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汚染された医療環境は、多剤耐性 (MDR) 微生物や C. ディフィシルの蔓延に重要な役割を果たしています。この研究の目的は、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス（VRE）、カルバペネム耐性肺炎桿菌（CRE）、カルバペネム耐性シュードモナス属菌に汚染されたさまざまな物質の抗菌効果に対する、誘電体バリア放電（DBD）プラズマリアクターによって生成されたオゾンの影響を評価することでした。緑膿菌（CRPA）、カルバペネム耐性アシネトバクター・バウマニ（CRAB）、クロストリジウム・ディフィシル胞子。VRE、CRE、CRPA、CRAB、C. ディフィシルの胞子で汚染されたさまざまな材料を、さまざまな濃度と暴露時間でオゾンで処理しました。原子間力顕微鏡 (AFM) は、オゾン処理後の細菌の表面修飾を実証しました。500 ppm のオゾンを VRE と CRAB に 15 分間適用すると、ステンレス鋼、布地、木材では約 2 log10 以上の減少が観察され、ガラスとプラスチックでは 1 ～ 2 log10 の減少が観察されました。C. ディフィシレの胞子は、試験した他のすべての微生物よりもオゾンに対する耐性が高いことが判明しました。AFM では、オゾン処理後に細菌細胞が膨張して変形しました。DBD プラズマ リアクターによって生成されるオゾンは、医療関連感染症の一般的な病原体であることが知られている MDRO および C. ディフィシル胞子に対するシンプルで価値のある除染ツールです。
多剤耐性 (MDR) 微生物の出現は、人間や動物における抗生物質の誤用によって引き起こされ、世界保健機関 (WHO) によって公衆衛生に対する重大な脅威として認識されています1。特に医療機関は、MRO の出現と蔓延にますます直面しています。主な MRO は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびバンコマイシン耐性腸球菌 (VRE)、拡張スペクトルβラクタマーゼ産生腸内細菌 (ESBL)、多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクター バウマンニー、およびカルバペネム耐性エンテロバクター (CRE) です。さらに、クロストリジウム ディフィシル感染は医療関連の下痢の主な原因となっており、医療システムに大きな負担をかけています。MDRO および C. ディフィシルは、医療従事者の手、汚染された環境、または人から人へ直接感染します。最近の研究では、医療従事者 (HCW) が汚染された表面に接触した場合、または患者が汚染された表面に直接接触した場合、医療現場の汚染環境が MDRO および C. ディフィシルの伝播に重要な役割を果たしていることが示されています 3,4。医療現場の汚染された環境は、MLRO および C. ディフィシルの感染または定着の発生率を減少させます 5、6、7。抗菌薬耐性の増加に関する世界的な懸念を考慮すると、医療現場での汚染除去の方法と手順についてさらなる研究が必要であることは明らかです。最近、非接触の端子洗浄方法、特に紫外線 (UV) 装置や過酸化水素システムが、有望な除染方法として認識されています。しかし、これらの市販の UV または過酸化水素装置は高価であるだけでなく、UV 消毒は露出した表面にのみ効果があり、過酸化水素プラズマ消毒では次の消毒サイクルまでに比較的長い除染時間が必要です5。
オゾンには既知の耐腐食特性があり、安価に製造できます8。これは人間の健康に有毒であることも知られていますが、急速に酸素に分解されます 8。誘電体バリア放電 (DBD) プラズマ リアクターは、最も一般的なオゾン発生器です 9。DBD装置を使用すると、空気中に低温プラズマを生成し、オゾンを生成できます。これまで、オゾンの実用化は主にプールの水、飲料水、下水の消毒に限られていました10。いくつかの研究で医療現場での使用が報告されています8,11。
