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血液脳関門と血液脳関門は、生物治療薬が中枢神経系の標的に到達するのを妨げ、その結果、神経疾患の効果的な治療が妨げられます。in vivo で新しい脳輸送体を発見するために、我々は T7 ファージ ペプチド ライブラリを導入し、カニューレを挿入したラットの意識大プール モデルを使用して血液と脳脊髄液 (CSF) を連続的に収集しました。4 ラウンドの選択後、特定のファージ クローンが CSF に高度に濃縮されました。個々の候補ペプチドのテストにより、CSF が 1000 倍以上濃縮されていることが明らかになりました。ペプチドを介した脳への送達の生物活性は、同定された新規輸送ペプチドに結合したBACE1ペプチド阻害剤を使用した脳脊髄液中のアミロイドβレベルの40%減少によって確認された。これらの結果は、in vivo ファージ選択法によって同定されたペプチドが、治療効果をもたらす高分子を脳に全身送達するための有用な媒体である可能性があることを示唆しています。
中枢神経系（CNS）標的療法の研究は主に、脳への能動的な薬物送達を推進するメカニズムの発見にはあまり力を入れず、CNS標的特性を示す最適化された薬物や薬剤を特定することに重点を置いてきた。ドラッグデリバリー、特に大きな分子が現代の神経科学の医薬品開発に不可欠な部分となっているため、この状況は変わり始めています。中枢神経系の環境は、血液脳関門 (BBB) と血液脳関門 (BCBB) からなる脳血管関門系によって十分に保護されているため、薬物を脳に送達することが困難となっています 1,2。ほぼすべての高分子薬と 98% 以上の低分子薬が脳から除去されると推定されています 3。このため、CNS への治療薬の効率的かつ特異的な送達を提供する新しい脳輸送システムを特定することが非常に重要です 4,5。しかし、BBB と BCSFB は、その広範な血管系を通って脳のすべての構造を貫通して侵入するため、薬物送達の優れた機会も提供します。したがって、脳への非侵襲性送達方法を使用する現在の取り組みは、主に内因性BBB6受容体を使用する受容体媒介輸送(PMT)の機構に基づいている。トランスフェリン受容体経路を使用した最近の重要な進歩にもかかわらず 7,8、特性を改善した新しい送達システムのさらなる開発が必要です。この目的を達成するために、我々の目標は、原理的には高分子をCNSに送達したり、新しい受容体経路を開くために使用できるため、CSF輸送を媒介できるペプチドを同定することでした。特に、脳血管系の特定の受容体および輸送体（BBB および BSCFB）は、生物治療薬の能動的かつ特異的な送達の潜在的な標的として機能する可能性があります。脳脊髄液（CSF）は脈絡叢（CS）の分泌産物であり、くも膜下腔および脳室腔を介して脳の間質液と直接接触しています4。最近、くも膜下脳脊髄液が脳の間質に過剰に拡散していることが示されました9。私たちは、このくも膜下流入路を使用するか、BBB を介して直接実質空間にアクセスしたいと考えています。これを達成するために、我々は、これら 2 つの異なる経路のいずれかによって輸送されるペプチドを理想的に同定する、堅牢な in vivo ファージ選択戦略を実装しました。
ここでは、最高のライブラリー多様性で初期選択ラウンドをモニタリングするために、CSF サンプリングとハイスループット シーケンシング (HTS) を組み合わせた逐次 in vivo ファージ ディスプレイ スクリーニング法について説明します。スクリーニングは、血液汚染を避けるために永久的に埋め込まれた大型槽（CM）カニューレを用いて、意識のあるラットに対して実施された。重要なのは、このアプローチでは、脳を標的とするペプチドと、脳血管関門を越える輸送活性を持つペプチドの両方が選択されることです。我々は、サイズが小さい（約60 nm）10ためT7ファージを使用し、それらが内皮および/または上皮髄質関門の経細胞通過を可能にする小胞の輸送に適していることを示唆しました。4ラウンドのパニングの後、ファージ集団が単離され、in vivoでの強力なCSF富化と脳微小血管関連が示されました。重要なのは、化学的に合成された最良の候補ペプチドがタンパク質カーゴを脳脊髄液に輸送できることを実証することで、我々の発見を確認することができたことです。まず、CNS の薬力学的効果は、主要な輸送ペプチドと BACE1 ペプチドの阻害剤を組み合わせることによって確立されました。in vivo 機能スクリーニング戦略により、効果的なタンパク質輸送体として新規な脳輸送ペプチドを同定できることを実証することに加えて、同様の機能的選択アプローチが新規な脳輸送経路の同定においても重要になることが期待される。
プラーク形成単位 (PFU) に基づいて、ファージパッケージングステップの後、約 109 の多様性を持つランダムな 12 mer 直鎖 T7 ファージ ペプチドのライブラリーが設計および作成されました (「材料と方法」を参照)。in vivo パニングの前にこのライブラリを注意深く分析したことに注意することが重要です。改変されたプライマーを使用したファージライブラリサンプルのPCR増幅により、HTSに直接適用できるアンプリコンが生成されました（補足図1a）。a）HTS11シーケンスエラー、b）プライマー（NNK）1-12の品質への影響、およびc）スタンバイライブラリ内の野生型（wt）ファージ（スケルトンインサート）の存在のため、検証された配列情報のみを抽出するために配列フィルター手順が実装されました（補足図1b）。これらのフィルター手順は、すべての HTS シーケンス ライブラリに適用されます。標準ライブラリの場合、合計 233,868 のリードが取得され、そのうち 39% がフィルター基準を通過し、ライブラリ分析と後続のラウンドの選択に使用されました (補足図 1c–e)。リードは主に 3 塩基対の長さの倍数であり、36 ヌクレオチドにピークがあり (補足図 1c)、ライブラリー設計 (NNK) 1-12 を確認しました。特に、ライブラリーメンバーの約 11% に 12 次元野生型 (wt) バックボーン PAGISRELVDKL インサートが含まれており、配列のほぼ半分 (49%) に挿入または欠失が含まれていました。ライブラリライブラリのHTSは、ライブラリ内のペプチドの高い多様性を確認しました。81％を超えるペプチド配列が1回のみ見つかり、4コピー以上で発生したのはわずか1.5％でした（補足図2a）。レパトア内の12位置すべてのアミノ酸（aa）の頻度は、縮重NKKレパトアによって生成されるコドンの数について予想される頻度とよく相関していました（補足図2b）。これらのインサートによってコードされたaa残基の観察された頻度は、計算された頻度（r = 0.893）とよく相関していました（補足図2c）。インジェクション用のファージライブラリーの調製には、増幅とエンドトキシンの除去のステップが含まれます。これは、ファージ ライブラリの多様性を減少させる可能性があることが以前に示されています 12、13。そこで、エンドトキシンを除去したプレート増幅ファージライブラリーの配列を決定し、それを元のライブラリーと比較して、AA の頻度を推定しました。元のプールと増幅および精製したプールとの間に強い相関関係（r = 0.995）が観察され（補足図2d）、T7ファージを使用してプレート上で増幅されたクローン間の競合が大きな偏りを引き起こさないことを示しました。ライブラリーの多様性 (約 109) は HTS を使用しても完全には捕捉できないため、この比較は各ライブラリーのトリペプチド モチーフの頻度に基づいています。各位置でのaaの頻度分析により、入力されたレパートリーの最後の3つの位置に小さな位置依存の偏りが明らかになりました（補足図2e）。結論として、ライブラリーの品質と多様性は許容範囲内であり、数回の選択ラウンド間のファージライブラリーの増幅と調製による多様性のわずかな変化のみが観察されたと結論付けました。
