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微生物の寄生虫の進化には、寄生虫を改善させる自然選択と、寄生虫に遺伝子を喪失させ、有害な突然変異を蓄積させる遺伝的浮動との間の反作用が含まれます。今回は、この反作用が単一の巨大分子のスケールでどのように起こるかを理解するために、自然界で最も小さなゲノムの 1 つを持つ真核生物であるエンセファリトゾーン クニクリのリボソームのクライオ EM 構造について説明します。E. cuniculi リボソームにおける rRNA の極端な減少は、これまで知られていなかった融合 rRNA リンカーやバルジのない rRNA の進化など、前例のない構造変化を伴います。さらに、E. cuniculi リボソームは、分解された rRNA フラグメントおよびタンパク質の構造模倣として小分子を使用する能力を開発することにより、rRNA フラグメントおよびタンパク質の損失から生き残りました。全体として、我々は、分子構造が減少し、変性し、衰弱性の突然変異を受けやすいと長い間考えられてきたが、極度の分子収縮にもかかわらず活性を維持する多くの代償機構を持っていることを示す。
微生物の寄生虫のほとんどのグループは宿主を利用するための独自の分子ツールを持っているため、多くの場合、異なる寄生虫のグループに対して異なる治療法を開発する必要があります 1,2。しかし、新たな証拠は、寄生虫の進化のいくつかの側面が収束しており、ほぼ予測可能であることを示唆しており、微生物寄生虫に対する広範な治療介入の潜在的な基礎を示しています3、4、5、6、7、8、9。
これまでの研究では、ゲノム減少またはゲノム崩壊と呼ばれる微生物寄生虫の共通の進化傾向が特定されています10、11、12、13。現在の研究では、微生物が自由生活をやめて細胞内寄生生物（または内部共生生物）になると、そのゲノムが数百万年かけてゆっくりではあるが驚くべき変態を起こすことが示されています9,11。ゲノム崩壊として知られるプロセスでは、微生物の寄生虫が有害な突然変異を蓄積し、これにより以前は重要だった多くの遺伝子が偽遺伝子に変わり、徐々に遺伝子が失われ、突然変異が崩壊します 14,15。この崩壊により、密接に関連した自由生活種と比較して、最古の細胞内生物の遺伝子の最大 95% が破壊される可能性があります。したがって、細胞内寄生虫の進化は、2 つの相反する力の間の綱引きです。つまり、寄生虫の改良をもたらすダーウィンの自然選択と、寄生虫を忘却の彼方に追いやるゲノムの崩壊です。この寄生虫がどのようにしてこの綱引きから抜け出し、その分子構造の活動を維持することができたのかはまだ不明である。
ゲノム崩壊のメカニズムは完全には理解されていませんが、主に頻繁な遺伝的浮動によって発生すると考えられています。寄生虫は、小さく、無性で、遺伝的に制限された集団で生息しているため、DNA複製中に時々発生する有害な突然変異を効果的に排除することができません。これは、有害な突然変異の不可逆的な蓄積と寄生虫ゲノムの減少につながります。その結果、寄生虫は細胞内環境での生存に必要なくなった遺伝子を失うだけではありません。寄生虫集団が散発的な有害な突然変異を効果的に除去できないため、最も重要な遺伝子を含むゲノム全体にこれらの突然変異が蓄積します。
ゲノム縮小に関する現在の理解の多くは、ゲノム配列の比較のみに基づいており、ハウスキーピング機能を実行し、潜在的な薬物標的として機能する実際の分子の変化にはあまり注意が払われていません。比較研究では、細胞内微生物の有害な突然変異の負担により、タンパク質や核酸がミスフォールディングや凝集を起こしやすくなり、シャペロン依存性が高まり、熱に対して過敏になることが示されています19,20,21,22,23。さらに、さまざまな寄生虫（独立した進化は 25 億年も離れていることもあります）でも、タンパク質合成 5,6 と DNA 修復機構 24 の品質管理中枢が同様に喪失しました。しかし、有害な突然変異の増加に対する分子の適応など、細胞内ライフスタイルが細胞高分子の他のすべての特性に及ぼす影響についてはほとんど知られていない。
この研究では、細胞内微生物のタンパク質と核酸の進化をより深く理解するために、細胞内寄生虫であるエンセファリトゾーン・クニクリのリボソームの構造を決定しました。E. cuniculi は、異常に小さい真核生物のゲノムを持つ寄生性微胞子虫のグループに属する真菌様生物であり、そのためゲノム崩壊を研究するためのモデル生物として使用されます 25、26、27、28、29、30。最近、Microsporidia、Paranosema locustae、および Vairimorpha necatrix の中程度に縮小したゲノム (約 3.2 Mb ゲノム) のクライオ EM リボソーム構造が決定されました。これらの構造は、rRNA 増幅の損失の一部が、隣接するリボソームタンパク質間の新たな接触の発達または新しい msL131,32 リボソームタンパク質の獲得によって補われることを示唆しています。エンセファリトゾーン種（ゲノム約250万塩基対）は、最も近い近縁種のオルドスポラとともに、真核生物におけるゲノムの究極的な縮小を示している。それらのタンパク質をコードする遺伝子の数は2000未満であり、それらのリボソームにはrRNA伸長フラグメント（真核生物のリボソームと細菌のリボソームを区別するrRNAフラグメント）が欠如しているだけでなく、hoが欠如しているために4つのリボソームタンパク質も存在すると予想されている。 E. cuniculi ゲノムのモローグ 26、27、28。したがって、我々は、E. cuniculi リボソームは、ゲノム崩壊に対する分子適応のためのこれまで知られていなかった戦略を明らかにできる可能性があると結論付けました。
