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ヒトの腸管形態形成は、3D上皮微細構造と空間構成の陰窩-絨毛特性を確立する。この独自の構造は、基底陰窩の幹細胞ニッチを外因性微生物抗原とその代謝物から保護することで、腸管恒常性を維持するために必要である。さらに、腸絨毛と分泌粘液は、腸粘膜表面に保護バリアを備えた機能的に分化した上皮細胞を提示する。したがって、3D上皮構造を再現することは、in vitro腸管モデルの構築に不可欠である。特に、有機模倣腸管オンチップは、生理機能と生体力学を強化し、腸管上皮の自発的な3D形態形成を誘導することができる。本稿では、マイクロ流体チップ上およびトランスウェル埋め込みハイブリッドチップ上で腸管の形態形成をロバストに誘導するための再現可能なプロトコルを提供する。デバイス作製、従来の設定およびマイクロ流体プラットフォーム上でのCaco-2または腸器官上皮細胞の培養、3D形態形成の誘導、および複数の画像化様式を使用した確立された3D上皮の特性評価。このプロトコルは、5日間の基底外側液の流れを制御することで、機能的な腸の微細構造の再生を実現します。私たちのin vitro形態形成法は、生理学的に関連する剪断応力と機械的運動を採用しており、複雑な細胞工学や操作を必要とせず、他の既存の技術よりも優れている可能性があります。私たちが提案するプロトコルは、生物医学研究コミュニティに幅広い影響を与え、生物医学、臨床、および製薬アプリケーションのためにin vitroで3D腸上皮層を再生する方法を提供すると考えています。
実験により、腸管上皮細胞 Caco-2 をガットオンチップ 1,2,3,4,5 または二重層マイクロ流体デバイス 6,7 で培養すると、体外で自発的に 3D 形態形成を起こす可能性があることが実証されていますが、その根本的なメカニズムは明確には解明されていません。私たちの最近の研究では、培養デバイスから基底外側に分泌される形態形成因子拮抗薬を除去することが、体外で 3D 上皮形態形成を誘導するために必要かつ十分であることを発見しました。これは Caco-2 および患者由来の腸管オルガノイドによって実証されています。上皮細胞が検証されました。この研究では、腸管オンチップおよびトランスウェルインサートを含む改良型マイクロ流体デバイス（「ハイブリッドチップ」）における強力なWnt拮抗薬であるDickkopf-1（DKK-1）の細胞産生と濃度分布に特に焦点を当てました。私たちは、外因性Wnt拮抗薬（DKK-1、Wntリプレッサー1、分泌型フリズルド関連タンパク質1、またはSoggy-1など）をオンチップ腸に追加すると、形態形成が阻害されるか、または事前構造化された3D上皮層が破壊されることを実証しました。これは、培養中の拮抗的ストレスがin vitroでの腸形態形成に関与していることを示唆しています。したがって、上皮界面で堅牢な形態形成を達成するための実用的なアプローチは、能動的なフラッシング（例えば、腸管オンチップまたはハイブリッドオンチッププラットフォーム）または拡散。基底外側培地（例：トランスウェルインサートからウェル内の大きな基底外側リザーバーへ）。
このプロトコルでは、腸管上皮細胞をポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースの多孔膜（ステップ6A、7A、8、9）またはトランスウェルインサートのポリエステル膜（ステップ6B、7B、8、9）上で培養し、in vitroで3D形態形成を誘導するための、腸管上皮細胞チップマイクロデバイスおよびトランスウェル挿入可能ハイブリッドチップ（ステップ1〜5）の詳細な製造方法を示します（ステップ10）。また、複数のイメージングモダリティを適用することにより、組織特異的な組織形成および系統依存的な細胞分化を示す細胞および分子の特徴を特定しました（ステップ11〜24）。Caco-2や腸管オルガノイドなどのヒト腸管上皮細胞を使用して、2つの培養形式で形態形成を誘導します。技術的な詳細には、多孔膜の表面改質、2D単層の作成、腸管の生化学的および再現性が含まれます。生体力学的微小環境。in vitro。2D上皮単層から3D形態形成を誘導するために、培地を培養の基底外側区画に流すことによって、両方の培養形態から形態形成因子拮抗薬を除去しました。最後に、形態形成因子依存性上皮成長、縦方向の宿主-微生物叢共培養、病原体感染、炎症性損傷、上皮バリア機能不全、およびプロバイオティクスベースの療法の影響をモデル化するために使用できる再生可能な3D上皮層の有用性を示します。
私たちのプロトコルは、幅広い基礎研究（腸粘膜生物学、幹細胞生物学、発生生物学など）および応用研究（前臨床薬物試験、疾患モデル化、組織工学、消化器病学など）の科学者に役立つ可能性があり、幅広い影響を与えます。in vitro で腸上皮の 3D 形態形成を誘導する私たちのプロトコルは再現性があり堅牢であるため、腸の発達、再生、または恒常性の過程での細胞シグナル伝達のダイナミクスを研究している人々に私たちの技術戦略を広めることができると考えています。さらに、私たちのプロトコルは、ノロウイルス 8、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2（SARS-CoV-2）、クロストリジウム・ディフィシル、サルモネラ・チフス菌 9、コレラ菌など、さまざまな感染性病原体による感染を調べるのにも役立ちます。