連続脳脊髄液サンプリングは、意識のあるラットのCMにカニューレを外科的に埋め込むことによって実行でき、BBBおよび/またはBCSFBを介して静脈内（iv）注射されたT7ファージの同定を容易にします（図1a-b）。in vivo 選択の最初の 3 ラウンドでは、2 つの独立した選択アーム (アーム A および B) を使用しました (図 1c)。最初の 3 ラウンドの選択で導入されるファージの総量を減らすことで、選択の厳密性を徐々に高めました。パンニングの 4 ラウンド目では、ブランチ A とブランチ B からのサンプルを結合し、さらに 3 つの独立した選択を実行しました。このモデルにおける T7 ファージ粒子の in vivo 特性を研究するために、野生型ファージ (PAGISRELVDKL マスター インサート) を尾静脈を介してラットに注射しました。さまざまな時点での脳脊髄液および血液からのファージの回収は、比較的小さなT7正二十面体ファージが血液コンパートメントからの迅速な初期クリアランス段階を有することを示した（補足図3）。投与された力価とラットの血液量に基づいて、我々は、わずか約 1 重量％のみがラットの血液量に影響すると計算しました。静脈内注射の 10 分後に、投与量からのファージが血液中に検出されました。この最初の急速な減少の後、より遅い一次クリアランスが測定され、半減期は 27.7 分でした。重要なことに、CSFコンパートメントから回収されたファージはごくわずかであり、CSFコンパートメントへの野生型ファージの移動のバックグラウンドが低いことを示しています（補足図3）。平均して、全サンプリング期間（０～２５０分）にわたって、血液中のＴ７ファージの力価はわずか約１×１０－３％、最初に注入されたファージの４×１０－８％のみが脳脊髄液中で検出された。注目すべきことに、脳脊髄液中の野生型ファージの半減期 (25.7 分) は血液中で観察された半減期と同様でした。これらのデータは、CMカニューレを挿入したラットでは、血液からCSF区画を隔てる障壁が無傷であることを示しており、ファージライブラリーのin vivo選択により、血液からCSF区画に容易に輸送されるクローンを同定できるようになる。
(a) 大きなプールから脳脊髄液 (CSF) を再サンプリングする方法を確立します。（b）中枢神経系（CNS）関門の細胞位置と、血液脳関門（BBB）および血液脳関門を通過するペプチドを同定するために使用される選択戦略を示す図。(c) In vivo ファージディスプレイスクリーニングのフローチャート。選択の各ラウンドで、ファージ (矢印内の動物識別子) が静脈内に注射されました。2 つの独立した代替ブランチ (A、B) は、選択の 4 ラウンド目まで別々に保持されます。選択ラウンド 3 および 4 では、CSF から抽出された各ファージ クローンを手動で配列決定しました。（ d ）T7ペプチドライブラリー（2×1012ファージ/動物）の静脈内注射後の2匹のカニューレ挿入ラットにおける最初の選択ラウンド中に血液（赤い丸）および脳脊髄液（緑の三角）から単離されたファージの動態。青い四角は、総血液量を考慮して、注入されたファージの量から計算された、血液中のファージの平均初期濃度を示します。黒い四角は、血中ファージ濃度から外挿された y 線の交点を示します。(e、f) ペプチド内で見つかったすべての重複トリペプチド モチーフの相対頻度と分布を示します。1000回の読み取りで見つかったモチーフの数が表示されます。有意に（p < 0.001）濃縮されたモチーフは赤い点でマークされます。（ e ）注入されたライブラリーのトリペプチドモチーフの相対頻度を動物#1.1および#1.2の血液由来ファージと比較する相関散布図。(f) 血液および脳脊髄液で単離された動物ファージ トリペプチド モチーフ #1.1 および #1.2 の相対頻度を比較する相関散布図。（g、h）両方の動物におけるインビボ選択のラウンド後の、血液に富んだファージ（g）対注入されたライブラリーおよびCSFに富んだファージ（h）対血液の配列ID表示。1 文字コードのサイズは、そのアミノ酸がその位置にどのくらいの頻度で出現するかを示します。緑 = 極性、紫 = 中性、青 = 塩基性、赤 = 酸性、黒 = 疎水性アミノ酸。図 1a、b は Eduard Urich によって設計および作成されました。
ファージペプチドライブラリを2匹のCM機器ラット（クレードAおよびB）に注入し、脳脊髄液および血液からファージを単離しました（図1d）。ライブラリーの初期の急速なクリアランスは、野生型ファージと比較してそれほど顕著ではありませんでした。両方の動物に注入されたライブラリーの平均半減期は、血中では野生型ファージと同様に 24.8 分、CSF 中では 38.5 分でした。各動物の血液および脳脊髄液のファージサンプルを HTS に供し、同定されたすべてのペプチドを短いトリペプチド モチーフの存在について分析しました。トリペプチドモチーフが選択された理由は、トリペプチドモチーフが構造形成とペプチド-タンパク質相互作用の最小限の基礎を提供するためです14、15。注入されたファージライブラリと両方の動物の血液から抽出されたクローンの間のモチーフの分布に良好な相関関係があることがわかりました（図1e）。データは、ライブラリーの組成が血液コンパートメントでわずかに濃縮されているだけであることを示しています。Weblogo16 ソフトウェアを利用して、各位置のアミノ酸頻度とコンセンサス配列をさらに分析しました。興味深いことに、血中グリシン残留物が大幅に増加していることがわかりました（図1g）。血液をCSFから選択されたクローンと比較した場合、モチーフの強い選択と一部の脱選択が観察され（図1f）、特定のアミノ酸が12メンバーの所定の位置に優先的に存在しました（図1h）。注目すべきことに、個々の動物の脳脊髄液は大きく異なりましたが、血中グリシンの濃縮は両方の動物で観察されました（補足図4a-j）。動物#1.1および#1.2の脳脊髄液中の配列データを厳密にフィルタリングした後、合計964および420の固有の12量体ペプチドが得られました（補足図1d〜e）。単離されたファージ クローンを増幅し、2 回目の in vivo 選択に供しました。2回目の選択ラウンドで抽出されたファージを各動物でHTSに供し、同定されたすべてのペプチドをモチーフ認識プログラムへの入力として使用して、トリペプチドモチーフの出現を分析しました（図2a、b、ef）。CSFから回収されたファージの最初のサイクルと比較して、分岐AおよびBのCSF内の多くのモチーフのさらなる選択および選択解除が観察されました（図2）。ネットワーク識別アルゴリズムを適用して、それらが一貫したシーケンスの異なるパターンを表しているかどうかを判断しました。代替クレードA（図2c、d）とクレードB（図2g、h）のCSFによって回収された12次元配列の間に明らかな類似性が観察されました。各ブランチのプール分析により、12量体ペプチドの異なる選択プロファイル（補足図5c、d）と、最初の選択ラウンドと比較して2回目の選択後のプールされたクローンの経時的なCSF /血液力価比の増加が明らかになりました（補足図5e）。）。
2 回連続の in vivo 機能的ファージディスプレイ選択による脳脊髄液中のモチーフおよびペプチドの濃縮。
