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制御不能な出血は主な死因の 1 つです。迅速な止血を達成することで、戦闘、交通事故、死亡者数削減作戦中の応急処置として対象者の生存が保証されます。連続相として単純な止血膜形成組成物 (HFFC) から得られるナノ多孔質繊維強化複合足場 (NFRCS) は、止血を誘発し、強化することができます。NFRCS の開発は、トンボの羽のデザインに基づいています。トンボの羽の構造は横方向の羽と縦方向の羽で構成されており、羽の膜は微細構造の完全性を維持するために互いに接続されています。HFFCは繊維の表面をナノメートルの厚さの膜で均一にコーティングし、ランダムに分布した綿の厚さ（Ct）（分散相）を結びつけてナノ多孔質構造を形成します。連続相と分散相を組み合わせることで、市販製品と比較して製品コストを 10 分の 1 に削減できます。改良された NFRCS (タンポンまたはリストバンド) は、さまざまな生物医学用途に使用できます。in vivo 研究では、開発された Cp NFRCS が適用部位での凝固プロセスを誘発し、促進すると結論付けています。NFRCS は、そのナノ多孔質構造により微小環境を調節し、細胞レベルで作用することができ、切除創傷モデルにおいてより良好な創傷治癒をもたらします。
戦闘中、手術中、緊急事態における制御不能な出血は、負傷者の生命に重大な脅威をもたらす可能性があります1。これらの状態はさらに末梢血管抵抗の全体的な増加をもたらし、出血性ショックを引き起こします。手術中および手術後の出血を制御するための適切な措置は、生命を脅かす可能性があると考えられています2,3。大きな血管の損傷は大量の失血につながり、戦闘中の死亡率は 50% 以下、手術中の死亡率は 31% になります1。大量の失血は体の体積の減少につながり、心拍出量が減少します。総末梢血管抵抗の増加と微小循環の進行性障害により、生命維持器官の低酸素状態が引き起こされます。効果的な介入が行われずに状態が続くと、出血性ショックが発生する可能性があります1、4、5。その他の合併症には、低体温症や代謝性アシドーシスの進行、凝固プロセスを妨げる凝固障害などがあります。重度の出血性ショックは死亡リスクの上昇と関連しています6、7、8。グレード III (進行性) ショックでは、術中および術後の罹患率および死亡率において患者の生存には輸血が不可欠です。上記の生命を脅かす状況をすべて克服するために、当社は水溶性止血ポリマーの組み合わせを使用した最小ポリマー濃度 (0.5%) を利用したナノ多孔質繊維強化複合足場 (NFRCS) を開発しました。
繊維強化材を使用することで、コスト効率の高い製品を開発できます。ランダムに配置された繊維はトンボの羽の構造に似ており、羽の横縞と縦縞によってバランスが保たれています。翼の横方向および縦方向の静脈は翼の膜と連絡しています（図1）。NFRCS は、より優れた物理的および機械的強度を備えた足場システムとして強化された Ct で構成されています (図 1)。手頃な価格と職人技により、外科医は手術や包帯の際に綿糸ゲージ (Ct) を使用することを好みます。 したがって、結晶セルロースが 90% 以上含まれる (止血活性の向上に寄与する) などの複数の利点を考慮して、Ct が NFRCS9,10 の骨格系として使用されました。 したがって、結晶セルロースが 90% 以上含まれる (止血活性の向上に寄与する) などの複数の利点を考慮して、Ct が NFRCS9,10 の骨格系として使用されました。 Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в)は、NFRCS9、10 を参照してください。 したがって、90% を超える結晶セルロース (止血活性の向上に関与) を含む多くの利点を考慮して、Ct が NFRCS 骨格系として使用されました 9,10。したがって、Ct は NFRCS9,10 の骨格系として機能しており、90% を超える結晶粒を含み (血栓活性の増強を助ける)、その多面的な利益を考慮しています。したがって、90% を超える多重利益を考慮すると、したがって、90％を超える結晶セルロース（止血作用の強化に役立つ）を含む多くの利点を考慮して、CtはNFRCS9、10の足場として使用されました。Ｃｔは表面的にコーティングされ（ナノ厚膜形成が観察された）、止血膜形成組成物（ＨＦＦＣ）と相互接続された。HFFC はマトリゲルのように機能し、ランダムに配置された Ct を保持します。開発されたデザインは、分散相（強化繊維）内で応力を伝達します。最小限のポリマー濃度を使用して良好な機械的強度を備えたナノ多孔質構造を得るのは困難です。さらに、さまざまな生物医学用途に合わせてさまざまな金型をカスタマイズすることは簡単ではありません。
この図は、トンボの羽の構造に基づいた NFRCS 設計の図を示しています (A)。この画像は、トンボの羽の構造 (羽の交差および縦方向の静脈が相互接続されている) と Cp NFRCS の断面顕微鏡写真 (B) の比較類似点を示しています。NFRCSの概略図。
