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微生物寄生虫の進化には、寄生虫の改良を促す自然選択と、寄生虫の遺伝子喪失および有害突然変異の蓄積を促す遺伝的浮動との間の拮抗作用が関与している。本研究では、この拮抗作用が単一高分子レベルでどのように起こるのかを理解するために、自然界で最も小さいゲノムの一つを持つ真核生物であるエンセファリトゾーン・クニクリのリボソームのクライオ電子顕微鏡構造を解析した。E. cuniculiリボソームにおけるrRNAの極端な減少は、これまで知られていなかった融合rRNAリンカーやバルジのないrRNAの進化など、前例のない構造変化を伴っている。さらに、E. cuniculiリボソームは、分解されたrRNA断片およびタンパク質の構造模倣として小分子を使用する能力を発達させることで、rRNA断片およびタンパク質の喪失を生き延びた。全体として、長い間縮小、退化し、衰弱性突然変異を起こしやすいと考えられてきた分子構造には、極端な分子収縮にもかかわらず、分子構造を活性に保ついくつかの補償メカニズムがあることを示しています。
微生物寄生虫のほとんどのグループは、宿主を利用するための独自の分子ツールを備えているため、寄生虫のグループごとに異なる治療法を開発する必要があることがよくあります1,2。しかし、新たな証拠は、寄生虫の進化のいくつかの側面が収束的であり、概ね予測可能であることを示唆しており、微生物寄生虫に対する幅広い治療介入の潜在的な基盤を示唆しています3,4,5,6,7,8,9。
これまでの研究で、微生物寄生虫にはゲノム縮小またはゲノム崩壊と呼ばれる共通の進化の傾向があることが明らかになっています10,11,12,13。現在の研究では、微生物が自由生活様式を放棄して細胞内寄生虫（または細胞内共生生物）になると、そのゲノムは数百万年をかけてゆっくりと、しかし驚くべき変態を起こすことが示されています9,11。ゲノム崩壊として知られるプロセスでは、微生物寄生虫は有害な突然変異を蓄積し、以前は重要だった多くの遺伝子を疑似遺伝子に変え、徐々に遺伝子の喪失と突然変異の崩壊を引き起こします14,15。この崩壊により、近縁の自由生活種と比較して、最も古い細胞内生物の遺伝子の最大95％が破壊される可能性があります。したがって、細胞内寄生虫の進化は、寄生虫の改良につながるダーウィンの自然選択と、寄生虫を忘却の彼方へと追いやるゲノムの崩壊という、2つの相反する力の綱引きとなっています。寄生虫がどのようにしてこの綱引きから抜け出し、その分子構造の活性を維持できたのかは、依然として不明である。
ゲノム崩壊のメカニズムは完全には解明されていないものの、主に頻繁な遺伝的浮動によって起こると考えられています。寄生虫は小規模で無性生殖を行い、遺伝的に限られた集団で生息するため、DNA複製中に時折発生する有害変異を効果的に排除することができません。これは有害変異の不可逆的な蓄積と寄生虫ゲノムの縮小につながります。その結果、寄生虫は細胞内環境での生存に不要になった遺伝子を失うだけでなく、寄生虫集団が散発的な有害変異を効果的に排除できないことで、これらの変異がゲノム全体に蓄積し、最も重要な遺伝子も含め、深刻な問題を引き起こします。
ゲノム縮小に関する現在の理解の多くは、ゲノム配列の比較のみに基づいており、ハウスキーピング機能を持ち、潜在的な薬剤ターゲットとなる実際の分子の変化についてはあまり考慮されていません。比較研究により、有害な細胞内微生物変異の負担により、タンパク質や核酸が誤って折り畳まれて凝集しやすくなり、シャペロン依存が高まり、熱に対して過敏になる傾向があることが示されています19,20,21,22,23。さらに、さまざまな寄生虫（時には25億年も離れた独立した進化を遂げた）が、タンパク質合成5,6とDNA修復メカニズム24における品質管理センターの同様の喪失を経験しました。しかし、有害変異の負担の増加に対する分子適応など、細胞内ライフスタイルが細胞高分子の他のすべての特性に与える影響についてはほとんどわかっていません。
本研究では、細胞内微生物のタンパク質と核酸の進化をより深く理解するため、細胞内寄生生物であるエンセファリトゾーン・クニクリのリボソーム構造を決定しました。エンセファリトゾーン・クニクリは真菌様生物で、寄生性微胞子虫群に属します。微胞子虫群は真核生物ゲノムが非常に小さいため、ゲノム崩壊の研究におけるモデル生物として用いられています25,26,27,28,29,30。最近、微胞子虫、パラノセマ・ロクスタエ、およびヴァイリモルファ・ネカトリクス31,32の中程度に縮小したゲノム（約3.2 Mbゲノム）のクライオ電子顕微鏡（クライオEM）リボソーム構造が決定されました。これらの構造は、rRNA増幅の損失の一部が、隣接するリボソームタンパク質間の新たな接触の発生、または新しいmsL1リボソームタンパク質の獲得によって補われていることを示唆しています31,32。エンセファリトゾーン（ゲノム約250万bp）は、近縁種のオルドスポラとともに、真核生物におけるゲノム縮小の究極的なレベルを示す。タンパク質コード遺伝子数は2000未満であり、リボソームにはrRNA拡張フラグメント（真核生物のリボソームと細菌のリボソームを区別するrRNAフラグメント）が存在しないだけでなく、E. cuniculiゲノムに相同遺伝子がないため、4つのリボソームタンパク質が存在すると予想される26,27,28。したがって、E. cuniculiのリボソームは、ゲノム減少に対するこれまで知られていなかった分子適応戦略を明らかにする可能性があると結論付けた。