疾患の病理と病因に関する読者も有用です。オンチップ腸微小生理学システムの使用により、縦断的共培養10 と、それに続く胃腸管11 における宿主防御、免疫応答、および病原体関連損傷修復の評価が可能になります。腸漏れ症候群、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸嚢炎、または過敏性腸症候群に関連するその他の消化管疾患は、患者の3D腸上皮層を使用して3D腸上皮層を調製することでシミュレートできます。これらの疾患には、絨毛萎縮、陰窩短縮、粘膜損傷、または上皮バリア障害が含まれます。生検または幹細胞由来の腸オルガノイド12,13。疾患環境のより複雑なモデル化をより適切に行うために、読者は、患者の末梢血単核細胞（PBMC）などの疾患関連細胞タイプを追加することを検討できます。 3D腸絨毛陰窩微細構造を含むモデル。組織特異的免疫細胞、5。
3D上皮微細構造は切片化プロセスなしで固定・可視化できるため、空間トランスクリプトミクスや高解像度／超解像度イメージングに取り組んでいる方は、上皮ニッチにおける遺伝子とタンパク質の時空間動態のマッピングに関心を持つかもしれません。テクノロジーへの関心。微生物または免疫刺激への反応。さらに、腸内恒常性を調整する縦断的な宿主-マイクロバイオームクロストーク10, 14は、特に腸内チップにおいて、様々な微生物種、微生物群集、または糞便微生物叢を共培養することにより、3D腸粘膜層に構築できます。このアプローチは、粘膜免疫学、消化器学、ヒトマイクロバイオーム、カルチュロミクス、臨床微生物学を研究し、これまで培養されていなかった腸内細菌叢を実験室で培養しようとしている人々にとって特に魅力的です。私たちのin vitro形態形成プロトコルが、24、96、または384ウェルプレートのマルチウェルインサートなど、基底外側区画を継続的に補充するスケーラブルな培養フォーマットに適応できる場合、このプロトコルは、製薬、生物医学、または食品業界向けのハイスループットスクリーニングまたは検証プラットフォームを開発している人々にも普及させることができます。原理実証として、私たちは最近、24ウェルプレートフォーマットに拡張可能なマルチプレックスハイスループット形態形成システムの実現可能性を実証しました。さらに、複数の臓器オンチップ製品が商品化されています16,17,18。したがって、私たちのin vitro形態形成法の検証は加速され、多くの研究に採用される可能性があります。研究室、業界、政府機関、規制当局が、トランスクリプトミクスレベルでの試験管内形態形成の細胞再プログラミングを理解し、薬物やバイオ医薬品を試験します。薬物候補の吸収と輸送は、3D腸代替物、またはカスタムまたは市販の臓器オンチップモデルを使用して評価され、腸形態形成プロセスの再現性が評価されました。
腸管上皮の形態形成を研究するために、ヒトに関連する実験モデルは限られており、その主な理由は、in vitroで3D形態形成を誘導するための実用的なプロトコルが不足していることです。実際、腸管形態形成に関する現在の知識の多くは、動物実験（例：ゼブラフィッシュ20、マウス21、ニワトリ22）に基づいています。しかし、これらのモデルは労力と費用がかかり、倫理的に問題となる可能性があり、最も重要なのは、ヒトの発達プロセスを正確に決定することができないことです。また、これらのモデルは、多方向スケーラブルな方法でテストする能力が非常に限られています。したがって、in vitroで3D組織構造を再生するための私たちのプロトコルは、in vivo動物モデルや他の従来の静的2D細胞培養モデルよりも優れています。前述のように、3D上皮構造を利用することで、様々な粘膜刺激や免疫刺激に対する分化細胞の陰窩-絨毛軸における空間的な局在を調べることができました。3D上皮層は、微生物細胞がどのようにして空間的ニッチを形成するために競合するか、また宿主因子（例：内側と外側の粘液層、IgAおよび抗菌ペプチドの分泌）に応じて生態学的進化を研究するためのスペースです。さらに、3D上皮形態学により、腸内細菌叢がどのようにそのコミュニティを構築し、基底陰窩の細胞組織と幹細胞ニッチを形成する微生物代謝産物（例：短鎖脂肪酸）を相乗的に生成するかを理解することができます。これらの機能は、3D上皮層がin vitroで確立された場合にのみ実証できます。
3D 腸上皮構造を作成する当社の方法に加えて、in vitro の方法がいくつかあります。腸オルガノイド培養は、特定のモルフォゲン条件下での腸幹細胞の培養に基づく最先端の組織工学技術です23,24,25。しかし、輸送分析や宿主-マイクロバイオームの共培養に 3D オルガノイド モデルを使用することは、腸管腔がオルガノイド内に囲まれているため、微生物細胞や外因性抗原などの管腔成分の導入が制限されるため、多くの場合困難です。オルガノイド管腔へのアクセスは、マイクロインジェクターの使用により改善できますが26,27、この方法は侵襲的で労働集約的であり、実行には専門知識が必要です。さらに、静的条件下でハイドロゲル スキャフォールドで維持される従来のオルガノイド培養は、アクティブな in vivo バイオメカニクスを正確に反映しません。
