Nature.com をご覧いただきありがとうございます。使用しているブラウザのバージョンでは、CSS サポートが制限されています。最高のエクスペリエンスを実現するには、更新されたブラウザを使用することをお勧めします (または Internet Explorer の互換モードを無効にする)。それまでの間、継続的なサポートを確保するために、サイトはスタイルと JavaScript なしでレンダリングされます。
リキッドバイオプシー (LB) は、生物医学分野で急速に普及しつつある概念です。この概念は主に、さまざまな組織で細胞死後に小さな断片として放出される循環細胞外 DNA (ccfDNA) の断片の検出に基づいています。これらの断片のごく一部は外来の組織または生物に由来します。現在の研究では、この概念を、高い海水濾過能力で知られる見張りの種であるムール貝に適用しました。私たちは、貝類が天然のフィルターとして機能する能力を利用して、さまざまな情報源から環境 DNA 断片を捕捉し、海洋沿岸生態系の生物多様性に関する情報を提供します。私たちの結果は、イガイの血リンパには、1 kb から 5 kb まで、サイズが大きく異なる DNA 断片が含まれていることを示しています。ショットガン配列決定により、多数の DNA 断片が外来微生物起源であることが示されました。その中には、沿岸の海洋生態系で一般的に見られるさまざまな宿主に感染することが知られているウイルスを含む、細菌、古細菌、ウイルスの DNA 断片も見つかりました。結論として、私たちの研究は、ムール貝に適用されたLBの概念が、海洋沿岸生態系における微生物の多様性に関する豊富ではあるがまだ開拓されていない知識源であることを示しています。
海洋生態系の生物多様性に対する気候変動 (CC) の影響は、急速に成長している研究分野です。地球温暖化は重要な生理学的ストレスを引き起こすだけでなく、海洋生物の熱安定性の進化の限界を押し広げ、多くの種の生息地に影響を与え、より好ましい条件を探すよう促します[1、2]。CC は後生動物の生物多様性に影響を与えるだけでなく、宿主と微生物の相互作用の微妙なバランスを崩します。この微生物の細菌異常症は、海洋生物を感染性病原体に感染しやすくするため、海洋生態系に深刻な脅威をもたらします[3、4]。SS は、地球規模の海洋生態系の管理にとって深刻な問題である大量死において重要な役割を果たしていると考えられています [5、6]。多くの海洋種が経済、生態学的、栄養に与える影響を考慮すると、これは重要な問題です。これは、CK の影響がより即時的かつ深刻である極地に生息する二枚貝に特に当てはまります [6、7]。実際、Mytilus spp.などの二枚貝は、海洋生態系に対する CC の影響を監視するために広く使用されています。当然のことながら、比較的多数のバイオマーカーが健康状態を監視するために開発されており、多くの場合、酵素活性や細胞生存率や貪食活性などの細胞機能に基づく機能的バイオマーカーを含む 2 段階のアプローチが使用されています [8]。これらの方法には、大量の海水を吸収した後に軟組織に蓄積する特定の圧力インジケーターの濃度の測定も含まれます。しかし、二枚貝の高い濾過能力と半開放循環系は、患者管理へのシンプルで低侵襲なアプローチであるリキッドバイオプシー（LB）の概念を使用して、新しい血リンパバイオマーカーを開発する機会を提供します。血液サンプル[9、10]。ヒト LB には数種類の循環分子が見られますが、この概念は主に血漿中の循環細胞外 DNA (ccfDNA) フラグメントの DNA 配列分析に基づいています。実際、ヒト血漿中に循環 DNA が存在することは 20 世紀半ばから知られていました [11]。しかし、ハイスループット シークエンシング法の出現により、ccfDNA に基づく臨床診断が可能になったのは近年のことです。これらの循環 DNA フラグメントの存在は、部分的には、細胞死後のゲノム DNA (核およびミトコンドリア) の受動的放出によるものです。 健康な人では、ccfDNA の濃度は通常低い (10 ng/mL 未満) ですが、さまざまな病状に苦しんでいる患者やストレスにさらされている患者では、5 ～ 10 倍に増加し、組織損傷を引き起こす可能性があります。 健康な人では、ccfDNA の濃度は通常低い (10 ng/mL 未満) ですが、さまざまな病状に苦しんでいる患者やストレスにさらされている患者では、5 ～ 10 倍に増加し、組織損傷を引き起こす可能性があります。 У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повыbolаться в 5–10 раз у больных с разли чной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. 健康な人では、cccDNA の濃度は通常低い (10 ng/mL 未満) ですが、さまざまな病状を患っている患者や組織損傷につながるストレス下にある患者では、濃度が 5 ～ 10 倍に増加する可能性があります。健康な体内では、ccfDNA の濃度は通常これより低い (<10 ng/mL) が、さまざまな病状や圧力に耐えている患者では 5 ～ 10 倍に増加し、組織の過敏を引き起こす可能性があります。健康な体内では、ccfdna の濃度は低い (<10 ng/ml) ですが、さまざまな病状や圧力に耐える患者では、5 ～ 10 倍に増加し、組織が強化される可能性があります。损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с разли чными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. 通常、健康な人では ccfDNA 濃度は低くなります (<10 ng/ml) が、さまざまな病状やストレスのある患者では 5 ～ 10 倍に増加し、組織損傷を引き起こす可能性があります。ccfDNA フラグメントのサイズは大きく異なりますが、通常は 150 ～ 200 bp の範囲です。[12]。自己由来の ccfDNA、つまり正常または形質転換宿主細胞からの ccfDNA の分析は、核および/またはミトコンドリアのゲノムに存在する遺伝的およびエピジェネティックな変化を検出するために使用でき、それによって臨床医が特定の分子標的療法を選択するのに役立ちます [13] 。ただし、ccfDNA は、妊娠中の胎児細胞または移植臓器からの ccfDNA など、外来ソースから取得することもできます [14、15、16、17]。ccfDNA は、感染性病原体 (外来) の核酸の存在を検出するための重要な情報源でもあり、血液培養では特定されない広範な感染症を非侵襲的に検出でき、感染組織の侵襲的な生検を回避できます [18]。実際、最近の研究では、人間の血液にはウイルスや細菌の病原体を特定するために使用できる豊富な情報源が含まれており、人間の血漿中に見られる ccfDNA の約 1% が外来起源であることが示されています [19]。これらの研究は、生物の循環マイクロバイオームの生物多様性が ccfDNA 分析を使用して評価できることを示しています。しかし、最近まで、この概念はもっぱら人間に使用され、程度は低いですが他の脊椎動物にも使用されていました[20、21]。
