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微生物腐食（MIC）は、莫大な経済的損失につながる可能性があるため、多くの産業で深刻な問題です。スーパー二相ステンレス鋼2707（2707 HDSS）は、優れた耐薬品性のため、海洋環境で使用されています。しかし、MICに対する耐性は実験的に実証されていません。この研究では、海洋好気性細菌Pseudomonas aeruginosaによって引き起こされるMIC 2707 HDSSの挙動を調べました。電気化学分析の結果、2216E培地中にPseudomonas aeruginosaバイオフィルムが存在すると、腐食電位の正の変化と腐食電流密度の増加が発生することが示されました。X線光電子分光法（XPS）の分析では、バイオフィルム下のサンプル表面のCr含有量の減少が示されました。ピットの視覚分析では、P. aeruginosaバイオフィルムが14日間の培養中に最大0.69 µmのピット深さを生成することが示されました。これは小さいですが、2707 HDSS が P. aeruginosa バイオフィルムの MIC に対して完全に免疫があるわけではないことを示しています。
二相ステンレス鋼（DSS）は、優れた機械的特性と耐食性の完璧な組み合わせにより、さまざまな業界で広く使用されています1,2。しかし、局所的な孔食は依然として発生し、この鋼の完全性に影響を与えます3,4。DSSは微生物腐食（MIC）に対して耐性がありません5,6。DSSの用途が広いにもかかわらず、DSSの耐食性が長期使用には不十分な環境が依然として存在します。これは、より高い耐食性を持つより高価な材料が必要になることを意味します。Jeonら7は、スーパー二相ステンレス鋼（SDSS）でさえ、耐食性の点でいくつかの限界があることを発見しました。そのため、場合によっては、より高い耐食性を持つスーパー二相ステンレス鋼（HDSS）が必要になります。これが、高合金HDSSの開発につながりました。
DSS の耐食性は、アルファ相とガンマ相の比率に依存し、第 2 相に隣接する Cr、Mo、W 領域 8、9、10 が枯渇しています。HDSS は Cr、Mo、N11 の含有量が高いため、優れた耐食性と、wt.% Cr + 3.3 (wt.% Mo + 0.5 wt. .%W) + 16% wt. N12 で決定される等価孔食抵抗値 (PREN) の高い値 (45～50) を備えています。その優れた耐食性は、約 50% のフェライト (α) 相と 50% のオーステナイト (γ) 相を含むバランスの取れた組成に依存しています。HDSS は機械的特性が優れており、塩化物腐食に対する耐性が高くなります。耐食性の向上により、海洋環境などのより攻撃的な塩化物環境での HDSS の使用が拡大します。
MIC は、石油、ガス、水道業界など、多くの業界で大きな問題となっています14。MIC は、すべての腐食損傷の 20% を占めています15。MIC は、多くの環境で見られる生体電気化学的腐食です。金属表面に形成されるバイオフィルムは電気化学的条件を変え、それによって腐食プロセスに影響を及ぼします。MIC 腐食はバイオフィルムによって引き起こされると広く考えられています。起電性微生物は、生存に必要なエネルギーを得るために金属を侵食します17。最近の MIC 研究では、EET (細胞外電子移動) が起電性微生物によって誘発される MIC の律速因子であることが示されています。Zhang ら18 は、電子中間体が Desulfurovibrio sessificans 細胞と 304 ステンレス鋼の間の電子移動を促進し、より深刻な MIC 攻撃を引き起こすことを実証しました20 の研究では、腐食性硫酸還元細菌 (SRB) のバイオフィルムが金属基質から電子を直接吸収し、深刻な孔食を引き起こす可能性があることが示されています。
DSSは、SRBや鉄還元細菌（IRB）などを含む培地ではMIC（微生物抵抗性）の影響を受けやすいことが知られています21。これらの細菌は、バイオフィルム下のDSS表面に局所的なピットを形成します22,23。DSSとは異なり、HDSS24のMICはよく分かっていません。
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、グラム陰性の運動性桿菌で、自然界に広く分布しています25。緑膿菌は海洋環境においても主要な微生物群であり、MIC濃度の上昇を引き起こします。緑膿菌は腐食プロセスに積極的に関与しており、バイオフィルム形成における先駆的なコロニー形成菌として知られています。Mahatら28とYuanら29は、緑膿菌が水環境において軟鋼および合金の腐食速度を高める傾向があることを実証しました。