我々のクライオ電子顕微鏡（クライオEM）構造は、真核生物の細胞質リボソームとして特徴付けられる最小のものであり、ゲノム縮小の度合いが細胞に不可欠な分子機構の構造、集合、そして進化にどのような影響を与えるかについての知見を提供する。E. cuniculiのリボソームは、RNAのフォールディングとリボソーム集合において広く保存されている原理の多くに違反していることを発見し、これまで知られていなかった新たなリボソームタンパク質を発見した。全く予想外であったが、微胞子虫リボソームは小分子に結合する能力を進化させてきたことを示し、rRNAとタンパク質の切断が進化的革新を引き起こし、最終的にリボソームに有用な特性を付与する可能性があるという仮説を立てた。
細胞内生物におけるタンパク質と核酸の進化についての理解を深めるため、感染した哺乳類細胞の培養物から E. cuniculi の胞子を分離し、リボソームを精製して構造を決定することにしました。寄生性微胞子虫は栄養培地で培養できないため、大量に入手することは困難です。代わりに、宿主細胞内でのみ成長し、繁殖します。そのため、リボソーム精製用の E. cuniculi バイオマスを得るために、哺乳類腎臓細胞株 RK13 に E. cuniculi の胞子を感染させ、これらの感染細胞を数週間培養して E. cuniculi が成長し、増殖できるようにしました。約 0.5 平方メートルの感染細胞単層を使用して、約 300 mg の微胞子虫胞子を精製し、それを使用してリボソームを単離することができました。精製した胞子をガラスビーズで破砕し、得られた溶解液を段階的にポリエチレングリコールで分画して粗リボソームを単離した。これにより、構造解析に用いるE. cuniculiの生リボソーム約300µgを得ることができた。
得られたリボソームサンプルを用いてクライオ電子顕微鏡像を収集し、大リボソームサブユニット、小サブユニットヘッド、小サブユニットに対応するマスクを用いてこれらの画像を処理しました。この過程で、約108,000個のリボソーム粒子の画像を収集し、2.7Åの分解能でクライオ電子顕微鏡像を計算しました（補足図1-3）。次に、クライオ電子顕微鏡像を用いて、E. cuniculiのリボソームに関連するrRNA、リボソームタンパク質、および冬眠因子Mdf1をモデル化しました（図1a、b）。
a 冬眠因子Mdf1（pdb id 7QEP）と複合体を形成したE. cuniculiリボソームの構造。b E. cuniculiリボソームと会合した冬眠因子Mdf1のマップ。c 微胞子虫種から回収されたrRNAを既知のリボソーム構造と比較した二次構造マップ。図は、増幅されたrRNA断片（ES）と、デコード部位（DC）、サルシニシンループ（SRL）、ペプチジルトランスフェラーゼセンター（PTC）を含むリボソーム活性部位の位置を示している。d E. cuniculiリボソームのペプチジルトランスフェラーゼセンターに対応する電子密度は、この触媒部位がE. cuniculi寄生虫とその宿主（H. sapiensを含む）において同じ構造を持つことを示唆している。 e, f デコード中心の対応する電子密度（e）とデコード中心の模式構造（f）は、E. cuniculiが他の多くの真核生物のA1491（大腸菌の番号）ではなくU1491残基を持つことを示している。この変化は、E. cuniculiがこの活性部位を標的とする抗生物質に感受性を示す可能性を示唆している。
これまでに確立されたV. necatrixおよびP. locustaeのリボソーム構造（両構造とも同じ微胞子虫科ノセマチダエ属に属し、非常に類似している）とは対照的に31,32、E. cuniculiのリボソームは、rRNAおよびタンパク質の断片化とさらなる変性という多数のプロセスを経ている（補足図4～6）。rRNAにおいて最も顕著な変化は、増幅された25S rRNA断片ES12Lの完全な消失と、h39、h41、およびH18ヘリックスの部分的な変性であった（図1c、補足図4）。リボソームタンパク質の中で最も顕著な変化は、eS30 タンパク質の完全な消失と、eL8、eL13、eL18、eL22、eL29、eL40、uS3、uS9、uS14、uS17、eS7 タンパク質の短縮でした (補足図 4、5)。
このように、エンセファロトゾーン/オルドスポラ属におけるゲノムの極端な減少は、そのリボソーム構造に反映されています。E. cuniculiのリボソームは、構造解析の対象となる真核生物の細胞質リボソームの中で最も劇的なタンパク質含量の減少を示しており、真核生物だけでなく生命の3つのドメインにおいて広く保存されているrRNAやタンパク質断片さえも存在しません。E. cuniculiのリボソーム構造は、これらの変化の初めての分子モデルを提供し、比較ゲノミクスと細胞内生体分子構造の研究の両方で見過ごされてきた進化的イベントを明らかにしています（補足図7）。以下では、これらのイベントのそれぞれについて、その進化的起源とリボソーム機能への潜在的な影響とともに説明します。
