栄養素の獲得と分配は、昆虫の採餌特性と生活史特性を統合します。さまざまなライフステージでの特定の栄養素の欠乏を補うために、昆虫は、たとえば水たまりと呼ばれるプロセスで脊椎動物の分泌物を食べることによって、補助的な給餌を通じてこれらの栄養素を得ることができます。蚊である Anopheles arabiani は栄養失調のようで、そのため代謝と繁殖の両方に栄養素が必要です。本研究の目的は、栄養素獲得のために An. arabiensis が牛の尿をかき混ぜることで、生活史特性が改善されるかどうかを評価することです。
安全であることを確認してください。arabiensis は、新鮮、24時間、72時間、168時間経過した牛の尿の匂いに引き寄せられ、宿主探索型および吸血型（吸血後48時間）の雌はY字管嗅覚計で測定され、妊娠した雌は産卵試験について評価されました。次に、化学分析と電気生理学分析を組み合わせた分析を使用して、4つの年齢クラスの牛の尿中の生物活性化合物を特定しました。生物活性化合物の合成混合物は、Y字管およびフィールド試験で評価されました。牛の尿とその主要な窒素含有化合物である尿素をマラリア媒介動物の潜在的な補助食として調査するために、摂食パラメータと生活史特性を測定しました。雌の蚊の割合と、吸収された牛の尿と尿素の量を評価しました。摂食後、雌は生存、繋留飛行、および繁殖について評価されました。
宿主の血と栄養を求めます。実験室およびフィールドでの研究では、アラブ人は新鮮な牛の尿と古い牛の尿の天然および合成の香りに惹かれました。妊娠したメスは産卵場所で牛の尿の反応に無関心でした。宿主を求めて吸血するメスは、牛の尿と尿素を積極的に吸収し、逃走、生存、または繁殖のための生理学的状態の関数としての生活史のトレードオフに従ってこれらのリソースを割り当てます。
アラビニスハマダラカの牛尿の獲得と分布は、生活史特性の改善につながります。牛尿の補給は、毎日の生存率とベクター密度を高めることで直接的に、また飛翔活動を変化させることで間接的にベクターの能力に影響を与えるため、将来のモデルでは考慮する必要があります。
栄養素の獲得と分配は、昆虫の採餌と生活史特性を統合する [1,2,3]。昆虫は、食物の入手可能性と栄養所要量に基づいて食物を選択して獲得し、代償的に摂食することができる [1, 3]。栄養素の分配は生活史プロセスに依存し、昆虫の異なるライフステージで食事の質と量に対する異なる要件につながる可能性がある [1, 2]。特定の栄養素の欠乏を補うために、昆虫は泥、脊椎動物のさまざまな排泄物や分泌物、死骸などの補助的な摂食（水たまりとして知られるプロセス）を通じてこれらの栄養素を得ることができる [2]。主に蝶や蛾のさまざまな種が記載されているが、水飲み場は他の昆虫の目でも発生し、これらの種類の資源への誘引と摂食は、健康やその他の生活史特性に大きな影響を与える可能性がある [2, 4, 5, 6] ,7]。マラリア蚊 Anopheles gambiae sensu lato (sl) は、成虫になると「栄養失調」の状態になるため[8]、給水行動はその生活史特性において重要な役割を果たしている可能性があるが、この行動はこれまで無視されてきた。この重要な輸送手段における栄養摂取量を増やす手段としての撹拌の利用は、重要な疫学的結果をもたらす可能性があるため注目に値する。
成虫の雌のハマダラカの窒素摂取量は、幼虫期から蓄えられたカロリー量が少なく、吸血を効率的に利用できないために限られている [9]。メスのハマダラカ（Ann.gambiae sl）は通常、吸血を補うことでこれを補う [10, 11]。そのため、より多くの人々が感染するリスクにさらされ、蚊は捕食されるリスクが高まっている。あるいは、蚊は他の昆虫で実証されているように、脊椎動物の排泄物を補助的に摂取することで、適応と飛行能力を高める窒素化合物を獲得することができる [2]。この点で、ガンビアの sl 種複合体内の兄弟種の一つである Anopheles arabinis が、新鮮および熟成した牛の尿に強く際立った魅力を示す [12,13,14] ことは興味深い。ハマダラカは宿主の好みにおいて日和見主義的で、牛と共存して餌とすることが知られている。牛尿は窒素化合物の豊富な資源であり、新鮮な尿に含まれる窒素のうち尿素は50～95%を占めます[15, 16]。牛の尿が古くなると、微生物がこれらの資源を利用して24時間以内に窒素化合物の複雑さを減らします[15]。有機窒素の減少に伴ってアンモニアが急増すると、好アルカリ性微生物（その多くは蚊に有毒な化合物を生成する）が繁殖します[15]。これは、雌のAnn.arabiensisが24時間以内に古くなった尿に優先的に引き寄せられることを意味する可能性があります[13, 14]。
この研究では、宿主および吸血したAnsが探された。最初のゴナドトロピン周期中に、arabiensisは尿の混合による尿素を含む窒素化合物の獲得について評価された。次に、メスの蚊が生存、繁殖およびさらなる採餌を改善するためにこの潜在的な栄養源をどのように割り当てるかを評価するために、一連の実験が行われた。最後に、新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿の臭いを評価し、これらが宿主および吸血したAnに信頼できる手がかりを提供するかどうかを判断した。この潜在的な栄養源の探索において、arabiensisは観察された異なる魅力の背後にある化学的相関関係を発見した。24時間熟成した尿で特定された揮発性有機化合物（VOC）の合成臭い混合物は、野外条件下でさらに評価され、実験室条件下で得られた結果を拡張し、牛の尿の臭いがさまざまな生理学的状態に与える影響を実証した。蚊の誘引。得られた結果により、Anが確認arabiensis は脊椎動物の尿中に存在する窒素化合物を獲得して分配し、生活史特性に影響を与えます。これらの結果は、潜在的な疫学的影響と、それが媒介生物の監視と制御にどのように使用できるかという観点から議論されています。