この研究では、コンパクトな DBD プラズマ オゾン発生器を使用して、医療現場で一般的に使用されるさまざまな材料に接種されたものであっても、MDRO および C. ディフィシルの除去におけるその有効性を実証しました。さらに、オゾン滅菌プロセスは、オゾン処理した細胞の原子間力顕微鏡 (AFM) 画像を使用して解明されました。
株は、VRE (SCH 479 および SCH 637)、カルバペネム耐性肺炎桿菌 (CRE; SCH CRE-14 および DKA-1)、カルバペネム耐性緑膿菌 (CRPA; 54 および 83)、およびカルバペネム耐性細菌の臨床分離株から取得されました。緑膿菌（CRPA; 54 および 83）。耐性アシネトバクター バウマニ (CRAB; F2487 および SCH-511)。C. ディフィシルは、韓国疾病予防管理庁の国立病原体培養コレクション (NCCP 11840) から入手しました。2019年に韓国の患者から分離され、多座位配列タイピングを用いてST15に属することが判明した。ＶＲＥ、ＣＲＥ、ＣＲＰＡおよびＣＲＡＢを接種したブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス（ＢＤ、米国メリーランド州スパークス）をよく混合し、３７℃で２４時間インキュベートした。
C.ディフィシルを嫌気的に血液寒天上に48時間画線培養した。次いで、いくつかのコロニーを5 mlのブレインハートブロスに加え、嫌気条件下で48時間インキュベートした。その後、培養物を振盪し、９５％エタノール５ｍｌを加え、再度振盪し、室温で３０分間放置した。3000gで20分間遠心分離した後、上清を捨て、胞子と死滅細菌を含むペレットを0.3mlの水に懸濁します。生細胞は、適切に希釈した後、細菌細胞懸濁液を血液寒天プレート上にらせん状に播種することによって計数した。グラム染色により、細菌構造の 85% ～ 90% が胞子であることが確認されました。
次の研究は、医療関連感染を引き起こすことが知られている MDRO および C. ディフィシルの胞子で汚染されたさまざまな表面に対する消毒剤としてのオゾンの影響を調査するために実施されました。1 cm x 1 cm のステンレス鋼、布 (綿)、ガラス、プラスチック (アクリル)、および木材 (パイン) のサンプルを準備します。クーポンは使用前に消毒してください。すべてのサンプルは、細菌に感染する前にオートクレーブ滅菌によって滅菌されました。
この研究では、細菌細胞を寒天プレート上だけでなくさまざまな基質表面上にも広げました。次に、密閉されたチャンバー内でパネルを一定時間、一定濃度のオゾンに曝露して滅菌します。図上。オゾン殺菌装置の写真である。DBD プラズマ リアクターは、穴があいて露出したステンレス鋼の電極を厚さ 1 mm のアルミナ (誘電体) プレートの前面と背面に取り付けることによって製造されました。穴あき電極の場合、開口部と穴の面積はそれぞれ 3 mm と 0.33 mm でした。各電極は直径 43 mm の円形です。高電圧高周波電源（GBS Elektronik GmbH Minipuls 2.2）を使用して、周波数 12.5 kHz でピークツーピーク約 8 kV の正弦波電圧を多孔電極に印加し、電極の端でプラズマを生成しました。穴あき電極。この技術はガス滅菌法であるため、滅菌は体積によって上部と下部のコンパートメントに分割されたチャンバー内で実行され、それぞれに細菌で汚染されたサンプルとプラズマ発生器が含まれます。上部コンパートメントには、残留オゾンを除去して排出するための 2 つのバルブ ポートがあります。実験に使用する前に、水銀灯の２５３．６５ｎｍのスペクトル線の吸収スペクトルにより、プラズマ装置を点灯してからの室内のオゾン濃度の時間変化を測定した。
(a) DBD プラズマリアクターで生成されたオゾンを使用してさまざまな材料上の細菌を滅菌するための実験装置の概略図、および (b) 滅菌チャンバー内のオゾン濃度とプラズマ生成時間。図は、OriginPro バージョン 9.0 (OriginPro ソフトウェア、米国マサチューセッツ州ノーサンプトン、https://www.originlab.com) を使用して作成されました。
