラスコに移します。
Caco-2 細胞を約 90% コンフルエントで通過させるには、まず Caco-2 培地、PBS、および 0.25% トリプシン/1 mM EDTA を 37°C ウォーターバスで温めます。
真空吸引により培地を吸引します。真空吸引を繰り返し、新鮮な PBS を加えることにより、5 mL の温かい PBS で細胞を 2 回洗浄します。


投稿日時: 2022 年 7 月 16 日