アラビカンスハマダラカ（ドンゴラ株）を25 ± 2 °C、65 ± 5% RH、12:12時間の明暗サイクルで飼育しました。幼虫は蒸留水を満たしたプラスチックトレイ（20 cm × 18 cm × 7 cm）で飼育し、テトラミン®魚用飼料（Tetra Werke、メレ、ドイツ）を与えました。蛹は30 mlカップ（Nolato Hertila、オーストプ、スウェーデン）に集められ、その後、成虫が羽化できるようにバグドームケージ（30 cm × 30 cm × 30 cm、MegaView Science、台中、台湾）に移されました。成虫には羽化後4日目（dpe）まで10%ショ糖溶液を自由に摂取させました。その時点で、宿主を求める雌には実験直前に餌を与えるか、または実験前に蒸留水で一晩絶食させました。飛行管実験に使用した雌は、4〜6時間のみ絶食し、水は自由に摂取できました。その後の生物学的検定のために吸血蚊を準備するため、4匹のdpe雌に膜給餌システム（Hemotek Discovery Workshops、アクリントン、英国）を使用して、線維化除去羊血液（Håtunalab、ブロ、スウェーデン）を与えました。その後、完全に充血した雌を個別のケージに移し、下記のように直接餌を与えるか、または下記の実験の3日前に10％スクロースを自由に摂取させました。後者の雌は飛行管生物学的検定に使用され、研究室に移され、実験前の4〜6時間、蒸留水を自由に摂取できました。
成虫のAn.Arab雌における尿および尿素の消費量を定量するために、摂食アッセイを使用しました。宿主探索性および血液を与えられた雌に、1％希釈の新鮮および熟成牛尿、さまざまな濃度の尿素、および2つのコントロール（10％ショ糖および水）を含む飼料を48時間与えました。さらに、食品着色料（1 mg ml-1キシレンシアニドFF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich、ストックホルム、SE）を飼料に加え、250 µlマイクロ遠心チューブ（Axygen Scientific、ユニオンシティ、カリフォルニア州、米国; 図1A）に4×4マトリックスで供給しました。端まで満たします（約300 µl）。蚊間の競争と染料の色による潜在的な影響を避けるために、10匹の蚊を大きなペトリ皿（直径12 cm、高さ6 cm; Semadeni、実験は5～10回繰り返されました。餌に曝露した後、蚊はさらなる分析が行われるまで-20℃に置かれました。
宿主および吸血性のアラビアナズナの雌によって吸収されたウシの尿と尿素を探します。給餌試験 (A) では、雌の蚊に、新鮮および熟成したウシの尿、さまざまな濃度の尿素、ショ糖 (10%)、蒸留水 (H2O) からなる餌を与えました。宿主探索型 (B) および吸血型 (C) の雌は、テストした他のどの餌よりも多くのショ糖を吸収しました。宿主探索型の雌は、168 時間のウシ​​の尿 (B) よりも 72 時間のウシ​​の尿を吸収していないことに注意してください。尿の平均総窒素含有量 (±標準偏差) は、挿入図に示されています。宿主探索型 (D、F) および吸血性 (E、G) の雌は、用量依存的に尿素を吸収します。異なる文字名の平均吸入量 (D、E) は、互いに有意に異なっていました (Tukey の事後分析を使用した一元配置分散分析、p < 0.05）。エラーバーは平均値の標準誤差（BE）を表す。破線は対数線形回帰直線（F、G）を表す。
吸収した食物を放出するために、蚊を230μlの蒸留水が入った1.5mlのマイクロ遠心管に個別に入れて、使い捨て乳棒とコードレスモーター（VWR International、ルンド、スウェーデン）を使用して組織を破壊し、10krpmで10分間遠心分離した。上清（200μl）を96ウェルマイクロプレート（Sigma-Aldrich）に移し、分光光度計ベースのマイクロプレートリーダー（SPECTROStar® Nano、BMG Labtech、オルテンベルク、ドイツ）を使用して吸光度（λ620 nm）を測定した。あるいは、蚊を1mlの蒸留水で粉砕し、その900μlをキュベットに移して分光光度計分析（λ620 nm; UV 1800、Shimadzu、キスタ、スウェーデン）を行った。食事摂取量を定量するために、標準曲線を作成した。段階希釈により 0.2 µl ～ 2.4 µl の 1 mg ml-1 キシレンシアニドを調製しました。次に、既知の染料濃度の光学密度を使用して、各蚊が摂取した食物の量を決定しました。
体積データは、一元配置分散分析（ANOVA）とそれに続くTukeyの事後対比較を使用して分析されました（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.、米国ノースカロライナ州キャリー、1989～2007年）。線形回帰分析では、濃度依存の尿素摂取量を説明し、宿主探索型蚊と吸血型蚊の反応を比較しました（GraphPad Prism v8.0.0 for Mac、GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ）。
各年齢群の尿サンプル約20µlをChromosorb® W/AW（10mg 80/100メッシュ、Sigma Aldrich）に結合させ、スズカプセル（8mm × 5mm）に封入しました。カプセルはCHNS/O分析装置（Flash 2000、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）の燃焼室に挿入され、メーカーのプロトコルに従って新鮮尿と古い尿の窒素含有量を測定しました。総窒素（g N l-1）は、標準として使用した既知の尿素濃度に基づいて定量化されました。