いくつかの研究グループが採用している他のアプローチでは、事前に構造化された3Dハイドロゲルスキャフォールドを用いて、単離されたヒト腸細胞をゲル表面で培養することで腸上皮構造を模倣しています。3Dプリント、マイクロミル加工、またはリソグラフィーで製造された型を使用してハイドロゲルスキャフォールドを作製します。この方法は、生理学的に関連する形態形成因子勾配を用いて、in vitroで単離された上皮細胞の自己組織化配列を示し、スキャフォールドに間質細胞を含めることで、高アスペクト比の上皮構造と間質-上皮クロストークを確立します。しかし、事前に構造化されたスキャフォールドの性質により、自発的な形態形成プロセス自体の表示が妨げられる可能性があります。これらのモデルはまた、動的な管腔内または間質の流れを提供しないため、腸細胞が形態形成を経て生理学的機能を獲得するために必要な流体せん断応力が欠如しています。最近の別の研究では、マイクロ流体プラットフォームでハイドロゲルスキャフォールドを使用し、パターン化された腸レーザーエッチング技術を用いて上皮構造を作製する。マウスの腸管オルガノイドはエッチングパターンに沿って腸管構造を形成し、マイクロ流体モジュールを用いて管腔内の流体の流れを再現することができる。しかし、このモデルは自発的な形態形成過程を示さず、腸の機械生物学的動きも備えていない。同じグループの3Dプリント技術は、自発的な形態形成過程を備えた小型腸管を作成することができた。チューブ内に異なる腸管セグメントを複雑に作製しているにもかかわらず、このモデルは管腔内の流体の流れと機械的変形を欠いている。さらに、特にバイオプリンティングプロセスが完了した後、モデルの操作性が制限され、実験条件や細胞間相互作用が乱れる可能性がある。代わりに、我々が提案するプロトコルは、自発的な腸管形態形成、生理学的に関連するせん断応力、腸管運動を模倣するバイオメカニクス、独立した頂端および基底外側区画へのアクセス、そして複雑な生物学的微小環境の再現を提供する。したがって、私たちの in vitro 3D 形態形成プロトコルは、既存の方法の課題を克服するための補完的なアプローチを提供する可能性があります。
我々のプロトコルは、培養物中に上皮細胞のみを存在させ、間葉系細胞、内皮細胞、免疫細胞などの他の種類の周囲細胞は含まない、3D上皮形態形成に完全に焦点を当てています。前述のように、我々のプロトコルの中核は、導入された培地の基底外側から分泌される形態形成阻害因子を除去することによって上皮形態形成を誘導することです。我々のgut-on-a-chipとhybrid-on-a-chipの堅牢なモジュール性により、波打つ3D上皮層を再現することができますが、上皮-間葉系相互作用33,34、細胞外マトリックス（ECM）沈着35、そして我々のモデルでは基底陰窩における幹細胞ニッチを運ぶ陰窩-絨毛特性など、追加の生物学的複雑性については、さらに検討する必要があります。間葉系の間質細胞（例えば、線維芽細胞）は​​、ECMタンパク質の産生と腸管粘膜の調節において重要な役割を果たします。生体内での形態形成35,37,38。私たちのモデルに間葉系細胞を追加することで、形態形成プロセスと細胞接着効率が向上しました。内皮層（毛細血管やリンパ管など）は、腸の微小環境における分子輸送39と免疫細胞の動員40の制御に重要な役割を果たしています。さらに、組織モデル間で接続できる血管成分は、多臓器相互作用を示すように組織モデルを設計する場合の前提条件です。したがって、臓器レベルの解像度でより正確な生理学的特徴をモデル化するには、内皮細胞を含める必要があるかもしれません。患者由来の免疫細胞は、腸疾患を模倣する状況において、自然免疫応答、抗原提示、自然適応免疫クロストーク、および組織特異的免疫を示すためにも不可欠です。
ハイブリッド チップの使用は、デバイスのセットアップがより単純であり、Transwell インサートを使用することで腸上皮のスケーラブルな培養が可能になるため、ガットオンチップより簡単です。ただし、ポリエステル メンブレンを備えた市販の Transwell インサートは伸縮性がないため、蠕動運動のような動きをシミュレートできません。さらに、ハイブリッド チップに配置された Transwell インサートの頂端コンパートメントは、頂端側に剪断応力がなく静止したままでした。明らかに、頂端コンパートメントの静的特性により、ハイブリッド チップ内での長期的な細菌共培養はほとんど可能になりません。ハイブリッド チップを使用すると Transwell インサートで 3D 形態形成を確実に誘発できますが、生理学的に関連する生体力学と頂端の流体の流れが不足しているため、潜在的なアプリケーションに対するハイブリッド チップ プラットフォームの実現可能性が制限される可能性があります。
腸オンチップおよびハイブリッド オンチップ培養におけるヒト陰窩-絨毛軸のフルスケール再構築はまだ完全には確立されていません。形態形成は上皮単層から始まるため、3D マイクロアーキテクチャは必ずしも生体内の陰窩と形態の類似性を提供するわけではありません。マイクロエンジニアリングされた 3D 上皮の基底陰窩領域付近で増殖する細胞集団を特徴付けましたが、陰窩と絨毛領域は明確に区別されていませんでした。チップ上の上部チャネルが高いほどマイクロエンジニアリングされた上皮の高さが増しますが、最大高さは依然として ~300–400 µm に制限されています。小腸と大腸のヒト腸陰窩の実際の深さはそれぞれ ~135 µm と ~400 µm であり、小腸絨毛の高さは ~600 µm です41。