NFRC は、上記の制限に対処するために、連続相として HFFC を使用して開発されました。HFFC は、血栓形成を促進する支持ポリマーとしてメチルセルロース (MC)、ヒドロキシプロピル メチルセルロース (HPMC 50 cp)、およびポリビニル アルコール (PVA) (125 kDa) を含むキトサン (主な止血ポリマーとして) を含むさまざまな膜形成止血ポリマーで構成されています。形成。ポリビニルピロリジン K30 (PVP K30) の添加により、NFRCS の吸湿能力が向上しました。結合ポリマーブレンドのポリマー架橋を改善するために、ポリエチレングリコール 400 (PEG 400) が添加されました。3 つの異なる HFFC 止血組成物 (Cm HFFC、Ch HFFC、および Cp HFFC)、すなわち MC を含むキトサン (Cm)、HPMC を含むキトサン (Ch)、および PVA を含むキトサン (Cp) を Ct に適用しました。さまざまな in vitro および in vivo 特性研究により、NFRCS の止血および創傷治癒活性が確認されています。NFRCS が提供する複合材料を使用すると、特定のニーズに合わせてさまざまな形式の足場をカスタマイズできます。
さらに、NFRCS は包帯やロールとして改造して、下肢や体の他の部分の損傷領域全体をカバーすることができます。特に戦闘による四肢の損傷の場合、設計された NFRCS デザインを腕の半分または脚全体に変更できます (補足図 S11)。NFRCS は組織接着剤でリストバンドを作成でき、重度の自殺による手首の損傷による出血を止めるために使用できます。私たちの主な目標は、（貧困線以下の）多くの人々に届けることができ、応急処置キットに入れることができる、ポリマーをできるだけ少なくした NFRCS を開発することです。シンプル、効率的、経済的な設計により、NFRCS は地域社会に利益をもたらし、世界的な影響を与えることができます。
キトサン (分子量 80 kDa) とアマランサスは、インドのメルクから購入しました。ヒドロキシプロピルメチルセルロース 50 Cp、ポリエチレングリコール 400、およびメチルセルロースは Loba Chemie Pvt. から購入しました。LLC、ムンバイ。ポリビニル アルコール (分子量 125 kDa) (87 ～ 90% 加水分解) は、グジャラート州の National Chemicals から購入しました。ポリビニルピロリジン K30 はムンバイの Molychem から購入し、滅菌綿棒はタミル ナドゥ州の Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd. から購入し、担体として Milli Q 水 (Direct-Q3 浄水システム、Merck、インド) を使用しました。
NFRCS は、凍結乾燥法を使用して開発されました 11,12。全てのＨＦＦＣ組成物（表１）は、メカニカルスターラーを使用して調製された。メカニカルスターラーで 800 rpm で連続撹拌することにより、1% 酢酸水溶液を使用してキトサンの 0.5% 溶液を調製します。表１に示される充填ポリマーの正確な重量をキトサン溶液に添加し、透明なポリマー溶液が得られるまで撹拌した。得られた混合物にＰＶＰ Ｋ３０およびＰＥＧ ４００を表１に示す量で加え、透明な粘稠なポリマー溶液が得られるまで撹拌を続けた。得られたポリマー溶液の浴を６０分間超音波処理して、ポリマー混合物から捕捉された気泡を除去した。補足図 S1(b) に示すように、Ct は、5 ml の HFFC を補充した 6 ウェル プレート (型) の各ウェルに均等に分散されました。
6 ウェル プレートを 60 分間超音波処理して、Ct ネットワーク内での HFFC の均一な濡れと分布を達成しました。次に、6 ウェル プレートを -20°C で 8 ～ 12 時間凍結します。凍結プレートを４８時間凍結乾燥して、ＮＦＲＣＳの様々な配合物を得た。同じ手順を使用して、タンポンや円筒形タンポン、またはさまざまな用途に合わせたその他の形状など、さまざまな形状や構造を製造します。
正確に秤量したキトサン (80 kDa) (3%) をマグネチックスターラーを使用して 1% 酢酸に溶解します。得られたキトサン溶液に１％ＰＥＧ４００を添加し、３０分間撹拌した。得られた溶液を正方形または長方形の容器に注ぎ、-80℃で12時間凍結させます。凍結サンプルを 48 時間凍結乾燥して、多孔質 Cs13 を得ました。
開発された NFRCS は、キトサンと他のポリマーとの化学的適合性を確認するために、フーリエ変換赤外分光法 (FTIR) (島津 8400 s FTIR、東京、日本) を使用した実験に供されました 14,15。テストしたすべてのサンプルの FTIR スペクトル (スペクトル範囲の幅 400 ～ 4000 cm-1) は、32 回のスキャンを実行することによって取得されました。