宿主探索行動および吸血行動態をとる雌の生存に対する食餌の影響を評価するために、換気と餌の供給のために蓋にメッシュの穴（直径3cm）を開けた大型ペトリ皿（直径12cm、高さ6cm、Semadeni）に蚊を1匹ずつ入れた。食餌は4日後に直接与えられ、1%希釈の新鮮な牛尿と熟成牛尿、4種類の濃度の尿素、および2種類の対照（10%ショ糖と水）が含まれていた。各食餌は、5mlシリンジ（Thermo Fisher Scientific、スウェーデン、ヨーテボリ）に挿入された歯科用タンポン（DAB Dental AB、スウェーデン、ウップランズ・ヴェスビー）にピペットで移し、プランジャーを外してペトリ皿の上に置いた（図1）。1A）。食餌は毎日交換する。上記のように研究室を維持する。生き残った蚊は1日に2回数え、死んだ蚊は最後の蚊が死亡した（処理ごとにn = 40）。さまざまな餌を与えられた蚊の生存は、Kaplan-Meyer生存曲線とlog-rank検定を使用して統計的に分析され、餌間の生存分布の比較が行われました（IBM SPSS Statistics 24.0.0.0）。
Attisanoら[17]に基づく特注の蚊取り器。厚さ5mmの透明アクリル板（幅10cm x 長さ10cm x 高さ10cm）で作られており、前面パネルと背面パネルはない（図3：上部）。ガスクロマトグラフィー用カラム（内径0.25mm、長さ7.5cm）でできた垂直チューブが付いたピボットアセンブリ。両端は、9cm間隔で吊り下げられた一対のネオジム磁石の間に吊り下げられた昆虫の針に接着されている。同じ材料でできた水平チューブ（長さ6.5cm）が垂直チューブを二分して、テザーアームと、光を遮断する信号として小さなアルミホイル片を備えたアームを形成している。
24時間絶食させた雌に、拘束前の30分間、上記の餌を与えた。満腹になった雌の蚊を、氷上で2～3分間個別に麻酔し、蜜蝋で昆虫ピン（Joel Svenssons Vaxfabrik AB、Munka Ljungby、SE）に取り付けて、水平チューブのアームに縛り付けた。フライングミル。1回の飛行あたりの回転数は、特注のデータロガーで記録し、PC-Lab 2000™ ソフトウェア（v4.01、Velleman、Gavere、BE）を使用して保存および表示した。フライトミルは、温度調節された部屋（12時間:12時間、明:暗、25 ± 2 °C、65 ± 5% RH）に設置した。
飛翔行動のパターンを視覚化するために、24時間にわたって1時間あたりの総飛行距離（m）と連続飛翔行動の総数を計算しました。さらに、各雌の平均飛翔距離を処理条件間で比較し、一元配置分散分析およびTukeyの事後分析（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.）を使用して分析しました。平均距離は従属変数、処理条件は独立因子とみなされました。また、平均ラウンド数は10分単位で計算されます。
An.arabiensis の繁殖成績に対する食餌の影響を評価するために、採血後 6 匹の雌 (4 dpe) を Bugdorm ケージ (30 cm × 30 cm × 30 cm) に直接移し、上記のように 48 時間実験食餌を与えました。その後、食餌を取り除き、蒸留水 20 ml を満たした産卵カップ (30 ml、Nolato Hertila) を 3 日目に 48 時間提供し、24 時間ごとに交換しました。各食餌療法を 20～50 回繰り返しました。各実験ケージの卵を数えて記録しました。卵のサブサンプルを使用して、Leica カメラ (DFC) 320 R2 を装備した Dialux-20 顕微鏡 (DM1000、Ernst Leitz Wetzlar、Wetzlar、DE) により、個々の卵 (食餌あたり n ≥ 200) の平均サイズと長さの変動を評価しました。残りの卵は、標準的な飼育条件のもとで、温度管理された室内に 24 時間保管され、最近羽化した 1 齢幼虫のサブサンプル (餌あたり n ≥ 200) が上記のように測定されました。卵の数と卵と幼虫のサイズは、処理間で比較され、一元配置分散分析と Tukey の事後分析 (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.) を使用していました。
コブ牛、アルシ種から採取したサンプルから、新鮮（採取後 1 時間）、24 時間、72 時間、168 時間経過した尿のヘッドスペース揮発性物質を採取しました。便宜上、尿サンプルは牛がまだ納屋にいる早朝に採取しました。尿サンプルは 10 頭から採取し、各サンプルの 100～200 ml を個別のポリアミド製ベーキングバッグ（Toppits Cofresco、Frischhalteprodukte GmbH and Co.、ミンデン、ドイツ）に移し、蓋付きの 3 l ポリアミド入り塩化ビニル製プラスチックドラムに入れました。各牛の尿サンプルからのヘッドスペース揮発性物質は、直接（新鮮）または室温で 24 時間、72 時間、168 時間熟成させた後に採取しました。つまり、各尿サンプルは各年齢グループを代表するものでした。
ヘッドスペース揮発性物質の収集には、ダイアフラム真空ポンプ（KNF Neuberger、フライブルク、ドイツ）を使用して、活性炭ろ過されたガス流（100 ml min-1）をポリアミドバッグを通して吸着カラムに2.5時間循環させる閉ループシステムを使用しました。コントロールとして、空のポリアミドバッグからヘッドスペース収集を行いました。吸着カラムは、ガラスウールプラグの間にPorapak Q（50/80メッシュ、Waters Associates、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）35mgを入れたテフロンチューブ（5.5 cm x 3 mm id）で作られました。使用前に、カラムを1mlの再蒸留n-ヘキサン（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）と1mlのペンタン（99.0％純度溶媒GCグレード、Sigma Aldrich）でフラッシュしました。吸着された揮発性物質は400μlのペンタンで溶出しました。ヘッドスペースコレクションはプールされ、さらなる分析に使用するまで -20°C で保管します。