本論文では、LB ポテンシャルを使用して、3,500 万年前に形成された大きな高原の上にある島々である亜南極のケルゲレン諸島で一般的に見られる南方種である Aulacomya atra の ccfDNA を分析します。火山噴火。in vitro 実験系を使用して、海水中の DNA 断片が貝類に急速に取り込まれ、血リンパ区画に入ることがわかりました。ショットガンシークエンシングにより、イガイの血リンパccfDNAには、共生細菌や冷たい火山性海洋沿岸生態系に典型的な生物群系からのDNA断片など、自己起源および非自己起源のDNA断片が含まれていることが示された。血リンパ ccfDNA には、異なる宿主範囲のウイルスに由来するウイルス配列も含まれています。また、硬骨魚、イソギンチャク、藻類、昆虫などの多細胞動物の DNA 断片も見つかりました。結論として、私たちの研究は、LBの概念を海洋無脊椎動物にうまく適用して、海洋生態系に豊富なゲノムレパートリーを生成できることを示しています。
成体（体長 55 ～ 70 mm）の Mytilus platensis (M. platensis) と Aulacomya atra (A. atra) を、ポルトー フランス (南緯 049 度 21.235 度、東経 070 度 13.490 度) の潮間帯の岩海岸から採取しました。2018 年 12 月、ケルゲレン諸島。他の成体青いムール貝 (Mytilus spp.) を商業供給業者 (PEI Mussel King Inc.、プリンスエドワード島、カナダ) から入手し、10 ～ 20 L の 32 リットルの人工塩水を含む温度制御された (4°C) 通気タンクに入れた。（人工海塩リーフクリスタル、インスタントオーシャン、バージニア州、米国）。各実験では、個々の貝殻の長さと重量が測定されました。
このプログラムの無料のオープンアクセス プロトコルはオンラインで入手できます (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)。簡単に言うと、LB 血リンパは記載されているように外転筋から収集されました [22]。血リンパを１２００×ｇで３分間遠心分離することによって清澄にし、上清を使用するまで凍結した（－２０℃）。cfDNA の単離と精製のために、サンプル (1.5 ～ 2.0 ml) を解凍し、NucleoSnap cfDNA キット (Macherey-Nagel、ベスレヘン、ペンシルベニア州) を製造者の指示に従って使用して処理しました。ccfDNA はさらなる分析まで -80°C で保存されました。一部の実験では、QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN、カナダ、オンタリオ州、トロント) を使用して ccfDNA を単離および精製しました。精製された DNA は、標準的な PicoGreen アッセイを使用して定量されました。単離された ccfDNA のフラグメント分布は、高感度 DNA キットを使用した Agilent 2100 バイオアナライザー (Agilent Technologies Inc.、カリフォルニア州サンタクララ) を使用したキャピラリー電気泳動によって分析されました。アッセイは、製造元の指示に従って 1 μl の ccfDNA サンプルを使用して実行されました。
血リンパの ccfDNA 断片の配列決定のために、Génome Québec (カナダ、ケベック州モントリオール) は、Illumina MiSeq PE75 キットの Illumina DNA Mix キットを使用してショットガン ライブラリを調製しました。標準アダプター (BioO) を使用しました。生データ ファイルは、NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 および SRR8924809) から入手できます。基本的な読み取り品質は、FastQC [23] を使用して評価されました。Trimmomatic [24] は、アダプターのクリッピングや低品質の読み取りに使用されています。ミスマッチを避けるために、ペアエンドを持つショットガンリードは、最小 20 bp のオーバーラップを持つ長いシングルリードに FLASH マージされました [25]。 マージされたリードには、二枚貝 NCBI 分類データベース (e 値 < 1e-3 および 90% の相同性) を使用して BLASTN で注釈が付けられ、低複雑性配列のマスキングは DUST [26] を使用して実行されました。 マージされたリードには、二枚貝 NCBI 分類データベース (e 値 < 1e-3 および 90% の相同性) を使用して BLASTN で注釈が付けられ、低複雑性配列のマスキングは DUST [26] を使用して実行されました。 Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюск ов NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии)、а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использование・ダスト [26]。 プールされたリードには、NCBI 二枚貝分類データベース (e 値 < 1e-3 および 90% の相同性) を使用して BLASTN で注釈が付けられ、DUST [26] を使用して低複雑性配列マスキングが実行されました。デュアルシェジ型 NCBI 分離型データ ベース (e 値 < 1e-3 および 90% の相同性) を使用して、BLASTN を注釈として組み合わせ、DUST [26] を使用して低濃度シーケンスのマスクを実行しました。二重殻型 ncbi 分別 ((<1e-3 および 90% 同一源) と注釈を組み合わせて計算し、ダスト [26] を使用して倍濃度シーケンスを実行します。。。掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスクОбъединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых мо NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии)、а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использоダスト[26]。 