すべての製剤の血液吸収率 (BAR) は、Chen et al. によって記載された方法を使用して評価されました。16に若干の変更を加えたもの。現像したすべての組成の NFRK を真空オーブン内で 105℃で一晩乾燥させ、残留溶媒を除去しました。30 mg の NFRCS (初期サンプル重量 – W0) と 30 mg の Ct (陽性対照) を、3.8% クエン酸ナトリウムのプレミックスを含む別々の皿に入れました。所定の時間間隔、すなわち５、１０、２０、３０、４０および６０秒ごとに、ＮＦＲＣＳを除去し、サンプルをＣｔ上に３０秒間置くことによって、その表面から未吸収の血液を除去した。各時点で、NFRCS 16 によって吸収された血液の最終重量 (W1) が考慮されました。次の式を使用して BAR パーセンテージを計算します。
血液凝固時間 (BCT) は、Wang et al. の報告に従って測定されました。１７．全血（３．８％クエン酸ナトリウムと予め混合したラット血液）がＮＦＲＣＳの存在下で凝固するのに必要な時間を、試験サンプルのＢＣＴとして計算した。さまざまな NFRCS 成分 (30 mg) を 10 ml スクリューキャップバイアルに入れ、37℃でインキュベートしました。血液(0.5ml)をバイアルに加え、0.2M CaCl2 0.3mlを加えて血液凝固を活性化した。最後に、しっかりとした血栓が形成されるまで、15 秒ごとにバイアルを反転します (最大 180°)。サンプルの BCT はフリップ ベイルの数によって推定されます 17,18。BCT に基づいて、さらなる特性評価研究のために NFRCS Cm、Ch、および Cp から 2 つの最適な組成が選択されました。
Ｃｈ ＮＦＲＣＳ組成物およびＣｐ ＮＦＲＣＳ組成物のＢＣＴは、Ｌｉらによって記載された方法を実施することによって決定された。１９．15 x 15 mm2 Ch NFRCS、Cp NFRCS、および Cs (ポジティブコントロール) を別のペトリ皿 (37 °C) に置きます。3.8% クエン酸ナトリウムを含む血液を 0.2 M CaCl2 と 10:1 の体積比で混合して、血液凝固プロセスを開始しました。20 μl の 0.2 M CaCl2 ラット血液混合物をサンプル表面に塗布し、空のペトリ皿に置きました。対照は、Ctを含まない空のペトリ皿に血液を注いだものであった。0、3、5 分の固定間隔で、凝固を乱すことなくディッシュを含むサンプルに 10 ml の脱イオン (DI) 水を加えて凝固を停止します。凝固していない赤血球（赤血球）は、脱イオン水の存在下で溶血を受け、ヘモグロビンを放出します。異なる時点でのヘモグロビン (HA(t)) を、UV-Vis 分光光度計を使用して 540 nm (λmax ヘモグロビン) で測定しました。10 ml の脱イオン水中の 20 μl の血液の 0 分間のヘモグロビンの絶対吸収 (AH(0)) を参照標準として採用しました。凝固した血液の相対ヘモグロビン取り込み (RHA) は、同じバッチの血液を使用して HA(t)/HA(0) の比から計算されました。
テクスチャーアナライザー (Texture Pro CT V1.3 Build 15、ブルックフィールド、米国) を使用して、損傷組織に対する NFRK の接着特性を測定しました。底の開いた円筒形の皿を豚の皮の内側（脂肪層なし）に押し付けます。サンプル (Ch NFRCS および Cp NFRCS) をカニューレを介して円筒形の型に適用し、ブタの皮膚に接着させました。室温（ＲＴ）（２５℃）で３分間インキュベートした後、ＮＦＲＣＳ接着強度を０．５ｍｍ／秒の一定速度で記録した。
外科用シーラントの主な特徴は、失血を減らしながら血液凝固を増加させることです。NFRCS におけるロスレス凝固は、以前に公開された方法に若干の変更を加えて評価されました 19 。遠心管の片側に 8 × 5 mm2 の穴 (開放創を表す) を備えた微量遠心管 (2 ml) (内径 10 mm) を作成します。NFRCS を使用して開口部を閉じ、テープを使用して外縁をシールします。3.8% クエン酸ナトリウムプレミックスを含む微量遠心管に 0.2 M CaCl2 20 μl を加えます。10 分後、微量遠心管をディッシュから取り外し、NFRK からの血液の流出によるディッシュの質量の増加を測定しました (n = 3)。失血 Ch NFRCS および Cp NFRCS を Cs と比較しました。
NFRCS の湿潤状態の完全性は、Mishra と Chaudhary21 によって記載された方法に若干の変更を加えて決定されました。NFRCSを50 mlの水とともに100 ml三角フラスコに入れ、上部を形成せずに60秒間旋回させます。収集に基づいてサンプルの物理的完全性を視覚的に検査し、優先順位を付けます。
HFFC の Ct への結合強度は、以前に公開された方法に若干の変更を加えて研究されました。表面コーティングの完全性は、milliQ 水 (Ct) の存在下で NFRK を音波 (外部刺激) にさらすことによって評価されました。開発した NFRCS Ch NFRCS および Cp NFRCS を水で満たしたビーカーに置き、それぞれ 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、および 30 分間超音波処理しました。乾燥後、NFRCS の初期重量と最終重量の間のパーセント差を使用して、材料の損失パーセント (HFFC) を計算しました。インビトロ BCT はさらに、表面物質の結合強度または損失を裏付けました。HFFC の Ct への結合効率により、血液凝固と Ct22 表面の弾性コーティングが提供されます。