宿主探索行動および吸血行動態を示す An の行動反応。新鮮尿、24 時間尿、72 時間尿、168 時間尿から採取したヘッドスペース揮発性抽出物を、直管ガラス嗅覚計 [18] を使用してシロイヌナズナ属蚊の揮発性抽出物について分析した。実験は、An の宿主探索行動のピーク期間である ZT 13-15 に実施した。Arab [19]。ガラス管嗅覚計 (内径 80 cm × 9.5 cm) を上から 3 ± 1 lx の赤色光で照射した。活性炭で濾過し加湿した空気流 (25 ± 2 °C、相対湿度 65 ± 2%) を 30 cm s-1 でバイオアッセイに通過させた。空気は一連のステンレス スチール メッシュ スクリーンを通過することで、層流と均一なプルーム構造が形成される。実験は、嗅覚計の風上端に5cmのコイルから吊るしたヘッドスペース抽出物（L:D、DAB Dental AB）を刺激物として用い、5分ごとに刺激物を交換した。分析には、各ヘッドスペース抽出物を1:10に希釈したものを刺激物として使用した。同量のペンタンを対照として使用した。宿主探索性または吸血性の蚊は、実験開始の2～3時間前に個別の放出ケージに入れられた。放出ケージは嗅覚計の風下側に設置され、蚊は1分間順応させられた後、ケージのバタフライバルブが開かれて放出された。処理または対照への誘引は、放出後5分以内に発生源に接触した蚊の割合として分析された。各ヘッドスペース揮発性抽出物および対照は、少なくとも30回複製され、1日の影響を避けるために、各実験で同数の処理および対照がテストされた。日。宿主および血液摂取者からの応答を求めます。アラビア語とヘッドスペース セットは、名義ロジスティック回帰を使用して分析され、その後、奇数比のペアワイズ比較が行われました (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.)。
アンの産卵反応。新鮮および熟成牛尿のヘッドスペース抽出物をバグドームケージ（30 cm × 30 cm × 30 cm、MegaView Science）で分析した。20 mLの蒸留水を満たしたプラスチックカップ（30 mL、Nolato Hertila）を産卵基質として、ケージの反対側の角に24 cm離して置いた。処理カップには、各ヘッドスペース抽出物を10 μlずつ1:10希釈で加えた。対照カップの調整には同量のペンタンを使用した。位置の影響をコントロールするため、各実験の間に処理カップと対照カップを交換した。血液を与えられた10頭の雌をZT 9-11に実験ケージに放ち、24時間後にカップ内の卵を数えた。産卵指数を計算する式は、（処理カップに産まれた卵の数 - 対照カップに産まれた卵の数）/（産まれた卵の総数）である。各処理は、 8回繰り返します。
ガスクロマトグラフィーと電子アンテナパターン検出（GC-EAD）によるAn.arabiensis雌株の分析を前述の方法[20]に従って実施した。簡単に説明すると、新鮮なヘッドスペース揮発性抽出物を、HP-5カラム（30 m × 0.25 mm id、0.25 μmフィルム厚、Agilent Technologies）を装備したAgilent Technologies 6890 GC（サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を使用して分離した。尿を老化させた。移動相として水素を使用し、平均線流量は45 cm s-1とした。各サンプル（2 μl）をスプリットレスモードで30秒間注入し、入口温度は225 °Cとした。GCオーブンの温度は、10 °C min-1で35 °C（3分間保持）から300 °C（10分間保持）までプログラムした。GC流出液スプリッターでは、4 psiの窒素が追加され、Gerstel 3D/2低デッドボリュームクロス（Gerstel、Mülheim、DE）で、炎イオン化検出器とEADの間で1：1に分割された。EAD用のGC流出液キャピラリーは、GCオーブン温度プラス5 °Cを追跡するGerstel ODP-2トランスファーラインを通過し、ガラスチューブ（10 cm × 8 mm）に送られ、そこで炭素濾過された、加湿空気（1.5 l/分）で試験した。アンテナはチューブの出口から0.5cm離れたところに設置した。個々の蚊は1回の反復試験とし、宿主探索型の蚊については、各年齢の尿サンプルで少なくとも3回の反復試験を実施した。
GCと質量分析計（GC-MS; 6890 GCおよび5975 MS; Agilent Technologies）を組み合わせた装置を用いて、70 eVの電子衝撃イオン化モードでGC-EAD分析における触角応答を誘発し、新鮮および熟成牛尿のヘッドスペースコレクション中の生理活性化合物を同定しました。GCには、HP-5MS UIコーティングされたフューズドシリカキャピラリーカラム（内径60 m × 0.25 mm、フィルム厚0.25 μm）が装備されており、移動相にはヘリウムを使用し、平均線流量は35 cm s-1でした。GC-EAD分析と同じインジェクタ設定とオーブン温度を使用して、2 μlのサンプルを注入しました。化合物は、保持時間（Kovát指数）と、カスタムライブラリおよびNIST14ライブラリ（Agilent）と比較した質量スペクトルに基づいて同定されました。同定された化合物は、真正標準（追加ファイル定量のために、ヘプチルアセテート（10 ng、化学純度99.8％、Aldrich）を外部標準として注入した。
新鮮尿および熟成尿中に同定された生理活性化合物からなる合成臭気混合物が、宿主探索性蚊および吸血性蚊Ans.arabiensisを誘引する効果を、上記と同じ嗅覚計およびプロトコルを用いて評価した。合成混合物は、新鮮尿、24時間尿、48時間尿、72時間尿、および168時間熟成尿の混合ヘッドスペース揮発性抽出物中の化合物の組成および割合を模倣した（図5D-G；追加ファイル1：表S2）。分析には、完全合成混合物の1:100希釈液10μlを使用し、総放出速度は約140～2400 ng/hの範囲で、宿主および吸血性蚊に対する誘引性を評価した。その後、完全混合物から単一化合物の減算混合物を除去した完全混合物に対して試験を行った。宿主および吸血蚊Ans.Arab vs 合成および減算混合物混合物は、名義ロジスティック回帰を使用して分析され、続いて奇数比の対比較が行われました（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.）。