本研究の主な目的は、海洋好気性細菌である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が生成するMIC 2707 HDSSの特性を、電気化学的手法、表面分析法、腐食生成物分析を用いて調査することであった。開路電位（OCP）、直線分極抵抗（LPR）、電気化学インピーダンス分光法（EIS）、電位動的分極などの電気化学的研究を実施し、MIC 2707 HDSSの挙動を調べた。エネルギー分散型分光分析（EDS）を実施し、腐食表面の化学元素を検出した。さらに、X線光電子分光法（XPS）を用いて、緑膿菌を含む海洋環境の影響下における酸化膜不動態化の安定性を測定した。腐食ピットの深さは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて測定した。
表1は2707 HDSSの化学組成を示しています。表2は、2707 HDSSが650 MPaの降伏強度という優れた機械的特性を有することを示しています。図1は、溶体化処理された2707 HDSSの光学顕微鏡組織を示しています。約50%のオーステナイト相と約50%のフェライト相を含む顕微鏡組織には、二次相のないオーステナイト相とフェライト相の細長い帯が見られます。
図2aは、2707 HDSSを2216E非生物培地およびP. aeruginosaブロスに37℃で14日間曝露した際の開放電位（Eocp）と曝露時間の関係を示しています。Eocpの最大かつ最も顕著な変化は、最初の24時間以内に発生することがわかります。どちらの場合も、Eocp値は16時間前後で-145 mV（SCEと比較）でピークに達し、その後急激に低下し、非生物培地では-477 mV（SCEと比較）、P. aeruginosaブロスでは-236 mV（SCEと比較）に達しました。 24時間後、P. aeruginosaのEocp 2707 HDSS値は-228 mV（SCEと比較）で比較的安定していましたが、非生物学的サンプルの対応する値は約-442 mV（SCEと比較）でした。P. aeruginosa存在下でのEocpは非常に低い値でした。
非生物培地および緑膿菌ブロス中の 2707 個の HDSS サンプルを 37 °C で電気化学的に調べた結果:
(a) 露出時間の関数としての Eocp、(b) 14 日目の分極曲線、(c) 露出時間の関数としての Rp、および (d) 露出時間の関数としての icorr。
表3は、14日間にわたり非生物的培地および緑膿菌接種培地に曝露された2707個のHDSSサンプルの電気化学的腐食パラメータを示している。陽極曲線と陰極曲線の接線を外挿し、標準法30,31に従って腐食電流密度（icorr）、腐食電位（Ecorr）、およびターフェル勾配（βαおよびβc）を与える交点を求めた。
図2bに示すように、Pseudomonas aeruginosaの曲線が上方にシフトすると、非生物的曲線と比較してEcorrが増加しました。腐食速度に比例するicorr値は、Pseudomonas aeruginosaサンプルでは0.328 µA cm-2に増加し、非生物的サンプル（0.087 µA cm-2）の4倍に増加しました。
LPRは、迅速な腐食分析のための古典的な非破壊電気化学的手法です。MIC32の研究にも使用されています。図2cは、暴露時間の関数としての分極抵抗（Rp）を示しています。Rp値が高いほど、腐食が少ないことを意味します。最初の24時間以内に、Rp 2707 HDSSは、非生物試料で1955 kΩ cm2、緑膿菌試料で1429 kΩ cm2でピークに達しました。図2cは、Rp値が1日後に急激に減少し、その後13日間は比較的変化がなかったことも示しています。緑膿菌試料のRp値は約40 kΩ cm2で、非生物試料の450 kΩ cm2よりもはるかに低い値です。
icorrの値は均一腐食速度に比例します。その値は、以下のStern-Giriの式から計算できます。
Zoe et al. 33によると、本研究におけるターフェル勾配Bの典型的な値は26 mV/decとされている。図2dは、非生物学的サンプル2707のicorrが比較的安定しているのに対し、P. aeruginosaサンプルは最初の24時間後に大きく変動していることを示す。P. aeruginosaサンプルのicorr値は、非生物学的コントロールよりも1桁ほど高かった。この傾向は、分極抵抗の結果と一致している。
EISは、腐食表面における電気化学反応の特性評価に用いられるもう一つの非破壊検査法です。非生物環境および緑膿菌溶液に曝露されたサンプルのインピーダンススペクトルと計算された静電容量値、サンプル表面に形成された不活性膜／バイオフィルム抵抗Rb、電荷移動抵抗Rct、電気二重層容量Cdl（EDL）、定数QCPE、位相要素パラメータ（CPE）が測定されました。これらのパラメータは、等価回路（EEC）モデルを用いてデータをフィッティングすることでさらに分析されました。