その結果、E. cuniculiのリボソームは、大きなrRNA切断に加えて、活性部位の1つにrRNA変異を有することを発見しました。E. cuniculiのリボソームのペプチジルトランスフェラーゼ中心は他の真核生物のリボソームと同じ構造（図1d）ですが、解読中心はヌクレオチド1491（大腸菌の番号、図1e、f）の配列変異により異なります。真核生物のリボソームの解読部位は、細菌型リボソームのA1408とG1491残基に対して、典型的にはG1408とA1491残基を含むため、この観察結果は重要です。この変異は、解読部位を標的とするアミノグリコシド系リボソーム抗生物質やその他の低分子に対する細菌と真核生物のリボソームの感受性の違いの根底にあります。 E. cuniculiのリボソーム解読部位において、残基A1491がU1491に置換されており、この活性部位を標的とする小分子との特異的な結合界面が形成される可能性がある。同じA14901変異体はP. locustaeやV. necatrixなどの他の微胞子虫にも存在しており、この変異体が微胞子虫種全体に広く分布していることを示唆している（図1f）。
E. cuniculiのリボソームサンプルは代謝的に不活性な胞子から単離されたため、ストレスまたは飢餓条件下でのE. cuniculiのクライオ電子顕微鏡（クライオEM）マップを用いて、これまでに報告されているリボソーム結合様式を検証した。冬眠因子31,32,36,37, 38。冬眠中のリボソームの既知構造を、E. cuniculiリボソームのクライオ電子顕微鏡（クライオEM）マップと照合した。ドッキングには、S. cerevisiaeリボソームは冬眠因子Stm138との複合体、イナゴリボソームはLso232因子との複合体、V. necatrixリボソームはMdf1およびMdf231因子との複合体を用いた。同時に、休止因子Mdf1に対応するクライオ電子顕微鏡（クライオEM）密度を求めた。 Mdf1 が V. necatrix リボソームに結合するのと同様に、Mdf1 は E. cuniculi リボソームにも結合し、リボソームの E サイトをブロックします。これにより、寄生虫の胞子が体の不活性化によって代謝的に不活性になったときにリボソームが利用できるようになると考えられます (図 2)。
Mdf1はリボソームのE部位を阻害し、寄生虫胞子が代謝的に不活性になった際にリボソームの不活性化を助けると考えられています。E. cuniculiのリボソーム構造において、Mdf1がL1リボソームステムとこれまで知られていなかった接触を形成することを発見しました。L1リボソームステムは、タンパク質合成中にリボソームから脱アセチル化tRNAの放出を促進するリボソームの一部です。これらの接触は、Mdf1が脱アセチル化tRNAと同じメカニズムでリボソームから解離することを示唆しており、リボソームがMdf1を除去してタンパク質合成を再活性化する仕組みについて、新たな説明が期待されます。
しかし、私たちの構造解析により、Mdf1とL1リボソームレッグ（タンパク質合成中に脱アシル化tRNAをリボソームから放出する役割を担うリボソーム部位）との間に、未知の接触が存在することが明らかになりました。特に、Mdf1は脱アシル化tRNA分子のエルボーセグメントと同じ接触部位を利用しています（図2）。このこれまで知られていなかった分子モデリングにより、Mdf1が脱アセチル化tRNAと同じメカニズムでリボソームから解離することが示され、リボソームがこの冬眠因子を除去してタンパク質合成を再活性化する仕組みが説明されました。
rRNAモデルを構築した際、E. cuniculiのリボソームには異常に折り畳まれたrRNA断片が存在することを発見しました。これを我々は融合rRNAと呼んでいます（図3）。生命の3つのドメインにまたがるリボソームでは、rRNAはほとんどのrRNA塩基が互いに塩基対を形成して折り畳まれるか、リボソームタンパク質と相互作用する構造に折り畳まれます38,39,40。しかし、E. cuniculiのリボソームでは、rRNAがこの折り畳みの原理に違反し、一部のヘリックスが折り畳まれていないrRNA領域に変換されているようです。
S. cerevisiae、V. necatrix、およびE. cuniculiにおけるH18 25S rRNAヘリックスの構造。通常、3つの生命ドメインにまたがるリボソームでは、このリンカーは24～34残基からなるRNAヘリックスに巻き付く。一方、微胞子虫では、このrRNAリンカーは徐々に縮減し、わずか12残基からなる2つのウリジンに富む一本鎖リンカーとなる。これらの残基のほとんどは溶媒に曝露されている。この図は、寄生性微胞子虫が、rRNA塩基が通常他の塩基と結合するか、rRNA-タンパク質相互作用に関与するというrRNAフォールディングの一般原則に反しているように見えることを示している。微胞子虫では、一部のrRNA断片が好ましくないフォールディングを受け、以前のrRNAヘリックスがほぼ直線状に伸長した一本鎖断片となる。これらの異常な領域の存在により、微胞子虫 rRNA は最小限の数の RNA 塩基を使用して遠く離れた rRNA 断片に結合することができます。