プールされたリードには、NCBI 二枚貝分類データベース (e 値 <1e-3 および 90% の相同性) を使用して BLASTN で注釈が付けられ、DUST [26] を使用して低複雑性配列マスキングが実行されました。リードは、二枚貝シーケンスに関連するもの（ここでは自己リードと呼ぶ）と無関係なもの（非自己リード）の 2 つのグループに分けられました。MEGAHIT を使用して 2 つのグループを別々に集めてコンティグを生成しました [27]。一方、外来微生物叢の読み取りの分類学的分布は、Kraken2 [28] を使用して分類され、Galaxy 上の Krona 円グラフによってグラフィック表示されました [29、30]。最適な kmers は、予備実験から kmers-59 であると決定されました。 次に、最終的なアノテーションのために、BLASTN (二枚貝 NCBI データベース、e 値 < 1e-10、相同性 60%) とのアラインメントによってセルフコンティグを同定しました。 次に、最終的なアノテーションのために、BLASTN (二枚貝 NCBI データベース、e 値 < 1e-10、相同性 60%) とのアラインメントによってセルフコンティグを同定しました。 Затем собственные контиги были идентифициров​​аны путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, зн) ачение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. 次いで、最終的なアノテーションのために、BLASTN (NCBI 二枚貝データベース、e 値 <1e-10 および 60% 相同性) と照合することによってセルフコンティグを同定しました。次に、BLASTN (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) との比較を通じて、最終的な検査を行うために自己重畳集団を認識します。その後、BLASTN (双壳贝類 NCBI データセット) を介して、e 値 < 1e-10 および 60% Затем были идентифициров​​аны собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI) для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)。 次いで、ＢＬＡＳＴＮ（ＮＣＢＩ二枚貝データベース、ｅ値＜１ｅ−１０および６０％の相同性）と照合することにより、最終的なアノテーションのためにセルフコンティグを同定した。 並行して、非自己グループのコンティグに BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) で注釈を付けました。 並行して、非自己グループのコンティグに BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) で注釈を付けました。 Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомолог) 60%）。 並行して、外来グループコンティグに BLASTN (NT NCBI データベース、e 値 <1e-10、相同性 60%) で注釈を付けました。並行して、BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を使用して、非集合集団自体を登録します。並行して、BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を使用して、非集合集団自体を登録します。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e) <1e-10 и гомология 60%)。 並行して、非自己グループコンティグに BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 <1e-10、相同性 60%) で注釈を付けました。 BLASTXは、nrおよびRefSeqタンパク質NCBIデータベースを使用して非自己コンティグに対しても実施されました（e値<1e-10および60％の相同性）。 BLASTXは、nrおよびRefSeqタンパク質NCBIデータベースを使用して非自己コンティグに対しても実施されました（e値<1e-10および60％の相同性）。 BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гом) 60%）。 BLASTXは、nrおよびRefSeq NCBIタンパク質データベースを使用して非自己コンティグに対しても実行されました(e値<1e-10および60%の相同性)。また、nr および RefSeq タンパク質 NCBI データ ベースを使用して、非自己重畳集団に対して BLASTX (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を実行しました。また、nr および RefSeq タンパク質 NCBI データ ベースを使用して、非自己重畳集団に対して BLASTX (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を実行しました。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомоло) 60%）。 BLASTXは、nrおよびRefSeq NCBIタンパク質データベースを使用して非自己コンティグに対しても実行されました(e値<1e-10および60%の相同性)。非自己コンティグの BLASTN および BLASTX プールは、最終的なコンティグを表します (補足ファイルを参照)。
PCRに使用したプライマーを表S1に示します。Taq DNA ポリメラーゼ (Bio Basic Canada、オンタリオ州マーカム) を使用して、ccfDNA 標的遺伝子を増幅しました。以下の反応条件を使用しました: 95℃で 3 分間の変性、95℃で 1 分間、設定アニーリング温度で 1 分間、72℃で 1 分間の伸長、35 サイクル、最後に 72℃で 10 分以内。。PCR 産物は、SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen、バーリントン、オンタリオ州、カナダ) を含むアガロースゲル (1.5%) での 95 V での電気泳動によって分離されました。