各動物（動物#1.1および#1.2）の最初のラウンドから回収されたすべての脳脊髄液ファージをプールし、増幅し、HT配列決定し、一緒に（2×1010ファージ/動物）2匹のSMカニューレ挿入ラット（#1.1→#）に再注射した。2.1 と 2.2、1.2 → 2.3 と 2.4)。(a、b、e、f) 1 回目と 2 回目の選択ラウンドにおけるすべての CSF 由来ファージのトリペプチド モチーフの相対頻度を比較する相関散布図。両方の方向のペプチドに見られる、重複する可能性のあるすべてのトリペプチドを表すモチーフの相対頻度と分布。1000回の読み取りで見つかったモチーフの数が表示されます。比較したライブラリーの 1 つで有意に (p < 0.001) 選択または除外されたモチーフは、赤い点で強調表示されます。(c、d、g、h) in vivo 選択のラウンド 2 および 1 に基づく、CSF に富むすべての 12 アミノ酸長配列の配列ロゴ表示。1 文字コードのサイズは、そのアミノ酸がその位置にどのくらいの頻度で出現するかを示します。ロゴを表すために、2 回の選択ラウンド間の個々の動物から抽出された CSF 配列の頻度が比較され、2 回目の選択ラウンドで濃縮された配列が示されます: (c) #1.1 – #2.1 (d) #1.1 – #2.2 (g) #1.2 – #2.3 および (h) #1.2 – #2.4。(c、d) 動物番号 1 の特定の位置で最も豊富なアミノ酸。2.1といいえ。動物番号 2.2 または (g, h)2.3といいえ。2.4はカラーで表示されます。緑 = 極性、紫 = 中性、青 = 塩基性、赤 = 酸性、黒 = 疎水性アミノ酸。
3回目の選択後、2匹の動物から単離された332個のCSF再構成ファージクローンから124個の固有のペプチド配列（#3.1および#3.2）を同定しました（補足図6a）。配列 LGSVS (18.7%) の相対比率が最も高く、野生型インサート PAGISRELVDKL (8.2%)、MRWFFSHASQGR (3%)、DVAKVS (3%)、TWLFSLG (2.2%)、および SARGSWREIVSLS (2.2%) が続きました。最後の第 4 ラウンドでは、3 匹の別々の動物から独立して選択した 2 つの枝をプールしました (図 1c)。CSFから回収された925個の配列決定されたファージクローンのうち、第4ラウンドで64個の固有のペプチド配列が見つかりました（補足図6b）。そのうち野生型ファージの相対比率は0.8％に低下しました。第 4 ラウンドで最も多かった CSF クローンは、LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)、LGSVS (17%)、GFVRFRLSNTR (14%)、KVAWRVFSLFWK (7%)、SVHGV (5%)、GRPQKINGARVC (3.6%)、および RLSSVDSDLSGC (3、2%) でした。%))。選択されたペプチドの長さの範囲は、NNK ライブラリーの設計に縮重コドンを使用する場合、ライブラリー プライマー内のヌクレオチドの挿入/欠失、または未熟な終止コドンによるものです。早期終止コドンはより短いペプチドを生成し、好ましい aa モチーフを含むため選択されます。合成ライブラリーのプライマーの挿入/欠失により、より長いペプチドが生じる可能性があります。これにより、設計された終止コドンがフレームの外側に配置され、新しい終止コドンが下流に現れるまでそれが読み取られます。一般に、入力データとサンプル出力データを比較することにより、4 つの選択ラウンドすべての濃縮係数を計算しました。スクリーニングの最初のラウンドでは、非特異的なバックグラウンド参照として野生型ファージ力価を使用しました。興味深いことに、ネガティブファージ選択は最初のCSFサイクルでは非常に強力でしたが、血液中ではそうではありませんでした（図3a）。これは、ペプチドライブラリーのほとんどのメンバーがCSFコンパートメントに受動的に拡散する可能性が低いためであるか、または相対的なファージがバクテリオファージよりも効率的に保持または血流から除去される傾向があるためである可能性があります。しかし、パニングの第2ラウンドでは、両方のクレードでCSF中のファージの強力な選択が観察され、前のラウンドではCSFの取り込みを促進するペプチドを表示するファージが豊富であったことが示唆されました（図3a）。繰り返しますが、血液の大幅な濃縮はありません。また、第 3 ラウンドと第 4 ラウンドでは、ファージ クローンの CSF が大幅に濃縮されました。最後の 2 ラウンドの選択間の各固有のペプチド配列の相対頻度を比較すると、4 ラウンドの選択では配列がさらに豊富であることがわかりました (図 3b)。両方のペプチド配向を使用して、合計 931 個のトリペプチド モチーフが 64 個のユニークなペプチド配列すべてから抽出されました。4回目のラウンドで最も濃縮されたモチーフは、注入されたライブラリ（カットオフ：10％濃縮）と比較して、すべてのラウンドにわたる濃縮プロファイルについてより詳しく検査されました（補足図6c）。選択の一般的なパターンは、研究された動機のほとんどが両方の選択ブランチの以前のすべてのラウンドで強化されていることを示しました。ただし、一部のモチーフ (例: SGL、VSG、LGS GSV) は主に代替クレード A 由来でしたが、その他のモチーフ (例: FGW、RTN、WGF、NTR) は代替クレード B に富んでいました。
CSFが豊富なファージディスプレイペプチドおよびストレプトアビジンペイロードに結合したビオチン化リーダーペプチドのCSF輸送の検証。
（ a ）注入された（インプット = I）ファージ（PFU）力価および決定されたCSFファージ力価（アウトプット = O）に基づいて、4つのラウンド（R1〜R4）すべてで計算された濃縮率。最後の 3 ラウンド (R2 ～ R4) の強化係数は、前のラウンドおよび最初のラウンド (R1) と重量データを比較することによって計算されました。白抜きのバーは脳脊髄液、影付きのバーは血漿です。(***p<0.001、スチューデントの t 検定に基づく)。(b) 最も豊富なファージ ペプチドのリスト。第 4 ラウンドの選択後に CSF で収集されたすべてのファージに対する相対比率に従ってランク付けされます。6 つの最も一般的なファージ クローンが、選択のラウンド 3 とラウンド 4 の間で色、番号、およびそれらの濃縮係数で強調表示されています (挿入図)。（ c 、 d ）ラウンド 4 からの 6 つの最も濃縮されたファージ クローン、空のファージおよび親ファージ ペプチド ライブラリーを CSF サンプリング モデルで個別に分析しました。CSF および血液サンプルを指定の時点で収集しました。（ｃ）等量の６つの候補ファージクローン（２×１０１０ファージ／動物）、空のファージ（＃１７７９）（２×１０１０ファージ／動物）およびストックファージペプチドライブラリー（２×１０１２ファージ／動物）を注射し、少なくとも３ＣＭをカニューレ挿入動物に尾静脈を介して別々に投与する。注入された各ファージ クローンおよびファージ ペプチド ライブラリーの経時的な CSF 薬物動態が示されています。(d) は、サンプリング時間にわたるすべての回収されたファージ/mL の平均 CSF/血液比を示します。（ e ）4つの合成リーダーペプチドと1つのスクランブルコントロールを、N末端を介してストレプトアビジンにビオチンで連結し（四量体ディスプレイ）、続いて注射しました（尾静脈iv、10 mgストレプトアビジン/ kg）。少なくとも 3 匹の挿管ラット (N = 3)。）。示された時点でCSFサンプルを収集し、CSF抗ストレプトアビジンELISAによってストレプトアビジン濃度を測定した(nd = 検出されなかった)。(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、ANOVA 検定に基づく)。(f) 最も濃縮されたファージペプチドクローン #2002 (紫) と、4 回目の選択で選択された他のファージ ペプチド クローンのアミノ酸配列の比較。同一または類似のアミノ酸フラグメントは色分けされています。