イメージングの観点から見ると、対物レンズから上皮層までの必要な作動距離が数ミリメートル程度であるため、3Dマイクロアーキテクチャのインサイチュー超解像イメージングは​​、チップ上の腸に限定される可能性があります。この問題を克服するには、遠距離の対物レンズが必要になる場合があります。さらに、PDMSの高弾性のため、イメージング標本の準備のために薄い切片を作ることは困難です。さらに、チップ上の腸の層ごとの微細加工には各層間の永久接着が含まれるため、上層を開けたり取り除いて上皮層の表面構造を調べることは非常に困難です。たとえば、走査型電子顕微鏡（SEM）を使用します。
PDMS の疎水性は、疎水性小分子を扱うマイクロ流体ベースの研究における制限要因となっています。これは、PDMS がそのような疎水性分子を非特異的に吸着できるためです。PDMS の代替として、他のポリマー材料が検討される場合があります。あるいは、疎水性分子の吸着を最小限に抑えるために、PDMS の表面改質 (例: 親油性材料 42 またはポリ (エチレングリコール) 43 によるコーティング) を検討することもできます。
最後に、我々の方法は、ハイスループットスクリーニングや「万能」なユーザーフレンドリーな実験プラットフォームを提供するという点では、十分に特徴付けられていません。現在のプロトコルでは、マイクロデバイスごとにシリンジポンプが必要であり、CO2インキュベーター内のスペースを占有し、大規模な実験を妨げています。この制限は、革新的な培養フォーマット（例：基底外側培地の連続的な補充と除去を可能にする24ウェル、96ウェル、または384ウェルの多孔性インサート）のスケーラビリティによって大幅に改善できます。
体外でヒト腸管上皮の 3D 形態形成を誘導するために、2 つの平行マイクロチャネルと、その間の弾性多孔膜を備えたマイクロ流体チップ腸デバイスを使用して、内腔-毛細管インターフェースを作成しました。また、Transwell インサート上で増殖した分極上皮層の下に連続的な基底外側フローを提供するシングルチャネル マイクロ流体デバイス (ハイブリッド チップ) の使用方法も示します。両方のプラットフォームでは、方向性のあるフロー操作を適用して基底外側コンパートメントから形態形成因子拮抗薬を除去することにより、さまざまなヒト腸管上皮細胞の形態形成を示すことができます。全体の実験手順 (図 1) は、次の 5 つの部分で構成されています。(i) 腸チップまたは Transwell 挿入可能ハイブリッド チップの微細加工 (手順 1 ～ 5、ボックス 1)、(ii) 腸管上皮細胞 (Caco-2 細胞) またはヒト腸管オルガノイドの調製。 （ボックス2〜5）、（iii）腸チップまたはハイブリッドチップ上での腸上皮細胞の培養（ステップ6〜9）、（iv）in vitroでの3D形態形成の誘導（ステップ10）、および（v））による3D上皮微細構造の特性評価（ステップ11〜24）。最後に、上皮形態形成を空間的、時間的、条件付き、または手順的コントロールと比較することにより、in vitro形態形成の有効性を検証するための適切なコントロールグループ（以下でさらに説明）が設計されました。
2種類の培養プラットフォームを使用しました。直線チャネルまたは非線形の渦巻きチャネルを備えたガットオンチップ、またはマイクロ流体デバイスにTranswell（TW）インサートを組み込んだハイブリッドチップです。これらはボックス1で説明したように作製され、ステップ1～5で示されています。「デバイス作製」では、シングルチップまたはハイブリッドチップを作成するための主な手順を示しています。「ヒト腸管上皮細胞の培養」では、このプロトコルで使用される細胞源（Caco-2またはヒト腸管オルガノイド）と培養手順について説明します。「in vitro形態形成」では、Caco-2またはオルガノイド由来上皮細胞を腸管チップまたはハイブリッドチップのTranswellインサート上で培養し、3D形態形成を誘導して特徴付けられた上皮構造を形成する全体的な手順を示しています。プログラムステップ番号またはボックス番号は、各矢印の下に表示されています。このアプリケーションでは、確立された腸管上皮層を、例えば細胞分化特性評価、腸管生理学などにどのように使用できるかの例を示しています。研究、宿主-マイクロバイオーム生態系の確立、および疾患モデル化。「細胞分化」の免疫蛍光画像は、腸チップ上に生成された3D Caco-2上皮層で発現した核、F-アクチン、およびMUC2を示しています。MUC2シグナル伝達は、杯細胞と粘膜表面から分泌される粘液に存在します。「腸生理学」の蛍光画像は、蛍光小麦胚芽凝集素を用いてシアリン酸およびN-アセチルグルコサミン残基を染色することにより生成された粘液を示しています。「宿主-マイクロバイオーム共培養」の2つの重なり合った画像は、チップ上の腸内での代表的な宿主-マイクロバイオーム共培養を示しています。左のパネルは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する大腸菌とマイクロエンジニアリングされた3D Caco-2上皮細胞の共培養を示しています。右のパネルは、3D Caco-2上皮細胞と共培養されたGFP大腸菌の局在を示しています。続いて、F-アクチン（赤）と核（青）による免疫蛍光染色を行った。疾患モデルは、細菌抗原（リポ多糖、LPSなど）と免疫細胞（PBMCなど、緑）による生理学的刺激下での腸の炎症チップにおける健常な腸とリーキーガットを示している。Caco-2細胞を培養して3D上皮層を確立した。スケールバー、50µm。下段の画像：「細胞の分化」は文献2より許可を得て改変。Oxford University Press。文献5より許可を得て転載。NAS。「宿主-微生物共培養」は文献3より許可を得て改変。NAS。「疾患モデル化」は文献5より許可を得て改変。NAS。