牛の尿がマラリア蚊の宿主生息地の手がかりとなるかどうかを評価するために、上記のように採取した新鮮な牛の尿と古い牛の尿、および水を、網目模様の 3 リットルのバケツ (100 ml) に入れて、宿主餌トラップに設置しました。 (BG-HDT 版、BioGents、ドイツ、レーゲンスブルク)。村落から 400 m 離れた牧草地 (エチオピア、シライ、北緯 5°53´24´´、東経 37°29´24´´) に 50 m 間隔でトラップ 10 個を設置しました。宿主の存在をシミュレートするために 5 つのトラップを加熱し、残りの 5 つのトラップは加熱しませんでした。各処理場所は、合計 5 晩、毎晩ローテーションしました。異なる年齢の尿を餌にしたトラップで捕獲された蚊の数を、ベータ二項分布 (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.) を使用したロジスティック回帰を使用して比較しました。
エチオピア、オロミア州マキの町の近くにあるマラリアが風土病となっている村（北緯 8° 11′ 08″、東経 38° 81′ 70″、図 6A）で調査が行われました。調査は、毎年恒例の屋内残留散布が行われる前の 8 月中旬から 9 月中旬まで、長い雨季の間に実施されました。村の郊外にある 5 組の家（20～50 メートル離れている）が調査のために選ばれました（図 6A）。家の選択基準は、家の中に動物を入れないこと、屋内での調理（薪や木炭をくべること）が禁止されていること（少なくとも試験期間中）、最大でも 2 人までの居住者がいて、寝るときは殺虫剤を使用していない家であることでした。処理済みの蚊帳の下で。世界医師会ヘルシンキ宣言で確立されたガイドラインに従い、アディスアベバ大学自然科学部（CNS-IRB）の機関研究倫理審査委員会（IRB/022/2016）により倫理的承認が与えられている。各世帯主からの同意は、保健普及スタッフの協力を得て得られた。プロセス全体は、地区および区（「ケベレ」）レベルの地方行政により支持されている。実験デザインは 2 × 2 ラテン方格設計に従い、合成混合物とコントロールを最初の夜にペアの家に割り当てられ、次の実験夜に家間で交換された。このプロセスは 10 回繰り返された。さらに、選択した家における蚊の活動を推定するために、CDC トラップを、フィールド試験の開始、中間、終了時に 5 夜連続して同じ時間帯に実行するように設定した。
6種類の生理活性化合物を含む合成混合物をヘプタン（97.0%溶媒GCグレード、シグマアルドリッチ）に溶解し、綿芯ディスペンサー[20]を使用して140 ng h-1で放出しました。このウィックディスペンサーにより、12時間の実験中、すべての化合物が一定の割合で放出されました。ヘプタンは対照として使用しました。バイアルは、疾病管理予防センター（CDC）ライトトラップ（John W. Hock Company、フロリダ州ゲインズビル、米国；図6A）の入口の隣に吊り下げられました。トラップは、ベッドの足元近くの地面から0.8～1 mの高さに吊り下げられ、ボランティアは未処理の蚊帳の下で就寝し、18:00から06:30の間に操作しました。その後、性別と生理学的状態（未吸血、吸血、半妊娠、妊娠[21]）別に捕獲された蚊は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析を使用して種を特定しました。形態学的にはA. gambiae slと同定されている。複合体[23]のメンバーである。野外調査では、誘引力を従属変数、処理（合成混合物 vs. 対照）を固定効果とする名義ロジスティックモデルを用いて、2棟の巣箱におけるトラップ捕獲を分析した（JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.）。ここでは、尤度比検定から得られたχ2値とp値を報告する。
安全かどうかを評価します。arabiensis は、宿主探索行動および吸血行動態の雌の摂食試験後 4 日（dpe）に、投与後 48 時間以内に尿（主な窒素源である尿素）を直接摂食によって得ることができました（図 1A）。宿主探索行動および吸血行動態の雌はどちらも、他のどの食事や水よりも有意に多くのショ糖を吸収しました（それぞれ F(5,426) = 20.15、p < 0.0001 および F(5,299) = 56.00、p < 0.0001、図 1B、C）。さらに、宿主探索行動の雌は、168 時間の尿と比較して、72 時間の尿で摂食量が少なかった（図 1B）。尿素を含む食事を与えた場合、宿主探索行動の雌は、他のすべての濃度および水と比較して、2.69 mM で有意に多くの尿素を吸収しましたが、尿素含有食からの摂取量は、10％ショ糖と区別がつかなかった（F（10,813）= 15.72、p < 0.0001、図1D）。これは、血液を与えられた雌の反応とは対照的であった。血液を与えられた雌は、通常、水よりも尿素含有食を有意に多く吸収したが、10％ショ糖よりは有意に少なかった（F（10,557）= 78.35、p < 0.0001、図1E）。さらに、2つの生理学的状態を比較すると、瀉血された雌は、最低濃度で宿主探索雌よりも多くの尿素を吸収し、これらの雌は、より高い濃度で同様の量の尿素を吸収した（F（1,953）= 78.82、p < 0.0001、図1F、G）。尿素含有食からの摂取量は最適値を持つように見えた（図1D、E）では、両方の生理学的状態の雌は、尿素濃度の範囲全体にわたって尿素の吸収量を対数線形に調節することができました（図1F、G）。同様に、蚊は尿の吸収量を調節することによって窒素の摂取を制御しているように見えます。尿中の窒素の量は吸収量に反映されるからです（図1B、C、Bの挿入図）。