ムール貝 (Mytilus spp.) を 500 ml の酸素添加海水 (32 PSU) に 4℃で 24 時間順応させました。ヒトガレクチン-7 cDNA配列(NCBIアクセッション番号L07769)をコードするインサートを含むプラスミドDNAを最終濃度190μg/μlでバイアルに添加した。DNAを添加せずに同じ条件下でインキュベートしたムール貝を対照とした。3 番目の対照タンクには、貝類を含まない DNA が含まれていました。海水中の DNA の品質を監視するために、指定された時間に各タンクから海水サンプル (20 μl; 3 回繰り返し) を採取しました。プラスミド DNA のトレーサビリティのために、指定された時間に LB 貝を採取し、qPCR および ddPCR によって分析しました。海水には塩分が多く含まれているため、すべての PCR アッセイの前に、アリコートを PCR 品質の水で希釈しました (1:10)。
デジタル液滴 PCR (ddPCR) は、BioRad QX200 プロトコール (カナダ、オンタリオ州、ミシサガ) を使用して実行されました。温度プロファイルを使用して最適温度を決定します (表 S1)。ドロップは、QX200 ドロップジェネレーター (BioRad) を使用して生成されました。ddPCR は次のように実行しました:95℃で 5 分間、95℃で 30 秒間および所定のアニーリング温度で 1 分間および 72℃で 30 秒間、4℃で 5 分間および 90℃で 5 分以内を 50 サイクル。QX200 ドロップリーダー (BioRad) を使用して、滴数と陽性反応 (コピー数/μl) を測定しました。液滴が 10,000 個未満のサンプルは拒否されました。パターン制御は、ddPCR を実行するたびに実行されるわけではありません。
qPCR は、Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research、シドニー、オーストラリア) および LGALS7 特異的プライマーを使用して実行されました。すべての定量的 PCR は、QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) を使用して 20 μl で実行されました。qPCR は 95℃で 15 分間のインキュベーションで開始し、続いて 95℃で 10 秒間および 60℃で 60 秒間の 40 サイクルを 1 回のデータ収集で開始しました。95℃で5秒間、65℃で60秒間、そしてqPCR終了時の97℃での連続測定を使用して、融解曲線を作成しました。対照サンプルを除いて、各 qPCR を 3 回実行しました。
ムール貝は濾過速度が高いことで知られているため、まず海水中に存在するDNA断片を濾過して保持できるかどうかを調べました。私たちはまた、これらの断片が半開放リンパ系に蓄積するかどうかにも興味がありました。私たちは、ムラサキイガイの水槽に添加された可溶性 DNA 断片の運命を追跡することで、この問題を実験的に解決しました。DNA 断片の追跡を容易にするために、ヒト ガレクチン 7 遺伝子を含む外来 (自己ではない) プラスミド DNA を使用しました。ddPCR は、海水とイガイ中のプラスミド DNA 断片を追跡します。私たちの結果は、イガイの非存在下で海水中のDNA断片の量が長期間（最大7日間）にわたって比較的一定のままである場合、イガイの存在下ではこのレベルが8時間以内にほぼ完全に消失することを示しています（図1a、b）。外因性 DNA の断片は、弁内液および血リンパ中で 15 分以内に簡単に検出されました (図 1c)。これらの断片は、曝露後 4 時間まで検出される可能性がありました。DNA 断片に関するこのフィルタリング活性は、細菌や藻類のフィルタリング活性に匹敵します [31]。これらの結果は、ムール貝が外来 DNA をろ過して体液コンパートメントに蓄積できることを示唆しています。
ddPCR によって測定された、イガイの存在下 (A) または非存在下 (B) における海水中のプラスミド DNA の相対濃度。A では、結果はパーセンテージで表され、ボックスの境界線は 75 パーセンタイルと 25 パーセンタイルを表します。近似された対数曲線は赤色で示され、灰色の陰影が付けられた領域は 95% 信頼区間を表します。B では、赤い線は平均を表し、青い線は濃度の 95% 信頼区間を表します。C プラスミド DNA の添加後のさまざまな時点でのイガイの血リンパおよび弁液におけるプラスミド DNA の蓄積。結果は、検出された絶対コピー数/mL (±SE) として表示されます。
次に、人為的影響が限定された遠隔の島群であるケルゲレン諸島の貝床から採取したムール貝の ccfDNA の起源を調査しました。この目的のために、ヒト cccDNA を精製するために一般的に使用される方法によって、イガイの体リンパから cccDNA が単離および精製されました [32、33]。ムール貝の平均血リンパ ccfDNA 濃度は、血リンパ 1 ml あたりの低いマイクログラムの範囲にあることがわかりました (表 S2、補足情報を参照)。この濃度範囲は健康な人よりもはるかに大きい（1ミリリットルあたり低ナノグラム）が、まれに、がん患者ではccfDNAのレベルが1ミリリットルあたり数マイクログラムに達する可能性がある[34、35]。血リンパ ccfDNA のサイズ分布の分析により、これらのフラグメントのサイズは 1000 bp から 1000 bp まで大きく異なることが示されました。最大 5000 bp (図 2)。シリカベースの QIAamp Investigator Kit を使用しても同様の結果が得られました。これは、ccfDNA などの低濃度 DNA サンプルからゲノム DNA を迅速に単離および精製するために法医学で一般的に使用される方法です [36]。
イガイ血リンパの代表的な ccfDNA 電気泳動図。NucleoSnap Plasma Kit (上) と QIAamp DNA Investigator Kit で抽出。B ムール貝の血リンパ ccfDNA 濃度 (±SE) の分布を示すバイオリン プロット。黒と赤の線はそれぞれ中央値と第 1 四分位数と第 3 四分位数を表します。
ヒトおよび霊長類の ccfDNA の約 1% には外来起源があります [21、37]。二枚貝の半開放循環系、微生物が豊富な海水、およびイガイのccfDNAのサイズ分布を考慮すると、イガイの体液ccfDNAには豊富で多様な微生物DNAのプールが含まれているのではないかという仮説を立てました。この仮説を検証するために、ケルゲレン諸島から収集したオーラコムヤ atra サンプルから血リンパ ccfDNA の配列を決定したところ、1,000 万を超えるリードが得られ、そのうち 97.6% が品質管理に合格しました。次に、BLASTN および NCBI の二枚貝データベースを使用して、読み取り値を自己情報源と非自己情報源に従って分類しました（図 S1、補足情報）。
