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最近、人工水ナノ構造（EWNS）を用いたナノテクノロジーに基づく、化学薬品を使用しない抗菌プラットフォームが開発されました。EWNSは表面電荷が高く、活性酸素種（ROS）で飽和しており、食品媒介性病原体を含む多くの微生物と相互作用して不活性化することができます。本研究では、合成中にEWNSの特性を微調整・最適化することで、抗菌力をさらに高めることができることが示されています。EWNS実験プラットフォームは、合成パラメータを変更することでEWNSの特性を微調整できるように設計されています。最新の分析手法を用いて、EWNSの特性（電荷、サイズ、ROS含有量）を解析しました。さらに、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、リステリア・イノキュアス、マイコバクテリウム・パラアクシデンタム、サッカロミセス・セレビシエなどの食品媒介性微生物に対する微生物不活性化能も評価しました。ここで示した結果は、EWNSの特性を合成中に微調整することで、不活化効率が飛躍的に向上することを示しています。特に、表面電荷は4倍に増加し、活性酸素種も増加しました。微生物除去率は微生物の種類に依存し、40,000 #/ccのEWNSエアロゾルに45分間曝露した後、1.0～3.8 logの範囲でした。
微生物汚染は、病原体またはその毒素の摂取によって引き起こされる食中毒の主な原因です。米国だけでも、食中毒により毎年約7,600万人が罹患し、32万5,000人が入院し、5,000人が死亡しています1。さらに、米国農務省（USDA）は、米国で報告されている食中毒の48%は生鮮食品の消費量の増加に起因すると推定しています2。米国における食中毒による病原体による疾病と死亡のコストは非常に高く、米国疾病予防管理センター（CDC）の推定によると、年間156億ドルを超えています3。
現在、食品の安全性を確保するための化学的4、放射線5、熱6による抗菌介入は、継続的に行われるのではなく、生産チェーンに沿った限定重要管理点（CCP）（通常は収穫後および/または包装中）で行われることがほとんどです。そのため、交差汚染が発生しやすくなります。7. 食中毒や食品の腐敗をより適切に管理するには、環境への影響とコストを削減しながら、農場から食卓までの連続体全体に適用できる可能性のある抗菌介入が必要です。
最近、人工水ナノ構造（EWNS）を用いて表面および空気中の細菌を不活性化できる、化学物質を使用しないナノテクノロジーベースの抗菌プラットフォームが開発されました。EWNSは、エレクトロスプレーと水のイオン化という2つの並行プロセスを用いて合成されました（図1a）。これまでの研究で、EWNSは独自の物理的および生物学的特性を持つことが示されています8,9,10。EWNSは、構造あたり平均10個の電子を持ち、平均ナノスケールサイズは25 nmです（図1b、c）8,9,10。さらに、電子スピン共鳴（ESR）により、EWNSには大量の活性酸素種（ROS）、主にヒドロキシル（OH•）およびスーパーオキシド（O2-）ラジカルが含まれていることが示されました（図1c）8。EVNSは空気中に長時間存在し、空気中に浮遊している微生物や表面に存在する微生物と衝突して、ROSペイロードを送達し、微生物の不活性化を引き起こします（図1d）。これらの初期研究では、EWNSが表面上および空気中の様々なグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌（結核菌を含む）と相互作用し、不活化できることも示されました。透過型電子顕微鏡観察では、この不活化は細胞膜の破壊によって引き起こされることが示されました。さらに、急性吸入試験では、高用量のEWNSが肺損傷や炎症を引き起こさないことが示されています8。
(a) エレクトロスプレーは、液体が入った毛細管と対電極の間に高電圧を印加すると発生します。(b) 高圧を加えると、(i) 水のエレクトロスプレーと (ii) EWNS に捕捉された活性酸素種（イオン）の形成という 2 つの異なる現象が発生します。(c) EWNS の独自の構造。(d) ナノスケールの性質により、EWNS は非常に移動性が高く、空気中の病原体と相互作用する可能性があります。