図3は、非生物培地および緑膿菌培養液中の2707個のHDSSサンプルについて、異なる培養時間における典型的なナイキスト線図（aおよびb）とボード線図（a'およびb'）を示しています。緑膿菌の存在下では、ナイキストリングの直径が減少します。ボード線図（図3b'）は、総インピーダンスの増加を示しています。緩和時間定数に関する情報は、位相最大値から得ることができます。図4は、単層（a）および二重層（b）に基づく物理構造と、対応するEECを示しています。CPEはEECモデルに導入されています。そのアドミタンスとインピーダンスは次のように表されます。
サンプル 2707 HDSS のインピーダンス スペクトルをフィッティングするための 2 つの物理モデルと対応する等価回路:
ここで、Y0はKPI値、jは虚数または(-1)1/2、ωは角周波数、nは1未満のKPI指数である35。電荷移動抵抗の反転（すなわち1/Rct）は腐食速度に対応する。Rctが小さいほど、腐食速度は高い27。14日間培養後、Pseudomonas aeruginosaサンプルのRctは32 kΩ cm2に達し、これは非生物サンプルの489 kΩ cm2を大幅に下回る値であった（表4）。
図5のCLSM像とSEM像は、HDSSサンプル2707の表面におけるバイオフィルムコーティングが7日後には緻密であることを明確に示しています。しかし、14日後にはバイオフィルムの被覆率が低下し、一部の死細胞が出現しました。表5は、P. aeruginosaに7日間および14日間曝露した後のHDSSサンプル2707のバイオフィルム厚を示しています。最大バイオフィルム厚は、7日後の23.4µmから14日後の18.9µmに変化しました。平均バイオフィルム厚もこの傾向を裏付け、7日後の22.2±0.7µmから14日後の17.8±1.0µmに減少しました。
(a) 7日目の3D CLSM像、(b) 14日目の3D CLSM像、(c) 7日目のSEM像、(d) 14日目のSEM像。
EMFは、14日間P. aeruginosaに曝露されたサンプルのバイオフィルムおよび腐食生成物中の化学元素を明らかにしました。図6は、バイオフィルムおよび腐食生成物中のC、N、O、Pの含有量が純金属よりも著しく高いことを示しています。これは、これらの元素がバイオフィルムおよびその代謝物に関連しているためです。微生物は微量のクロムと鉄しか必要としません。サンプル表面のバイオフィルムおよび腐食生成物中に高濃度のCrとFeが含まれていることは、金属マトリックスが腐食によって元素を失ったことを示しています。
14日後、培地2216EでP. aeruginosaの有無によるピットが観察されました。インキュベーション前は、サンプルの表面は滑らかで欠陥はありませんでした（図7a）。インキュベーション後、バイオフィルムと腐食生成物を除去後、図7bとcに示すように、CLSMを使用してサンプル表面の最も深いピットを調べました。非生物学的コントロールの表面には明らかなピットは見つかりませんでした（最大ピット深さ0.02 µm）。P. aeruginosaによる最大ピット深さは、3つのサンプルの平均最大ピット深さ（各サンプルについて10の最大ピット深さを選択）に基づくと、7日目で0.52 µm、14日目で0.69 µmでした。それぞれ0.42 ± 0.12 µmと0.52 ± 0.15 µmを達成しました（表5）。これらの穴の深さの値は小さいですが重要です。
(a) 暴露前、(b) 非生物的環境での 14 日間、および (c) Pseudomonas aeruginosa 培地での 14 日間。
図8は様々なサンプル表面のXPSスペクトルを示しており、各表面で分析された化学組成は表6にまとめられています。表6では、P. aeruginosa（サンプルAとB）の存在下でのFeとCrの原子百分率は、非生物学的コントロール（サンプルCとD）の値よりもはるかに低いことがわかりました。P. aeruginosaサンプルの場合、Cr 2p核レベルのスペクトル曲線は、結合エネルギー（BE）が574.4、576.6、578.3、586.8 eVの4つのピーク成分にフィッティングされ、これらはそれぞれCr、Cr2O3、CrO3、Cr(OH)3に起因すると考えられます（図9aとb）。非生物試料の場合、主Cr 2p準位のスペクトルには、図9cとdにそれぞれCr（BEで573.80 eV）とCr2O3（BEで575.90 eV）の2つの主要なピークが含まれています。非生物試料とP. aeruginosa試料の最も顕著な違いは、バイオフィルム直下にCr6+が存在し、Cr(OH)3（BEで586.8 eV）の相対的な割合が高いことです。
2 つの媒体におけるサンプル 2707 HDSS の表面の広い XPS スペクトルは、それぞれ 7 日と 14 日です。