私たちのクライオ EM 構造は、特徴づけられる最小の真核生物の細胞質リボソームを表しており、最終的なゲノム縮小の程度が細胞に不可欠な分子機構の構造、集合、進化にどのような影響を与えるかについての洞察を提供します。私たちは、E. cuniculi リボソームが RNA の折り畳みとリボソーム構築の広く保存されている原理の多くに違反していることを発見し、これまで知られていなかった新しいリボソームタンパク質を発見しました。まったく予期せぬことに、我々は微胞子虫リボソームが小分子に結合する能力を進化させてきたことを示し、rRNAやタンパク質の切断が進化的革新を引き起こし、最終的にはリボソームに有用な性質を与える可能性があると仮説を立てた。
細胞内生物におけるタンパク質と核酸の進化についての理解を深めるために、我々は、リボソームを精製し、これらのリボソームの構造を決定するために、感染した哺乳動物細胞の培養物から E. cuniculi 胞子を単離することにしました。微胞子虫は栄養培地で培養できないため、寄生性微胞子虫を多数入手することは困難です。代わりに、それらは宿主細胞内でのみ成長し、繁殖します。したがって、リボソーム精製用の E. cuniculi バイオマスを取得するために、哺乳類腎臓細胞株 RK13 に E. cuniculi 胞子を感染させ、これらの感染細胞を数週間培養して E. cuniculi を成長させ、増殖させました。約0.5平方メートルの感染細胞単層を使用して、約300 mgの微胞子虫胞子を精製し、それらをリボソームの単離に使用することができました。次に、精製した胞子をガラスビーズで破壊し、溶解物の段階的なポリエチレングリコール分画を使用して粗製リボソームを単離しました。これにより、構造解析用に約 300 μg の生の E. cuniculi リボソームを取得することができました。
次に、得られたリボソームサンプルを使用してクライオ EM 画像を収集し、リボソーム大サブユニット、小サブユニット頭部、および小サブユニットに対応するマスクを使用してこれらの画像を処理しました。このプロセス中に、約108,000個のリボソーム粒子の画像を収集し、解像度2.7ÅでクライオEM画像を計算しました（補足図1〜3）。次に、cryoEM 画像を使用して、E. cuniculi リボソームに関連する rRNA、リボソームタンパク質、および冬眠因子 Mdf1 をモデル化しました（図 1a、b）。
a 冬眠因子 Mdf1 と複合体を形成した E. cuniculi リボソームの構造 (pdb id 7QEP)。b E. cuniculi リボソームに関連する冬眠因子 Mdf1 のマップ。c 微胞子虫種で回収されたrRNAを既知のリボソーム構造と比較した二次構造マップ。パネルは、増幅された rRNA フラグメント (ES) と、解読部位 (DC)、サルシニシン ループ (SRL)、ペプチジル トランスフェラーゼ センター (PTC) を含むリボソーム活性部位の位置を示します。d E. cuniculi リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ中心に対応する電子密度は、この触媒部位が E. cuniculi 寄生虫とその宿主 (H. sapiens を含む) で同じ構造を持っていることを示唆しています。e、f 解読中心の対応する電子密度（e）および解読中心の概略構造（f）は、E. cuniculi が他の多くの真核生物の A1491 (大腸菌番号付け) の代わりに残基 U1491 を持っていることを示しています。この変化は、E. cuniculi がこの活性部位を標的とする抗生物質に感受性がある可能性を示唆しています。
以前に確立された V. necatrix および P. locustae リボソームの構造 (どちらの構造も同じ小胞子虫科 Nosematidae を表し、互いに非常によく似ています) とは対照的に、31,32 E. cuniculi リボソームは rRNA およびタンパク質の断片化の多数のプロセスを受けます。さらなる変性(補足図4〜6)。rRNAでは、最も顕著な変化には、増幅された25S rRNAフラグメントES12Lの完全な喪失と、h39、h41、およびH18ヘリックスの部分的な変性が含まれます（図1c、補足図4）。リボソームタンパク質の中で、最も顕著な変化には、eS30タンパク質の完全な喪失と、eL8、eL13、eL18、eL22、eL29、eL40、uS3、uS9、uS14、uS17、およびeS7タンパク質の短縮が含まれます（補足図4、5）。
したがって、エンセファロトゾーン/オルドスポラ種のゲノムの極端な減少は、そのリボソーム構造に反映されています。E. cuniculi リボソームは、構造的特徴付けの対象となる真核生物の細胞質リボソームのタンパク質含有量の最も劇的な損失を経験しており、真核生物だけでなく生命の 3 つの領域でも広く保存されている rRNA およびタンパク質の断片さえもっていません。E. cuniculi リボソームの構造は、これらの変化の最初の分子モデルを提供し、比較ゲノミクスと細胞内生体分子構造の研究の両方で見落とされてきた進化的事象を明らかにします（補足図7）。以下では、これらのそれぞれの出来事を、おそらく進化的起源とリボソーム機能への潜在的な影響とともに説明します。