EWNS抗菌プラットフォームが、生鮮食品表面の食中毒微生物を不活化する能力があることも最近実証されました。また、EWNSの表面電荷と電界を組み合わせることで、標的への送達を実現できることも示されています。さらに、有機トマトを約50,000 #/cm3のEWNSに90分間曝露した後の予備的な結果は有望で、大腸菌やリステリア11などのさまざまな食中毒微生物が観察されました。さらに、予備的な官能検査では、対照トマトと比較して感覚への影響は見られませんでした。これらの初期の不活化結果は、50,000 #/ccという非常に低いEWNS用量であっても、食品安全用途にとって有望ですが、感染と腐敗のリスクをさらに低減するには、不活化ポテンシャルが高いほど有益であることは明らかです。
本研究では、EWNSの合成パラメータの微調整と物理化学的特性の最適化を可能にし、抗菌活性を高めるEWNS生成プラットフォームの開発に焦点を当てます。特に、最適化においては、表面電荷の増加（標的への送達向上）とROS含有量の増加（不活化効率向上）に重点を置いています。最新の分析手法を用いて、E. などの一般的な食品微生物を用いて、最適化された物理化学的特性（サイズ、電荷、ROS含有量）を解析します。
EVNSは、高純度水（18 MΩ cm–1）の同時エレクトロスプレーとイオン化によって合成されました。電気ネブライザー12は、液体の霧化、および制御されたサイズのポリマーおよびセラミック粒子13と繊維14の合成に一般的に使用されます。
以前の文献 8, 9, 10, 11 で詳述されているように、典型的な実験では、金属毛細管と接地された対電極の間に高電圧が印加されました。このプロセス中に、i) エレクトロスプレーと ii) 水のイオン化という 2 つの異なる現象が発生します。2 つの電極間の強力な電界により、凝縮水の表面に負電荷が蓄積され、テイラーコーンが形成されます。その結果、高電荷の水滴が形成され、レイリー理論 16 に従い、小さな粒子に分解され続けます。同時に、強力な電界により一部の水分子が分裂して電子を剥ぎ取り (イオン化)、大量の活性酸素種 (ROS) が形成されます 17。同時に生成された ROS 18 は EWNS に封入されました (図 1c)。
図2aは、本研究でEWNS合成に開発され、使用されたEWNS生成システムを示しています。密閉ボトルに保存された精製水は、テフロンチューブ（内径2mm）を介して30Gステンレス鋼ニードル（金属毛細管）に供給されました。図2bに示すように、水の流れはボトル内の空気圧によって制御されます。ニードルはテフロンコンソールに取り付けられており、対電極から特定の距離に手動で調整できます。対電極は、中央にサンプリング用の穴が開いた研磨されたアルミニウムディスクです。対電極の下にはアルミニウムサンプリング漏斗があり、サンプリングポートを介して実験装置の残りの部分に接続されています（図2b）。サンプラーの動作を妨げる可能性のある電荷の蓄積を回避するために、すべてのサンプラーコンポーネントは電気的に接地されています。
(a) エンジニアリングウォーターナノ構造生成システム（EWNS）。(b) サンプラーとエレクトロスプレーの断面図。最も重要なパラメータを示しています。(c) 細菌不活化のための実験装置。
上述のEWNS生成システムは、主要な動作パラメータを変更することで、EWNS特性の微調整を容易にします。印加電圧（V）、針と対電極間の距離（L）、および毛細管を通過する水流（φ）を調整することで、EWNS特性を微調整できます。異なる組み合わせを表す記号は[V（kV）、L（cm）]です。水流を調整することで、特定の組み合わせ[V、L]で安定したテイラーコーンが得られます。本研究では、対電極の開口部径（D）は0.5インチ（1.29 cm）に設定しました。
形状の制約と非対称性のため、電界強度を第一原理から計算することはできません。代わりに、QuickField™ソフトウェア（スベンボー、デンマーク）19を用いて電界を計算しました。電界は均一ではないため、キャピラリー先端の電界値を様々な構成における基準値として使用しました。
本研究では、電圧と針と対電極間の距離の複数の組み合わせについて、テイラーコーンの形成、テイラーコーンの安定性、EWNS生成の安定性、および再現性の観点から評価しました。様々な組み合わせは補足表S1に示されています。