(a) P. aeruginosa への 7 日間の曝露、(b) P. aeruginosa への 14 日間の曝露、(c) 非生物的環境での 7 日間、および (d) 非生物的環境での 14 日間。
HDSSはほとんどの環境において高い耐食性を示します。Kimら2は、HDSS UNS S32707がPRENが45を超える高度に合金化されたDSSであると報告しました。本研究におけるサンプル2707 HDSSのPREN値は49でした。これは、クロム含有量が高く、モリブデンとニッケルの含有量も高いためです。これらは酸性環境や塩化物含有量の高い環境で有用です。さらに、バランスの取れた組成と欠陥のない微細構造は、構造安定性と耐食性に有益です。しかし、優れた耐薬品性に​​もかかわらず、本研究の実験データは、2707 HDSSが緑膿菌バイオフィルムのMICに対して完全に耐性があるわけではないことを示唆しています。
電気化学的な結果から、2707 HDSS の P. aeruginosa ブロスでの腐食速度は、非生物学的環境と比較して 14 日後に大幅に増加したことが示されました。図 2a では、最初の 24 時間は非生物的培地と P. aeruginosa ブロスの両方で Eocp の減少が観察されました。その後、バイオフィルムがサンプルの表面を完全に覆い、Eocp は比較的安定しました36。しかし、生物学的 Eocp レベルは非生物学的 Eocp レベルよりもはるかに高かったです。この差は P. aeruginosa バイオフィルムの形成に関連していると考えられる理由があります。図 2d では、P. aeruginosa の存在下で、icorr 2707 HDSS 値は 0.627 μA cm-2 に達しました。これは、非生物的コントロール (0.063 μA cm-2) よりも 1 桁高く、EIS で測定した Rct 値と一致していました。最初の数日間は、P. aeruginosa細胞の付着とバイオフィルムの形成により、P. aeruginosaブロス中のインピーダンス値が増加しました。しかし、バイオフィルムがサンプル表面を完全に覆うと、インピーダンスは減少します。保護層は、主にバイオフィルムとバイオフィルム代謝物の形成によって攻撃されます。その結果、耐食性は時間の経過とともに低下し、P. aeruginosaの付着は局所的な腐食を引き起こしました。非生物的環境での傾向は異なり、非生物学的コントロールの耐食性は、P. aeruginosaブロスにさらされたサンプルの対応する値よりもはるかに高かったです。さらに、非生物的系統では、Rct 2707 HDSS値は14日目に489 kΩ cm2に達し、これはP. aeruginosa存在下のRct値（32 kΩ cm2）の15倍でした。したがって、2707 HDSS は滅菌環境において優れた耐腐食性を備えていますが、P. aeruginosa バイオフィルムからの MIC に対しては耐性がありません。
これらの結果は、図 2b の分極曲線からも確認できます。陽極分岐は、Pseudomonas aeruginosa バイオフィルムの形成および金属酸化反応に関連しています。この場合、陰極反応は酸素の還元です。P. aeruginosa の存在により、腐食電流密度が大幅に増加し、非生物的コントロールよりも約 1 桁高くなりました。これは、P. aeruginosa バイオフィルムが 2707 HDSS の局所腐食を増強することを示しています。Yuan ら29 は、Cu-Ni 70/30 合金の腐食電流密度が P. aeruginosa バイオフィルムの作用下で増加することを発見しました。これは、Pseudomonas aeruginosa バイオフィルムによる酸素還元の生体触媒によるものと考えられます。この観察結果は、本研究の MIC 2707 HDSS も説明できる可能性があります。好気性バイオフィルム下では酸素が少ない可能性もあります。したがって、金属表面を酸素で再不動態化することを拒否することが、この研究における MIC に寄与する要因である可能性があります。
Dickinsonら38は、化学反応および電気化学反応の速度は、試料表面の付着細菌の代謝活性と腐食生成物の性質に直接影響を受ける可能性があると示唆しています。図5および表5に示すように、細胞数とバイオフィルムの厚さは14日後に減少しました。これは、14日後、2216E培地の栄養枯渇、または2707 HDSSマトリックスからの有毒金属イオンの放出により、2707 HDSS表面の付着細胞のほとんどが死滅したという事実によって合理的に説明できます。これはバッチ実験の限界です。