まず、オゾン濃度と処理時間を変化させながら、寒天プレート上の菌体をオゾンで滅菌することにより、MDROおよびC.ディフィシルの除染に適したオゾン濃度と処理時間を決定した。滅菌プロセス中、チャンバーはまず周囲の空気でパージされ、次にプラズマ ユニットをオンにしてオゾンで満たされます。サンプルを所定の時間オゾンで処理した後、ダイヤフラムポンプを使用して残留オゾンを除去します。測定には、完全な 24 時間培養のサンプル (約 108 CFU/ml) を使用しました。細菌細胞の懸濁液のサンプル (20 μl) を最初に滅菌生理食塩水で 10 倍に連続希釈し、次にこれらのサンプルをチャンバー内でオゾンで滅菌した寒天プレート上に分配しました。その後、オゾンに曝露したサンプルと曝露しなかったサンプルからなるサンプルを繰り返し、37℃で 24 時間インキュベートし、コロニーをカウントして滅菌の有効性を評価しました。
さらに、上記の研究で定義された滅菌条件に従って、医療機関で一般的に使用されるさまざまな材質のクーポン（ステンレス鋼、布、ガラス、プラスチック、木製クーポン）を使用して、MDROおよびC.ディフィシルに対するこの技術の除染効果が評価されました。完全な 24 時間培養 (~108 cfu/ml) を使用しました。細菌細胞懸濁液のサンプル (20 μl) を滅菌生理食塩水で 10 倍に連続希釈し、次にこれらの希釈ブロスにクーポンを浸して汚染を評価しました。希釈ブロスに浸した後に取り出したサンプルを滅菌ペトリ皿に置き、室温で 24 時間乾燥させました。ペトリ皿の蓋をサンプルの上に置き、慎重に試験チャンバーに置きます。ペトリ皿から蓋を外し、サンプルを 500 ppm オゾンに 15 分間曝露します。対照サンプルは生物学的安全キャビネットに配置され、オゾンには曝露されませんでした。オゾンに曝露した直後、サンプルおよび非照射サンプル（すなわち対照）をボルテックスミキサーを使用して滅菌生理食塩水と混合し、表面から細菌を分離した。溶出した懸濁液を滅菌生理食塩水で10倍に段階希釈した後、血液寒天平板（好気性菌の場合）または嫌気性のブルセラ菌用血液寒天平板（クロストリジウム・ディフィシルの場合）上で希釈菌数を測定し、37℃で24時間培養した。または、嫌気条件下で 37°C で 48 時間、2 回繰り返して接種材料の初期濃度を決定します。曝露されていない対照と曝露されたサンプルとの間の細菌数の差を計算して、試験条件下での細菌数の対数減少（すなわち、滅菌効率）を求めた。
生体細胞は AFM イメージング プレート上に固定化する必要があります。したがって、セルサイズよりも小さい粗さスケールを備えた平らで均一に粗いマイカディスクが基板として使用されます。ディスクの直径および厚さは、それぞれ２０ｍｍおよび０．２１ｍｍであった。細胞を表面にしっかりと固定するために、雲母の表面はポリ-L-リジン（200 μl）でコーティングされ、雲母は正に帯電し、細胞膜は負に帯電します。ポリ-L-リジンでコーティングした後、雲母ディスクを1 mlの脱イオン(DI)水で3回洗浄し、一晩空気乾燥させた。次に、細菌細胞を、希釈細菌溶液を投与することによってポリ-L-リジンでコーティングされた雲母表面に適用し、30分間放置し、その後、雲母表面を1 mlの脱イオン水で洗浄した。
サンプルの半分をオゾンで処理し、VRE、CRAB、および C. ディフィシレの胞子をロードした雲母プレートの表面形態を AFM (XE-7、パーク システム) を使用して視覚化しました。AFM の動作モードはタッピング モードに設定されており、これは生体細胞をイメージングするための一般的な方法です。実験では、非接触モード用に設計されたマイクロカンチレバー（OMCL-AC160TS、OLYMPUS Microscopy）を使用しました。AFM 画像は 0.5 Hz のプローブ走査速度に基づいて記録され、画像解像度は 2048 × 2048 ピクセルになりました。