腸オンチップとハイブリッドチップはどちらも、ソフトリソグラフィー1,44 によってシリコン型から脱型され、SU-8 でパターン化された PDMS レプリカを使用して製造されました。各チップのマイクロチャネルの設計は、せん断応力や流体圧力1,4,12 などの流体力学を考慮して決定されます。2 つの並置された平行直線マイクロチャネルで構成された元の腸オンチップ設計 (拡張データ図 1a) は、流体滞留時間の延長、非線形フロー パターン、培養細胞の多軸変形 (図 2a–f) を誘発する一対の湾曲マイクロチャネルを含む複雑な腸オンチップ (拡張データ図 1b) に進化しました。12。より複雑な腸のバイオメカニクスを再現する必要がある場合は、複雑な腸オンチップを選択できます。私たちは、複雑な腸チップも同様の時間枠で 3D 形態形成を強力に誘発することを実証しました。培養細胞の種類に関わらず、オリジナルのGut-Chipと比較して上皮細胞の成長度合いは同程度であった。したがって、3D形態形成を誘導するために、直線状および複雑なオンチップ腸管設計は互換性がある。SU-8パターンを有するシリコン型上で硬化させたPDMSレプリカは、脱型後にネガティブフィーチャを提供した（図2a）。チップ上に腸管を製造するために、準備した上層PDMS層を多孔質PDMSフィルムに順次接着し、次にコロナ処理装置を用いて不可逆接着により下層PDMS層と位置合わせした（図2b～f）。ハイブリッドチップを製造するために、硬化したPDMSレプリカをガラススライドに接着し、トランスウェルインサートを収容できるシングルチャネルマイクロ流体デバイスを作成した（図2hおよび拡張データ図2）。接着プロセスは、PDMSレプリカとガラスの表面を酸素プラズマまたはコロナ処理することによって行われる。シリコンチューブに取り付けられた微細加工デバイスを滅菌した後、デバイスのセットアップは腸上皮の3D形態形成（図2g）。
a, SU-8パターンのシリコン型からPDMS部品を作製する模式図。未硬化のPDMS溶液をシリコン型（左）に注ぎ、60℃で硬化（中央）させ、型から取り出した（右）。型から取り出したPDMSは、さらに使用できるように切断し、洗浄した。b, PDMS上層を作製するために使用したシリコン型の写真。c, PDMS多孔質膜を作製するために使用したシリコン型の写真。d, 上部および下部PDMSコンポーネントと組み立てられたオンチップ腸管デバイスの一連の写真。e, 上部、膜、および下部PDMSコンポーネントの配置の模式図。各層は、プラズマまたはコロナ処理によって不可逆的に結合されている。f, 重ね合わせた渦巻き状のマイクロチャネルと真空チャンバーを備えた、作製されたガットオンチップデバイスの模式図。g, マイクロ流体細胞培養用のガットオンチップのセットアップ。組み立てられたガットオンチップシリコンチューブとシリンジを取り付けたチップをカバーガラス上に置きました。チップデバイスは、処理のために150 mmペトリ皿の蓋の上に置きました。バインダーはシリコンチューブを閉じるために使用します。h、ハイブリッドチップの製造とハイブリッドチップを使用した3D形態形成のビジュアルスナップショット。腸上皮細胞の2D単層を培養するために個別に調製したトランスウェルインサートをハイブリッドチップに挿入し、腸の3D形態形成を誘導しました。培地は、トランスウェルインサート上に確立された細胞層の下のマイクロチャネルを通して灌流されます。スケールバー、1 cm。h 出典：Elsevier、許可を得て転載。4. Elsevier。
このプロトコルでは、Caco-2細胞株と腸オルガノイドを上皮細胞源として使用しました（図3a）。両方のタイプの細胞は独立して培養され（ボックス2とボックス5）、オンチップ腸またはトランスウェルインサートのECMコーティングされたマイクロチャネルに播種されました。細胞がコンフルエント（フラスコ内の95%を超える被覆率）になったら、Tフラスコで通常培養されているCaco-2細胞（継代数10～50）を収穫し、トリプシン処理液で解離した細胞懸濁液を調製しました（ボックス2）。腸生検または外科的切除から得られたヒト腸オルガノイドは、構造的微小環境をサポートするために、24ウェルプレートのマトリゲルスキャフォールドドームで培養されました。ボックス3で説明したように調製した必須モルフォゲン（Wnt、R-スポンジン、ノギンなど）と成長因子を含む培地は、オルガノイドは直径約 500 µm まで成長しました。完全に成長したオルガノイドを収穫し、チップ上の腸または Transwell インサートに播種するために単一細胞に分離します (ボックス 5)。以前に報告したように、疾患タイプ 12,13 (例: 潰瘍性大腸炎、クローン病、大腸がん、または正常ドナー)、病変部位 (例: 病変部と非病変部)、および消化管内の位置 (例: 十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、または直腸) に応じて区別することができます。ボックス 5 では、通常、小腸オルガノイドよりも高濃度のモルフォゲンを必要とする結腸オルガノイド (コロイド) を培養するための最適化されたプロトコルを示しています。