次に、我々は、rRNA の大きな切断に加えて、E. cuniculi リボソームの活性部位の 1 つに rRNA 変異があることを発見しました。E. cuniculi リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ中心は他の真核生物のリボソームと同じ構造を持っていますが（図1d）、ヌクレオチド1491の配列変異により解読中心は異なります（大腸菌の番号付け、図1e、f）。真核生物のリボソームの解読部位には、細菌型の残基 A1408 および G1491 と比較して、通常、残基 G1408 および A1491 が含まれるため、この観察は重要です。この変化は、リボソーム抗生物質のアミノグリコシドファミリーや解読部位を標的とする他​​の小分子に対する細菌リボソームと真核生物のリボソームの感受性の違いの根底にあります。E. cuniculi リボソームの解読部位では、残基 A1491 が U1491 に置き換えられ、この活性部位を標的とする小分子に固有の結合界面が形成される可能性があります。同じ A14901 変異体は、P. locustae や V. necatrix などの他の微胞子虫にも存在しており、それが微胞子虫種の間で広く普及していることを示唆しています (図 1f)。
E. cuniculi リボソームサンプルは代謝的に不活性な胞子から単離されたため、ストレスまたは飢餓条件下で前述のリボソーム結合について E. cuniculi の低温 EM マップをテストしました。冬眠因子 31、32、36、37、38。我々は、以前に確立された冬眠リボソームの構造を E. cuniculi リボソームの低温 EM マップと照合しました。ドッキングには、冬眠因子 Stm138 と複合体を形成した S. cerevisiae リボソーム、Lso232 因子と複合体を形成したイナゴ リボソーム、および Mdf1 および Mdf231 因子と複合体を形成した V. necatrix リボソームを使用しました。同時に、静止係数 Mdf1 に対応するクライオ EM 密度も見つかりました。Mdf1 が V. necatrix リボソームに結合するのと同様に、Mdf1 は E. cuniculi リボソームにも結合し、そこでリボソームの E 部位をブロックし、寄生虫の胞子が体内の不活化により代謝的に不活性になったときにリボソームを利用できるようにするのに役立っている可能性があります (図 2)。）。
Mdf1 はリボソームの E 部位をブロックします。これは、寄生虫の胞子が代謝的に不活性になったときにリボソームを不活性化するのに役立つと考えられます。E. cuniculi リボソームの構造において、Mdf1 が、タンパク質合成中にリボソームからの脱アシル化 tRNA の放出を促進するリボソームの一部である L1 リボソームステムと、これまで知られていなかった接触を形成していることを発見しました。これらの接触は、Mdf1 が脱アセチル化 tRNA と同じメカニズムを使用してリボソームから解離することを示唆しており、リボソームがどのように Mdf1 を除去してタンパク質合成を再活性化するかについての考えられる説明を提供します。
しかし、我々の構造は、Mdf1 と L1 リボソーム脚 (タンパク質合成中にリボソームから脱アシル化 tRNA を放出するのに役立つリボソームの部分) との間に未知の接触があることを明らかにしました。特に、Mdf1 は、脱アシル化された tRNA 分子のエルボ セグメントと同じコンタクトを使用します (図 2)。このこれまで知られていなかった分子モデリングにより、Mdf1 が脱アセチル化 tRNA と同じメカニズムを使用してリボソームから解離することが示されました。これは、リボソームがこの冬眠因子を除去してタンパク質合成を再活性化する仕組みを説明します。
rRNA モデルを構築する際、E. cuniculi リボソームが異常に折りたたまれた rRNA フラグメントを持っていることを発見しました。これを融合 rRNA と呼びます (図 3)。生命の 3 つのドメインにまたがるリボソームでは、rRNA は折りたたまれて、ほとんどの rRNA 塩基が互いに塩基対合して折りたたまれるか、リボソームタンパク質と相互作用する構造になります 38、39、40。しかし、E. cuniculi リボソームでは、rRNA はヘリックスの一部を折り畳まれていない rRNA 領域に変換することにより、この折り畳み原理に違反しているようです。
S. cerevisiae、V. necatrix、および E. cuniculi における H18 25S rRNA ヘリックスの構造。通常、3 つの生命ドメインにわたるリボソームでは、このリンカーは 24 ～ 34 残基を含む RNA ヘリックスを形成します。対照的に、微胞子虫では、この rRNA リンカーは徐々に減少して、わずか 12 残基を含む 2 つの一本鎖ウリジンに富んだリンカーになります。これらの残留物のほとんどは溶媒にさらされます。この図は、寄生性小胞子虫が、通常、rRNA 塩基が他の塩基と結合するか、rRNA とタンパク質の相互作用に関与する、rRNA フォールディングの一般原則に違反しているようであることを示しています。小胞子虫では、一部の rRNA フラグメントは好ましくない折り畳みをとり、元の rRNA ヘリックスはほぼ直線に伸長した一本鎖フラグメントになります。これらの異常な領域の存在により、小胞子虫 rRNA は最小限の数の RNA 塩基を使用して離れた rRNA 断片に結合することができます。