第 4 ラウンドのすべての濃縮ファージ (図 3b) から、CSF サンプリング モデルでのさらなる個別分析のために 6 つの候補クローンが選択されました。等量の6つの候補ファージ、空のファージ（インサートなし）およびプロファージペプチドライブラリを3匹のカニューレ挿入CM動物に注射し、CSF（図3c）および血液（補足図7）アッセイで薬物動態を決定した。試験したすべてのファージ クローンは、空の対照ファージ (#1779) のレベルよりも 10 ～ 1000 倍高いレベルで CSF コンパートメントを標的としていました。例えば、クローン#2020および#2077は、対照ファージよりも約1000倍高いCSF力価を有していた。選択された各ペプチドの薬物動態プロファイルは異なりますが、それらはすべて高い CSF ホーミング能力を持っています。クローン #1903 および #2011 では時間の経過とともに一定の減少が観察されましたが、クローン #2077、#2002、および #2009 では最初の 10 分間の増加は能動輸送を示している可能性がありますが、検証する必要があります。クローン #2020、#2002、および #2077 は高レベルで安定しましたが、クローン #2009 の CSF 濃度は最初の増加後にゆっくりと減少しました。次に、各CSF候補の相対頻度とその血中濃度を比較しました（図3d）。すべてのサンプリング時間における各ＣＳＦ候補の平均力価とその血液力価との相関関係は、６つの候補のうち３つが血液ＣＳＦにおいて有意に濃縮されていることを示した。興味深いことに、クローン#2077はより高い血液安定性を示しました（補足図7）。ペプチド自体がファージ粒子以外の積荷をCSFコンパートメントに能動的に輸送できることを確認するために、ペプチドがファージ粒子に結合するN末端でビオチンで誘導体化された4つのリーダーペプチドを合成しました。ビオチン化ペプチド (番号 2002、2009、2020、および 2077) をストレプトアビジン (SA) と結合させて、ファージの幾何学的形状をいくらか模倣した多量体形態を得ました。このフォーマットにより、血液および脳脊髄液中の SA 曝露を貨物輸送タンパク質ペプチドとして測定することもできました。重要なことに、合成ペプチドがこのSA結合フォーマットで投与された場合、ファージデータは多くの場合再現できました（図3e）。スクランブルペプチドは、初期曝露が少なく、CSF クリアランスが速く、48 時間以内には検出不可能なレベルでした。これらのペプチドファージクローンのCSF空間への送達経路についての洞察を得るために、in vivoでの静脈内注射の1時間後にファージ粒子を直接検出する免疫​​組織化学（IHC）を使用して、個々のファージペプチドヒットの局在を分析しました。特に、クローン#2002、#2077、および#2009は脳毛細血管の強い染色によって検出できましたが、対照ファージ(#1779)およびクローン#2020は検出されませんでした(補足図8)。これは、これらのペプチドがまさに BBB を通過することによって脳への影響に寄与していることを示唆しています。BSCFB ルートも関与している可能性があるため、この仮説を検証するにはさらに詳細な分析が必要です。最も濃縮されたクローン（#2002）のアミノ酸配列を他の選択されたペプチドと比較すると、それらの一部は同様のアミノ酸伸長を有しており、これは同様の輸送機構を示している可能性があることがわかりました（図3f）。
その独特の血漿プロファイルと経時的なCSFの顕著な増加により、ファージディスプレイクローン#2077をさらに長い48時間にわたって調査し、持続的なSAレベルに関連して観察されるCSFの急速な増加を再現することができました（図4a）。他の同定されたファージクローンに関しては、#2077 は脳毛細血管を強く染色し、より高解像度で観察した場合に毛細血管マーカーレクチンとの顕著な共局在を示し、おそらく実質空間に若干の染色を示しました（図 4b）。ペプチド媒介の薬理効果がCNSで得られるかどうかを調べるために、i) #2077輸送ペプチドおよびii) BACE1阻害ペプチドのビオチン化バージョンを2つの異なる比率でSAと混合する実験を実施しました。1 つの組み合わせでは BACE1 ペプチド阻害剤のみを使用し、もう 1 つの組み合わせでは BACE1 ペプチド阻害剤と #2077 ペプチドを 1:3 の比率で使用しました。両方のサンプルを静脈内に投与し、血液および脳脊髄液中のベータアミロイドペプチド 40 (Abeta40) レベルを経時的に測定しました。Ａβ４０は、脳実質におけるＢＡＣＥ１阻害を反映するため、ＣＳＦにおいて測定された。予想通り、両方の複合体は血中Aβ40レベルを大幅に低下させました（図4c、d）。ただし、ペプチド番号 2 の混合物を含むサンプルに限ります。２０７７およびＳＡに結合したＢＡＣＥ１ペプチドの阻害剤は、脳脊髄液中のＡβ４０の有意な減少を引き起こした（図４ｃ）。データはペプチド番号を示しています。2077 は 60 kDa SA タンパク質を CNS に輸送することができ、SA 結合型 BACE1 ペプチド阻害剤による薬理学的効果も誘導します。
（ a ）少なくとも3匹のCM挿管ラットにおけるCSFペプチド#2077（RLSSVDSDLSGC）および未注射の対照ファージ（#1779）の長期薬物動態プロファイルを示すT7ファージのクローン注射（2×10ファージ/動物）。(b) ペプチド #2077 と血管 (レクチン) の対比染色を示す、ファージを注射したラット (2 × 10 10 ファージ/動物) の代表的な皮質微小血管の共焦点顕微鏡画像。これらのファージ クローンを 3 匹のラットに投与し、灌流前に 1 時間循環させました。脳を切片にし、T7 ファージキャプシドに対するポリクローナル FITC 標識抗体で染色しました。灌流とそれに続く固定の 10 分前に、DyLight594 標識レクチンを静脈内投与しました。微小血管の内腔側のレクチン染色（赤）と、毛細血管の内腔および血管周囲の脳組織内のファージ（緑）を示す蛍光画像。スケールバーは10μmに相当します。（ c 、 d ）ビオチン化 BACE1 阻害ペプチドを単独で、またはビオチン化輸送ペプチド #2077 と組み合わせてストレプトアビジンに結合させ、その後少なくとも 3 匹のカニューレ挿入 CM ラットに静脈内注射しました（ストレプトアビジン 10 mg/kg）。BACE1 ペプチド阻害剤による Aβ40 の減少は、示された時点での血液 (赤色) および脳脊髄液 (オレンジ色) における Aβ1-40 ELISA によって測定されました。わかりやすくするために、グラフ上に 100% のスケールで点線が描かれています。（ c ）トランジットペプチド#2077とBACE1阻害ペプチドを3：1の比率で結合させたストレプトアビジンで治療したラットにおける血液（赤い三角）および脳脊髄液（オレンジ色の三角）中のAβ40の減少率。（d）BACE1阻害ペプチドのみに結合したストレプトアビジンで処置したラットの血中Aβ40（赤丸）および脳脊髄液（オレンジ丸）の減少率。対照における Aβ 濃度は 420 pg/ml (標準偏差 = 101 pg/ml) でした。