この進化的変遷の最も顕著な例は、H18 25S rRNAヘリックスに観察されます（図3）。大腸菌からヒトに至るまでの種において、このrRNAヘリックスの塩基は24～32ヌクレオチドで構成され、やや不規則なヘリックスを形成しています。これまでに同定されたV. necatrixおよびP. locustaeのリボソーム構造31,32では、H18ヘリックスの塩基は部分的に解けていますが、ヌクレオチド塩基対は保存されています。しかし、E. cuniculiでは、このrRNA断片は最短のリンカー228UUUGU232および301UUUUUUUUU307となります。典型的なrRNA断片とは異なり、これらのウリジンに富むリンカーはコイル状になったり、リボソームタンパク質と広範囲に接触したりすることはありません。その代わりに、溶媒に開放された完全に折り畳まれていない構造をとり、rRNA鎖はほぼ真っ直ぐに伸びています。この伸張した構造により、E. cuniculi は H16 rRNA ヘリックスと H18 rRNA ヘリックスの間の 33 Å のギャップを埋めるために 12 個の RNA 塩基しか使用しないのに対し、他の種ではギャップを埋めるために少なくとも 2 倍の rRNA 塩基が必要となることが説明されます。
このように、寄生性微胞子虫は、エネルギー的に不利な折り畳み構造を通じて、生命の3つのドメインにおいて種を超えて広く保存されているrRNAセグメントでさえも縮小する戦略を発達させてきたことが実証されました。明らかに、rRNAヘリックスを短いポリUリンカーに変換する変異を蓄積することで、E. cuniculiは、末端のrRNA断片との連結に必要となるヌクレオチド数を可能な限り少なくした、特異なrRNA断片を形成できるのです。これは、微胞子虫が構造的・機能的完全性を失うことなく、基本的な分子構造を劇的に縮小できた理由を説明するのに役立ちます。
E. cuniculi rRNAのもう一つの珍しい特徴は、rRNAが肥厚していないように見えることです（図4）。隆起部は塩基対を持たないヌクレオチドで、RNAヘリックスの中に隠れるのではなく、ねじれて外側に伸びています。rRNAの隆起部のほとんどは分子接着剤として機能し、隣接するリボソームタンパク質や他のrRNA断片との結合を助けます。隆起部の一部はヒンジとして機能し、rRNAヘリックスが最適な屈曲と折り畳みを行い、生産的なタンパク質合成を可能にします41。
a rRNA突起（S. cerevisiaeの番号）はE. cuniculiのリボソーム構造には存在しないが、他のほとんどの真核生物には存在する。b E. coli、S. cerevisiae、H. sapiens、およびE. cuniculiの内部リボソーム。寄生虫は、古くから高度に保存されているrRNA隆起の多くを欠いている。これらの隆起はリボソーム構造を安定化させるため、微胞子虫にrRNA隆起が存在しないことは、微胞子虫寄生虫におけるrRNAの折り畳みの安定性が低下していることを示している。Pステム（細菌のL7/L12ステム）との比較により、rRNA隆起の消失は、消失した隆起の隣に新たな隆起が出現する時期と一致する場合があることが示される。 23S/28S rRNAのH42ヘリックスには、3つの生命ドメインで保護されているため、少なくとも35億年前から存在すると推定される古代のバルジ（サッカロミセス・セレビシエではU1206）が存在する。微胞子虫ではこのバルジは消失するが、失われたバルジの隣に新たなバルジ（E. cuniculiではA1306）が出現した。
驚くべきことに、E. cuniculiのリボソームは、他の種に見られるrRNAバルジの大部分を欠いており、その中には他の真核生物で保存されている30以上のバルジも含まれています（図4a）。この欠失により、リボソームサブユニットと隣接するrRNAヘリックス間の多くの接触が失われ、リボソーム内に大きな空洞が形成されることがあります。そのため、E. cuniculiのリボソームは、従来のリボソームと比較してより多孔質になっています（図4b）。特筆すべきことに、これらのバルジの大部分は、以前に同定されたV. necatrixおよびP. locustaeのリボソーム構造においても失われており、これまでの構造解析では見落とされていました31,32。
rRNAバルジの消失は、失われたバルジに隣接して新たなバルジの形成を伴う場合がある。例えば、リボソームPステムにはU1208バルジ（サッカロミセス・セレビシエ）が含まれており、これは大腸菌からヒトまで生き残り、35億年前から存在していると推定されている。タンパク質合成において、このバルジはPステムが開いた構造と閉じた構造の間を移動することを助け、リボソームが翻訳因子をリクルートして活性部位へ送達できるようにする。E. cuniculiのリボソームにはこの肥厚は見られないが、わずか3塩基対に位置する新たな肥厚（G883）がPステムの最適な柔軟性の回復に寄与する可能性がある（図4c）。
隆起のない rRNA に関する我々のデータは、rRNA の最小化がリボソームの表面上の rRNA 要素の損失に限定されず、リボソーム核も関与し、自由生活細胞では説明されていない寄生虫特有の分子欠陥を生み出す可能性があることを示唆しています。生きている種が観察されています。