この研究では、P. aeruginosa バイオフィルムが 2707 HDSS 表面のバイオフィルム下の Cr と Fe の局所的減少に寄与しました (図 6)。表 6 は、サンプル C と比較したサンプル D の Fe と Cr の減少を示しており、P. aeruginosa バイオフィルムによって引き起こされた溶解した Fe と Cr が最初の 7 日間持続したことを示しています。2216E 環境は、海洋環境をシミュレートするために使用されます。この環境には 17700 ppm Cl- が含まれており、これは天然海水の含有量に匹敵します。17700 ppm Cl- の存在は、XPS で分析した 7 日および 14 日後の非生物サンプルにおける Cr の減少の主な原因でした。P. aeruginosa サンプルと比較して、非生物サンプル中の Cr の溶解は、非生物条件下での 2707 HDSS の塩素に対する強い耐性により、はるかに少なかった図9は、不動態皮膜中にCr6+が存在することを示しています。ChenとClaytonが示唆しているように、Cr6+はP. aeruginosaバイオフィルムによる鋼表面からのクロム除去に関与している可能性があります。
細菌の増殖により、培養前後の培地のpHはそれぞれ7.4と8.2であった。したがって、P. aeruginosaバイオフィルム下では、バルク培地のpHが比較的高いため、有機酸による腐食が本試験に寄与する可能性は低いと考えられる。非生物学的対照培地のpHは、14日間の試験期間中、初期7.4から最終7.5まで大きな変化はなかった。培養後のシード培地のpHの上昇は、P. aeruginosaの代謝活動によるものであり、試験紙がない場合でもpHに同様の影響を与えることが確認された。
図7に示すように、P. aeruginosaバイオフィルムによる最大ピット深さは0.69 µmで、非生物培地のピット深さ（0.02 µm）を大幅に上回っています。これは、前述の電気化学データと一致しています。ピット深さ0.69 µmは、同じ条件下で2205 DSSで報告された9.5 µmという値の10分の1以下です。これらのデータは、2707 HDSSが2205 DSSよりもMICに対する耐性が優れていることを示しています。これは驚くべきことではありません。なぜなら、2707 HDSSはCrレベルが高く、不動態化が長くなり、P. aeruginosaの脱不動態化がより困難になり、有害な二次沈殿のないバランスの取れた相構造によってピットが形成されるからです。
結論として、P. aeruginosa培養液中の2707 HDSS表面には、MICピットが認められたのに対し、非生物環境下では有意なピットは認められなかった。本研究は、2707 HDSSは2205 DSSよりもMICに対する耐性が優れているものの、P. aeruginosaバイオフィルムの存在によりMICに対して完全に耐性があるわけではないことを示している。これらの結果は、海洋環境に適したステンレス鋼の選定と寿命予測に役立つ。
2707 HDSS のクーポンは、中国瀋陽のノースイースタン大学 (NEU) 冶金学院から提供されました。2707 HDSS の元素組成は表 1 に示されており、NEU 材料分析および試験部門で分析されました。すべてのサンプルは、1180°C で 1 時間固溶体処理されました。腐食試験の前に、上部開口面積 1 cm2 のコイン型 2707 HDSS をシリコンカーバイドサンドペーパーで 2000 グリットに研磨し、次に 0.05 µm Al2O3 粉末スラリーで研磨しました。側面と底面は不活性塗料で保護されています。乾燥後、サンプルを滅菌脱イオン水で洗浄し、75% (v/v) エタノールで 0.5 時間滅菌しました。次に、使用前に紫外線 (UV) 下で 0.5 時間風乾しました。
海洋性緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）MCCC 1A00099株は、中国の厦門海洋培養コレクションセンター（MCCC）から購入しました。Pseudomonas aeruginosaは、Marine 2216E液体培地（Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd.、中国青島市）を用いて、250 mlフラスコおよび500 mlガラス電気化学セルで37℃の好気条件下で培養しました。培地組成（g/l）：NaCl 19.45g、MgCl₂ 5.98g、Na₂SO₄ 3.24g、CaCl₂ 1.8g、KCl 0.55g、Na₂CO₄ 0.16g、KBr 0.08g、SrCl₂ 0.034g、SrBr₂ 0.08g、H₂BO₄ 0.022g、NaSiO₄ 0.004g、6NH₂₄NH₄ 0.016g、NH₄ 3.0016g、ペプトン 5.0g、酵母エキス 1.0g、クエン酸鉄 0.1g。接種前に121℃で20分間オートクレーブ処理する。付着細胞および浮遊細胞は、光学顕微鏡下、400倍の倍率で血球計算盤を用いて計数する。接種直後のプランクトン性緑膿菌の初期濃度は約 106 個/ml でした。