DBD プラズマ リアクターが滅菌に効果的である条件を決定するために、MDRO (VRE、CRE、CRPA、CRAB) と C. ディフィシルの両方を使用して、オゾン濃度と曝露時間を変化させる一連の実験を実施しました。図上。図１ｂは、プラズマ装置の電源を入れた後の各試験条件におけるオゾン濃度の時間曲線を示す。濃度は対数的に増加し、1.5 分後と 2.5 分後にそれぞれ 300 ppm と 500 ppm に達しました。VRE を使用した予備テストでは、細菌を効果的に除染するために最低限必要なオゾンは 300 ppm で 10 分間であることが示されています。したがって、以下の実験では、MDRO および C. ディフィシルを 2 つの異なる濃度 (300 および 500 ppm) および 2 つの異なる曝露時間 (10 分および 15 分) でオゾンに曝露しました。各オゾン線量と曝露時間設定における滅菌効率を計算し、表 1 に示しました。300 または 500 ppm のオゾンに 10 ～ 15 分間曝露すると、全体的な VRE が 2 log10 以上低下しました。CRE によるこの高レベルの細菌死滅は、300 または 500 ppm のオゾンに 15 分間曝露することで達成されました。 500 ppm のオゾンに 15 分間曝露すると、CRPA の高い減少 (> 7 log10) が達成されました。 500 ppm のオゾンに 15 分間曝露すると、CRPA の高い減少 (> 7 log10) が達成されました。 CRPA (> 7 log10) は、500 時間以内に 15 分以内に表示されます。 500 ppm オゾンに 15 分間曝露すると、CRPA の大幅な減少 (> 7 log10) が達成されました。500 ppm の臭気ガスに 15 分間曝露すると、CRPA は大幅に低下します (> 7 log10)。500 ppm の臭気ガスに 15 分間曝露すると、CRPA は大幅に低下します (> 7 log10)。 CRPA (> 7 log10) は 15 分以内に 500 ppm を記録しました。 500 ppm オゾンに 15 分間暴露した後の CRPA の大幅な減少 (> 7 log10)。300 ppm のオゾンでは CRAB 細菌の死滅はほとんどありません。 ただし、500 ppm のオゾンでは、> 1.5 log10 の減少が見られました。 ただし、500 ppm のオゾンでは、> 1.5 log10 の減少が見られました。 однако при концентрации озона 500 частей на миллион наблюдалось снижение > 1,5 log10。 ただし、オゾン濃度 500 ppm では、>1.5 log10 の減少が観察されました。しかしながら、５００ｐｐｍの臭気ガスでは＞１．５ｌｏｇ１０減少した。しかしながら、５００ｐｐｍの臭気ガスでは＞１．５ｌｏｇ１０減少した。 Однако при концентрации озона 500 частей на миллион наблюдалось снижение >1,5 log10。 ただし、オゾン濃度 500 ppm では、>1.5 log10 の減少が観察されました。 C. ディフィシルの胞子を 300 または 500 ppm のオゾンに曝露すると、log10 が 2.5 以上減少しました。 C. ディフィシルの胞子を 300 または 500 ppm のオゾンに曝露すると、log10 が 2.5 以上減少しました。 Воздействие на споры C. difficile озона с концентрацией 300 или 500 частей на миллион приводило к снижению > 2,5 log10。 C. ディフィシレの胞子を 300 または 500 ppm のオゾンに曝露すると、log10 が 2.5 以上減少しました。300 または 500 ppm の臭気に曝露されると、> 2.5 log10 の減少がもたらされます。 300 または 500 ppm の臭気では > 2.5 log10 の減少が生じます。 Воздействие на споры C. difficile озона с концентрацией 300 или 500 частей на миллион приводило к снижению >2,5 log10。 C. ディフィシレの胞子を 300 または 500 ppm のオゾンに曝露すると、log10 が 2.5 以上減少しました。