開発された NFRCS の均一性は、NFRCS の一般的な場所からランダムに選択されたサンプル (30 mg) の BCT によって決定されました。前述の BCT 手順に従って、NFRCS 準拠を確認します。5 つのサンプルすべてが近接しているため、Ct メッシュでの均一な表面被覆と HFFC の堆積が保証されます。
公称血液接触面積 (NBCA) は、以前に報告されたとおりにいくつかの修正を加えて決定されました。Ct、Ch NFRCS、Cp NFRCS、および Cs の 2 つの表面の間に血液 20 μl をクランプして血液を凝固させます。1時間後、ステントの2つの部分を分離し、血餅の面積を手動で測定しました。3 回の繰り返しの平均値を NBCA NFRCS19 とみなしました。
動的蒸気吸着 (DVS) 分析を使用して、外部環境または凝固の開始に関与する損傷部位から水を吸収する NFRCS の有効性を評価しました。DVS は、質量分解能 ±0.1 µg の超高感度天秤を使用して、サンプル内の蒸気の取り込みと損失を重量測定で評価または記録します。蒸気分圧 (相対湿度) は、飽和キャリアガスと乾燥キャリアガスを混合することにより、電子マスフローコントローラーによってサンプル周囲に生成されます。 欧州薬局方ガイドラインに従って、サンプルによる水分吸収率に基づいて、サンプルは 4 つのカテゴリー（0 ～ 0.012% w/w- 非吸湿性、0.2 ～ 2% w/w わずかに吸湿性、2 ～ 15% 中等度の吸湿性、および > 15% 非常に吸湿性）に分類されました23。 欧州薬局方ガイドラインに従って、サンプルによる水分吸収率に基づいて、サンプルは 4 つのカテゴリー（0 ～ 0.012% w/w- 非吸湿性、0.2 ～ 2% w/w わずかに吸湿性、2 ～ 15% 中等度の吸湿性、および > 15% 非常に吸湿性）に分類されました23。欧州薬局方の推奨に従って、サンプルによる吸湿率に応じて、サンプルは 4 つのカテゴリー (0 ～ 0.012% w/w – 非吸湿性、0.2 ～ 2% w/w わずかに吸湿性、2 ～ 15%) に分類されました。% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % 中程度の吸湿性、> 15% 非常に吸湿性)23.欧洲薬典南によれば、試料が水分を吸収する割合に応じて、試料の割合は４種類（０〜０．０１２％ｗ／ｗ−非吸湿性、０．２〜２％ｗ／ｗ、微吸湿性、２〜１５％、＞１５％超吸湿性）である２３。欧洲药典指南による、吸湿水分の百分率样品分別 分別 （（0-0.012% W/w-吸湿性、 、 、 、 0.2-2% W/w 微微、2-15% 吸湿性、> 15 % 非常吸湿性）23 。欧州薬局方の推奨に従って、サンプルは、サンプルが吸収する水分の割合に応じて 4 つのクラスに分類されます (0 ～ 0.012 重量％ – 非吸湿性、0.2 ～ 2 重量％ – わずかに吸湿性、2 ～ 15 重量％)。% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % 中程度の吸湿性、> 15% 非常に吸湿性) 23.NFCS X NFCS および TsN NFCS の吸湿効率は、分析装置 DVS TA TGA Q5000 SA で測定されました。このプロセス中に、実行時間、相対湿度 (RH)、および 25°C でのリアルタイムのサンプル重量が取得されました24。水分含有量は、次の式を使用した正確な NFRCS 質量分析によって計算されます。
MC は NFRCS 湿度です。m1 – NSAID の乾燥重量。m2 は、特定の RH におけるリアルタイムの NFRCS 質量です。
総表面積は、サンプルを 25 °C で 10 時間 (< 7 × 10-3 Torr) 空にした後、液体窒素を用いた窒素吸着実験を使用して推定されました。 総表面積は、サンプルを 25 °C で 10 時間 (< 7 × 10-3 Torr) 空にした後、液体窒素を用いた窒素吸着実験を使用して推定されました。 Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнени気温 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр)。 総表面積は、サンプルを 25°C で 10 時間 (< 7 × 10-3 Torr) 空にした後、液体窒素を用いた窒素吸着実験を使用して推定されました。２５℃の清浄なサンプルを１０時間（＜７×１０−３Ｔｏｒｒ）放置した後、液体窒素を使用して表面全体を観察した。25℃ Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опоро気温は 10 ℃、25 °C (< 7 × 10-3 торр) です。 総表面積は、サンプルを 25°C (< 7 x 10-3 torr) で 10 時間空にした後、液体窒素を用いた窒素吸着実験を使用して推定されました。総表面積、細孔容積、およびNFRCS細孔サイズは、オーストリアのNOVA 1000eのQuantachromeを使用し、RS 232ソフトウェアを使用して測定しました。