ファージディスプレイは、生物医学研究のいくつかの分野で首尾よく適用されています17。この方法は、in vivo の血管多様性研究 18,19 および脳血管を対象とした研究 20,21,22,23,24,25,26 に使用されています。この研究では、この選択法の適用を、脳血管を標的とするペプチドの直接同定だけでなく、血液脳関門を通過する能動輸送特性を持つ候補の発見にも拡張しました。我々はここで、CM挿管ラットにおけるインビボ選択手順の開発について説明し、CSFホーミング特性を持つペプチドを同定する可能性を実証します。12 mer のランダムペプチドのライブラリーを表示する T7 ファージを使用して、T7 ファージが血液脳関門に適応するのに十分小さい (直径約 60 nm) 10 ため、血液脳関門または脈絡叢を直接通過できることを実証できました。われわれは、カニューレを挿入したCMラットからのCSF採取がよく制御された生体内機能スクリーニング法であり、抽出されたファージが血管構造に結合するだけでなく、血液脳関門を通過するトランスポーターとしても機能することを観察した。さらに、血液の採取と CSF および血液由来のファージへの HTS の適用を同時に行うことにより、CSF の選択が血液濃縮や選択ラウンド間の拡大適性に影響を受けないことを確認しました。ただし、CSF コンパートメントに到達できるファージは、脳内で富化するのに十分な時間生存して血流中を循環する必要があるため、血液コンパートメントは選択手順の一部です。生の HTS データから信頼できる配列情報を抽出するために、プラットフォーム固有の配列エラーに適応したフィルターを分析ワークフローに実装しました。スクリーニング法に動態パラメータを組み込むことにより、血中における野生型 T7 ファージの迅速な薬物動態 (t1/2 ～ 28 分) を確認し 24、27、28、さらに脳脊髄液中での 1 分あたりの半減期 (t1/2 ～ 26 分) も測定しました。血液およびCSFにおける薬物動態プロファイルは類似しているにもかかわらず、CSFではファージの血中濃度の0.001%しか検出できず、血液脳関門を通過する野生型T7ファージのバックグラウンド移動性が低いことを示しています。この研究は、特にCNSコンパートメントに到達できるクローンがほとんどないため、循環から急速に除去されるファージシステムの場合、in vivoパニング戦略を使用する際の最初の選択ラウンドの重要性を強調しています。したがって、この非常に厳密な CSF モデルでは最終的に限られた数のクローンのみが収集されたため、最初のラウンドではライブラリーの多様性の減少が非常に大きくなりました。この in vivo パニング戦略には、CSF コンパートメントでの活発な蓄積、血液コンパートメントでのクローンの生存、最初の 10 分以内の血液からの T7 ファージ クローンの迅速な除去など、いくつかの選択ステップが含まれていました（図 1d および補足図 4M）。）。したがって、最初のラウンドの後、同じ初期プールが個々の動物に使用されたにもかかわらず、異なるファージクローンがCSF中で同定された。これは、多数のライブラリ メンバーを含むソース ライブラリに対する複数の厳密な選択手順により、多様性が大幅に低下することを示唆しています。したがって、ランダムイベントは初期選択プロセスの不可欠な部分となり、結果に大きな影響を与えます。おそらく、元のライブラリー内のクローンの多くは、非常によく似た CSF 濃縮傾向を持っていたと考えられます。ただし、同じ実験条件下であっても、初期プール内の特定のクローンの数が少ないため、選択結果が異なる場合があります。
CSFに豊富に含まれるモチーフは血液中のモチーフとは異なります。興味深いことに、我々は個々の動物の血液中でグリシンが豊富なペプチドへの最初の変化に気づきました。(図1g、補足図4e、4f)。グリシンペプチドを含むファージはより安定しており、循環から取り出される可能性が低い可能性があります。しかし、これらのグリシンに富むペプチドは脳脊髄液サンプルでは検出されず、厳選されたライブラリーが 2 つの異なる選択ステップを経たことが示唆されました。1 つは血液中に、もう 1 つは脳脊髄液に蓄積させたものです。4 回目の選択で得られた CSF が豊富なクローンは広範囲にテストされています。個別に試験したほぼすべてのクローンは、ブランク対照ファージと比較してCSFが豊富であることが確認されました。1 つのペプチド ヒット (#2077) をより詳細に調べました。他のヒットと比較して長い血漿半減期を示しました (図 3d および補足図 7)。興味深いことに、このペプチドには C 末端にシステイン残基が含まれていました。最近、ペプチドにシステインを添加すると、アルブミンに結合して薬物動態特性を改善できることが示されました 29 。ペプチド #2077 については現在不明であり、さらなる研究が必要です。一部のペプチドは CSF 濃縮において原子価依存性を示しました (データは示されていません)。これは、T7 キャプシドの表示された表面形状に関連している可能性があります。私たちが使用した T7 システムは、ファージ粒子あたり各ペプチドの 5 ～ 15 コピーを示しました。IHCは、ラットの大脳皮質に静脈内注射された候補リードファージクローンに対して実行されました（補足図8）。データは、少なくとも 3 つのクローン (No. 2002、No. 2009、および No. 2077) が BBB と相互作用したことを示しました。この BBB 相互作用が CSF の蓄積を引き起こすのか、それともこれらのクローンの BCSFB への直接移動を引き起こすのかはまだ判明していません。重要なのは、選択したペプチドが合成されてタンパク質カーゴに結合したときにCSF輸送能力を保持していることを示しています。N末端ビオチン化ペプチドのSAへの結合は、血液および脳脊髄液中のそれぞれのファージクローンで得られた結果を本質的に繰り返します（図3e）。最後に、リードペプチド#2077がSAに結合したBACE1のビオチン化ペプチド阻害剤の脳作用を促進し、CSF中のAβ40レベルを大幅に低下させることによりCNSに顕著な薬力学的効果を引き起こすことができることを示します（図4）。すべてのヒットのペプチド配列相同性検索を実行しても、データベース内の相同体を特定できませんでした。T7 ライブラリのサイズは約 109 であるのに対し、12 mer の理論的なライブラリ サイズは 4 x 1015 であることに注意することが重要です。 したがって、12 mer ペプチド ライブラリの多様性空間のごく一部のみを選択しました。これは、これらの識別されたヒットの隣接配列空間を評価することで、より最適化されたペプチドを識別できることを意味している可能性があります。仮説として、これらのペプチドの天然相同体が見つからない理由の 1 つは、特定のペプチド モチーフが制御されずに脳に侵入するのを防ぐための進化の過程での選択解除である可能性があります。