上記の実験に基づいて、500 ppm のオゾン量で 15 分間細菌を不活化するのに十分な要件が判明しました。VRE、CRAB、および C. ディフィシルの胞子は、病院で一般的に使用されるステンレス鋼、布地、ガラス、プラスチック、木材などのさまざまな材料に対するオゾンの殺菌効果についてテストされています。それらの滅菌効率を表 2 に示します。試験微生物は 2 回評価されました。VRE および CRAB では、オゾンはガラスやプラスチックの表面ではあまり効果がありませんでしたが、ステンレス鋼、布地、木材の表面では約 2 倍以上の log10 の減少が観察されました。C. ディフィシレの胞子は、試験した他のすべての微生物よりもオゾン処理に対する耐性が高いことが判明しました。VRE、CRAB、および C. ディフィシルに対するさまざまな物質の殺菌効果に対するオゾンの影響を統計的に研究するために、t 検定を使用して、さまざまな物質に対する対照群と実験群の 1 ミリリットルあたりの CFU 数の差を比較しました (図 2)。菌株は統計的に有意な差を示しましたが、C. ディフィシル胞子よりも VRE および CRAB 胞子の方がより有意な差が観察されました。
さまざまな物質の細菌死滅に対するオゾンの影響の散布図 (a) VRE、(b) CRAB、および (c) C. ディフィシル。
オゾンガス滅菌プロセスを詳細に研究するために、オゾン処理したおよび未処理の VRE、CRAB、および C. ディフィシルの胞子に対して AFM イメージングを実行しました。図上。図３ａ、ｃ、およびｅは、それぞれ未処理のＶＲＥ、ＣＲＡＢ、およびＣ．ディフィシレ胞子のＡＦＭ画像を示す。3D 画像で見られるように、細胞は滑らかで無傷です。図 3b、d、および f は、オゾン処理後の VRE、CRAB、および C. ディフィシルの胞子を示しています。テストしたすべてのセルで全体のサイズが減少しただけでなく、オゾンに曝露した後、その表面が著しく粗くなりました。
500 ppm オゾンで 15 分間処理した未処理の VRE、MRAB、C. ディフィシレ胞子 (a、c、e) および (b、d、f) の AFM 画像。画像は、Park Systems XEI バージョン 5.1.6 (XEI Software、水原、韓国、https://www.parksystems.com/102-products/park-xe-bio) を使用して描画されました。
私たちの研究は、DBD プラズマ装置によって生成されたオゾンが、医療関連感染の主な原因として知られている MDRO および C. ディフィシルの胞子を効果的に除染する能力を実証していることを示しています。さらに、我々の研究では、MDRO および C. ディフィシレの胞子による環境汚染が医療関連感染症の原因となる可能性があることを考慮し、主に病院環境で使用される材料に対してオゾンの殺菌効果が成功していることが判明しました。汚染除去テストは、ステンレス鋼、布、ガラス、プラスチック、木材などの材料を MDRO および C. ディフィシル胞子で人為的に汚染した後、DBD プラズマ装置を使用して実施されました。その結果、物質によって除染効果は異なりますが、オゾンの除染能力は顕著です。
病室で頻繁に触れる物体には、定期的な低レベルの消毒が必要です。このような物体の汚染を除去する標準的な方法は、第 4 級アンモニウム化合物などの液体消毒剤を使用した手動洗浄です 13。消毒剤の使用に関する推奨事項を厳守したとしても、MPO を従来の環境洗浄 (通常は手動洗浄) で除去することは困難です 14。そのため、非接触方式などの新たな技術が必要となります。その結果、過酸化水素やオゾンなどのガス状消毒剤に関心が集まっています10。ガス状消毒剤の利点は、従来の手作業では到達できない場所や物体に到達できることです。最近では医療現場でも過酸化水素が使用されるようになりましたが、過酸化水素自体が有毒であるため、厳密な取り扱い手順に従う必要があります。過酸化水素によるプラズマ滅菌では、次の滅菌サイクルまでに比較的長いパージ時間が必要です。対照的に、オゾンは広域スペクトルの抗菌剤として作用し、他の消毒剤に耐性のある細菌やウイルスに対して効果的です8、11、15。さらに、オゾンは大気から安価に生成でき、最終的には酸素に分解されるため、環境に有害な足跡を残す可能性のある追加の有毒化学物質を必要としません。