この進化的変遷の最も顕著な例は、H18 25S rRNA ヘリックスで観察できます (図 3)。大腸菌からヒトに至るまでの種では、この rRNA ヘリックスの塩基には 24 ～ 32 個のヌクレオチドが含まれており、わずかに不規則なヘリックスを形成しています。以前に同定された V. necatrix および P. locustae のリボソーム構造では 31,32、H18 ヘリックスの塩基は部分的にほどかれていますが、ヌクレオチドの塩基対形成は保存されています。しかし、E. cuniculi では、この rRNA フラグメントは最も短いリンカー 228UUUGU232 および 301UUUUUUUUU307 になります。典型的な rRNA フラグメントとは異なり、これらのウリジンに富んだリンカーは、リボソームタンパク質とコイル状になったり、広範囲に接触したりしません。代わりに、rRNA 鎖がほぼ真っ直ぐに伸びる、溶媒に開いた完全に折り畳まれていない構造を採用します。この伸張した立体構造は、他の種がギャップを埋めるために少なくとも 2 倍の rRNA 塩基を必要とするのに対し、E. cuniculi がどのようにして H16 と H18 rRNA ヘリックス間の 33 Å のギャップを埋めるのに 12 RNA 塩基のみを使用するかを説明しています。
したがって、寄生性微胞子虫は、エネルギー的に不利なフォールディングを通じて、生命の 3 つの領域において種を超えて広く保存されている rRNA セグメントさえも収縮させる戦略を開発したことを証明できます。どうやら、E. cuniculi は、rRNA ヘリックスを短いポリ U リンカーに変換する変異を蓄積することにより、遠位の rRNA 断片のライゲーションに必要なヌクレオチドをできるだけ少ない珍しい rRNA 断片を形成できるようです。これは、微胞子虫が構造的および機能的完全性を失うことなく、どのようにして基本的な分子構造の劇的な減少を達成したかを説明するのに役立ちます。
E. cuniculi rRNA のもう 1 つの珍しい特徴は、肥厚のない rRNA の外観です (図 4)。バルジは、RNA ヘリックスの中に隠れるのではなく、ねじれて外に出る、塩基対を持たないヌクレオチドです。ほとんどの rRNA 突起は分子接着剤として機能し、隣接するリボソームタンパク質または他の rRNA フラグメントとの結合を助けます。膨らみの一部はヒンジとして機能し、rRNA ヘリックスが生産的なタンパク質合成に最適に曲がったり折りたたまれたりすることを可能にします 41 。
a rRNA 突出（S. cerevisiae の番号付け）は E. cuniculi のリボソーム構造には存在しませんが、他のほとんどの真核生物には存在します。 b E. coli、S. cerevisiae、H. sapiens、および E. cuniculi の内部リボソームには存在します。寄生虫には、古代の高度に保存された rRNA バルジの多くが欠けています。これらの肥厚はリボソーム構造を安定化します。したがって、小胞子虫にそれらが存在しないことは、小胞子虫寄生虫におけるrRNAフォールディングの安定性が低下していることを示しています。P ステム (細菌の L7/L12 ステム) との比較では、rRNA バンプの消失が、消失したバンプの隣に新しいバンプの出現と同時に発生する場合があることが示されています。23S/28S rRNA の H42 ヘリックスには、生命の 3 つの領域で保護されているため、少なくとも 35 億年前のものと推定される古代のバルジ (出芽酵母の U1206) があります。小胞子虫では、この膨らみは解消されます。しかし、失われたバルジの隣に新しいバルジが現れました (E. cuniculi の A1306)。
驚くべきことに、E. cuniculi リボソームには、他の真核生物に保存されている 30 以上のバルジを含む、他の種に見られる rRNA バルジのほとんどが欠けていることがわかりました（図 4a）。この喪失により、リボソームのサブユニットと隣接するrRNAヘリックスの間の多くの接触がなくなり、場合によってはリボソーム内に大きな中空の空隙が生じ、E. cuniculiのリボソームは従来のリボソームと比較してより多孔質になります（図4b）。注目すべきことに、これらの膨らみのほとんどが、以前に同定された V. necatrix および P. locustae のリボソーム構造でも失われていることがわかりました。これらは、以前の構造解析では見落とされていました 31,32。
場合によっては、rRNA バルジの喪失に伴って、失われたバルジの隣に新しいバルジが発生することがあります。たとえば、リボソーム P ステムには、大腸菌からヒトまで生き残った U1208 バルジ (出芽酵母) が含まれており、したがって 35 億年前のものと推定されます。タンパク質合成中、このバルジは P ステムが開いた立体構造と閉じた立体構造の間を移動するのを助け、リボソームが翻訳因子を動員して活性部位に届けることができます。E. cuniculi リボソームでは、この肥厚は存在しません。しかし、3塩基対のみに位置する新しい肥厚（G883）は、Pステムの最適な柔軟性の回復に寄与する可能性があります（図4c）。