EWNS 生成システムの出力は、粒子数濃度測定用の走査型移動度粒子サイズ分析装置 (SMPS、モデル 3936、TSI、ミネソタ州ショアビュー) に直接接続され、またエアロゾルファラデー電位計 (TSI、モデル 3068B、ミネソタ州ショアビュー) にも接続されました。 ) は、以前の出版物で説明したように測定されました。 SMPS とエアロゾル電位計の両方で、流量 0.5 L/分 (合計サンプル流量 1 L/分) でサンプリングしました。 粒子数濃度とエアロゾル流量は 120 秒間測定されました。 測定は 30 回繰り返されます。 電流測定に基づいて、総エアロゾル電荷が計算され、選択された EWNS 粒子の特定の総数に対する平均 EWNS 電荷が推定されます。 EWNS の平均コストは、式 (1) を使用して計算できます。
ここで、IEl は測定電流、NSMPS は SMPS で測定されたデジタル濃度、φEl は電位計あたりの流量です。
相対湿度 (RH) は表面電荷に影響を与えるため、実験中は温度と (RH) はそれぞれ 21°C と 45% で一定に保たれました。
原子間力顕微鏡（AFM）、Asylum MFP-3D（Asylum Research、カリフォルニア州サンタバーバラ）およびAC260Tプローブ（Olympus、東京、日本）を用いて、EWNSのサイズと寿命を測定した。AFMの走査周波数は1Hz、走査領域は5μm×5μm、走査線数は256本であった。全ての画像は、Asylumソフトウェア（マスク範囲100nm、閾値100pm）を用いて1次画像アライメントを行った。
試験漏斗を取り外し、雲母表面を対電極から 2.0 cm の距離に置き、平均時間 120 秒間、粒子の凝集と雲母表面での不規則な液滴の形成を回避しました。EWNS は、切りたての雲母 (Ted Pella、カリフォルニア州レディング) の表面に直接スプレーされました。AFM スパッタリング直後の雲母表面の画像。切りたての未改質雲母の表面の接触角は 0° に近いため、EVNS はドーム状に雲母表面に分布しています。拡散する液滴の直径 (a) と高さ (h) は AFM トポグラフィーから直接測定され、以前に検証した方法を使用して EWNS のドーム状拡散体積を計算するために使用されました。搭載されている EWNS が同じ体積であると仮定すると、等価直径は式 (2) を使用して計算できます。
以前に開発した方法に基づき、電子スピン共鳴（ESR）スピントラップを用いてEWNS中の短寿命ラジカル中間体の存在を検出した。エアロゾルは、235 mMのDEPMPO（5-（ジエトキシホスホリル）-5-メチル-1-ピロリン-N-オキシド）（Oxis International Inc.、オレゴン州ポートランド）溶液を含む650 μm Midgetスパージャー（Ace Glass、ニュージャージー州バインランド）に通して泡立てた。すべてのESR測定は、Bruker EMX分光計（Bruker Instruments Inc.、マサチューセッツ州ビレリカ、米国）およびフラットパネルセルを使用して実施した。データの収集および分析には、Acquisitソフトウェア（Bruker Instruments Inc.、マサチューセッツ州ビレリカ、米国）を使用した。ROS特性の判定は、一連の動作条件（-6.5 kV、4.0 cm）に対してのみ実施した。 EWNS 濃度は、インパクターでの EWNS 損失を考慮した後、SMPS を使用して測定されました。
オゾン濃度は、205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies、コロラド州ボルダー)8,9,10 を使用して監視されました。
すべてのEWNSプロパティについて、平均値を測定値として、標準偏差を測定誤差として使用します。最適化されたEWNS属性の値をベースEWNSの対応する値と比較するために、t検定を実施しました。