全血から 5% RBC (希釈剤として生理食塩水) を調製します。次に、HFFC (0.25 ml) のアリコートを 96 ウェル プレートと 5% RBC 質量 (0.1 ml) に移します。混合物を 37°C で 40 分間インキュベートします。赤血球と血清の混合物を陽性対照とし、生理食塩水と赤血球の混合物を陰性対照とみなしました。赤血球凝集は、Stajitzky スケールに従って測定されました。提案されたスケールは次のとおりです。 + + + + 緻密な粒状骨材。+ + + 湾曲したエッジを持つ滑らかな底部パッド。+ + エッジが破れた滑らかな底部パッド。+ 滑らかなパッドの端の周りにある細い赤いリング。– (マイナス) 下部ウェルの中央にある個別の赤いボタン 12。
NFRCS の血液適合性は、国際標準化機構 (ISO) (ISO10993-4、1999) の方法に従って研究されました 26,27。Singh et al. によって記載された重量法。NFRCSの存在下または表面上での血栓形成を評価するために、若干の変更を加えました。500 mgのCs、Ch NFRCSおよびCp NFRCSをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で37℃で24時間インキュベートしました。２４時間後、ＰＢＳを除去し、ＮＦＲＣＳを３．８％クエン酸ナトリウムを含む血液２ｍｌで処理した。NFRCS の表面で、インキュベートしたサンプルに 0.1 M CaCl2 0.04 ml を加えます。４５分後、５ｍｌの蒸留水を加えて凝固を止めた。NFRK 表面の凝固血液を 36 ～ 38% ホルムアルデヒド溶液で処理しました。ホルムアルデヒドで固定された凝塊を乾燥させ、重量を量った。血栓症の割合は、血液とサンプルのないガラス (陰性対照) と血液のあるガラス (陽性対照) の重量を計算することによって推定されました。
最初の確認として、HFFC 表面コーティング、相互接続された Ct、および細孔を形成する Ct ネットワークの能力を理解するために、サンプルを光学顕微鏡で視覚化しました。NFRCS からの Ch および Cp の薄切片をメスの刃でトリミングしました。得られた切片をスライドガラス上に置き、カバースリップで覆い、端を接着剤で固定しました。調製したスライドを光学顕微鏡で観察し、さまざまな倍率で写真を撮りました。
Ct ネットワーク内のポリマーの堆積は、Rice et al.29 によって記載された方法に基づく蛍光顕微鏡を使用して視覚化されました。 配合に使用した HFFC 組成物を蛍光色素 (アマランサス) と混合し、前述の方法に従って NFRCS (Ch および Cp) を調製しました。 配合に使用した HFFC 組成物を蛍光色素 (アマランサス) と混合し、前述の方法に従って NFRCS (Ch および Cp) を調製しました。配合に使用したＨＦＦＣ組成物を蛍光色素（アマランサス）と混合し、前述の方法に従ってＮＦＲＣＳ（ＣｈおよびＣｐ）を得た。配合に使用したＨＦＦＣ組成物を蛍光色素（菜）と混合し、前述の方法に従ってＮＦＲＣＳ（Ｃｈ＆Ｃｐ）を調製した。配合に使用したＨＦＦＣ組成物を蛍光色素（菜）と混合し、前述の方法に従ってＮＦＲＣＳ（Ｃｈ＆Ｃｐ）を調製した。前述したように、配合物に使用される HFFC 組成物は蛍光染料 (アマランス) と混合され、NFRCS (Ch および Cp) を受けました。得られたサンプルから NFRK の薄切片を切り出し、スライドガラス上に置き、カバースリップで覆いました。準備したスライドを緑色フィルター (310 ～ 380 nm) を使用して蛍光顕微鏡で観察します。Ct 関係と Ct ネットワークにおける過剰なポリマーの堆積を理解するために、画像を 4 倍の倍率で撮影しました。
NFRCS Ch および Cp の表面トポグラフィーは、タッピング モードで超鋭利な TESP カンチレバーを備えた原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して測定しました: 42 N/m、320 kHz、ROC 2 ～ 5 nm (ブルカー、台湾)。表面粗さは、ソフトウェア（Scanning Probe Image Processor）を使用して二乗平均平方根（RMS）によって測定しました。表面の均一性をチェックするために、さまざまな NFRCS 位置が 3D 画像上にレンダリングされました。所定の領域のスコアの標準偏差が表面粗さとして定義されます。RMS 方程式を使用して、NFRCS31 の表面粗さを定量化しました。