総合すると、我々の結果は、生体内での脳血管関門の輸送システムをより詳細に特定し、特徴付けるための将来の研究の基礎を提供する。このメソッドの基本的なセットアップは、脳血管結合特性を持つクローンを同定するだけでなく、成功したクローンが in vivo で生物学的障壁を越えて CNS コンパートメントに入る固有の活性を持つという重要なステップも含む機能的選択戦略に基づいています。これらのペプチドの輸送機構と、脳領域に特有の微小血管への結合の優先性を解明することです。これは、BBB および受容体の輸送のための新しい経路の発見につながる可能性があります。我々は、同定されたペプチドが脳血管受容体、あるいはBBBやBCSFBを介して輸送される循環リガンドに直接結合できると期待している。この研究で発見されたCSF輸送活性を有するペプチドベクターはさらに研究される予定である。私たちは現在、これらのペプチドの BBB および/または BCSFB を通過する能力について脳特異性を調査しています。これらの新しいペプチドは、新しい受容体や経路の潜在的な発見や、生物製剤などの高分子を脳に送達するための新しい高効率プラットフォームの開発にとって、非常に貴重なツールとなるでしょう。
前述の方法の修正を使用して、大槽 (CM) にカニューレを挿入します。麻酔をかけたウィスターラット（２００〜３５０ｇ）を定位固定装置に載せ、剃毛して無菌的に準備した頭皮の上に正中切開を加えて頭蓋骨を露出させた。上部サッシの領域に 2 つの穴を開け、固定ネジを穴に締めます。ステンレス鋼カニューレをＣＭ内に定位誘導するために、外側後頭頂に追加の穴を開けた。カニューレの周囲に歯科用セメントを塗布し、ネジで固定します。光硬化およびセメント硬化後、皮膚創傷を4/0上顎縫合糸で閉じた。カニューレの適切な配置は、脳脊髄液 (CSF) の自然漏出によって確認されます。定位固定装置からラットを取り出し、適切な術後ケアと痛みの管理を受け、脳脊髄液に血液の兆候が観察されるまで少なくとも 1 週間回復させます。Wistar ラット (Crl:WI/Han) は Charles River (フランス) から入手しました。すべてのラットは、病原体が存在しない特定の条件下で飼育されました。すべての動物実験はスイスのバーゼル市獣医局によって承認され、動物ライセンス番号 2474 (ラットの脳脊髄液および脳中の治療候補物質のレベルの測定による能動脳輸送の評価) に従って実施されました。
CM カニューレを手に持ってラットの意識をそっと保ちます。カニューレからチョウセンアサガオを取り外し、自発的に流れる脳脊髄液 10 μl を収集します。最終的にカニューレの開存性が損なわれたため、血液汚染や変色の証拠がない透明な脳脊髄液サンプルのみがこの研究に含まれました。並行して、尾の先端の小さな切開から約 10 ～ 20 μl の血液を採取し、ヘパリン (Sigma-Aldrich) を含むチューブに入れました。T7 ファージの静脈内注射後のさまざまな時点で CSF と血液を収集しました。各 CSF サンプルを収集する前に、約 5 ～ 10 μl の液体が廃棄されました。これは、カテーテルのデッドボリュームに相当します。
ライブラリーは、T7Select システムマニュアル (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) に記載されているように、T7Select 10-3b ベクターを使用して生成されました。簡単に言うと、ランダムな 12 mer DNA インサートが次の形式で合成されました。
NNK コドンは、インサート内の二重停止コドンとアミノ酸の過剰発現を避けるために使用されました。N は手動で混合した各ヌクレオチドの等モル比、K は手動で混合したアデニンおよびシトシン ヌクレオチドの等モル比です。一本鎖領域を、クレノウ緩衝液（ニューイングランドバイオラブズ）中でｄＮＴＰ（ノバジェン）およびクレノウ酵素（ニューイングランドバイオラブズ）とともに３７℃で３時間さらにインキュベートすることによって二本鎖ＤＮＡに変換した。反応後、EtOH沈殿により二本鎖DNAを回収した。得られたDNAを制限酵素EcoRIおよびHindIII(両方ともRoche社製)で消化した。次いで、切断および精製した（QIAquick、Qiagen）インサート（T4リガーゼ、New England Biolabs）を、10Bキャプシド遺伝子のアミノ酸348の後ろの予め切断されたT7ベクターにインフレームで連結した。ライゲーション反応物は、インビトロパッケージングの前に、１６℃で１８時間インキュベートした。インビトロでのファージパッケージングは​​、T7Select 10-3b クローニングキット（Novagen）に付属の説明書に従って実施し、パッケージング溶液を大腸菌（BLT5615、Novagen）を使用して溶解するまで一度増幅した。溶解物を遠心分離し、滴定し、グリセロールのストック溶液として-80℃で凍結した。
独自の 454/Roche-amplicon 融合プライマーを使用して、ブロスまたはプレートで増幅されたファージ可変領域の直接 PCR 増幅。フォワード融合プライマーには、可変領域 (NNK) 12 (テンプレート特異的)、GS FLX チタンアダプター A、および 4 塩基のライブラリキー配列 (TCAG) に隣接する配列が含まれています (補足図 1a)。
逆融合プライマーには、捕捉ビーズに結合したビオチンと、エマルジョン PCR 中のクローン増幅に必要な GS FLX チタン アダプター B も含まれています。
次いで、アンプリコンを、454 GS-FLX Titanium プロトコールに従って 454/Roche パイロシーケンシングに供しました。手動サンガー配列決定 (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) では、T7 ファージ DNA を PCR で増幅し、以下のプライマー ペアを使用して配列決定しました。
個々のプラークからのインサートを、Roche Fast Start DNA ポリメラーゼ キット (製造元の指示に従って) を使用して PCR 増幅に供しました。ホット スタート (95 °C で 10 分間) と 35 ブースト サイクル (95 °C で 50 秒、50 °C で 1 分間、72 °C で 1 分間) を実行します。
ライブラリーからのファージ、野生型ファージ、CSF および血液からレスキューしたファージ、または個々のクローンを、TB ブロス (Sigma Aldrich) または 500 cm2 ディッシュ (Thermo Scientific) 内の大腸菌 BL5615 中で 37°C で 4 時間増幅しました。プレートをTris-EDTA緩衝液(Fluka Analytical)ですすぐことによって、または滅菌ピペットチップでプラークを収集することによって、プレートからファージを抽出した。ファージを培養上清またはポリエチレングリコール（PEG 8000）沈殿（Promega）を1回行って抽出緩衝液から単離し、Tris-EDTA緩衝液に再懸濁した。
