LC のトラブルシューティングのトピックの中には、時間の経過とともに機器の技術が向上しても、LC の実践には問題があるため、決して時代遅れになることはありません。LC システムで問題が発生し、最終的に不適切なピーク形状になる可能性にはさまざまな方法があります。ピーク形状に関連する問題が発生した場合、これらの結果について考えられる原因の短いリストは、トラブルシューティングのエクスペリエンスを簡素化するのに役立ちます。
この「LC トラブルシューティング」コラムを書き、毎月トピックについて考えるのは楽しいです。いくつかのトピックは決して時代遅れになることがないからです。クロマトグラフィー研究の分野では、より新しく優れたアイデアに取って代わられると特定のトピックやアイデアが時代遅れになりますが、トラブルシューティングの分野では、最初のトラブルシューティングの記事が 1983 年にこの雑誌 (当時の LC ジャーナル) に掲載されて以来 (1)、過去数年間、私はいくつかの LC T に焦点を当ててきました。液体クロマトグラフィー (LC) に影響を与える現代の傾向に関するトラブルシューティングのセクション (たとえば、保持に対する圧力の影響に関する理解の相対比較 [2] 新しい進歩) LC の結果の解釈と最新の LC 機器でトラブルシューティングを行う方法。今月の連載では、2021 年 12 月に開始したシリーズ (3) を継続します。このシリーズでは、LC トラブルシューティングの「生と死」のトピックのいくつかに焦点を当てました。トラブルシューティング担当者にとって最適な要素は、年齢に関係なく不可欠です。このシリーズの中心的なトピックは、多くの研究室にぶら下がっている LCGC の有名な「LC トラブルシューティング ガイド」ウォール チャート (4) と非常に関連しています。このシリーズの第 3 部では、ピーク形状またはピーク特性に関連する問題に焦点を当てることにしました。信じられないことに、ウォール チャートには、ピーク形状が悪い場合の 44 の異なる潜在的な原因がリストされています。これらの問題すべてを 1 つの記事で詳細に検討することはできないため、このトピックの最初の記事では、いくつかの問題に焦点を当てます。若い人も年配の LC ユーザーも、この重要なトピックについて役立つヒントやリマインダーを見つけられることを願っています。
私は、トラブルシューティングの質問に「何でも可能です」と答えることが多くなっていることに気づきました。解釈が難しい観察結果を考慮すると、この答えは簡単に見えるかもしれませんが、多くの場合、それが適切であると感じています。ピークの形状が良くない原因は数多く考えられるため、問題が何であるかを検討する際には広い心を保つことが重要であり、最も一般的な可能性に焦点を当ててトラブルシューティングの取り組みを開始する潜在的な原因に優先順位を付けることができることが重要です。この点は非常に重要です。可能です。
トラブルシューティング演習における重要なステップは、解決する必要がある問題があることを認識することです。問題があると認識することは、多くの場合、ツールに起こっていることが、理論、経験的知識、経験によって形作られた私たちの期待とは異なることを認識することを意味します (5)。ここで言う「ピークの形状」とは、実際には、ピークの形状 (対称、非対称、滑らか、ふわふわ、リーディング エッジ、テーリングなど) だけを指すわけではありません。実際のピーク形状に対する予想は単純です。理論 (6) は、図 1a に示すように、ほとんどの場合、クロマトグラフィーのピークは対称でガウス分布の形状に一致するはずであるという教科書の予想を十分に裏付けています。ピーク幅から予想することはより複雑な問題であり、このトピックについては今後の記事で説明します。図 1 の他のピーク形状は、観察される可能性のある他の可能性のいくつか、つまり、物事がうまくいかない可能性のいくつかを示しています。この記事の残りの部分では、これらの形状タイプにつながる可能性のある状況の具体的な例をいくつか説明することに時間を費やします。
場合によっては、ピークが溶出されると予想されるクロマトグラムでピークがまったく観察されないことがあります。上記の壁図は、ピークの欠如 (実際にサンプルに実際に検出器の応答がノイズを超えて検出するのに十分な濃度の標的分析物を含んでいると仮定した場合) は、何らかの機器の問題または不正確な移動相条件 (もし観察された場合) に関連していることを示しています。このカテゴリの潜在的な問題と解決策の短いリストを表 I に示します。
上で述べたように、ピークの広がりに注意を払って修正しようとする前に、どの程度のピークの広がりを許容すべきかという問題は、今後の記事で説明する複雑なトピックです。私の経験では、ピークの大幅な広がりにはピーク形状の大幅な変化が伴うことが多く、ピークのテーリングはピーク前や分割よりも一般的です。ただし、名目上対称なピークも広がり、これはいくつかの異なる理由によって引き起こされる可能性があります。