しかし、オゾンが消毒剤として広く使用されない理由は次のとおりです。オゾンは人間の健康に有毒であるため、その濃度は 8 時間を超えても平均 0.07 ppm を超えないため 16、主に排気ガスの浄化を目的としてオゾン滅菌器が開発され、市場に投入されています。除染後にガスを吸入して不快な臭いが発生する可能性もあります5,8。オゾンは医療機関では積極的に使用されていませんでした。ただし、オゾンは滅菌チャンバー内で適切な換気手順を使用すれば安全に使用でき、触媒コンバーターを使用するとオゾンの除去を大幅に加速できます。この研究では、プラズマオゾン滅菌器が医療現場での消毒に使用できることを実証します。高い滅菌能力と簡単な操作性、入院患者様への迅速な対応を実現した装置を開発しました。さらに、追加費用なしで外気を利用した簡易滅菌ユニットを開発しました。現在まで、MDRO を不活化するためのオゾンの最小要件については十分な情報がありません。私たちの研究で使用された装置はセットアップが簡単で稼働時間が短く、頻繁な装置の滅菌に役立つことが期待されています。
オゾンの殺菌作用のメカニズムは完全には明らかではありません。いくつかの研究では、オゾンが細菌の細胞膜に損傷を与え、細胞内漏洩と最終的には細胞溶解を引き起こすことが示されています17,18。オゾンはチオール基と反応して細胞の酵素活性を妨害し、核酸のプリン塩基やピリミジン塩基を修飾する可能性があります。この研究では、オゾン処理前後の VRE、CRAB、および C. ディフィシルの胞子の形態を視覚化したところ、それらのサイズが減少しただけでなく、表面が著しく粗くなり、最外膜の損傷または腐食が示されたことがわかりました。オゾンガスにより内部物質は強い酸化力を持っています。この損傷は、細胞変化の重症度に応じて、細胞の不活性化を引き起こす可能性があります。
C. ディフィシルの胞子を病室から除去するのは困難です。胞子は10、20個放出した場所に残ります。さらに、この研究では、500 ppm オゾンで 15 分間、寒天プレート上の細菌数の最大対数 10 倍減少は 2.73 でしたが、C 胞子.ディフィシルを含むさまざまな材料に対するオゾンの殺菌効果は減少しました。したがって、医療現場で C. ディフィシル感染を減らすためにさまざまな戦略が考えられます。隔離された C. ディフィシル チャンバーのみで使用する場合、オゾン処理の曝露時間と強度を調整することも役立つ場合があります。さらに、オゾン除染法は、消毒剤や抗菌戦略による従来の手動洗浄を完全に置き換えることはできず、C. ディフィシルの制御にも非常に効果的である可能性があることを心に留めておく必要があります 5 。この研究では、消毒剤としてのオゾンの有効性は MPO の種類によって異なりました。有効性は、成長段階、細胞壁、修復機構の効率などのいくつかの要因に依存する可能性があります21、22。各素材の表面におけるオゾンの殺菌効果が異なる理由は、バイオフィルムの形成によるものと考えられます。これまでの研究では、E. faecium と E. faecium がバイオフィルムとして存在すると環境耐性が高まることが示されています 23、24、25。しかし、この研究は、オゾンが MDRO と C. difficile の胞子に対して顕著な殺菌効果があることを示しています。
私たちの研究の限界は、修復後のオゾン保持の影響を評価したことです。これは、生存細菌細胞数の過大評価につながる可能性があります。
この研究は病院環境における消毒剤としてのオゾンの有効性を評価するために実施されましたが、私たちの結果をすべての病院環境に一般化することは困難です。したがって、実際の病院環境におけるこの DBD オゾン滅菌器の適用性と適合性を調査するには、さらなる研究が必要です。
DBD プラズマ リアクターによって生成されるオゾンは、MDRO および C. ディフィシルにとって簡単で価値のある除染剤となる可能性があります。したがって、オゾン処理は病院環境の消毒に代わる効果的な手段と考えられます。
現在の研究で使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて各著者から入手できます。
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