a, 腸チップにおける腸の形態形成誘導のワークフロー。このプロトコルでは、Caco-2ヒト腸上皮細胞および腸オルガノイドを用いて3D形態形成を実証する。単離した上皮細胞を、準備した腸オンチップデバイス（チップ準備）に播種した。0日目（D0）に細胞をPDMS多孔質膜に播種（播種）し、接着（接着）すると、頂端（AP）フローが開始され、最初の2日間維持される（フロー、AP、D0-D2）。完全な2D単層が形成されると、周期的な伸張運動（伸張、フロー、APおよびBL）とともに、基底外側（BL）フローも開始される。腸の3D形態形成は、マイクロ流体培養の5日後（形態形成、D5）に自発的に発生した。位相差画像は、各実験ステップまたは時点におけるCaco-2細胞の代表的な形態を示す（棒グラフ、 100 µm）。腸の形態形成の対応するカスケードを示す4つの模式図（右上）。模式図の破線矢印は流体の流れの方向を表しています。b、樹立された3D Caco-2上皮の表面トポロジーを示すSEM画像（左）。拡大された領域（白い破線ボックス）を強調表示する挿入図は、3D Caco-2層（右）上に再生された微絨毛を示しています。c、樹立されたCaco-2 3D、クローディン（ZO-1、赤）、および連続刷子縁膜の水平正面図。F-アクチン（緑）および核（青）で標識された腸チップ上の上皮細胞の免疫蛍光共焦点可視化。中央の模式図を指す矢印は、各共焦点ビューの焦点面の位置を示しています。d、位相差顕微鏡法によって得られたチップ上で培養されたオルガノイドの形態学的変化の経時変化。3日目、7日目、9日目、11日目、および13. 挿入図（右上）は、提供された画像の高倍率を示しています。e, 7 日目に採取したスライス上の腸管に定着したオルガノイド 3D 上皮の DIC 顕微鏡写真。f, 腸管チップ上で 3 日間培養した幹細胞（LGR5、マゼンタ）、杯細胞（MUC2、緑）、F アクチン（灰色）、核（シアン）のマーカー（左）と、上皮層上の 13 日目（中央）のオルガノイドを示す免疫蛍光画像を重ね合わせた画像。MUC2 シグナル伝達なしの LGR5 シグナル伝達を強調した拡張データ図 3 も参照してください。培養 13 日目に、CellMask 色素（右）で細胞膜を染色することにより、チップ上で腸管に定着した 3D オルガノイド上皮の上皮微細構造（右）を示す蛍光画像。特に記載がない限り、スケールバーは 50 μm です。b 文献より許可を得て転載。2. Oxford University Press; c 文献2（オックスフォード大学出版局）の許可を得て改変。eとf 文献12（クリエイティブ・コモンズ・ライセンス CC BY 4.0 に基づく）の許可を得て改変。
チップ上の腸管において、ECMコーティングを成功させるには、PDMS多孔膜の疎水性表面を改質する必要があります。このプロトコルでは、PDMS膜の疎水性を改質するために2つの異なる方法を適用します。Caco-2細胞の培養では、UV/オゾン処理による表面活性化のみでPDMS表面の疎水性を低下させ、ECMをコーティングしてCaco-2細胞をPDMS膜に接着させるのに十分でした。しかし、オルガノイド上皮のマイクロ流体培養では、ポリエチレンイミン（PEI）とグルタルアルデヒドをPDMSマイクロチャネルに順次塗布することにより、ECMタンパク質を効率的に沈着させる化学的な表面機能化が必要です。表面改質後、ECMタンパク質を機能化PDMS表面を覆うように沈着させ、単離されたオルガノイド上皮に導入します。細胞が接着した後、マイクロ流体細胞培養は、細胞が完全な単層を形成するまで上部マイクロチャネルに培地のみを灌流することから開始され、下部マイクロチャネルは静的状態を維持します。この最適化された方法は、表面活性化および ECM コーティングにより、オルガノイド上皮の付着が可能になり、PDMS 表面上で 3D 形態形成を誘導できます。
Transwell 培養でも細胞を播種する前に ECM コーティングが必要ですが、Transwell 培養では多孔質インサートの表面を活性化するための複雑な前処理は必要ありません。Caco-2 細胞を Transwell インサートで増殖させる場合、多孔質インサートを ECM コーティングすると、解離した Caco-2 細胞の接着 (<1 時間) と密着結合バリアの形成 (<1～2 日) が促進されます。オルガノイドを Transwell インサートで培養するには、分離したオルガノイドを ECM コーティングしたインサートに播種し、膜表面に接着させて (<3 時間)、オルガノイドがバリアの完全性を備えた完全な単層を形成するまで維持します。Transwell 培養は、ハイブリッド チップを使用せずに 24 ウェル プレートで行います。
試験管内 3D 形態形成は、確立された上皮層の基底外側面に流体の流れを適用することによって開始できます。チップ上の腸では、培地が上部および下部のマイクロチャネルに灌流されたときに上皮形態形成が始まりました (図 3a)。前述のように、方向性分泌型形態形成阻害剤を継続的に除去するには、下部 (基底外側) コンパートメントに流体の流れを導入することが重要です。多孔質膜に結合した細胞に十分な栄養素と血清を提供し、内腔せん断応力を生成するために、通常、チップ上の腸ではデュアル フローを適用します。ハイブリッド チップでは、上皮単層を含む Transwell インサートをハイブリッド チップに挿入しました。次に、培地をマイクロチャネルを通して多孔質 Transwell インサートの基底外側の下に適用しました。両方の培養プラットフォームで、基底外側フローの開始から 3 ～ 5 日後に腸の形態形成が起こりました。