バルジのないrRNAに関する我々のデータは、rRNAの最小化がリボソーム表面のrRNA要素の喪失に限定されず、リボソーム核にも関与し、自由生活細胞では報告されていない寄生虫特異的な分子欠損を引き起こす可能性があることを示唆している。生きた種が観察されます。
標準的なリボソームタンパク質と rRNA をモデル化した後、従来のリボソーム コンポーネントではクライオ EM 画像の 3 つの部分を説明できないことがわかりました。これらのフラグメントのうち 2 つはサイズが小さい分子です (図 5、補足図 8)。最初のセグメントは、リボソームタンパク質 uL15 と eL18 の間に挟まれており、通常は eL18 の C 末端が占める位置にあり、E. cuniculi では短縮されています。この分子の正体を特定することはできませんが、この密度島の大きさと形状はスペルミジン分子の存在によって十分に説明されます。リボソームへの結合は、uL15 タンパク質の小胞子虫特異的変異 (Asp51 および Arg56) によって安定化されており、uL15 が小分子をリボソーム構造に包み込むことができるため、この小分子に対するリボソームの親和性が高まると考えられます。補足図2)。8、追加データ1、2）。
E. cuniculi リボソームに結合したリボース外側のヌクレオチドの存在を示すクライオ EM イメージング。E. cuniculi リボソームでは、このヌクレオチドは、他のほとんどの真核生物リボソームの 25S rRNA A3186 ヌクレオチド (Saccharomyces cerevisiae の番号付け) と同じ場所を占めています。b E. cuniculi のリボソーム構造では、このヌクレオチドはリボソームタンパク質 uL9 と eL20 の間に位置し、それによって 2 つのタンパク質間の接触を安定化します。微胞子虫種間のcd eL20配列保存解析。微胞子虫属種の系統樹（c）およびeL20タンパク質の多重配列アラインメント（d）は、ヌクレオチド結合残基F170およびK172が、ES39L rRNA伸長を保持した初期分岐微胞子虫を除き、S. lophiiを除くほとんどの典型的な微胞子虫で保存されていることを示しています。e この図は、ヌクレオチド結合残基 F170 および K172 が高度に減少した微胞子虫ゲノムの eL20 にのみ存在し、他の真核生物には存在しないことを示しています。全体として、これらのデータは、微胞子虫のリボソームが、AMP 分子に結合し、リボソーム構造におけるタンパク質間相互作用を安定化するために使用すると思われるヌクレオチド結合部位を開発したことを示唆しています。微胞子虫ではこの結合部位が高度に保存されており、他の真核生物ではこの結合部位が存在しないことは、この部位が微胞子虫に選択的な生存上の利点を提供する可能性があることを示唆しています。したがって、微胞子虫リボソームのヌクレオチド結合ポケットは、前述のようなrRNA分解の退化した特徴や最終形態ではなく、むしろ微胞子虫リボソームが小分子を分子構成要素として使用して、小分子と直接結合できるようにする有用な進化的革新であると考えられる。リボソームの構成要素。この発見により、小胞子虫リボソームは、その構造的構成要素として単一のヌクレオチドを使用することが知られている唯一のリボソームとなった。f ヌクレオチド結合に由来する仮説の進化経路。
2番目の低分子量密度は、リボソームタンパク質uL9とeL30の間の界面に位置しています（図5a）。この界面は、出芽酵母リボソームの構造において、rRNA A3186 (ES39L rRNA 伸長の一部) の 25S ヌクレオチドの結合部位として以前に記載されています 38。縮重した P. locustae ES39L リボソームでは、この界面が未知の単一ヌクレオチド 31 に結合することが示されており、このヌクレオチドは rRNA の還元された最終形態であり、rRNA の長さは約 130 ～ 230 塩基であると推定されています。ES39L は単一ヌクレオチド 32.43 に還元されます。私たちのクライオ EM 画像は、密度がヌクレオチドによって説明できるという考えを裏付けています。しかし、我々の構造のより高い解像度は、このヌクレオチドがリボソーム外分子、おそらくAMPであることを示しました（図5a、b）。
次に、ヌクレオチド結合部位が E. cuniculi リボソームに現れたのか、それとも以前から存在していたのかを調べました。ヌクレオチド結合は主に eL30 リボソームタンパク質の Phe170 残基と Lys172 残基によって媒介されるため、4396 個の代表的な真核生物におけるこれらの残基の保存性を評価しました。上記のuL15の場合と同様に、我々は、Phe170およびLys172残基が典型的な微小胞子虫でのみ高度に保存されているが、ES39L rRNAフラグメントが還元されていない非定型微胞子虫ミトスポリジウムおよびアンフィアンブリスを含む他の真核生物には存在しないことを発見した44、45、46（図5c）。-e)。
総合すると、これらのデータは、E. cuniculi とおそらく他の標準的な微胞子虫が、rRNA とタンパク質レベルの低下を補うためにリボソーム構造内の多数の小さな代謝産物を効率的に捕捉する能力を進化させてきたという考えを裏付けています。そうすることで、彼らはリボソームの外側のヌクレオチドに結合する独自の能力を開発し、寄生分子構造が豊富な小さな代謝産物を捕捉し、それらを分解されたRNAやタンパク質断片の構造模倣物として使用することによって補償していることを示した。。