図 2c は、以前に開発され特性評価された静電集塵 (EPES)「プル」システムを示しており、これは表面での EWNS の標的送達に使用できます。EPES は、強力な電界の影響下でターゲットの表面に直接「誘導」できる EVNS 電荷を使用します。EPES システムの詳細は、Pyrgiotakis らによる最近の出版物 11 で発表されています。つまり、EPES は、先細りの両端を持つ 3D プリントされた PVC チャンバーで構成され、中央に 15.24 cm 離れた 2 つの平行なステンレス鋼 (304 ステンレス鋼、ミラー コーティング) 金属プレートが含まれています。ボードは外部の高電圧源 (Bertran 205B-10R、Spellman、ニューヨーク州ホーポージ) に接続され、下部のプレートは常に正電圧に接続され、上部のプレートは常にアース (フローティング アース) に接続されていました。チャンバーの壁はアルミホイルで覆われており、粒子の損失を防ぐために電気的にアースされています。チャンバーには密閉された前面ローディングドアがあり、高電圧干渉を避けるためにテスト表面をプラスチック製スタンドの上に置いて下部の金属プレートより上に上げることができます。
EPES における EWNS の沈着効率は、補足図 S111 に詳述されている以前に開発されたプロトコルに従って計算されました。
制御室として、2つ目の円筒形フローチャンバーをEPESシステムに直列に接続し、中間HEPAフィルターを用いてEWNSを除去しました。図2cに示すように、EWNSエアロゾルは2つの内蔵チャンバーを通過しました。制御室とEPESの間にあるフィルターは残留EWNSを除去し、温度（T）、相対湿度（RH）、オゾン濃度を一定に保ちます。
生鮮食品を汚染する重要な食中毒微生物が見つかっています。これには、大腸菌 (ATCC #27325)、糞便指標菌、サルモネラ・エンテリカ (ATCC #53647)、食中毒病原菌、リステリア・ハームレス (ATCC #33090)、病原性リステリア・モノサイトゲネスの代替菌でATCC (バージニア州マナサス) 由来、腐敗酵母の代替菌であるサッカロミセス・セレビシエ (ATCC #4098)、およびより耐性のある不活性化細菌であるマイコバクテリウム・パララッキー (ATCC #19686) などがあります。
地元のスーパーでオーガニックのグレープトマトを箱単位でランダムに購入し、使用するまで（最大3日間）4℃で冷蔵保存します。実験に使用したトマトはすべて同じ大きさで、直径約1.3cmです。
培養、接種、曝露、およびコロニー数のプロトコルは、以前の発表および補足データで詳述されています。EWNS の有効性は、接種したトマトを 40,000 #/cm3 に 45 分間曝露することにより評価しました。簡単に説明すると、3 個のトマトを使用して、t = 0 分時点で生存している微生物を評価しました。3 個のトマトを EPES に入れ、40,000 #/cc の EWNS に曝露し (EWNS 曝露トマト)、残りの 3 個をコントロールチャンバーに入れました (コントロールトマト)。両グループのトマトに対して追加処理は行いませんでした。EWNS に曝露したトマトとコントロールトマトは、EWNS の効果を評価するために 45 分後に取り除かれました。
各実験は3回実施し、データ解析は補足データに記載されているプロトコルに従って実施しました。
不活化メカニズムは、照射済みEWNSサンプル（40,000 #/cm3 EWNSエアロゾル濃度で45分間）と、無害な大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、ラクトバチルスの非照射サンプルの沈降によって評価した。粒子は、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）中の2.5%グルタルアルデヒド、1.25%パラホルムアルデヒド、0.03%ピクリン酸に室温で2時間固定された。洗浄後、1%四酸化オスミウム（OsO4）/1.5%フェロシアン化カリウム（KFeCN6）混合液で2時間後固定し、水で3回洗浄した後、1%酢酸ウラニルで1時間インキュベートし、さらに水で2回洗浄した後、50%、70%、90%、100%アルコールで10分間脱水した。その後、サンプルをプロピレンオキシドに1時間浸漬し、プロピレンオキシドとTAAP Epon（Marivac Canada Inc.、カリフォルニア州セントローレン）の1:1混合液に浸漬した。サンプルをTAAB Eponに包埋し、60℃で48時間重合させた。硬化した粒状樹脂を切断し、AMT 2k CCD カメラ (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA) を備えた従来の透過型電子顕微鏡 JEOL 1200EX (JEOL、東京、日本) を使用して TEM で観察しました。