増幅されたファージを、静脈内（IV）注射（500μl/動物）前に、エンドトキシン除去ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用して2～3ラウンドのエンドトキシン除去に供した。最初のラウンドでは、2×1012 個のファージが導入されました。2 番目では、2×1010 個のファージ。3 回目と 4 回目の選択ラウンドでは、動物あたり 2×109 ファージ。示された時点で採取されたＣＳＦおよび血液サンプル中のファージ含有量を、製造業者の指示（Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔシステムマニュアル）に従ってプラーク計数によって決定した。ファージの選択は、精製したライブラリーを尾静脈に静脈内注射するか、前の選択ラウンドでCSFから抽出したファージを再注射することによって行い、その後のCSFサンプルと血液サンプルのそれぞれ10分、30分、60分、90分、120分、180分、および240分の時点で採取を行った。合計 4 ラウンドの in vivo パニングを実施し、選択した 2 つのブランチを別々に保存し、最初の 3 ラウンドの選択中に分析しました。最初の 2 ラウンドの選択で CSF から抽出されたすべてのファージインサートを 454/Roche パイロシーケンシングに供し、最後の 2 ラウンドの選択で CSF から抽出されたすべてのクローンを手動で配列決定しました。第 1 ラウンドの選択からのすべての血液ファージも 454/Roche パイロシークエンシングに供しました。ファージ クローンを注入するために、選択したファージを大腸菌 (BL5615) 内で 500 cm2 プレート上、37℃で 4 時間増幅させました。個別に選択され、手動で配列決定されたクローンを TB 培地で増殖させました。ファージ抽出、精製およびエンドトキシンの除去（上記の通り）後、３００μｌ中の２×１０１０個のファージ／動物を一方の尾静脈に静脈内注射した。
配列データの前処理と定性的フィルタリング。生の 454/Roche データは、ベンダー ソフトウェアを使用してバイナリ標準ストリーム マップ形式 (sff) からピアソン人間可読形式 (fasta) に変換されました。ヌクレオチド配列のさらなる処理は、以下に説明する独自の C プログラムおよびスクリプト (未リリースのソフトウェア パッケージ) を使用して実行されました。一次データの分析には、厳密な多段階のフィルタリング手順が含まれます。有効な 12mer インサート DNA 配列を含まないリードをフィルターで除外するために、グローバル Needleman-Wunsch テストを使用して、リードを開始ラベル (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)、ストップラベル (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA)、およびバックグラウンドインサート (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) に順次アライメントしました。アライメントでは、アライメントごとに最大 2 つの不一致が許容されます31。したがって、開始タグと停止タグのないリード、およびバックグラウンドインサートを含むリード、つまり許容される不一致数を超えるアライメントはライブラリから削除されました。残りのリードについては、スタートマークから伸びてストップマークの手前で終わるN-mer DNA配列を元のリード配列から切り出し、さらに処理した（以下「インサート」という）。インサートの翻訳後、プライマーの 5' 末端にある最初の停止コドンの後の部分がインサートから除去されます。さらに、プライマーの 3' 末端の不完全なコドンにつながるヌクレオチドも除去されました。バックグラウンド配列のみを含むインサートを除外するために、アミノ酸パターン「PAG」で始まる翻訳されたインサートも除去されました。翻訳後の長さが 3 アミノ酸未満のペプチドはライブラリーから除去されました。最後に、挿入プールの冗長性を削除し、それぞれの一意の挿入の頻度を決定します。この分析の結果には、ヌクレオチド配列 (挿入) とその (読み取り) 頻度のリストが含まれています (補足図 1c および 2)。
配列類似性による N マー DNA インサートのグループ化: 454/Roche 固有のシーケンシング エラー (シークエンシング ホモポリマー拡張の問題など) を排除し、重要度の低い冗長性を除去するために、事前にフィルター処理された N マー DNA 配列インサート (インサート) が類似性によってソートされます。次のように定義された反復アルゴリズムを使用した挿入 (最大 2 つの不一致塩基が許可されます): 挿入は、まず頻度 (最高値から最低値) によって並べ替えられ、それらが同じである場合は、長さ (最長から最短) による 2 番目の並べ替えによって並べ替えられます。したがって、最も頻繁で最も長い挿入が最初の「グループ」を定義します。グループ周波数はキー周波数に設定されます。次に、ソートされたリストに残っている各挿入を、ペアワイズ Needleman-Wunsch アライメントによってグループに追加することを試みました。アライメント内の不一致、挿入、または削除の数がしきい値 2 を超えない場合、グループに挿入が追加され、挿入が追加された頻度によってグループ全体の頻度が増加します。グループに追加されたインサートは使用済みとしてマークされ、以降の処理から除外されます。挿入シーケンスを既存のグループに追加できない場合、その挿入シーケンスを使用して、適切な挿入頻度で新しいグループが作成され、使用済みとしてマークされます。反復は、各挿入配列が新しいグループの形成に使用されるか、既存のグループに含まれる可能性があるときに終了します。結局のところ、ヌクレオチドから構成されるグループ化されたインサートは、最終的にペプチド配列 (ペプチド ライブラリー) に翻訳されます。この分析の結果は、連続読み取り数を構成する一連の挿入とそれに対応する頻度です (補足図 2)。
モチーフの生成: 固有のペプチドのリストに基づいて、以下に示すようにすべての可能なアミノ酸パターン (aa) を含むライブラリーを作成しました。長さ 3 の考えられる各パターンがペプチドから抽出され、その逆パターンがすべてのパターン (トリペプチド) を含む共通モチーフ ライブラリーとともに追加されました。反復性の高いモチーフのライブラリーの配列が決定され、冗長性が除去されました。次に、モチーフ ライブラリー内の各トリペプチドについて、計算ツールを使用してライブラリー内にそのトリペプチドが存在するかどうかを確認しました。この場合、見つかったモチーフトリペプチドを含むペプチドの頻度が追加され、モチーフライブラリー内のモチーフに割り当てられます（「モチーフ数」）。モチーフ生成の結果は、トリペプチド (モチーフ) のすべての出現とそれぞれの値を含む 2 次元配列です。これらの値は、リードがフィルター処理、グループ化、および翻訳されたときに対応するモチーフとなるシーケンスリードの数です。メトリクスは上で詳しく説明したとおりです。
モチーフの数と対応する散布図の正規化: 各サンプルのモチーフの数は、以下を使用して正規化されました。
ここで、ni はトピック i を含む読み取りの数です。したがって、vi は、サンプル中のモチーフ i を含むリード (またはペプチド) の頻度のパーセンテージを表します。正規化されていないモチーフ数の P 値は、フィッシャーの直接確率検定を使用して計算されました。動機の数の相関グラムについては、R で正規化された動機の数を使用してスピアマンの相関を計算しました。
ペプチドライブラリーの各位置のアミノ酸の含有量を視覚化するために、Web ロゴグラム 32、33 (http://weblogo.threeplusone.com) を作成しました。まず、12 mer ペプチドの各位置のアミノ酸の含有量が 20×12 のマトリックスに保存されます。次に、各位置で同じ相対アミノ酸含有量を含む 1000 個のペプチドのセットが fasta シーケンス形式で生成され、web-logo 3 への入力として提供され、各位置での相対アミノ酸含有量のグラフ表示が生成されます。特定のペプチドライブラリの場合。多次元データセットを視覚化するために、R で内部開発されたツール (biosHeatmap、まだリリースされていない R パッケージ) を使用してヒート マップが作成されました。ヒート マップに表示される樹状図は、ユークリッド距離計量を使用したウォードの階層的クラスタリング手法を使用して計算されました。モチーフスコアリングデータの統計分析のために、フィッシャーの直接確率検定を使用して非正規化スコアリングの P 値を計算しました。他のデータセットの P 値は、Student の t 検定または ANOVA を使用して R で計算されました。