クライオ EM マップの 3 番目のシミュレーションされていない部分は、大きなリボソーム サブユニットにあります。私たちのマップの比較的高い解像度（2.6 Å）は、この密度が大きな側鎖残基の独特の組み合わせを持つタンパク質に属していることを示唆しており、これにより、この密度がこれまで知られていなかったリボソームタンパク質であることがわかり、msL2（微胞子虫特異的タンパク質L2）と名付けられました（方法、図6）。我々の相同性検索により、msL2 はエンセファリッター属およびオロスポリジウム属の微胞子虫クレードでは保存されているが、他の微胞子虫を含む他の種には存在しないことが示されました。リボソーム構造では、msL2 は伸長された ES31L rRNA の損失によって形成されたギャップを占めます。この空隙において、msL2 は rRNA フォールディングの安定化を助け、ES31L の損失を補うことができます (図 6)。
a E. cuniculi リボソームに見出される Microsporidia 特異的リボソームタンパク質 msL2 の電子密度とモデル。b Saccharomyces cerevisiae の 80S リボソームを含むほとんどの真核生物のリボソームでは、ほとんどのミクロスポリディアン種で ES19L rRNA 増幅が失われています。以前に確立された V. necatrix microsporidia リボソームの構造は、これらの寄生虫における ES19L の損失が新しい msL1 リボソーム タンパク質の進化によって補われることを示唆しています。この研究では、E. cuniculi リボソームが、ES19L の損失を明らかに補うために、追加のリボソーム RNA 模倣タンパク質も開発したことを発見しました。ただし、msL2 (現在、仮説上の ECU06_1135 タンパク質として注釈が付けられている) と msL1 は、構造的および進化的起源が異なります。c 進化的に無関係なmsL1およびmsL2リボソームタンパク質の生成に関するこの発見は、リボソームがそのrRNAに有害な変異を蓄積すると、密接に関連した種の小さなサブセットであっても前例のないレベルの組成多様性を達成できることを示唆している。この発見は、rRNAの高度な減少と種間のタンパク質組成の異常なばらつきで知られるミトコンドリボソームの起源と進化を解明するのに役立つ可能性がある。
次に、msL2 タンパク質を、V. necatrix リボソームで見つかった唯一既知の小胞子虫特異的リボソーム タンパク質である、以前に記載された msL1 タンパク質と比較しました。私たちは、msL1 と msL2 が進化的に関連しているかどうかをテストしたいと考えました。我々の分析により、msL1とmsL2はリボソーム構造の同じ空洞を占めているが、異なる一次構造と三次構造を持っていることが示され、これはそれらが独立した進化的起源を示している（図6）。したがって、msL2 の発見は、コンパクトな真核生物種のグループが独立して構造的に異なるリボソームタンパク質を進化させて、rRNA 断片の損失を補うことができるという証拠を提供します。この発見は、ほとんどの細胞質真核生物リボソームが、81 個のリボソームタンパク質の同じファミリーを含む不変タンパク質を含むという点で注目に値します。伸長rRNAセグメントの喪失に応じて小胞子虫のさまざまなクレードにmsL1およびmsL2が出現することは、寄生虫の分子構造の劣化により寄生虫が代償的変異を求めるようになり、最終的には異なる寄生虫集団での獲得につながる可能性があることを示唆している。構造物。
最後に、モデルが完成したとき、E. cuniculi リボソームの組成をゲノム配列から予測されたものと比較しました。eL14、eL38、eL41、および eS30 を含むいくつかのリボソームタンパク質は、E. cuniculi ゲノムにそれらの相同体が明らかに存在しないため、E. cuniculi ゲノムには欠損していると以前は考えられていました。多くのリボソームタンパク質の損失は、高度に減少した他のほとんどの細胞内寄生生物や内部共生生物でも予測されています。たとえば、ほとんどの自由生活細菌には 54 個のリボソームタンパク質の同じファミリーが含まれていますが、これらのタンパク質ファミリーのうち 11 個だけが宿主制限細菌の分析された各ゲノムで検出可能な相同体を持っています。この考えを裏付けるように、eL38 タンパク質と eL4131,32 タンパク質を欠く V. necatrix および P. locustae microsporidia ではリボソームタンパク質の損失が実験的に観察されています。
しかし、我々の構造は、eL38、eL41、およびeS30だけがE. cuniculiリボソームで実際に失われていることを示しています。eL14タンパク質は保存されており、我々の構造は、なぜこのタンパク質が相同性検索で見つからないのかを示しました（図7）。E. cuniculi リボソームでは、rRNA 増幅された ES39L の分解により、eL14 結合部位の大部分が失われます。ES39L が存在しない場合、eL14 は二次構造の大部分を失い、E. cuniculi と S. cerevisiae では eL14 配列の 18% のみが同一でした。15億年離れて進化した生物であるサッカロミセス・セレビシエとホモ・サピエンスでさえ、eL14の同じ残基の51%以上を共有しているため、この配列保存の悪さは注目に値する。この異常な保存喪失は、E. cuniculi eL14 が現在 eL1427 リボソームタンパク質ではなく、推定上の M970_061160 タンパク質として注釈付けされている理由を説明しています。