標準的なリボソームタンパク質とrRNAをモデル化した結果、従来のリボソーム構成要素ではクライオ電子顕微鏡像の3つの部分を説明できないことがわかった。これらの断片のうち2つは、小分子である（図5、補足図8）。最初のセグメントは、リボソームタンパク質uL15とeL18に挟まれており、通常はeL18のC末端が占める位置にあるが、E. cuniculiでは短縮されている。この分子の正体を特定することはできませんが、この密度島の大きさと形状は、スペルミジン分子の存在によって十分に説明できます。リボソームへの結合は、uL15タンパク質（Asp51およびArg56）の微胞子虫特異的変異によって安定化されており、これらの変異により、uL15がこの小分子をリボソーム構造に包み込むことができるため、リボソームとこの小分子の親和性が高まると考えられます。（補足図2）。8、追加データ1、2）。
E. cuniculiのリボソームに結合したリボース外側のヌクレオチドの存在を示すクライオ電子顕微鏡画像。E. cuniculiのリボソームにおいて、このヌクレオチドは、他のほとんどの真核生物リボソームにおける25S rRNAのA3186ヌクレオチド（サッカロミセス・セレビシエの番号）と同じ位置を占めている。b E. cuniculiのリボソーム構造において、このヌクレオチドはリボソームタンパク質uL9とeL20の間に位置し、両タンパク質間の接触を安定化させている。cd 微胞子虫種におけるeL20配列の保存性解析。微胞子虫種の系統樹 (c) と eL20 タンパク質の多重配列アライメント (d) から、ヌクレオチド結合残基 F170 と K172 が、S. lophii を除き、また ES39L rRNA 延長部を保持していた初期分岐微胞子虫を除くほとんどの典型的な微胞子虫で保存されていることが分かります。e この図は、ヌクレオチド結合残基 F170 と K172 が、高度に縮小した微胞子虫ゲノムの eL20 にのみ存在し、他の真核生物には存在しないことを示しています。全体として、これらのデータは、微胞子虫リボソームがヌクレオチド結合部位を発達させており、これが AMP 分子に結合してリボソーム構造内のタンパク質間相互作用を安定化するのに使用されていることを示唆しています。微胞子虫でこの結合部位が高く保存されており、他の真核生物には存在しないことから、この部位は微胞子虫に選択的な生存上の利点をもたらす可能性があることが示唆されます。したがって、微胞子虫リボソームのヌクレオチド結合ポケットは、これまで述べられたような退化した特徴やrRNA分解の最終形態ではなく、むしろ微胞子虫リボソームが小分子を直接結合し、それらを分子構成要素として利用することを可能にする有用な進化的革新であると考えられます。リボソームの構成要素。この発見により、微胞子虫リボソームは、単一のヌクレオチドを構造構成要素として利用する唯一のリボソームとなりました。f ヌクレオチド結合から導かれた仮説的な進化経路。
2つ目の低分子量密度は、リボソームタンパク質uL9とeL30の界面に位置している（図5a）。この界面は、以前、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）リボソームの構造において、rRNA A3186（ES39L rRNA伸長鎖の一部）の25Sヌクレオチドの結合部位として記載されていた38。縮重したP. locustae ES39Lリボソームでは、この界面に未知の単一ヌクレオチド31が結合することが示されており、このヌクレオチドはrRNAの長さが約130～230塩基であるrRNAの縮小最終形態であると推定されている。ES39Lは単一ヌクレオチド32.43に縮小されている。我々のクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）画像は、密度がヌクレオチドによって説明できるという考えを支持している。しかし、我々の構造の高解像度により、このヌクレオチドはリボソーム外分子、おそらくAMPであることが示された（図5a、b）。
次に、E. cuniculiのリボソームにヌクレオチド結合部位が新たに出現したのか、それとも以前から存在していたのかを調べた。ヌクレオチド結合は主にeL30リボソームタンパク質中のPhe170およびLys172残基によって媒介されるため、4396種の代表的な真核生物におけるこれらの残基の保存性を評価しました。上記のuL15の場合と同様に、Phe170およびLys172残基は典型的な微胞子虫類においてのみ高度に保存されており、ES39L rRNA断片が還元されない非定型微胞子虫類であるミトスポリジウムやアンフィアムブリスなどの他の真核生物では保存されていないことがわかった44, 45, 46（図5c-e）。
これらのデータを総合すると、E. cuniculi、そしておそらく他の典型的な微胞子虫が、rRNAとタンパク質レベルの低下を補うために、リボソーム構造内に多数の小さな代謝物を効率的に捕捉する能力を進化させたという考えを支持する。その過程で、リボソーム外でヌクレオチドに結合する独自の能力を発達させており、寄生性の分子構造が豊富な小さな代謝物を捕捉し、それらを分解されたRNAとタンパク質断片の構造模倣物として利用することで、その低下を補っていることを示している。