宿主探索性および吸血性の蚊の生存に対する尿と尿素の影響を評価するために、雌に4つの年齢（新鮮、24時間後、72時間後、および168時間後）の尿とさまざまな尿素濃度、および蒸留水と対照として10％ショ糖を与えた（図2A）。この生存分析では、宿主探索性の雌（尿：χ2 = 108.5、df = 5、p < 0.0001、尿素：χ2 = 122.8、df = 5、p < 0.0001、図2B、C）および吸血性の雌（尿：χ2 = 93.0、df = 5、p < 0.0001、尿素：χ2 = 137.9、自由度= 5、p < 0.0001; 図2D、E）。すべての実験において、尿、尿素、水の食事を与えられた雌は、ショ糖食事を与えられた雌と比較して、生存率が有意に低かった（図2B-E）。新鮮な尿と古い尿を与えられた宿主探索雌は異なる生存率を示し、72時間古い尿（p = 0.016）を与えられた雌は最も低い生存確率を示した（図2B）。さらに、135 mM尿素を与えられた宿主探索雌は、水を与えられた対照よりも長く生存した（p < 0.04）（図2C）。水と比較して、新鮮な尿と24時間尿を与えられた雌はより長く生存し（それぞれp = 0.001とp = 0.012、図2D）、72時間尿を与えられた雌は、新鮮な尿と短い尿を与えられた雌よりも長く生存した。 24時間経過した尿（それぞれp < 0.0001およびp = 0.013、図2D）。135 mM尿素を与えられた場合、血液を摂取した雌は、他のすべての尿素および水の濃度よりも長く生存しました（p < 0.013、図2E）。
牛の尿と尿素を摂取したアラビニスハマダラカ（Anopheles arabinis）の宿主と吸血雌の生存。バイオアッセイ（A）では、雌の蚊に、新鮮および熟成牛尿、さまざまな濃度の尿素、ショ糖（10％）、蒸留水（H2O）からなる餌を与えた。宿主探索型（B、C）および吸血型（D、E）の蚊の生存率は、尿（B、D）と尿素（C、E）を摂取したすべての雌、およびショ糖と水を摂取した対照群の雌が死ぬまで、12時間ごとに記録された。
24 時間の飛行ミル試験で測定された総距離とラウンド数は、宿主探索型蚊と吸血型蚊とで異なり、吸血型蚊は全体的に飛行活動が少ないことが示されました (図 3)。新鮮な尿と熟成尿、またはショ糖と水を与えた宿主探索型蚊は明確な飛行パターンを示し (図 3)、新鮮な尿を摂取した雌は夜明けに活動が活発であるのに対し、24 時間および 168 時間経過した尿を摂取した雌は活動が活発でした。尿を摂取した蚊は異なる飛行パターンを示し、主に昼行性でした。ショ糖または 72 時間尿を摂取した雌は 24 時間を通して活動を示しましたが、水を与えた雌は中頃に活動が活発でした。ショ糖を摂取した蚊は深夜と早朝に最も高い活動レベルを示しましたが、72 時間経過した尿を摂取した蚊は 24 時間にわたって活動が着実に低下しました (図3）。
牛の尿と尿素を餌とする、狩猟行動をとる吸血性のアラビニスハマダラカ（Anopheles arabinis）の雌の飛行性能。飛行ミル試験では、新鮮な牛の尿と熟成牛の尿、さまざまな濃度の尿素、スクロース（10%）、蒸留水（H2O）を餌とする雌の蚊を、水平で自由に回転するアーム（上）に繋ぎました。宿主探索行動をとる雌（左）と吸血行動をとる雌（右）について、24時間にわたる各餌の1時間あたりの飛行距離と飛行回数を記録しました（濃い：灰色、明るい：白）。平均距離と平均飛行回数は、概日活動グラフの右側に示されています。エラーバーは平均の標準誤差を示しています。統計分析については本文をご覧ください。
一般的に、宿主探索雌の全体的な飛翔活動は、24時間の飛翔距離のパターンと同様のパターンを示した。平均飛翔距離は摂取した餌によって有意に影響を受け（F(5, 138) = 28.27, p < 0.0001）、72時間尿を摂取した宿主探索雌は他のすべての餌と比較して有意に長い距離を飛翔した（p < 0.0001）。また、ショ糖を摂取した蚊は、新鮮な尿（p = 0.022）および24時間熟成した尿（p = 0.022）を摂取した蚊よりも長く飛翔した。尿餌によって記述される飛翔活動パターンとは対照的に、尿素を摂取した宿主探索雌は、24時間にわたって持続的な飛翔活動を示し、暗期の後半にピークを迎えた（図3）。活動パターンは類似していたが、尿素を摂取した宿主探索雌は有意に長い飛翔距離を示した。吸収濃度に依存して平均飛行距離が増加した（F（5、138）= 1310.91、p < 0.0001）。尿素の濃度に関わらず、宿主探索行動中の雌は水またはショ糖を与えられた雌よりも長く飛行した（p < 0.03）。
吸血蚊の全体的な飛翔活動は、すべての餌において 24 時間にわたって安定して持続しましたが、水を摂取したメスと、新鮮な餌および 24 時間経過した餌を摂取したメスでは、暗期の後半に尿活動が増加しました (画像 3)。尿餌は吸血メスの平均飛翔距離に有意な影響を与えましたが (F(5, 138) = 4.83、p = 0.0004)、尿素餌では影響を与えませんでした (F(5, 138) = 1.36、p = 0.24)。他の尿およびコントロール餌 (新鮮な餌、p = 0.0091、72 時間、p = 0.0022、168 時間、p = 0.001、スクロース、p = 0.0017、dH2O、p = 0.036)。
尿と尿素の摂取が生殖パラメータに与える影響は、産卵バイオアッセイ（図4A）で評価され、各雌が産んだ卵の数、卵の大きさ、および新たに孵化した1齢幼虫に基づいて調査されました。産まれた卵の数。尿を与えられたアラブの雌は、食事によって異なりました（F（5,222）= 4.38、p = 0.0008、図4B）。24時間尿、血液ミールを与えられた雌は、他の尿ミールを与えられた雌よりも有意に多くの卵を産み、ショ糖を与えられた雌と似ていました（図4B）。同様に、尿を与えられた雌が産んだ卵のサイズは食事によって異なり（F（5、209）= 12.85、p < 0.0001）、24時間尿とショ糖を与えられた雌は、水を与えられた雌よりも有意に大きい卵を産みましたが、 168時間の尿を与えられた雌は有意に小さかった（図4C）。さらに、尿餌は幼虫のサイズに有意な影響を及ぼし（F（5、187）= 7.86、p < 0.0001）、24時間および72時間齢の尿を与えられた雌が産んだ卵から生まれた幼虫は、卵幼虫から産まれた卵から生まれた幼虫よりも有意に大きかった。水を与えた雌と168時間尿を与えられた雌（図4D）。