マイクロエンジニアリングされた3D上皮層の形態学的特徴は、位相差顕微鏡、微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡、SEM、免疫蛍光共焦点顕微鏡など、さまざまなイメージング手法を適用することで分析できます（図3および4）。位相差またはDICイメージングは​​、培養中にいつでも簡単に実行でき、3D上皮層の形状と突出をモニタリングできます。PDMSとポリエステルフィルムは光学的に透明であるため、ガットオンチップとハイブリッドチッププラットフォームはどちらも、デバイスの切断や分解を必要とせずに、リアルタイムのin situイメージングを提供できます。免疫蛍光イメージング（図1、3c、f、および4b、c）を実行する場合、細胞は通常、4％（wt/vol）パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、次にトリトンX-100、2％（wt/vol）ウシ血清アルブミン（BSA）で固定します。細胞の種類に応じて、異なる固定剤、透過化剤、ブロッキング剤などを使用することができます。系統依存細胞または領域マーカーを標的とする一次抗体を使用して、チップ上にin situで固定された細胞をハイライトし、続いて二次抗体とともに、核（例：4',6-ジアミジノ-2-フェニレン）インドール（DAPI）またはF-アクチン（例：蛍光標識ファロイジン）を標的とする対比染色色素を使用します。蛍光ベースのライブイメージングもin situで実行でき、粘液産生（図1、「細胞分化」および「腸管生理学」）、微生物細胞のランダムコロニー形成（図1、「宿主-微生物共培養」）、免疫細胞の動員（図1、「疾患モデリング」）、または3D上皮形態の輪郭（図3c、fおよび4b、c）を検出できます。チップ上の腸を改変して上層と下層のマイクロチャネル層を分離する場合、 ref に記載されているとおりです。図 2 に示すように、3D 上皮形態と頂端刷子縁の微絨毛を SEM で視覚化できます (図 3b)。分化マーカーの発現は、定量 PCR5 または単一細胞 RNA シーケンスを実行することによって評価できます。この場合、腸チップまたはハイブリッド チップで増殖した上皮細胞の 3D 層をトリプシン処理によって収穫し、分子または遺伝子分析に使用します。
a, ハイブリッドチップにおける腸管形態形成誘導のワークフロー。このプロトコルでは、Caco-2と腸管オルガノイドを用いて、ハイブリッドチッププラットフォームにおける3D形態形成を実証します。分離した上皮細胞を、調製済みのTranswellインサート（TW prep、下図参照）に播種しました。細胞をTranswellインサートに播種（seeded）し、ポリエステルメンブレンに接着させた後、すべての細胞を静置条件下で培養しました（TW culture）。7日後、上皮細胞の2D単層を含むTranswellインサート1枚をハイブリッドチップに組み込み、基底外側フロー（Flow、BL）を導入することで、最終的に3D上皮層（morphogenesis）を生成しました。各実験ステップまたは時点における、正常ドナー（C103系統）由来のヒト臓器上皮細胞の形態学的特徴を示す位相差顕微鏡写真。上層の図は、各ステップの実験構成を示しています。b, ハイブリッドチップ（左の図）異なる Z 位置 (上、中、下) で撮影したトップダウンの共焦点顕微鏡画像により、オルガノイド上皮細胞の 3D 形態形成につながる可能性があります (右の概略図と対応する点線を参照)。明らかな形態学的特徴が見られました。F-アクチン (シアン)、核 (灰色)。c、静的 Transwell (TW、白破線ボックス内の挿入図) とハイブリッド チップ (最大フル ショット) で培養されたオルガノイド由来上皮細胞の蛍光共焦点顕微鏡写真 (3D 斜めビュー)。それぞれ 2D と 3D の形態を比較しています。2D 垂直横断ビューのペア (右上隅の挿入図、「XZ」) も 2D と 3D の特徴を示しています。スケール バー、100 µm。c 文献から許可を得て転載。4. Elsevier。
コントロールは、従来の静的培養条件下で同じ細胞（Caco-2 または腸器官上皮細胞）を 2 次元単層に培養することによって準備できます。特に、マイクロチャネルの容量が限られているため（つまり、元の腸チップ設計の上部チャネルで約 4 µL）、栄養素が枯渇する可能性があります。したがって、基底外側流を適用する前と適用した後の上皮形態を比較することもできます。
ソフトリソグラフィープロセスはクリーンルームで実行する必要があります。チップ上の各層（上層と下層および膜）とハイブリッドチップでは、マイクロチャネルの高さが異なるため、異なるフォトマスクが使用され、別々のシリコンウェーハ上に製造されました。チップ上のガットの上部および下部マイクロチャネルの目標高さは、それぞれ 500 µm と 200 µm です。ハイブリッドチップのチャネル目標高さは 200 µm です。
3 インチのシリコン ウェハーをアセトンを入れた皿に置きます。プレートを 30 秒間軽く回転させ、ウェハーを空気乾燥させます。ウェハーを IPA を入れたプレートに移し、プレートを 30 秒間回転させて洗浄します。