選択したファージクローンおよびインサートのないファージを尾静脈を介して静脈内注射した(300μl PBS中2×1010ファージ/動物)。灌流およびその後の固定の10分前に、同じ動物に100μlのDyLight594標識レクチン(Vector Laboratories Inc.、DL-1177)を静脈内注射した。ファージ注射の６０分後、ラットに５０ｍｌのＰＢＳ、続いて５０ｍｌの４％ＰＦＡ／ＰＢＳを心臓を通して灌流した。さらに脳サンプルを 4% PFA/PBS で一晩固定し、30% スクロースに 4℃で一晩浸漬しました。サンプルは OCT 混合物中で急速冷凍されます。凍結サンプルの免疫組織化学分析は、1% BSA でブロックした 30 µm 凍結切片に対して室温で実施し、T7 ファージに対するポリクローナル FITC 標識抗体 (Novus NB 600-376A) とともに 4 °C でインキュベートしました。一晩インキュベートします。最後に、切片を PBS で 3 回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡 (Leica TCS SP5) で検査しました。
最低純度 98% のすべてのペプチドは GenScript USA によって合成され、ビオチン化され、凍結乾燥されました。ビオチンは、N 末端の追加の三重グリシン スペーサーを介して結合します。質量分析を使用してすべてのペプチドをチェックします。
ストレプトアビジン (Sigma S0677) を、5 倍等モル過剰のビオチン化ペプチド、ビオチン化 BACE1 阻害ペプチド、またはビオチン化 BACE1 阻害ペプチドと BACE1 阻害ペプチドの組み合わせ (3:1 比) と 5 ～ 10% DMSO 中で混合し、PBS 中でインキュベートしました。注入前に室温で 1 時間。ストレプトアビジン結合ペプチドを、脳腔を有するラットの尾静脈の1つに10 mg/kgの用量で静脈内注射した。
ストレプトアビジン-ペプチド複合体の濃度をELISAによって評価した。Nunc Maxisorpマイクロタイタープレート(Sigma)を、1.5μg/mlのマウス抗ストレプトアビジン抗体(Thermo、MA1-20011)で4℃で一晩コーティングした。室温で２時間ブロッキング（ブロッキング緩衝液：１４０ｎＭ ＮａＣＬ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮＰ４０、０．２５％ゼラチン、１％ ＢＳＡ）した後、プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ（洗浄緩衝液）で３秒間洗浄し、ＣＳＦおよび血漿サンプルをブロッキング緩衝液で希釈したウェルに添加した（血漿１：１０，０００、ＣＳＦ１： 115）。次いで、プレートを検出抗体(1μg/ml、抗ストレプトアビジン-HRP、Novus NB120-7239)とともに4℃で一晩インキュベートした。3 回の洗浄ステップの後、TMB 基質溶液 (Roche) 中で最大 20 分間インキュベートすることによりストレプトアビジンが検出されました。1M H2SO4 で発色を止めた後、450 nm で吸光度を測定します。
ストレプトアビジン-ペプチド-BACE1阻害剤複合体の機能を、製造業者のプロトコールに従ってAβ(1-40) ELISAによって評価した(Wako、294-64701)。簡単に説明すると、CSFサンプルを標準希釈剤(1:23)で希釈し、BNT77捕捉抗体でコーティングした96ウェルプレート内で4℃で一晩インキュベートしました。５回の洗浄工程の後、ＨＲＰ結合ＢＡ２７抗体を添加し、４℃で２時間インキュベートし、続いて５回の洗浄工程を行った。Aβ(1-40) は、TMB 溶液中で室温で 30 分間インキュベートすることによって検出されました。停止液で発色を止めた後、450nmの吸光度を測定します。血漿サンプルは、Aβ(1-40) ELISA の前に固相抽出に供されました。血漿を９６ウェルプレート中の０．２％ＤＥＡ（Ｓｉｇｍａ）に添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＳＰＥプレート（Ｏａｓｉｓ、１８６０００６７９）を水および１００％メタノールで連続的に洗浄した後、血漿サンプルをＳＰＥプレートに添加し、すべての液体を除去した。サンプルを洗浄し（最初に５％メタノール、次に３０％メタノール）、２％ＮＨ４ＯＨ／９０％メタノールで溶出した。一定の N2 流下、55℃で 99 分間溶出液を乾燥させた後、サンプルを標準希釈剤で還元し、上記のように Aβ(1-40) を測定しました。
この記事を引用する方法: Urich, E. et al.in vivoで同定された輸送ペプチドを使用した脳への貨物輸送。科学。5、14104;土井:10.1038/srep14104 (2015)。
Likhota J.、Skjoringe T.、Thomsen LB、Moos T. 標的療法を使用した高分子薬の脳への送達。神経化学ジャーナル 113、1–13、10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)。
Brasnjevic, I.、Steinbusch, HW、Schmitz, C.、および Martinez-Martinez, P. 血液脳関門を通過するペプチドおよびタンパク質薬物の送達。Prog Neurobiol 87、212–251、10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)。
パードリッジ、WM 血液脳関門: 脳内治療薬開発のボトルネック。NeuroRx 2、3–14、10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)。
Johanson, KE、Duncan, JA、Stopa, EG、および Byrd, A. 脈絡叢-CSF 経路を介した脳への薬物送達と標的化の改善の見通し。製薬研究 22、1011–1037、10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)。
パドリッジ、WM 脳送達のための分子トロイの木馬によるバイオ医薬品の近代化。Bioconjug Chem 19、1327–1338、10.1021/bc800148t (2008)。
パドリッジ、血液脳関門を通過する WM 受容体媒介ペプチド輸送。Endocr Rev. 7、314–330 (1986)。
Niewoehner、J. et al.一価の分子シャトルを使用して、治療用抗体の脳への浸透と有効性を高めます。ニューロン 81、49–60、10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)。
Bien-Lee, N. et al.トランスフェリン受容体 (TfR) の輸送は、TfR 抗体のアフィニティー変異体の脳への取り込みを決定します。J Exp Med 211、233–244、10.1084/jem.20131660 (2014)。