牛の尿と尿素を摂取した雌のAnopheles arabinisの繁殖成績。吸血した雌の蚊に、新鮮および熟成牛の尿、様々な濃度の尿素、ショ糖（10%）、蒸留水（H2O）からなる餌を48時間与えた後、生物検定にかけ、産卵基質を採取した（A）。卵数（B、E）、卵の大きさ（C、F）、幼虫の大きさ（D、G）は、与えられた餌（牛の尿：BD、尿素：EG）によって有意に影響を受けた。異なる文字名を用いて測定した各パラメータの平均値は、互いに有意に異なっていた（Tukeyの事後分析を用いた一元配置分散分析、p < 0.05）。エラーバーは平均の標準誤差を表す。
尿素は尿の主な窒素成分であるため、吸血雌に餌として与えると、すべての研究で生殖パラメータに有意な影響を及ぼしました。吸血後に尿素を与えられた雌が産んだ卵の数は、尿素濃度に依存しており (F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001)、134 µM ～ 1.34 mM の尿素濃度を与えられた雌の方が多くの卵を産みました (図 4E)。134 µM 以上の尿素濃度を与えられた雌は、水を与えられた雌よりも大きな卵を産み (F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; 図 4F)、幼虫のサイズは、母親の尿素濃度が同程度であったにもかかわらず (F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001)、より変動が大きかったです (図4G)。
宿主を求めるウシ尿のヘッドスペース揮発性抽出物に対する全体的な魅力。ガラス管嗅覚計で評価したアラビエンシス（図5A）は、尿の年齢によって有意に影響を受けていました（χ2 = 15.9、df = 4、p = 0.0032、図5B）。事後分析では、24時間後の古い尿の臭いは、他のすべての処理と比較して有意に高いレベルの魅力を引き起こしました（72時間：p = 0.0060、168時間：p = 0.012、ペンタン：p = 0.00070）。新鮮な尿の臭いを除いて（p = 0.13、図5B）。吸血蚊の尿の臭いに対する全体的な魅力には有意差はありませんでしたが（χ2 = 8.78、df = 4、p = 0.067、図5C）、これらの雌は72時間熟成した尿と比較すると、ヘッドスペース揮発性抽出物に対する誘引性が有意に高かった（p = 0.0066、図5C）。
宿主および吸血蚊Anopheles arabianusの探索における、天然および合成牛尿臭に対する行動反応。ガラス管嗅覚計の概略図（A）。新鮮および熟成牛尿のヘッドスペース揮発性抽出物が宿主（B）および吸血蚊（C）に引き寄せられる様子。Lord Anの触手反応を見つける。新鮮（D）、24時間（E）、72時間（F）、および168時間（G）熟成牛尿から単離されたヘッドスペース抽出物を示す。電子アンテナ検出（EAD）トレースは、ガスクロマトグラフから溶出され、水素炎イオン化検出器（FID）によって検出されたヘッドスペース中の生理活性化合物に対する電圧変化を示す。スケールバーは、応答振幅（mV）と保持時間（秒）の関係を示す。生理活性化合物の特性と放出速度（µg h-1）を示す。アスタリスク（*）は、一貫して低振幅であることを示す。応答。二重アスタリスク（**）は再現できない応答を示す。宿主（H）と吸血（I）An.arabiensisは、新鮮な牛の尿と古い牛の尿の合成混合物に対して異なる魅力を持っている。異なる文字名に引き寄せられた蚊の平均割合は、互いに有意に異なっていた（Tukeyの事後分析を用いた一元配置分散分析、p < 0.05）。エラーバーは、スケールの標準誤差を表す。
産卵期の血液摂取72時間後と120時間後の雌のAnn.arabiensisでは、ペンタン対照群と比較して、新鮮および熟成牛尿からのヘッドスペース揮発性抽出物に対する選好性は示されなかった（χ2 = 3.07、p> 0.05、追加ファイル1：図S1）。
メスの Ann.arabiensis については、GC-EAD および GC-MS 分析により、8、6、3、3 つの生理活性化合物が特定されました (図 5D-G)。電気生理学的反応を誘発する化合物の数には違いが見られましたが、これらの化合物のほとんどは、新鮮な尿と古い尿から採取された各ヘッドスペース揮発性抽出物に存在していました。したがって、各抽出物については、メスの触角から閾値を超える生理学的反応を引き起こした化合物のみが、以降の分析に含められました。
ヘッドスペースコレクションにおける生物活性化合物の全揮発性放出率は、主にp-クレゾールとm-ホルムアルデヒドフェノールの増加とフェノールにより、新鮮尿での29 µg h-1から168時間経過した尿での242 µg h-1に増加しました。対照的に、2-シクロヘキセン-1-オンやデカナールなどの他の化合物の放出率は尿の老化とともに減少し、これはクロマトグラム（図5D-G左パネル）における信号強度（存在量）の観察された減少およびこれらの化合物に対する生理学的反応（図5D-G右パネル）と相関していました。
全体的に、合成混合物は、新鮮尿と熟成尿のヘッドスペースの揮発性抽出物で特定された生理活性化合物の自然な比率と同様であり (図 5D–G)、宿主探索 (χ2 = 8.15、df = 4、p = 0.083、図 5H) や吸血蚊 (χ2 = 4.91、df = 4、p = 0.30、図 5I) に対して有意な魅力を引き出すようには見えませんでした。ただし、処理間の事後一対比較では、宿主探索蚊はペンタンコントロールと比較して、24時間熟成した尿の合成混合物に対して有意に魅力的であることが示されました (p = 0.0086、図 5H)。