ピラニア溶液（過酸化水素と濃硫酸の混合液、1:3（vol/vol））をオプションで使用して、シリコン ウェーハ表面から有機残留物を最大限に除去することもできます。
ピラニア溶液は極めて腐食性が強く、熱を発生します。追加の安全対策が必要です。廃棄物を処分する場合は、溶液を冷ましてから、清潔で乾燥した廃棄物容器に移してください。二次容器を使用し、廃棄物容器には適切なラベルを付けてください。詳細な手順については、施設の安全ガイドラインに従ってください。
ウェーハを 200 °C のホットプレート上に 10 分間置いて脱水します。脱水後、ウェーハを空気中で 5 回振って冷却します。
洗浄したシリコン ウェーハの中央にフォトレジスト SU-8 2100 を約 10 g 注ぎます。ピンセットを使用して、フォトレジストをウェーハ上に均等に広げます。フォトレジストの粘着性を低下させて広げやすくするために、時々ウェーハを 65°C のホット プレート上に置いてください。ウェーハをホット プレート上に直接置かないでください。
スピンコーティングを実行することで、SU-8 がウェーハ上に均一に分散されました。SU-8 の入ってくる回転を 5～10 秒間プログラムし、100 rpm/s の加速度で 500 rpm で伝播させます。メインスピンを 1,500 rpm で 200 µm の厚さのパターンにするか、または 1,200 rpm で 30 秒間、300 rpm/s の加速度に設定して 250 µm の厚さを実現します (チップ上のガットの上層の高さは 500 µm になります。以下の「重要な手順」を参照してください)。
メインスピン速度は、シリコン ウェーハ上の SU-8 パターンの目標厚さに応じて調整できます。
チップ上のガットの上部層に高さ 500 µm の SU-8 パターンを製造するために、このボックスのスピン コーティングとソフト ベイクの手順 (手順 7 と 8) を順番に繰り返し (手順 9 を参照)、厚さ 250 µm の SU-8 の層を 2 つ生成しました。この層は、このボックスの手順 12 で UV 露光によって重ね合わせて結合し、高さ 500 µm の層を作ることができます。
SU-8 でコーティングしたウェーハを、65 °C のホット プレート上に慎重に置き、5 分間ソフトベークします。その後、設定を 95 °C に切り替え、さらに 40 分間インキュベートします。
上部マイクロチャネルの SU-8 パターンの高さを 500 μm にするには、手順 7 と 8 を繰り返して、厚さ 250 μm の SU-8 層を 2 つ生成します。
UV マスク アライナーを使用して、製造元の指示に従ってランプ テストを実行し、ウェーハの露光時間を計算します。(露光時間、ms) = (露光量、mJ/cm2)/(ランプ電力、mW/cm2)。
露光時間を決定した後、UVマスクアライナーのマスクホルダーにフォトマスクを置き、SU-8コーティングされたウェーハにフォトマスクを配置します。
UV分散を最小限に抑えるために、フォトマスクの印刷面をシリコンウェーハのSU-8コーティング面に直接置きます。
SU-8 でコーティングされたウェーハとフォトマスクを、所定の露光時間にわたって 260 mJ/cm2 の UV 光に垂直に露光します (このボックスの手順 10 を参照)。
UV照射後、SU-8コーティングしたシリコンウェーハを各ホットプレート上で65°Cで5分間、95°Cで15分間焼成し、高さ200μmのパターンを作製しました。95°Cでのポストベーク時間を30分に延長して、高さ500μmのパターンを作製しました。
現像液をガラス皿に注ぎ、焼き上がったウェハーをその中に置きます。SU-8 現像液の量は、ガラス板のサイズによって異なります。露光されていない SU-8 を完全に除去するのに十分な量の SU-8 現像液を使用してください。たとえば、直径 150 mm、容量 1 L のガラス皿を使用する場合は、約 300 mL の SU-8 現像液を使用します。時々ゆっくりと回転させながら、型を 25 分間現像します。
現像した型を約 10 mL の新しい現像液ですすぎ、続いてピペットを使用して溶液をスプレーして IPA で洗い流します。
ウェーハをプラズマクリーナーに入れ、酸素プラズマ（大気ガス、ターゲット圧力1×10−5 Torr、電力125 W）に1.5分間さらします。
スライドガラスを入れた真空デシケーターにウェハーを入れます。ウェハーとスライドは並べて置くことができます。真空デシケーターがプレートで複数層に分かれている場合は、スライドを下のチャンバーに、ウェハーを上のチャンバーに置きます。トリクロロ(1H, 1H, 2H, 2H-パーフルオロオクチル)シラン溶液100μLをスライドガラスに滴下し、真空にしてシラン化します。
凍結した Caco-2 細胞のバイアルを 37°C のウォーターバスで解凍し、解凍した細胞を 37°C に予熱した Caco-2 培地 15 mL が入った T75 フラスコに移します。
Caco-2 細胞を約 90% の集密度で継代するには、まず Caco-2 培地、PBS、および 0.25% トリプシン/1 mM EDTA を 37°C のウォーターバスで温めます。
真空吸引で培地を吸引します。真空吸引を繰り返し、新鮮な PBS を加えて、細胞を 5 mL の温かい PBS で 2 回洗浄します。