これらの問題のそれぞれについては、トラブルシューティング LC の前号で詳しく説明されており、これらのトピックに興味のある読者は、これらの問題の根本原因と考えられる解決策について、以前の記事を参照してください。さらに詳しく。
ピークのテーリング、ピークのフロンティング、および分割はすべて、化学的現象または物理的現象によって引き起こされる可能性があり、これらの問題に対する考えられる解決策のリストは、扱うのが化学的問題か物理的問題かによって大きく異なります。多くの場合、クロマトグラム内の異なるピークを比較することで、どれが原因であるかについて重要な手がかりを見つけることができます。クロマトグラム内のすべてのピークが同様の形状を示す場合、原因は物理的ではない可能性が高くなります。1 つまたは少数のピークのみが影響を受け、残りは問題がないように見える場合、原因は化学的である可能性が最も高くなります。
ピークテーリングの化学的原因は、ここで簡単に説明するには複雑すぎるため、より詳細な議論については、最新号の「LC Troubleshooting」を参照してください (10)。ただし、簡単に試せるのは、注入された分析物の質量を減らし、ピークの形状が改善するかどうかを確認することです。そうであれば、これは問題が「質量過負荷」であることを示す良い手がかりになります。この場合、メソッドは少量の分析物の注入に限定するか、クロマトグラフィー条件を適切にする必要があります。より大きな質量を注入しても良好なピーク形状が得られるように変更されました。
ピーク テーリングには多くの潜在的な物理的理由もあります。可能性の詳細な議論に興味がある読者は、別の最新号「LC トラブルシューティング」を参照してください (11)。ピーク テーリングのより一般的な物理的原因の 1 つは、インジェクターと検出器間の接続不良です (12)。数週間前に私の研究室で得られた図 1d に極端な例を示します。この場合、これまで使用したことのない新しい注入バルブを備えたシステムを構築し、少量の注入ループを設置しました。ステンレス鋼のキャピラリに成形されたフェルールです。最初のトラブルシューティング実験をいくつか行った結果、噴射バルブのステータのポートの深さが以前よりもはるかに深く、その結果、ポートの底部に大きなデッドボリュームが生じることがわかりました。この問題は、噴射ループを別のチューブに交換することで簡単に解決できます。フェルールを適切な位置に調整してポートの底部のデッドボリュームを排除できます。
図 1e に示すようなピーク フロントは、物理的または化学的問題によって発生することもあります。リーディング エッジの一般的な物理的原因は、カラムの粒子床が十分に充填されていないこと、または時間の経過とともに粒子が再構成されたことです。この物理現象によって引き起こされるピーク テーリングと同様、これを修正する最善の方法は、カラムを交換して使い続けることです。基本的に、化学的起源を持つリーディング エッジのピーク形状は、いわゆる「非線形」保持条件から発生することがよくあります。理想的 (線形) 条件下では、分析物の量は保持されます。固定相によるピーク（したがって、保持係数）は、カラム内の分析物の濃度と直線的に関係します。クロマトグラフィー的には、これは、カラムに注入される分析物の質量が増加すると、ピークは高くなるが幅は広くならないことを意味します。この関係は、保持挙動が非線形の場合には崩れ、より多くの質量が注入されると、ピークは高くなるだけでなく幅も広くなります。さらに、非線形形状がクロマトグラフィーのピークの形状を決定し、その結果、先頭または末尾が決まります。ピークテーリングを引き起こす質量過負荷と同様に (10)、非線形保持によって引き起こされるピークリーディングも、注入された分析物の質量を減らすことによって診断できます。ピーク形状が改善する場合は、リーディングエッジの原因となる注入品質を超えないようにメソッドを修正するか、この動作を最小限に抑えるためにクロマトグラフィー条件を変更する必要があります。
図 1f に示すように、「分割」ピークのように見えるものが観察されることがあります。この問題を解決するための最初のステップは、ピークの形状が部分的な共溶出 (つまり、2 つの異なるが近くに溶出する化合物の存在) によるものであるかどうかを判断することです。実際に 2 つの異なる分析物が近くに溶出している場合、それはそれらの分離能を改善すること (たとえば、選択性、保持、またはプレート数を増やすことによる) の問題であり、見かけの「分割」ピークは物理的なパフォーマンスとは関係がありません。多くの場合、この決定に対する最も重要な手がかりは、クロマトグラム内のすべてのピークが分割形状を示すか、それとも 1 つまたは 2 つだけであるかということです。1 つまたは 2 つだけの場合は、おそらく共溶出の問題です。すべてのピークが分割されている場合は、おそらく物理的な問題であり、カラム自体に関連している可能性が最も高くなります。