24時間熟成した尿の合成混合物における個々の成分の役割を評価するために、個々の化合物を除去したYチューブアッセイで、6つの減算混合物を完全混合物に対して評価しました。宿主探索蚊の場合、完全混合物から個々の化合物を減算すると、行動反応に有意な影響がありました（χ2 = 19.63、df = 6、p = 0.0032、追加ファイル1：図S2A）。すべての減算混合物は、完全に混合されたものよりも誘引性が低かったです。対照的に、完全合成混合物から個々の化合物を除去しても、吸血蚊の行動反応には影響しませんでした（χ2 = 11.38、df = 6、p = 0.077）。ただし、デカナールは、完全混合物の誘引性と比較してレベルが低かったです（p = 0.022、追加ファイル1：図S2B）。
エチオピアのマラリア流行地の村で、24時間牛の尿の合成混合物が野外条件下で蚊を誘引する有効性を10夜にわたって評価しました（図6A）。合計4,861匹の蚊が捕獲・同定され、そのうち45.7%がAnthropus.gambiae sl、18.9%がAnopheles pharoensis、35.4%がCulex sppでした（追加ファイル1：表S1）。Anopheles arabinisは、PCR分析によって特定されたAn.Gambian種複合体のメンバーのみです。平均して、一晩あたり320匹の蚊が捕獲され、その間、合成混合物餌を使用したトラップは、混合物を使用しないトラップよりも多くの蚊を捕獲しました（χ2（0、3196）= 170.0、p < 0.0001）。餌なしトラップ試験開始時、中間時、終了時の5日間の対照夜にそれぞれトラップを設置した。各トラップペアで捕獲された蚊の数は同程度であり、家屋間の偏りはなく（χ2（0, 1665）= 9 × 10-13、p> 0.05）、研究期間中の個体数の減少もなかったことが示された。対照トラップと比較して、合成混合物を含むトラップで捕獲された蚊の数は有意に増加した：宿主探索（χ2（0, 2107）= 138.7、p<0.0001）、最近の吸血（χ2（0, 650）= 32.2、p<0.0001）、妊娠（χ2（0, 228）= 6.27、p = 0.0123；追加ファイル1：表S1）。これは捕獲された蚊の総数にも反映されており、宿主探索＞吸血＞妊娠> 半妊娠 > 男性。
24時間合成牛尿臭気混合物の有効性の現地評価。現地試験は、疾病予防管理センター（CDC）ライトトラップ（右）を2軒の鶏舎に設置し、エチオピア中南部（地図）のマキ（挿入）付近で実施しました（航空写真）（A）。合成臭気を餌としたCDCフォトトラップは、異なる方法で、アラベスクハマダラカ（B）を誘引して捕獲しますが、ファロハマダラカ（C）は誘引して捕獲しません。これは生理的状態に依存する効果です。さらに、これらのトラップでは、宿主であるイエカの捕獲数が有意に増加しました。（D）対照群と比較。左側のバーは、臭気餌（緑）と対照群（オープン）トラップのペアで捕獲された蚊の平均選択指数（N = 10）を示し、右側のバーは対照群（オープン、N = 5）のペアで捕獲された蚊の平均選択指数を示します。アスタリスクは統計的有意水準を示す（*p = 0.01、***p < 0.0001）
3 種は、合成混合物を含むトラップで異なる方法で捕獲されました。宿主を探している蚊 (χ2(1, 1345) = 71.7、p < 0.0001)、吸血 (χ2(1, 517) = 16.7、p < 0.0001)、および妊娠 (χ2(1, 180) = 6.11、p = 0.0134) について、合成混合物を放出したトラップに .arabiensis が捕獲されました (図 6B)。An の量に違いはありませんでした。さまざまな生理学的状態の Pharoensis が見つかりました (図 6C)。Culex については、対照トラップと比較して、合成混合物を餌にしたトラップでのみ、宿主を探している蚊の数に有意な増加が見られました (χ2(1,1319) = 12.6、p = 0.0004、図 6D)。
エチオピアの繁殖地と農村地域の間の潜在的宿主の外側に設置された宿主ベイトトラップは、マラリア蚊が宿主生息地の手がかりとして牛の尿の臭いを利用しているかどうかを評価するために使用された。宿主の手がかりや熱がない場合、また牛の尿の臭いの有無にかかわらず、蚊は捕獲されなかった（追加ファイル1：図S3）。しかし、高温と牛の尿の臭いがある場合、尿の年齢に関係なく、少数ではあるが雌のマラリア蚊が引き寄せられ、捕獲された（χ2（5、25）= 2.29、p = 0.13、追加ファイル1：図S3）。対照的に、水コントロールでは高温でマラリア蚊は捕獲されなかった（追加ファイル1：図S3）。
マラリア蚊は、他の昆虫と同様に、牛の尿（つまり、水たまり）を代償的に摂食することで窒素含有化合物を獲得・分配し、生活史特性を強化します [2, 4, 24, 25, 26]。牛の尿は、マラリア媒介昆虫の休息場所（牛舎、農村部の住居や産卵場所の近くの背の高い植物など）と密接に関連する、容易に入手可能な再生可能な資源です。雌蚊は匂いでこの資源を見つけ、尿中の主要窒素成分である尿素を含む尿中の窒素化合物の摂取を調節することができます [15, 16]。雌蚊の生理状態に応じて、尿中の栄養素は、宿主を求める雌蚊の飛翔活動と生存、および最初のゴナドトロピン周期中の吸血個体の​​生存と生殖特性を強化するために配分されます。したがって、尿の混合はマラリアにとって重要な栄養的役割を果たしますベクターは栄養失調の成虫のように閉じた体で、メスの蚊に低リスクの摂食行動によって重要な窒素化合物を獲得する能力を与えるため[8]、この行動はベクターにとって有利である。この発見は重大な疫学的結果をもたらす。メスの平均寿命、活動性、生殖能力が増すため、これらはすべてベクターの能力に影響を及ぼすからである。さらに、この行動は将来のベクター管理プログラムの対象となる可能性がある。