ヒトでは、核 DNA とミトコンドリア DNA の両方が血流に放出される可能性があります [38]。しかし、本研究では、A. atra ゲノムの配列決定も記載もされていないため、イガイの核ゲノム DNA を詳細に記載することはできませんでした。しかし、二枚貝ライブラリを使用して、私たち自身の起源の多数のccfDNA断片を特定することができました（図S2、補足情報）。また、配列決定された A. atra 遺伝子の指向性 PCR 増幅によって、独自の起源の DNA 断片の存在も確認しました (図 3)。同様に、A. atra のミトコンドリア ゲノムが公的データベースで入手できることを考えると、A. atra の血リンパ中にミトコンドリア ccfDNA 断片が存在する証拠を見つけることができます。ミトコンドリア DNA 断片の存在は PCR 増幅によって確認されました (図 3)。
さまざまなミトコンドリア遺伝子が A. atra (赤い点 - ストック番号: SRX5705969) および M. platensis (青い点 - ストック番号: SRX5705968) の体リンパに存在し、PCR によって増幅されました。図は Breton et al., 2011 B A. atra からの血リンパ上清の増幅 FTA 紙に保存。3 mm パンチを使用して、PCR ミックスを含む PCR チューブに直接添加します。
海水には微生物が豊富に含まれていることを考慮して、我々は当初、体液中の微生物 DNA 配列の特徴付けに焦点を当てました。これを行うために、2 つの異なる戦略を使用します。最初の戦略では、BLAST や他のツールに匹敵する精度で微生物の配列を特定できるアルゴリズムベースの配列分類プログラムである Kraken2 を使用しました [28]。6719 を超えるリードが細菌起源であることが判明しましたが、それぞれ 124 と 64 が古細菌とウイルスに由来していました (図 4)。最も豊富な細菌 DNA フラグメントは、ファーミクテス (46%)、プロテオバクテリア (27%)、およびバクテロイデス (17%) でした (図 4a)。この分布は、マリンブルーイガイのマイクロバイオームに関する以前の研究と一致しています[39、40]。ガンマプロテオバクテリアはプロテオバクテリアの主要なクラス（44％）であり、多くのビブリオナル属を含みました（図4b）。ddPCR 法により、A. atra 体リンパの ccfDNA にビブリオ DNA 断片が存在することが確認されました (図 4c) [41]。ccfDNA の細菌起源に関するより多くの情報を得るために、追加のアプローチがとられました (図 S2、補足情報)。 この場合、重複したリードはペアエンドリードとして組み立てられ、BLASTN、1e-3のe値および>90%の相同性のカットオフを使用して、自己（二枚貝）起源または非自己起源として分類されました。 この場合、重複したリードはペアエンドリードとして組み立てられ、BLASTN、1e-3のe値および>90%の相同性のカットオフを使用して、自己（二枚貝）起源または非自己起源として分類されました。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифициров​​аны как собс твенные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомо > 90%。 この場合、重複するリードはペアエンドリードとして収集され、BLASTN と 1e-3 の e 値および >90% 相同性のカットオフを使用してネイティブ (二枚貝) または非オリジナルとして分類されました。この場合、反復されたカウントは末端のカウントにまとめられ、BLASTNおよび1e-3のe値および＞90%の同一性の終了値の分割がそれ自体（二重型）または非自己源のものとして使用される。このような場合には、blastn と 1e-3 の値と > 90% の相同性の分別タイプ (二重シベジタイプ) を使用して、再試行数の組合わせを末端の試行数として行います。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифициров​​аны как собственн ые (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии > 90%。 この場合、重複するリードはペアエンドリードとして収集され、e BLASTN および 1e-3 値と相同性閾値 >90% を使用して、独自（二枚貝）または非オリジナルとして分類されました。A. atra ゲノムはまだ配列決定されていないため、MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) アセンブラーの de novo アセンブリ戦略を使用しました。合計 147,188 個のコンティグが、起源に依存する (二枚貝) として特定されました。これらのコンティグは、BLASTN および BLASTX を使用して 1e-10 の e 値で展開されました。この戦略により、A. atra ccfDNA に存在する 482 個の非二枚貝断片を同定することができました。これらの DNA 断片の半分以上 (57%) は細菌、主に硫酸栄養性共生生物を含む鰓共生生物、および鰓共生生物 Solemya velum から得られました (図 5)。
種類レベルでの相対的な豊富さ。B 2 つの主要な門 (ファーミクテス属とプロテオバクテリア) の微生物の多様性。ddPCR C Vibrio spp.の代表的な増幅。A. 3 つの atra 体リンパにおける 16S rRNA 遺伝子の断片 (青)。
合計 482 個の収集されたコンティグが分析されました。メタゲノムコンティグアノテーション (原核生物および真核生物) の分類学的分布の一般的なプロファイル。B BLASTN および BLASTX によって同定された細菌 DNA 断片の詳細な分布。
Kraken2分析では、イガイのccfDNAには、Euryarchaeota（65％）、Crenarchaeota（24％）、Thaurmarcheota（11％）のDNA断片を含む古細菌のDNA断片が含まれていることも示されました（図6a）。カリフォルニア産貝類の微生物群集で以前に発見されていた Euryarchaeota および Crenarchaeota に由来する DNA 断片の存在は驚くべきことではありません [42]。Euryaarchaeota は極端な条件に関連付けられることが多いですが、現在では Euryaarchaeota と Crenarcheota の両方が海洋極低温環境で最も一般的な原核生物の 1 つであることが認識されています [43, 44]。ケルゲレン高原の底部漏洩からの大規模なメタン漏出に関する最近の報告[45]と、ケルゲレン諸島の沖合で微生物によるメタン生成の可能性が観察されたことを考慮すると、ムール貝にメタン生成微生物が存在することは驚くべきことではない[46]。