Ch NFRCS および Cp NFRCS の表面形態を理解するために、FESEM、SU8000、HI-0876-0003、東京、日立を使用して FESEM ベースの研究が実行され、Cm NFRCS よりも優れた BCT が示されました。FESEM 研究は、Zhao et al. によって記載された方法に従って実行されました。32に若干の変更を加えたもの。NFRCS 20 ～ 30 mg の Ch NFRCS および Cp NFRCS を、ラットの血液と予め混合した 20 μl の 3.8% クエン酸ナトリウムと予め混合しました。20μlの0.2M CaCl2を血液処理サンプルに添加して凝固を開始し、サンプルを室温で10分間インキュベートした。さらに、生理食塩水ですすぐことにより、過剰な赤血球が NFRCS 表面から除去されました。
後続のサンプルを 0.1% グルタルアルデヒドで処理し、37℃の熱風オーブンで乾燥して水分を除去しました。乾燥させたサンプルをコーティングして分析した３２。分析中に得られたその他の画像には、個々の綿繊維の表面上の凝固形成、Ct 間のポリマー堆積、赤血球の形態 (形状)、凝固の完全性、および NFRCS 存在下での赤血球の形態が含まれます。血液とインキュベートした未処理の NFRCS 領域と Ch および Cp で処理した NFRCS 領域の元素イオン (ナトリウム、カリウム、窒素、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、銅、セレン) をスキャンしました 33。処理済みサンプルと未処理サンプル間の元素イオンの割合を比較して、血餅形成中の元素イオンの蓄積と血餅の均一性を理解します。
Ct表面上のCp HFFC表面コーティングの厚さは、FESEMを使用して測定されました。Cp NFRCS の断面をフレームワークから切り出し、スパッタ コーティングしました。得られたスパッタコーティングサンプルをＦＥＳＥＭによって観察し、表面コーティングの厚さを測定した３４、３５、３６。
X 線マイクロ CT は、高解像度の 3D 非破壊イメージングを提供し、NFRK の内部構造配置を研究することができます。マイクロ CT は、サンプルを通過する X 線ビームを使用して、サンプル内の X 線の局所線減衰係数を記録します。これは形態学的情報の取得に役立ちます。NFRCS の存在下での吸収効率と血液凝固を理解するために、Cp NFRCS および血液処理 Cp NFRCS における Ct の内部位置をマイクロ CT で検査しました 37、38、39。血液処理および未処理の Cp NFRCS サンプルの 3D 構造は、マイクロ CT (V|tome|x S240、フェニックス、ドイツ) を使用して再構築されました。VG STUDIO-MAX ソフトウェア バージョン 2.2 を使用して、NFRCS 用の 3D 画像を開発するために、さまざまな角度からいくつかの X 線画像が撮影されました (理想的には 360° カバー)。収集された投影データは、対応するシンプルな 3D ScanIP Academic ソフトウェアを使用して 3D ボリューム画像に再構築されました。
さらに、血餅の分布を理解するために、20 μl の予め混合したクエン酸処理血液と 20 μl の 0.2 M CaCl2 を NFRCS に添加して血液凝固を開始しました。準備されたサンプルは硬化するまで放置されます。NFRK 表面を 0.5% グルタルアルデヒドで処理し、30 ～ 40°C の熱風オーブンで 30 分間乾燥させました。NFRCS 上に形成された血栓をスキャンして再構築し、血栓の 3D 画像を視覚化しました。
抗菌アッセイは、前述の方法に若干の変更を加えたものを使用して、Cp NFRCS (Ch NFRCS と比較して最良) で実行されました。Cp NFRCS および Cp HFFC の抗菌活性は、インキュベーター内のペトリ皿の寒天上で増殖する 3 つの異なる試験微生物 [黄色ブドウ球菌 (グラム陽性菌)、大腸菌 (グラム陰性菌)、および白色カンジダ (C.アルビカンス)] を使用して測定されました。105 ～ 106 CFU ml-1 の濃度で希釈した細菌培養懸濁液 50 ml を寒天培地に均一に接種します。培地をペトリ皿に注ぎ、固めます。寒天プレートの表面にウェルを作成し、ＨＦＦＣを充填した（ＨＦＦＣ用に３つのウェル、陰性対照用に１つのウェル）。200μlのHFFCを3つのウェルに加え、200μlのpH7.4 PBSを4番目のウェルに加えます。ペトリ皿の反対側に、凝固した寒天上に 12 mm Cp NFRCS ディスクを置き、PBS (pH 7.4) で湿らせます。シプロフロキサシン、アンピシリン、およびフルコナゾール錠剤は、黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびカンジダ・アルビカンスの参照標準とみなされます。抑制ゾーンを手動で測定し、抑制ゾーンのデジタル画像を撮影します。