我々のクライオ電子顕微鏡写真マップの3番目の未シミュレーション部分は、大きなリボソームサブユニットで見つかった。我々のマップの比較的高い解像度（2.6Å）は、この密度が大きな側鎖残基のユニークな組み合わせを持つタンパク質に属することを示唆しており、これにより、我々はこの密度をこれまで知られていなかったリボソームタンパク質であると特定し、msL2（微胞子虫特異的タンパク質L2）と名付けた（方法、図6）。我々の相同性検索により、msL2はエンセファリター属およびオロスポリジウム属の微胞子虫クレードでは保存されているが、他の微胞子虫を含む他の種には存在しないことが分かった。リボソーム構造において、msL2は、伸長したES31L rRNAの喪失によって形成されたギャップを占める。この空隙において、msL2はrRNAの折り畳みを安定化させ、ES31Lの喪失を補うことができる（図6）。
a E. cuniculiリボソーム中に見られる微胞子虫特異的リボソームタンパク質msL2の電子密度とモデル。b Saccharomyces cerevisiaeの80Sリボソームを含むほとんどの真核生物リボソームでは、ほとんどの微胞子虫種においてES19L rRNA増幅が失われている。V. necatrix微胞子虫リボソームの既に確立された構造は、これらの寄生虫におけるES19Lの喪失が、新しいmsL1リボソームタンパク質の進化によって補われていることを示唆している。本研究では、E. cuniculiリボソームがES19Lの喪失を補うため、追加のリボソームRNA模倣タンパク質も発達させていることを明らかにした。しかし、msL2（現在、仮説上のECU06_1135タンパク質としてアノテーションされている）とmsL1は、構造的にも進化的にも異なる起源を持つ。 c 進化的に無関係なmsL1およびmsL2リボソームタンパク質の生成に関する今回の発見は、リボソームがrRNAに有害な変異を蓄積すると、たとえ近縁種のごく一部においてさえ、前例のないレベルの組成多様性を達成できることを示唆しています。この発見は、rRNAの大幅な減少と種間でのタンパク質組成の異常な変動で知られるミトコンドリアリボソームの起源と進化の解明に役立つ可能性があります。
次に、msL2タンパク質を、V. necatrixリボソーム中に見られる唯一の既知の微胞子虫特異的リボソームタンパク質である、既報のmsL1タンパク質と比較しました。msL1とmsL2が進化的に関連しているかどうかを検証したかったのです。解析の結果、msL1とmsL2はリボソーム構造において同じ空洞を占めているものの、一次構造と三次構造が異なり、独立した進化起源であることが示されました（図6）。つまり、msL2の発見は、コンパクトな真核生物種群が、rRNA断片の喪失を補うために、構造的に異なるリボソームタンパク質を独立して進化させることができるという証拠となります。この発見は、ほとんどの細胞質真核生物リボソームに、同じ81種類のリボソームタンパク質ファミリーを含む不変タンパク質が含まれているという点で注目に値します。拡張された rRNA セグメントの損失に応じて微胞子虫のさまざまな系統に msL1 と msL2 が出現したことは、寄生虫の分子構造の劣化によって寄生虫が補償的突然変異を求め、最終的に異なる寄生虫集団でそれらの構造を獲得する可能性があることを示唆しています。
最後に、モデルが完成したとき、私たちは E. cuniculi のリボソームの構成をゲノム配列から予測されるものと比較しました。eL14、eL38、eL41、eS30 を含むいくつかのリボソームタンパク質は、E. cuniculi ゲノムに相同タンパク質が明らかに存在しないため、これまで E. cuniculi ゲノムには存在しないと考えられていました。他のほとんどの高度に減少した細胞内寄生虫や細胞内共生生物でも、多くのリボソームタンパク質の喪失が予測されています。たとえば、ほとんどの自由生活細菌は同じ 54 種類のリボソームタンパク質ファミリーを含んでいますが、解析した宿主制限細菌の各ゲノムで相同タンパク質が検出されるタンパク質ファミリーは、これらのうち 11 種類だけです。この考えを裏付けるように、eL38 および eL41 タンパク質を欠く V. necatrix および P. locustae の微胞子虫で、リボソームタンパク質の喪失が実験的に観察されています31,32。
しかし、我々の構造は、E. cuniculi リボソームでは実際に eL38、eL41、eS30 のみが失われていることを示している。eL14 タンパク質は保存されており、我々の構造は、このタンパク質が相同性検索で見つからなかった理由を示している (図 7)。E. cuniculi リボソームでは、rRNA 増幅された ES39L の分解により、eL14 結合部位の大部分が失われている。ES39L が存在しない場合、eL14 は二次構造の大部分を失い、E. cuniculi と S. cerevisiae で同一であった eL14 配列はわずか 18% であった。この配列保存性の低さは注目に値する。なぜなら、15 億年も進化の過程を隔てた生物である Saccharomyces cerevisiae と Homo sapiens ですら、eL14 の残基の 51% 以上を共有しているからである。この異常な保存性の喪失により、E. cuniculi eL14 が現在、eL1427 リボソームタンパク質ではなく推定 M970_061160 タンパク質として注釈付けされている理由が説明されます。