そして、Microsporidia リボソームは ES39L rRNA 伸長を失い、これにより eL14 リボソームタンパク質結合部位が部分的に除去されました。ES39L が存在しない場合、eL14 小胞子タンパク質は二次構造を失い、以前の rRNA 結合αヘリックスは最小長のループに縮退します。b 多重配列アラインメントは、eL14タンパク質が真核生物種では高度に保存されている（酵母とヒトホモログの間で57％の配列同一性）が、小胞子虫では保存性が低く、分岐している（残基の24％以下がeL14ホモログと同一である）ことを示しています。S. cerevisiae または H. sapiens 由来)。この不十分な配列保存性と二次構造の多様性は、なぜ eL14 ホモログが E. cuniculi でこれまで発見されなかったのか、そしてなぜこのタンパク質が E. cuniculi で失われたと考えられるのかを説明しています。対照的に、E. cuniculi eL14 は、推定上の M970_061160 タンパク質として以前に注釈が付けられていました。この観察は、微胞子虫のゲノム多様性が現在過大評価されていることを示唆しています。現在、微胞子虫で失われていると考えられているいくつかの遺伝子は、高度に分化した形ではあるものの、実際には保存されています。その代わりに、いくつかは線虫特異的タンパク質の小胞子虫遺伝子をコードしていると考えられています（たとえば、仮説上のタンパク質 M970_061160）は、実際には他の真核生物に見られる非常に多様なタンパク質をコードしています。
この発見は、rRNA の変性により、隣接するリボソームタンパク質の配列保存が劇的に失われ、これらのタンパク質が相同性検索で検出できなくなる可能性があることを示唆しています。したがって、失われたと考えられていた一部のタンパク質は、高度に変化した形ではあるものの、実際には残っているため、小さなゲノム生物における実際の分子分解の程度を過大評価する可能性があります。
極端なゲノム減少の条件下で、寄生虫はどのようにして分子機械の機能を維持できるのでしょうか?私たちの研究は、最も小さな真核生物のゲノムを持つ生物の 1 つである E. cuniculi の複雑な分子構造 (リボソーム) を説明することで、この疑問に答えています。
寄生微生物のタンパク質やRNA分子は、品質管理センターを持たず、自由生活微生物ではサイズが50％に縮小するなどの理由で、しばしば自由生活種の相同分子とは異なることが約20年前から知られていた。折り畳みと機能を損なう多くの衰弱性の突然変異。例えば、多くの細胞内寄生虫や内部共生生物を含む小さなゲノム生物のリボソームには、自由生活種と比較していくつかのリボソームタンパク質と最大 3 分の 1 の rRNA ヌクレオチドが欠如していると予想されます 27、29、30、49。しかし、これらの分子が寄生虫内でどのように機能するかは、主に比較ゲノミクスを通じて研究されており、依然として大きな謎のままです。
私たちの研究は、高分子の構造によって、細胞内寄生虫や他の宿主制限生物の従来の比較ゲノム研究からは抽出することが困難な進化の多くの側面を明らかにできることを示しています（補足図7）。たとえば、eL14 タンパク質の例は、寄生種における分子装置の実際の分解度を過大評価する可能性があることを示しています。脳炎性寄生虫は現在、数百の微胞子虫特異的遺伝子を持っていると考えられています。しかし、私たちの結果は、これらの一見特異的な遺伝子のいくつかは、実際には他の真核生物に一般的な遺伝子の非常に異なる変異体にすぎないことを示しています。さらに、msL2 タンパク質の例は、私たちがいかに新しいリボソームタンパク質を見落とし、寄生分子機械の内容を過小評価しているかを示しています。小分子の例は、それらに新しい生物学的活性を与える可能性のある寄生分子構造における最も独創的なイノベーションを私たちがどのようにして見逃してしまうのかを示しています。
これらの結果を総合すると、宿主に制限された生物の分子構造と自由生活生物の対応する分子構造の違いについての理解が深まります。私たちは、長い間、還元され、変性し、さまざまな衰弱性の突然変異を受けやすいと考えられてきた分子機械が、体系的に見落とされてきた一連の異常な構造的特徴を持っていることを示します。
一方、E. cuniculi のリボソームで発見されたかさばらない rRNA フラグメントと融合フラグメントは、ゲノム縮小によって、生命の 3 つの領域でほぼ 35 億年を経て保存されている基本的な分子機構の部分さえも変化する可能性があることを示唆しています。種の独立した進化。
E. cuniculi リボソームのバルジのない融合 rRNA フラグメントは、内部共生細菌の RNA 分子に関するこれまでの研究を踏まえると、特に興味深いものです。例えば、アブラムシの内部共生生物 Buchnera aphidicola では、rRNA および tRNA 分子は、A+T 組成の偏りおよび高い割合の非標準塩基対により、温度に敏感な構造を持つことが示されています 20,50。RNA のこれらの変化は、タンパク質分子の変化と同様に、内部共生生物のパートナーへの過度の依存と、内部共生生物が熱を伝達できない原因であると現在考えられています 21, 23 。寄生性微胞子虫 rRNA は構造的に異なる変化を持っていますが、これらの変化の性質は、熱安定性の低下とシャペロンタンパク質への高い依存性が、ゲノムが減少した生物における RNA 分子の共通の特徴である可能性を示唆しています。