電気化学試験は、培地容量500 mlの標準的な3電極ガラスセルで実施しました。白金シートと飽和カロメル電極（SAE）は、塩橋を充填したルギン毛細管を介してリアクターに接続され、それぞれ対極と参照電極として機能しました。作用電極を作製するために、各サンプルにゴム引き銅線を取り付け、エポキシ樹脂で覆い、片側に作用電極用に約1 cm2の保護されていない領域を残しました。電気化学測定中、サンプルは2216E培地に置かれ、ウォーターバスで一定のインキュベーション温度（37°C）に保たれました。OCP、LPR、EIS、および電位動的分極データは、Autolabポテンショスタット（Reference 600TM、Gamry Instruments、Inc.、米国）を使用して測定されました。LPR試験は、Eocpで-5～5 mVの範囲で0.125 mV s-1のスキャン速度で、1 Hzのサンプリング速度で記録されました。 EISは、0.01～10,000 Hzの周波数範囲で正弦波を使用し、定常状態のEocpで5 mVの印加電圧を用いて実施しました。電位掃引前、電極はアイドルモードにあり、自由腐食電位が安定値に達するまで待機状態でした。その後、分極曲線をEocpの関数として-0.2～1.5 Vの範囲で0.166 mV/sの走査速度で測定しました。各試験は、P. aeruginosaの有無で3回繰り返しました。
金属組織学的分析用の試料は、2000番のSiC研磨紙を用いて湿式機械研磨し、その後、光学観察のために0.05μmのAl2O3粉末懸濁液を用いてさらに研磨した。金属組織学的分析は光学顕微鏡を用いて実施した。試料は10重量%水酸化カリウム溶液43を用いてエッチングした。
インキュベーション後、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH 7.4 ± 0.2）で3回洗浄し、2.5%（v/v）グルタルアルデヒドで10時間固定してバイオフィルムを固定しました。その後、バッチエタノール（50%、60%、70%、80%、90%、95%、および100%（体積比））で脱水し、風乾しました。最後に、SEM観察用の導電性を確保するために、サンプル表面に金薄膜を蒸着しました。SEM画像は、各サンプル表面で最も付着性の強いP. aeruginosa細胞が集中するスポットに焦点を合わせました。化学元素を特定するため、EDS分析を実施しました。ピットの深さは、ツァイス共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）（LSM 710、ツァイス、ドイツ）を使用して測定しました。バイオフィルムの下の腐食ピットを観察するために、まずテストサンプルを中国国家規格 (CNS) GB/T4334.4-2000 に従って洗浄し、テストサンプルの表面から腐食生成物とバイオフィルムを除去しました。
X線光電子分光法（XPS、ESCALAB250表面分析システム、Thermo VG社、米国）による分析は、単色X線源（エネルギー1500 eV、出力150 WのアルミニウムKα線）を用いて、標準状態（-1350 eV）において結合エネルギー0の広い範囲で実施した。透過エネルギー50 eV、0.2 eVステップで高分解能スペクトルを記録した。
インキュベートしたサンプルを取り出し、PBS（pH 7.4 ± 0.2）で15秒間穏やかに洗浄した45。サンプル上のバイオフィルムの細菌生存能を観察するために、バイオフィルムをLIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit（Invitrogen、オレゴン州ユージーン、米国）を使用して染色した。キットには、SYTO-9緑色蛍光色素とヨウ化プロピジウム（PI）赤色蛍光色素の2種類の蛍光色素が含まれている。CLSMでは、蛍光の緑色と赤色の点は、それぞれ生細胞と死細胞を表す。染色のために、3 µlのSYTO-9と3 µlのPI溶液を含む混合物1 mlを暗所で室温（23°C）で20分間インキュベートした。その後、染色したサンプルをNikon CLSM装置（C2 Plus、Nikon、日本）を使用して2つの波長（生細胞の場合は488 nm、死細胞の場合は559 nm）で調べた。バイオフィルムの厚さは3Dスキャンモードで測定されました。
この記事の引用方法: Li, H. et al. Microbial corrosion of 2707 super duplex Stainless Steel by Pseudomonas aeruginosa marine biofilm. the science. 6, 20190. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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