そして、微胞子虫リボソームはES39L rRNA伸長部を失い、これによりeL14リボソームタンパク質結合部位が部分的に除去された。ES39Lがない場合、eL14微胞子タンパク質は二次構造が失われ、以前のrRNA結合αヘリックスが最短長のループに退化する。b 多重配列アライメントにより、eL14タンパク質は真核生物種で高度に保存されている（酵母とヒトホモログ間で57%の配列同一性）が、微胞子虫では保存性が低く、多様性に富んでいる（eL14ホモログと同一の残基は24%以下）ことがわかる。S. cerevisiaeまたはH. sapiens由来）。この配列保存性の低さと二次構造の多様性により、eL14ホモログがE. cuniculiでこれまで一度も見つからず、E. cuniculiで失われたと考えられている理由が説明される。対照的に、E. cuniculi eL14は以前、M970_061160タンパク質と推定されるアノテーションが付けられていました。この観察結果は、微胞子虫ゲノムの多様性が現在過大評価されていることを示唆しています。微胞子虫では失われていると考えられている遺伝子の中には、高度に分化した形ではあるものの、実際には保存されているものも存在します。実際、微胞子虫特有のタンパク質をコードする遺伝子（例えば、仮説上のタンパク質M970_061160）は、実際には他の真核生物に見られる非常に多様なタンパク質をコードしていると考えられます。
この発見は、rRNAの変性が隣接するリボソームタンパク質の配列保存性の劇的な喪失につながり、これらのタンパク質が相同性検索で検出できなくなることを示唆しています。したがって、失われたと考えられていたタンパク質の中には、大きく変化した形ではあるものの、実際には残存しているものもあるため、小型ゲノム生物における分子分解の実際の程度を過大評価している可能性があります。
寄生虫は、極度のゲノム縮小という条件下で、どのようにして分子機械の機能を維持できるのでしょうか？私たちの研究は、真核生物の中で最も小さなゲノムを持つ生物の一つであるE. cuniculiの複雑な分子構造（リボソーム）を解明することで、この疑問に答えます。
微生物寄生生物のタンパク質分子やRNA分子は、品質管理センターを欠いていたり、自由生活微生物ではサイズが50%に縮小していたり​​するなど、自由生活種の相同分子としばしば異なることが、約20年前から知られています。多くの衰弱性変異によって折り畳みや機能が損なわれます。例えば、多くの細胞内寄生生物や細胞内共生生物を含む小ゲノム生物のリボソームは、自由生活種と比較して、いくつかのリボソームタンパク質と最大3分の1のrRNAヌクレオチドを欠いていると予想されています27, 29, 30, 49。しかし、これらの分子が寄生生物内でどのように機能するかは、主に比較ゲノミクスを通じて研究されているものの、依然として大部分が謎に包まれています。
私たちの研究は、高分子の構造から、細胞内寄生虫やその他の宿主限定生物の従来の比較ゲノム研究では抽出が困難な進化の多くの側面を明らかにできることを示している（補足図7）。例えば、eL14タンパク質の例は、寄生虫種における分子装置の実際の劣化度合いを過大評価しがちなことを示しています。脳炎寄生虫は現在、微胞子虫特異的な遺伝子を数百個も有すると考えられています。しかし、私たちの研究結果は、一見特異的に見えるこれらの遺伝子の一部が、実際には他の真核生物に共通する遺伝子の非常に異なる変異体に過ぎないことを示しています。さらに、msL2タンパク質の例は、私たちがいかにして新しいリボソームタンパク質を見落とし、寄生虫の分子機械の内容を過小評価しているかを示しています。小分子の例は、寄生虫の分子構造における、新たな生物学的活性をもたらす可能性のある最も独創的な革新をいかに見落としているかを示しています。
これらの結果を総合すると、宿主限定生物と自由生活生物の分子構造の違いに関する理解が深まります。これまで長い間、還元され、退化し、様々な衰弱性変異を受けると考えられてきた分子機械が、実際には、体系的に見過ごされてきた一連の異常な構造的特徴を有していることが示されました。
一方、E. cuniculi のリボソームで発見された、かさばらない rRNA 断片と融合断片は、ゲノム縮小によって、ほぼ 35 億年を経ても生命の 3 つのドメインで保存されている基本的な分子機構の一部さえも変化する可能性があることを示唆しています。つまり、種の独立した進化です。
E. cuniculi のリボソーム中のバルジのない rRNA 断片と融合 rRNA 断片は、これまでの共生細菌の RNA 分子の研究を踏まえると特に興味深い。例えば、アブラムシの共生細菌 Buchnera aphidicola では、rRNA と tRNA 分子は A+T 組成の偏りと非標準塩基対の割合が高いために、温度に敏感な構造をとることが示されている20,50。これらの RNA の変化は、タンパク質分子の変化と同様に、共生細菌がパートナーに過度に依存し、熱を伝達できない原因であると考えられている21, 23 。寄生性微胞子虫の rRNA には構造的に明確な変化があるが、これらの変化の性質から、熱安定性の低下とシャペロンタンパク質への依存度の高さは、ゲノムが縮小した生物の RNA 分子に共通する特徴である可能性が示唆される。