すべての実験は3回繰り返して実施しました。各時点において、細菌洗浄液を3回ずつ播種し、1時点あたり合計9つのデータポイントが得られました。これらの平均値を、その微生物の細菌濃度として使用しました。測定誤差として標準偏差を使用しました。すべてのポイントがカウントされます。
t = 0 分と比較した細菌濃度の減少の対数は、次の式を使用して計算されました。
ここで、C0 は時間 0 (つまり、表面が乾燥した後でチャンバー内に置かれる前) のコントロール サンプル内の細菌濃度であり、Cn は n 分間の暴露後の表面上の細菌濃度です。
45 分間の暴露中に細菌が自然に分解されることを考慮して、45 分後のコントロールと比較した log 減少も次のように計算されました。
ここで、Cnはn時点における対照サンプル中の細菌濃度、Cn-Controlはn時点における対照細菌の濃度です。データは、対照（EWNS曝露なし）と比較した対数減少として示されています。
研究では、電圧と針と対電極間の距離のいくつかの組み合わせが、テイラーコーンの形成、テイラーコーンの安定性、EWNS生成の安定性、および再現性の観点から評価されました。さまざまな組み合わせが補足表S1に示されています。安定した再現可能な特性（テイラーコーン、EWNS生成、および経時的な安定性）を示す2つのケースが包括的な研究のために選択されました。図3に、両方のケースのROSの電荷、サイズ、および含有量の結果を示します。結果は表1にもまとめられています。参考までに、図3と表1の両方に、以前に合成された最適化されていないEWNS8、9、10、11（ベースラインEWNS）の特性が含まれています。両側t検定を使用した統計的有意性の計算は、補足表S2に再公開されています。さらに、追加データには、対電極のサンプリング穴の直径（D）と接地電極と先端間の距離（L）の影響の研究が含まれます（補足図S2およびS3）。
(ac) AFM で測定したサイズ分布。(df) 表面電荷特性。(g) EPR の ROS 特性。
また、上記のすべての条件において、測定されたイオン化電流は2～6μA、電圧は-3.8～-6.5kVであり、このEWNS生成接触モジュール単体の消費電力は50mW未満であったことも重要です。EWNSは高圧下で合成されましたが、オゾン濃度は非常に低く、60ppbを超えることはありませんでした。
補足図S4は、それぞれ[-6.5 kV、4.0 cm]および[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおける電界シミュレーション結果を示しています。[-6.5 kV、4.0 cm]および[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオでは、電界計算値はそれぞれ2 × 105 V/mおよび4.7 × 105 V/mです。後者の場合、電圧距離比がはるかに高いため、これは予想通りです。
図3a、bはAFM8で測定したEWNSの直径を示しています。計算された平均EWNS直径は、[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のスキームでそれぞれ27 nmと19 nmでした。[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオでは、分布の幾何標準偏差はそれぞれ1.41と1.45であり、狭いサイズ分布を示しています。平均サイズと幾何標準偏差はどちらもベースラインEWNSに非常に近く、それぞれ25 nmと1.41です。図3cは、同じ方法と条件で測定したベースEWNSのサイズ分布を示しています。
図3d、eは電荷特性評価の結果を示しています。データは、濃度（#/cm3）と電流（I）の同時測定30回の平均値です。解析の結果、EWNSの平均電荷は、[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]でそれぞれ22 ± 6 e-と44 ± 6 e-でした。これらの表面電荷は、ベースラインEWNS（10 ± 2 e-）と比較して大幅に高く、[-6.5 kV、4.0 cm]のシナリオの2倍、[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオの4倍に相当します。図3fは、ベースラインEWNSの電荷データを示しています。