カラム自体の物理的特性に関連する分割ピークは、通常、入口または出口のフリットの部分的な詰まり、またはカラム内の粒子の再構成が原因で、カラム チャネル形成の特定の領域で移動相が他の領域の移動相よりも速く流れます (11)。部分的に詰まったフリットは、カラムを通る流れを逆転させることで除去できる場合があります。ただし、私の経験では、これは通常、長期的な解決策ではなく短期的な解決策です。最新のカラムでは、粒子がカラム内で再結合すると致命的となることがよくあります。この時点で、カラムを交換して続行するのが最善です。
図 1g のピークは、これも私自身の研究室で最近行った例のものですが、通常、信号が非常に高く、応答範囲の上限に達していることを示しています。光吸光度検出器 (この場合は UV-vis) の場合、検体の濃度が非常に高い場合、検体は検出器のフローセルを通過する光の大部分を吸収し、検出される光はほとんど残りません。これらの条件下では、光検出器からの電気信号は、迷光や「暗電流」などのさまざまなノイズ源によって大きく影響されます。そのため、信号の外観が非常に「あいまい」になり、分析物の濃度に依存しません。このような場合、多くの場合、分析物の注入量を減らす、つまり注入量を減らす、サンプルを希釈する、またはその両方を行うことで問題を簡単に解決できます。
クロマトグラフィーの学校では、サンプル中の分析対象物濃度の指標として検出器信号 (つまり、クロマトグラムの Y 軸) を使用します。したがって、単純に解釈すると、これは負の分析対象物濃度を示していると考えられるため、信号がゼロ未満のクロマトグラムを見るのは奇妙に思えますが、もちろん物理的にはあり得ません。私の経験では、吸光度検出器 (UV-vis など) を使用したときに負のピークが最もよく観察されます。
この場合、負のピークは、単にカラムから溶出する分子がピークの前後で移動相自体よりも少ない光を吸収することを意味します。これは、たとえば、比較的低い検出波長 (<230 nm) と、これらの波長の光の大部分を吸収する移動相添加剤を使用する場合に発生する可能性があります。このような添加剤には、メタノールなどの移動相溶媒成分や、酢酸塩やギ酸塩などの緩衝成分が考えられます。実際に負のピークを使用して検量線を作成し、正確な定量情報を得ることができます。それら自体を回避する基本的な理由はありません (この方法は「間接 UV 検出」と呼ばれることもあります) (13)。ただし、吸光度検出の場合、負のピークを完全に回避したい場合、最良の解決策は、分析対象物が移動相よりも多く吸収するように別の検出波長を使用するか、分析対象物よりも少ない光を吸収するように移動相の組成を変更することです。
溶媒マトリックスなど、サンプル中の分析物以外の成分の屈折率が移動相の屈折率と異なる場合、屈折率 (RI) 検出を使用する場合にも負のピークが現れることがあります。これは UV-vis 検出でも起こりますが、この効果は RI 検出に比べて弱まる傾向があります。どちらの場合も、サンプル マトリックスの組成を移動相の組成とより厳密に一致させることで、負のピークを最小限に抑えることができます。
LC トラブルシューティングの基本的なトピックに関するパート 3 では、観察されたピーク形状が予想または通常のピーク形状と異なる状況について説明しました。このような問題の効果的なトラブルシューティングは、予想されるピーク形状 (理論または既存の方法での事前の経験に基づく) を知ることから始まるため、これらの予想からの逸脱は明らかです。ピーク形状の問題には、さまざまな潜在的な原因 (幅が広すぎる、テーリング、リーディング エッジなど) があります。今回は、最も頻繁に見られる理由のいくつかについて詳しく説明します。これらの詳細を知ることで、トラブルを開始するのに適した場所が提供されます。原因と解決策のより詳細なリストに興味のある読者は、LCGC の「LC トラブルシューティング ガイド」ウォール チャートを参照してください。
(4) LCGC「LC トラブルシューティング ガイド」ウォール チャート。https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021)。
(6) A. Felinger、「クロマトグラフィーにおけるデータ分析と信号処理」(エルゼビア、ニューヨーク州、ニューヨーク州、1998 年)、43 ～ 96 ページ。
(8) ワハブ MF、ダスグプタ PK、カジョ AF、アームストロング DW、Anal.Chim.Journal.Rev。907、31–44 (2016)。https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043。