一方、我々の構造は、寄生虫微胞子虫が広く保存されたrRNAやタンパク質の断片に抵抗する独自の能力を進化させ、豊富で容易に入手可能な小さな代謝物を縮重したrRNAやタンパク質の断片の構造模倣物として使用する能力を発達させたことを示している。分子構造の劣化。。この意見は、E. cuniculi の rRNA およびリボソームにおけるタンパク質断片の損失を補う小分子が、uL15 および eL30 タンパク質の微胞子虫特異的残基に結合するという事実によって裏付けられています。これは、小分子のリボソームへの結合が正の選択の産物である可能性を示唆しており、リボソームタンパク質における微胞子虫特異的変異は、小分子に対するリボソームの親和性を高める能力により選択されており、これによりより効率的なリボソーム生物が得られる可能性がある。この発見は、微生物の寄生虫の分子構造における賢明な革新を明らかにし、還元的進化にも関わらず寄生虫の分子構造がどのように機能を維持するのかについてのより良い理解をもたらします。
現時点では、これらの小分子の同定は不明のままです。リボソーム構造におけるこれらの小分子の外観が微胞子虫種間で異なる理由は明らかではありません。特に、V. necatrix の eL20 および K172 タンパク質には F170 残基が存在するにもかかわらず、ヌクレオチド結合が E. cuniculi および P. locustae のリボソームで観察され、V. necatrix のリボソームでは観察されない理由は明らかではありません。この欠失は残基 43 uL6 (ヌクレオチド結合ポケットに隣接して位置する) によって引き起こされる可能性があり、これは V. necatrix ではチロシンであり、E. cuniculi および P. locustae ではスレオニンではありません。Tyr43 のかさばる芳香族側鎖は、立体的な重複によりヌクレオチドの結合を妨げる可能性があります。あるいは、明らかなヌクレオチド欠失は、低温 EM イメージングの解像度が低いためである可能性があり、これが V. necatrix リボソーム断片のモデリングを妨げます。
一方で、私たちの研究は、ゲノム崩壊のプロセスが発明力となる可能性があることを示唆しています。特に、E. cuniculi リボソームの構造は、微胞子虫リボソームにおける rRNA とタンパク質断片の喪失が、リボソーム構造の変化を促進する進化圧力を生み出すことを示唆しています。これらの変異体はリボソームの活性部位から遠く離れたところに発生し、さもなければrRNAの減少によって破壊されてしまう最適なリボソーム構築を維持（または回復）するのに役立つと考えられます。これは、小胞子虫リボソームの主要な革新が、遺伝子ドリフトを緩衝する必要性へと進化したようであることを示唆しています。
おそらくこれは、これまで他の生物では観察されたことがないヌクレオチド結合によって最もよく説明される。ヌクレオチド結合残基が典型的な微胞子虫には存在するが、他の真核生物には存在しないという事実は、ヌクレオチド結合部位が、消滅を待つ単なる遺物や、rRNA が個々のヌクレオチドの形に復元される最終部位ではないことを示唆しています。むしろ、このサイトは、数回のポジティブセレクションを経て進化した可能性がある便利な機能のように思えます。ヌクレオチド結合部位は自然選択の副産物である可能性があります。ES39L が分解されると、小胞子虫は ES39L の非存在下で最適なリボソーム生合成を回復するために代償を求めざるを得なくなります。このヌクレオチドは ES39L の A3186 ヌクレオチドの分子接触を模倣できるため、ヌクレオチド分子はリボソームの構成要素となり、その結合は eL30 配列の変異によってさらに改善されます。
細胞内寄生虫の分子進化に関して、私たちの研究は、ダーウィンの自然選択の力とゲノム崩壊の遺伝的変動が並行して作用するのではなく、振動していることを示しています。まず、遺伝的浮動により生体分子の重要な特徴が失われるため、その補償が非常に必要になります。寄生虫がダーウィンの自然選択を通じてこのニーズを満たした場合にのみ、寄生虫の高分子は最も印象的で革新的な形質を発達させる機会を得ることができます。重要なことに、E. cuniculi リボソームにおけるヌクレオチド結合部位の進化は、分子進化のこの損失から獲得へのパターンが有害な突然変異を消滅させるだけでなく、時には寄生高分子にまったく新しい機能を与えることを示唆しています。
この考えは、厳密な自然選択システムが生物の革新能力を制限するとするシーウェル・ライトの移動平衡理論と一致しています51,52,53。しかし、遺伝的浮動によって自然選択が破壊される場合、これらの浮動は、それ自体は適応的ではない（または有害な）変化を生み出す可能性がありますが、より高い適応度または新しい生物学的活性をもたらすさらなる変化を引き起こす可能性があります。私たちのフレームワークは、生体分子の折り畳みと機能を低下させる同じ種類の突然変異が、その改善の主な引き金であると思われることを示すことで、この考えを裏付けています。Win-Win進化モデルに沿って、私たちの研究は、伝統的に変性プロセスとみなされてきたゲノム崩壊もイノベーションの主要な推進力であり、時には、そしておそらく頻繁に高分子が新たな寄生活動を獲得することを可能にすることを示しています。それらを使用できます。