その後、私たちの注意は DNA ウイルスからの読み取りに移りました。私たちの知る限り、これはムール貝のウイルス含有量に関する最初のオフターゲット研究です。予想通り、バクテリオファージ (カウドウイルス目) の DNA 断片が見つかりました (図 6b)。しかし、最も一般的なウイルス DNA は、核細胞質ラージ DNA ウイルス (NCLDV) としても知られるヌクレオサイトウイルス門に由来し、ウイルスの中で最大のゲノムを持っています。この門内では、ほとんどの DNA 配列はミミミドウイルス科 (58%) およびポックスウイルス科 (21%) に属しており、その自然宿主には脊椎動物や節足動物が含まれますが、これらの DNA 配列のごく一部は既知のウイルス学的藻類に属しています。海洋真核藻類に感染します。この配列は、既知のウイルス属の中で最大のゲノムサイズを持つ巨大ウイルスであるパンドラ ウイルスからも得られました。興味深いことに、血リンパccfDNA配列決定によって決定されたように、ウイルスに感染していることが知られている宿主の範囲は比較的広かった（図S3、補足情報）。これには、バキュロウイルス科やイリドウイルス科などの昆虫に感染するウイルスのほか、アメーバ、藻類、脊椎動物に感染するウイルスも含まれます。また、ピトウイルス シベリカムのゲノムと一致する配列も発見しました。ピトウイルス (「ゾンビウイルス」としても知られる) は、シベリアの 30,000 年前の永久凍土から初めて分離されました [47]。したがって、我々の結果は、これらのウイルスの現生種がすべて絶滅したわけではなく[48]、これらのウイルスが遠隔地の亜寒帯海洋生態系に存在する可能性があることを示す以前の報告と一致している。
最後に、他の多細胞動物から DNA 断片を見つけられるかどうかをテストしました。合計 482 個の外来コンティグが、nt、nr、および RefSeq ライブラリー (ゲノムおよびタンパク質) を備えた BLASTN および BLASTX によって同定されました。我々の結果は、多細胞動物のccfDNAの外来断片の中で、骨のDNAが優勢であることを示しています（図5）。昆虫や他の種の DNA 断片も発見されています。DNA 断片の比較的大部分は特定されていないが、これはおそらくゲノム データベースにおいて陸生種と比較して多数の海洋種が過小評価されているためであると考えられる [49]。
本論文では、LB の概念をムール貝に適用し、血リンパ ccfDNA ショット シークエンシングによって海洋沿岸生態系の構成についての洞察が得られると主張しています。特に、1) イガイの血リンパには比較的高濃度 (マイクログラムレベル) の比較的大きな (約 1 ～ 5 kb) の循環 DNA 断片が含まれていることを発見しました。2) これらの DNA フラグメントは、独立したものと非独立的なものがあります。 3) これらの DNA フラグメントの外来源の中には、細菌、古細菌、ウイルスの DNA、さらには他の多細胞動物の DNA も見つかりました。4) これらの外来 ccfDNA 断片の体リンパへの蓄積は急速に起こり、イガイの内部濾過活性に寄与します。結論として、私たちの研究は、これまで主に生物医学の分野で適用されてきたLBの概念が、センチネル種とその環境の間の相互作用をより深く理解するために使用できる豊富ではあるが未開拓の知識源をコード化していることを実証しました。
霊長類に加えて、マウス、イヌ、ネコ、ウマなどの哺乳類でもccfDNAの単離が報告されている[50、51、52]。しかし、私たちの知る限り、私たちの研究は、開放循環システムを備えた海洋種におけるccfDNAの検出と配列決定を報告した最初の研究です。ムール貝のこの解剖学的特徴と濾過能力は、他の種と比較して循環する DNA 断片のサイズの特徴が異なることを少なくとも部分的に説明できる可能性があります。ヒトの場合、血液中を循環するほとんどの DNA 断片は、サイズが 150 ～ 200 bp の小さな断片です。最大ピークは 167 bp です [34、53]。DNA 断片の小さいながらも重要な部分のサイズは 300 ～ 500 bp であり、約 5% は 900 bp より長くなります。[54]。このサイズ分布の理由は、血漿中の ccfDNA の主な供給源が、健康な人の細胞死または循環造血細胞の壊死、または癌患者の腫瘍細胞 (循環腫瘍 DNA として知られる) のアポトーシスのいずれかによる細胞死の結果として発生するためです。、ctDNA）。我々がイガイで発見した血リンパccfDNAのサイズ分布は1000から5000 bpの範囲であり、イガイのccfDNAが異なる起源を持つことを示唆している。ムール貝は半開放血管系を持ち、高濃度の微生物ゲノム DNA を含む海洋水環境に生息しているため、これは論理的な仮説です。実際、外因性 DNA を使用した私たちの実験では、イガイが海水中に DNA 断片を蓄積し、少なくとも数時間後には細胞に取り込まれて分解され、および/または放出され、および/またはさまざまな組織に保管されることが示されました。細胞（原核生物および真核生物の両方）の希少性を考慮すると、弁内コンパートメントの使用により、自己源および外来源からの ccfDNA の量が減少します。二枚貝の自然免疫の重要性と多数の循環食細胞を考慮して、我々はさらに、外来 ccfDNA であっても、微生物および/または細胞残骸の摂取により外来 DNA を蓄積する循環食細胞に富んでいると仮説を立てました。総合すると、我々の結果は、二枚貝の血リンパccfDNAが分子情報のユニークな宝庫であり、監視種としての二枚貝の地位を強化することを示している。
私たちのデータは、細菌由来の血リンパ ccfDNA 断片の配列決定と分析により、宿主細菌叢と周囲の海洋生態系に存在する細菌に関する重要な情報が得られることを示しています。ショットシークエンシング技術により、従来の 16S rRNA 同定方法が一部参照ライブラリーの偏りにより見逃されていた共生細菌 A. atra gill の配列が明らかになりました。実際、ケルゲレンの同じ貝層の M. platensis から収集した LB データを使用したところ、鰓に関連する細菌共生生物の組成が両方の貝種で同じであることが示されました（図 S4、補足情報）。遺伝的に異なる 2 つの貝のこの類似性は、ケルゲレンの低温、硫黄、火山性の堆積物における細菌群集の組成を反映している可能性があります [55、56、57、58]。ポルトーフランスの海岸など、生物撹乱された沿岸地域[59]からムール貝を収穫する場合、硫黄還元微生物のレベルが高くなることがよく報告されています。別の可能性としては、ムール貝の共生植物相が水平感染の影響を受けている可能性があるということである[60、61]。海洋環境、海底表面、およびムール貝の共生細菌の組成の間の相関関係を明らかにするには、さらなる研究が必要です。これらの研究は現在進行中です。