機関の倫理的承認後、この研究はインド南部カルナータカ州マニパルにあるカストゥルバ医科教育研究大学で実施された。in vitro TEG 実験プロトコルは、カルナータカ州マニパルにあるカストゥルバ医科大学の施設倫理委員会によって審査され、承認されています (IEC: 674/2020)。被験者は病院の血液銀行からボランティア献血者（18歳から55歳）から募集された。さらに、血液サンプルの収集についてボランティアからインフォームドコンセントフォームを取得しました。天然 TEG (N-TEG) を使用して、クエン酸ナトリウムと事前混合した全血に対する Cp HFFC 製剤の影響を研究しました。N-TEG は、ポイントオブケア蘇生における役割が広く認識されていますが、結果 (定期的な凝固検査) が臨床的に大幅に遅れる可能性があるため、臨床医にとっては問題となります。N-TEG 分析は全血を使用して実行されました。すべての参加者からインフォームドコンセントと詳細な病歴を得ました。この研究には、妊娠/産後、肝疾患などの止血性または血栓性合併症のある参加者は含まれていませんでした。凝固カスケードに影響を与える薬剤を服用している被験者も研究から除外されました。基本的な臨床検査 (ヘモグロビン、プロトロンビン時間、活性化トロンボプラスチン、血小板数) が標準手順に従ってすべての参加者に対して実施されました。N-TEG は、血栓の粘弾性、初期の血栓構造、粒子相互作用、血栓の強化、および血栓の溶解を決定します。N-TEG 分析は、いくつかの細胞要素と血漿の集合的な影響に関するグラフおよび数値データを提供します。N-TEG 分析は、2 つの異なる容量の Cp HFFC (10 μl および 50 μl) で実行されました。その結果、クエン酸を含む全血１ｍｌをＣｐ ＨＦＦＣ １０μｌに添加した。1 ml (Cp HFFC + クエン酸添加血液)、340 μl の混合血液を 20 μl の 0.2 M CaCl2 含有 TEG ディッシュに加えます。その後、TEG ディッシュを TEG® 5000, US にロードし、Cp HFFC41 の存在下で血液サンプルの 30% の R、K、アルファ角、MA、G、CI、TPI、EPL、LY を測定しました。
in vivo 研究プロトコールは、マニパル高等教育研究所カストゥルバ医学部の施設内動物倫理委員会 (IAEC) によって審査され、承認されました (IAEC/KMC/69/2020)。すべての動物実験は、動物実験管理監督委員会 (CPCSEA) の推奨に従って実施されました。すべての in vivo NFRCS 研究 (2 × 2 cm2) は雌の Wistar ラット (体重 200 ～ 250 g) に対して実施されました。全ての動物を２４～２６℃の温度に順応させ、標準的な餌と水を自由に摂取させた。すべての動物をランダムに異なるグループに分け、各グループは 3 匹の動物から構成されました。すべての研究は、動物研究: In Vivo 実験報告書 43 に従って実施されました。研究の前に、２０〜５０ｍｇのケタミン（体重１ｋｇ当たり）および２〜１０ｍｇのキシラジン（体重１ｋｇ当たり）の混合物を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与することによって動物を麻酔した。研究後、サンプルの初期重量と最終重量の差を評価することによって出血量を計算し、3 回の試験から得られた平均値をサンプルの出血量として採用しました。
ラットの尾切断モデルは、外傷、戦闘、または交通事故における出血を調節する NFRCS の可能性を理解するために実装されました (傷害モデル)。メスの刃で尾の 50% を切り取り、正常な出血を確保するために 15 秒間空気中に置きます。さらに、圧力を加えて試験サンプルをラットの尾に置きました（Ct、Cs、Ch NFRCS、およびCp NFRCS）。試験片 (n = 3) では出血と PCT が報告されました 17,45。
戦闘における NFRCS 圧力制御の有効性が、浅大腿動脈のモデルで調査されました。大腿動脈を露出させ、24G トロカールで穿刺し、15 秒以内に出血させます。制御不能な出血が観察された後、試験片を穿刺部位に配置し、圧力を加えます。試験サンプルの適用直後に凝固時間を記録し、次の 5 分間の止血効率を観察しました。同じ手順を Cs と Ct46 で繰り返しました。
ダウリングら。47 人は、術中出血に関連して止血材の止血能力を評価する肝損傷モデルを提案しました。BCT は、Ct サンプル (ネガティブ コントロール)、Cs フレームワーク (ポジティブ コントロール)、Ch NFRCS サンプル、および Cp NFRCS サンプルについて記録されました。ラットの肝上大静脈を、正中開腹術を行うことにより露出させた。その後、左葉の遠位部分をハサミで切り取った。メスの刃で肝臓を切開し、数秒間出血させます。正確に秤量したCh NFRCSおよびCp NFRCS試験サンプルを、正圧を加えずに損傷表面に置き、BCTを記録しました。次に、対照群 (Ct) は、損傷を壊すことなく圧力を加え、続いて Cs 30 s47 を加えました。