EWNS数濃度マップ（補足図S5およびS6）から、[-6.5 kV、4.0 cm]シナリオでは[-3.8 kV、0.5 cm]シナリオよりも粒子数が大幅に多いことがわかります。また、EWNS数濃度は最大4時間までモニタリングされており（補足図S5およびS6）、EWNS生成安定性はどちらのケースでも同じレベルの粒子数濃度を示していることも注目に値します。
図3gは、[-6.5 kV、4.0 cm]における最適化されたEWNSコントロール（バックグラウンド）を差し引いた後のEPRスペクトルを示しています。ROSスペクトルは、以前発表された研究におけるBaseline-EWNSシナリオとも比較されました。スピントラップと反応するEWNSの数は7.5 × 104 EWNS/sと計算され、これは以前発表されたBaseline-EWNS8とほぼ同数です。EPRスペクトルは2種類のROSの存在を明確に示しており、O2-が主要な種であり、OH•はそれより少ないことが示されています。さらに、ピーク強度を直接比較すると、最適化されたEWNSはベースラインEWNSと比較してROS含有量が大幅に高いことがわかりました。
図4は、EPESにおけるEWNSの堆積効率を示しています。データは表Iにもまとめられており、元のEWNSデータと比較されています。EUNSのどちらのケースでも、3.0 kVという低電圧でも堆積率は100%に近づいています。通常、表面電荷の変化に関わらず、3.0 kVで100%の堆積率を達成できます。同じ条件下で、Baseline-EWNSの堆積効率は、電荷が低い（EWNSあたり平均10電子）ため、わずか56%でした。
図5および表2は、トマト表面に接種した微生物を、最適モード（-6.5 kV、4.0 cm）で約40,000 #/cm3のEWNSに45分間曝露した後の不活化値をまとめたものです。接種したE. coliとLactobacillus innocuousは、45分間の曝露中に3.8 logの有意な減少を示しました。同じ条件下で、S. entericaは2.2 logの減少、S. cerevisiaeとM. parafortutumは1.0 logの減少を示しました。
電子顕微鏡写真（図6）は、EWNSが無害な大腸菌、連鎖球菌、および乳酸菌細胞に引き起こした物理的変化を示しており、これらの細胞は不活化されている。対照細菌の細胞膜は無傷であったが、曝露された細菌は外膜が損傷していた。
対照細菌と曝露細菌の電子顕微鏡画像では、膜損傷が明らかになりました。
最適化された EWNS の物理化学的特性に関するデータは総合的に、EWNS の特性 (表面電荷および ROS 含有量) が、以前公開された EWNS のベースライン データ8,9,10,11 と比較して大幅に改善されたことを示しています。一方、それらのサイズはナノメートル範囲にとどまり、以前に報告された結果と非常に類似しているため、長期間空気中に留まることができます。観測された多分散性は、EWNS のサイズを決定する表面電荷の変化、レイリー効果のランダム性、および潜在的な凝集によって説明できます。しかし、Nielsen ら 22 によって詳述されているように、高い表面電荷は水滴の表面エネルギー/張力を効果的に増加させることによって蒸発を減少させます。私たちの以前の出版物8 では、この理論はマイクロ液滴 22 と EWNS について実験的に確認されました。時間経過による電荷の損失もサイズに影響を与え、観測されるサイズ分布に寄与する可能性があります。
さらに、構造あたりの電荷量は状況に応じて約22～44 e-であり、これは構造あたり平均10 ± 2電子の基本的なEWNSと比較して大幅に高くなります。ただし、これはEWNSの平均電荷であることに注意する必要があります。Setoらは、電荷が不均一であり、対数正規分布に従うことを示し21ました。私たちの以前の研究と比較すると、表面電荷を2倍にすると、EPESシステムにおける堆積効率はほぼ100%に倍増します11。