血リンパ ccfDNA の長さと濃度、精製の容易さ、および迅速なショットガンシーケンシングを可能にする高品質などは、海洋沿岸生態系の生物多様性を評価するためにイガイの ccfDNA を使用することの多くの利点の一部です。このアプローチは、特定の生態系におけるウイルスコミュニティ (バイローム) を特徴付けるのに特に効果的です [62、63]。細菌、古細菌、真核生物とは異なり、ウイルスのゲノムには 16S 配列などの系統発生的に保存された遺伝子が含まれていません。私たちの結果は、イガイなどの指標種からのリキッドバイオプシーを使用して、通常沿岸の海洋生態系に生息する宿主に感染することが知られている比較的多数のccfDNAウイルス断片を同定できることを示しています。これには、原生動物、節足動物、昆虫、植物、および細菌ウイルス (バクテリオファージなど) に感染することが知られているウイルスが含まれます。ケルゲレンの同じイガイ層で収集されたアオイガイ (M. platensis) の血リンパ ccfDNA バイロームを調べたときにも、同様の分布が見つかりました (表 S2、補足情報)。確かに、ccfDNA のショットガン シーケンスは、ヒトまたは他の種のバイロームの研究において勢いを増している新しいアプローチです [21、37、64]。ボルチモアで最も多様で広範なクラスのウイルスを代表するすべての二本鎖 DNA ウイルスの間で単一の遺伝子が保存されていないため、このアプローチは二本鎖 DNA ウイルスの研究に特に役立ちます [65]。これらのウイルスのほとんどは未分類のままであり、ウイルス世界のまったく未知の部分からのウイルスが含まれている可能性があります[66]が、我々は、イガイA. atraとM. platensisのウイルスームと宿主範囲が2つの種の間にあることを発見しました。同様に (図 S3、追加情報を参照)。この類似性は、環境中に存在する DNA の取り込みにおける選択性の欠如を反映している可能性があるため、驚くべきことではありません。RNA バイロームの特徴を明らかにするには、精製 RNA を使用した今後の研究が現在必要です。
私たちの研究では、Kowarski らの研究 [37] を応用した非常に厳密なパイプラインを使用しました。Kowarski らは、ネイティブ ccfDNA のアセンブリの前後に、プールされたリードとコンティグの 2 段階の削除を使用し、その結果、マップされていないリードが高い割合で生成されました。したがって、主にこのイガイ種の参照ゲノムがないため、これらのマッピングされていないリードの一部がまだ独自の起源を持っている可能性を排除することはできません。また、自己リードと非自己リード間のキメラ、および Illumina MiSeq PE75 によって生成されるリード長が懸念されたため、このパイプラインを使用しました。大多数の未解明のデータのもう 1 つの理由は、海洋微生物の多く、特にケルゲレンなどの遠隔地に存在する微生物に注釈が付けられていないことです。ヒト ccfDNA と同様の ccfDNA フラグメント長を想定して、Illumina MiSeq PE75 を使用しました。今後の研究では、血リンパの ccfDNA がヒトや哺乳類よりも長いリードを持つことを示す結果を考慮して、より長い ccfDNA フラグメントにより適したシーケンシング プラットフォームを使用することをお勧めします。これを実践すると、より深い分析のためのより多くの兆候を特定することがはるかに簡単になります。現在利用できない完全な A. atra 核ゲノム配列を入手できれば、ccfDNA を自己源と非自己源から区別することも大幅に容易になるでしょう。私たちの研究はリキッドバイオプシーの概念を貝に適用する可能性に焦点を当ててきたことを考えると、この概念が将来の研究で使用されるにつれて、新しいツールやパイプラインが開発され、貝の微生物多様性を研究するためのこの方法の可能性が高まることを期待しています。海洋生態系。
非侵襲性の臨床バイオマーカーとして、ヒト血漿中の ccfDNA レベルの上昇は、さまざまな疾患、組織損傷、ストレス状態と関連しています [67、68、69]。この増加は、組織損傷後のそれ自身の起源の DNA 断片の放出に関連しています。私たちは、ムール貝を 30 °C の温度に短時間さらすという急性熱ストレスを使用して、この問題に取り組みました。この分析は、3 つの異なる種類のムール貝に対して 3 つの独立した実験で実行されました。ただし、急性熱ストレス後の ccfDNA レベルの変化は見つかりませんでした (図 S5、追加情報を参照)。この発見は、ムール貝が半開放循環系を持ち、その高い濾過活性により大量の外来 ​​DNA を蓄積するという事実を少なくとも部分的に説明する可能性がある。一方、イガイは多くの無脊椎動物と同様に、ストレス誘発性の組織損傷に対してより耐性がある可能性があり、それによって血リンパ中のccfDNAの放出が制限される[70、71]。
これまで、水生生態系における生物多様性の DNA 解析は、主に環境 DNA (eDNA) メタバーコーディングに焦点を当ててきました。ただし、生物多様性解析ではプライマーを使用する場合、この方法は通常制限されます。ショットガン シークエンシングの使用により、PCR の制限とプライマー セットの偏った選択が回避されます。したがって、ある意味では、私たちの方法は、断片化された DNA を直接配列し、ほぼすべての生物を分析できる、最近使用されているハイスループット eDNA ショットガン シーケンス法に近いものです [72、73]。ただし、LB を標準の eDNA 手法と区別する基本的な問題がいくつかあります。もちろん、eDNA と LB の主な違いは、天然フィルター ホストを使用することです。eDNA 研究のための天然フィルターとして海綿動物や二枚貝 (Dresseina spp.) などの海洋種を使用することが報告されています [74、75]。しかし、Dreissena 氏の研究では、DNA が抽出された組織生検が使用されました。LB からの ccfDNA の分析には、組織生検、eDNA または組織生検に関連する専門的で場合によっては高価な機器および物流が必要ありません。実際、我々は最近、コールドチェーンを維持することなく、FTA サポートを利用して LB からの ccfDNA を保存および分析できることを報告しました。これは遠隔地での研究にとって大きな課題です [76]。リキッドバイオプシーからの ccfDNA の抽出も簡単で、ショットガンシークエンシングや PCR 分析に高品質の DNA を提供します。これは、eDNA 解析に関連する技術的な制限の一部を考慮すると、大きな利点です [77]。サンプリング方法のシンプルさと低コストは、長期の監視プログラムにも特に適しています。二枚貝の高い濾過能力に加えて、二枚貝のもう一つのよく知られた特徴は、ウイルスの吸収を促進する粘液の化学的ムコ多糖組成である[78、79]。このため、二枚貝は、特定の水生生態系における生物多様性と気候変動の影響を特徴付けるための理想的な天然フィルターとなります。宿主由来の DNA フラグメントの存在は、eDNA と比較してこの方法の制限であると見なすことができますが、eDNA と比較してそのようなネイティブ ccfDNA を使用することに関連するコストは、健康研究に利用できる膨大な量の情報を考慮すると同時に理解できます。オフセットホスト。これには、宿主のゲノムに組み込まれたウイルス配列の存在が含まれます。