一方、我々の構造は、寄生性微胞子虫が広く保存されたrRNAおよびタンパク質断片に抵抗する独自の能力を進化させ、豊富で入手しやすい小さな代謝物を、変性したrRNAおよびタンパク質断片の構造模倣物として利用する能力を発達させてきたことを示しています。分子構造の劣化。この見解は、E. cuniculiのrRNAおよびリボソームにおけるタンパク質断片の損失を補う小分子が、uL15およびeL30タンパク質の微胞子虫特異的残基に結合するという事実によって裏付けられています。これは、小分子のリボソームへの結合が正の選択の産物である可能性を示唆しています。正の選択では、リボソームタンパク質における微胞子虫特異的な変異が、小分子に対するリボソームの親和性を高める能力に基づいて選択され、より効率的なリボソーム生物につながる可能性があります。この発見は、微生物寄生虫の分子構造における賢明な革新を明らかにし、寄生虫の分子構造が還元的進化にもかかわらずどのように機能を維持しているかについての理解を深めます。
現時点では、これらの小分子の同定は未だに進んでいません。微胞子虫種によってリボソーム構造におけるこれらの小分子の出現が異なる理由も不明です。特に、V. necatrixのeL20タンパク質とK172タンパク質にF170残基が存在するにもかかわらず、E. cuniculiとP. locustaeのリボソームではヌクレオチド結合が観察されるのに、V. necatrixのリボソームではヌクレオチド結合が観察されない理由も不明です。この欠失は、ヌクレオチド結合ポケットに隣接する残基43 uL6によって引き起こされる可能性があります。この残基はV. necatrixではチロシンですが、E. cuniculiとP. locustaeではスレオニンではありません。Tyr43の嵩高い芳香族側鎖は、立体的重なりによりヌクレオチド結合を阻害する可能性があります。あるいは、この見かけ上のヌクレオチド欠失は、クライオ電子顕微鏡（CEM）イメージングの解像度が低く、V. necatrixリボソーム断片のモデリングを妨げていることが原因かもしれません。
一方、我々の研究は、ゲノム崩壊のプロセスが発明の力となる可能性を示唆しています。特に、E. cuniculiのリボソーム構造は、微胞子虫リボソームにおけるrRNAとタンパク質断片の喪失が、リボソーム構造の変化を促す進化圧を生み出すことを示唆しています。これらの変異体はリボソームの活性部位から遠く離れた場所に存在し、rRNAの減少によって阻害されるであろう最適なリボソーム構築を維持（または回復）するのに役立つと考えられます。これは、微胞子虫リボソームにおける主要な革新が、遺伝子浮動を緩和する必要性へと進化したことを示唆しています。
おそらく、これはヌクレオチド結合によって最もよく例証されるでしょう。これはこれまで他の生物では観察されていません。ヌクレオチド結合残基が典型的な微胞子虫には存在するのに、他の真核生物には存在しないという事実は、ヌクレオチド結合部位が単に消滅を待つ遺物でも、rRNAが個々のヌクレオチドの形に戻るための最終部位でもないことを示唆しています。むしろ、この部位は複数回の正の選択を経て進化した有用な特徴のように思えます。ヌクレオチド結合部位は自然選択の副産物である可能性があります。ES39Lが分解されると、微胞子虫はES39Lが存在しない状況で最適なリボソーム生合成を回復するために代償を求めざるを得なくなります。このヌクレオチドはES39LのA3186ヌクレオチドの分子接触を模倣できるため、ヌクレオチド分子はリボソームの構成要素となり、eL30配列の変異によってリボソームへの結合がさらに改善されます。
細胞内寄生虫の分子進化に関して、本研究は、ダーウィンの自然選択とゲノム崩壊による遺伝的浮動の力が並行して作用するのではなく、振動的に作用することを示しています。まず、遺伝的浮動は生体分子の重要な特徴を排除するため、補償が切実に必要となります。寄生虫がダーウィンの自然選択によってこの必要性を満たした場合にのみ、その高分子は最も印象的で革新的な形質を発達させる機会を得ます。重要なのは、E. cuniculiのリボソームにおけるヌクレオチド結合部位の進化が、この分子進化における損失から獲得へのパターンが、有害な変異を償却するだけでなく、寄生虫の高分子に全く新しい機能を付与することもあることを示唆している点です。
この考え方は、厳格な自然選択システムが生物の革新能力を制限するという、シーウェル・ライトの移動平衡理論と一致しています51,52,53。しかし、遺伝的浮動が自然選択を阻害すると、それ自体は適応的ではない（または有害でさえない）変化を生み出す可能性がありますが、より高い適応度や新しい生物学的活動をもたらすさらなる変化につながる可能性があります。私たちのフレームワークは、生体分子の折り畳みと機能を低下させるのと同じタイプの突然変異が、その改良の主な引き金となるように見えることを示すことで、この考え方を裏付けています。win-winの進化モデルに沿って、私たちの研究は、従来は退化プロセスと見なされてきたゲノムの減衰も革新の主要な推進力であり、時には、おそらく多くの場合、高分子が新しい寄生活動を獲得することを可能にすることを示しています。それらを利用できます。