二枚貝には水平伝播する白血病レトロウイルスが存在するため、これはイガイにとって特に重要である[80、81]。eDNA に対する LB のもう 1 つの利点は、微生物 (およびそのゲノム) を飲み込む、血リンパ中の循環血球の貪食活性を利用していることです。食作用は二枚貝における血球の主な機能である[82]。最後に、この方法は、ムール貝の高い濾過能力 (平均 1.5 l/h の海水) と 2 日間の循環を利用しており、これにより海水の異なる層の混合が増加し、異種 eDNA の捕捉が可能になります。[83、84]。したがって、ムール貝の栄養、経済、環境への影響を考慮すると、ムール貝の ccfDNA 分析は興味深い手段となります。ヒトから収集した LB の分析と同様に、この方法でも、外因性物質に応答した宿主 DNA の遺伝的およびエピジェネティックな変化を測定する可能性が開かれます。例えば、第 3 世代のシーケンス技術では、ナノポア シーケンスを使用してネイティブ ccfDNA のゲノム全体のメチル化解析を実行することが考えられます。このプロセスは、イガイの ccfDNA フラグメントの長さが、化学変換を必要とせずに 1 回のシークエンシング実行でゲノム全体の DNA メチル化解析を可能にするロングリードシークエンシングプラットフォームと理想的に適合するという事実によって促進されるはずです 85,86]。DNA メチル化パターンが環境ストレスへの反応を反映し、何世代にもわたって持続することが示されているため、これは興味深い可能性です。したがって、気候変動や汚染物質にさらされた後の反応を支配する根本的なメカニズムについての貴重な洞察を提供する可能性がある[87]。ただし、LB の使用には制限がないわけではありません。言うまでもなく、これには生態系内に指標種が存在することが必要です。前述したように、LB を使用して特定の生態系の生物多様性を評価するには、ソースからの DNA フラグメントの存在を考慮した厳密なバイオインフォマティクス パイプラインも必要です。もう 1 つの大きな問題は、海洋種の参照ゲノムが利用できるかどうかです。海洋哺乳類ゲノムプロジェクトや最近設立されたFish10kプロジェクト[88]などの取り組みにより、将来そのような分析が促進されることが期待されています。海洋濾過摂食生物への LB 概念の適用は、配列決定技術の最新の進歩にも適合しており、環境ストレスに応じた海洋生息地の健全性に関する重要な情報を提供するマルチオームバイオマーカーの開発に適しています。
ゲノム配列決定データは、NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 の Bioprojects SRR8924808 に保管されています。
ブライアリー AS、キングスフォード MJ 海洋生物と生態系に対する気候変動の影響。コール生物学。2009年;19: P602 – P614。
Gissi E、Manea E、Mazaris AD、Fraschetti S、Almpanidou V、Bevilacqua S、他。海洋環境に対する気候変動とその他の地域的なストレス要因の複合的な影響を考慮してください。一般的な科学環境。2021;755:142564。
Carella F、Antuofermo E、Farina S、Salati F、Mandas D、Prado P、他。）。3 月 1 日の科学。2020;7:48。
Seront L、Nicastro CR、Zardi GI、Goberville E. 反復的な熱ストレス条件下での耐熱性の低下は、青いムール貝の高い夏の死亡率を説明します。科学レポート 2019;9:17498。
Fey SB、Siepielski AM、Nussle S、Cervantes-YOSHIDA K、Hwan JL、Huber ER、他動物の死亡の頻度、原因、程度の最近の変化。Proc Natl Acad Sci USA。2015;112:1083-8。
スカルパ F、サンナ D、アッツェナ I、ムゲッティ D、セルッティ F、ホッセイニ S、他複数の非種特異的病原体が耳介の大量死亡を引き起こした可能性があります。人生。2020;10:238。
ブラッドリー M、クーツ SJ、ジェンキンス E、オハラ TM。北極の人獣共通感染症に対する気候変動の潜在的な影響。Int J 周極の健康。2005年;64:468–77。
Beyer J.、Greene NW、Brooks S.、Allan IJ、Russ A.、Gomez T. 他海岸汚染モニタリングにおけるシグナル生物としてのアオガイ (Mytilus edulis spp.): レビュー。2017 年 3 月環境調査;130:338-65。
Siravegna G、Marsoni S、Siena S、Bardelli A. がん治療におけるリキッドバイオプシーの統合。Nat Rev Clean オンコル。2017年;14:531–48。
ワン JCM、マッシー C、ガルシア＝コルバチョ J、ムリエール F、ブレントン JD、カルダス C 他リキッドバイオプシーの成熟: 腫瘍 DNA の循環を可能にします。ナット・レブ・ガン。2017;17:223–38。
Mandel P.、Metais P. ヒト血漿中の核酸。Soc Biol 子会社の会議議事録。1948年。142:241-3。
Bronkhorst AJ、Ungerer W、Holdenrieder S. がん治療の分子マーカーとしての無細胞 DNA の新たな役割。バイオモル分析の定量化。2019;17:100087。
Ignatiadis M.、Sledge GW、Jeffrey SS リキッドバイオプシーがクリニックに導入される - 導入の問題と今後の課題。Nat Rev Clin Oncol。2021年;18:297–312。
ロー YM、コルベッタ N.、チェンバレン PF、ライ W.、サージェント IL、レッドマン CW 他。胎児 DNA は母体の血漿および血清中に存在します。ランセット。1997年;350:485-7。
Mufarray MN、Wong RJ、Shaw GM、Stevenson DK、Quake SR 妊娠中の女性の血液中の循環細胞外 RNA を使用した、妊娠の経過とその合併症の研究。ドー小児科医。2020;8:605219。
Ollerich M、Sherwood K、Keown P、Schütz E、Beck J、Stegbauer J、他。リキッドバイオプシー: ドナーの無細胞 DNA を使用して腎移植片の同種異系病変を検出します。ナット・レヴ・ネフロル。2021年;17:591–603。
Juan FC、Lo YM 出生前診断における革新: 母体血漿ゲノム配列決定。アンナ医師。2016;67:419-32。
Gu W、Deng X、Lee M、Sucu YD、Arevalo S、Stryke D 他感染した体液の次世代メタゲノムシーケンスによる迅速な病原体検出。ナット医学。2021;27:115-24。