開発されたポリマーベースの NFRCS の創傷治癒特性を評価するために、切除創傷モデルを使用して in vivo 創傷治癒アッセイを実施しました。切除創傷のモデルを選択し、若干の修正を加えた以前に公開された方法に従って実行しました 19、32、48。すべての動物は前述のように麻酔をかけました。生検パンチ (12 mm) を使用して、背中の皮膚に円形の深い切開を加えます。準備された創傷部位は、Cs (陽性対照)、Ct (綿パッドが治癒を妨げることを認識)、Ch NFRCS および Cp NFRCS (実験グループ)、および何の治療も行わない陰性対照で被覆されました。研究の毎日、すべてのラットの傷の面積が測定されました。デジタルカメラを使用して創傷領域の写真を撮り、新しい包帯を装着します。創傷閉鎖率は次の式で測定されました。
研究12日目の創傷閉鎖率に基づいて、最良の群((Cp NFRCS)および対照群)のラット皮膚を切除し、H&E染色およびマッソントリクローム染色によって研究した。 研究12日目の創傷閉鎖率に基づいて、最良の群((Cp NFRCS)および対照群)のラット皮膚を切除し、H&E染色およびマッソントリクローム染色によって研究した。研究12日目の創傷閉鎖率に基づいて、最良の群((Cp NFRCS)および対照群)のラットの皮膚を切除し、ヘマトキシリン・エオシンおよびマッソントリクロームで染色して検査した。１２日目の経口結合比の研究に基づいて、最適なグループ（（Ｃｐ ＮＦＲＣＳ）および対照グループ）のマウス皮を切除し、Ｈ＆Ｅ染色およびマッソン三色染色研究を行った。12日目の研究に基づいて、最適なグループ（(Cp NFRCS)および対照グループ）のタイツ皮を切除し、H&E染色および組織を実施した。最良のグループ（(Cp NFRCS)および対照グループ）のラットを、研究の12日目に創傷閉鎖率に基づいてヘマトキシリン・エオシン染色およびマッソントリクローム染色のために切除した。実装された染色手順は、以前に説明された方法に従って実行されました49、50。簡単に説明すると、10% ホルマリンで固定した後、一連の段階的アルコールを使用してサンプルを脱水しました。ミクロトームを使用して、切除した組織の薄い切片 (厚さ 5 μm) を取得します。対照およびＣｐ ＮＦＲＣＳの薄い連続切片をヘマトキシリンおよびエオシンで処理して、組織病理学的変化を研究した。マッソントリクローム染色を使用して、コラーゲン原線維の形成を検出した。得られた結果は病理学者によって盲目的に研究されました。
Cp NFRCS サンプルの安定性は、室温 (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) で 12 か月間調査されました 51。Cp NFRCS (表面の変色と微生物の増殖) を目視検査し、「材料と方法」のセクションで概説した上記の方法に従って耐折り曲げ摩耗性と BCT をテストしました。
Cp NFRCS のスケーラビリティと再現性は、15 × 15 cm2 のサイズの Cp NFRCS を準備することによって検査されました。さらに、30 mg のサンプル (n = 5) をさまざまな Cp NFRCS 画分から切り出し、研究サンプルの BCT を「方法」セクションで前述したように評価しました。
我々は、さまざまな生物医学用途のために Cp NFRCS 組成物を使用してさまざまな形状と構造の開発を試みてきました。このような形状または構成には、鼻血、歯科処置用の円錐形の綿棒、および膣出血用の円筒形の綿棒が含まれる。
すべてのデータセットは平均±標準偏差として表され、Prism 5.03 (GraphPad、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用した ANOVA とそれに続く Bonferroni の多重比較検定によって分析されました (*p<0.05)。
人体研究で実施されるすべての手順は、研究所および国立研究評議会の基準、ならびに 1964 年のヘルシンキ宣言およびその後の修正、または同様の倫理基準に従っていました。すべての参加者は、研究の特徴とその自主的な性質について知らされました。参加者のデータは収集された後は機密のままとなります。in vitro TEG 実験プロトコルは、カルナータカ州マニパルにあるカストゥルバ医科大学の施設倫理委員会によって審査され、承認されています (IEC: 674/2020)。ボランティアは血液サンプルを採取するためのインフォームドコンセントに署名しました。
動物実験で行われたすべての手順は、マニパルのマニパル高等教育研究所カストゥバ医学部（IAEC/KMC/69/2020）に従って実行されました。計画されたすべての動物実験は、動物実験管理監督委員会 (CPCSEA) のガイドラインに従って実施されました。すべての著者は ARRIVE ガイドラインに従います。
すべての NFRCS の FTIR スペクトルを分析し、図 2A に示すキトサン スペクトルと比較しました。キトサンの特徴的なスペクトル ピーク (記録) 3437 cm-1 (OH および NH 伸縮、オーバーラップ)、2945 および 2897 cm-1 (CH 伸縮)、1660 cm-1 (NH2 歪み)、1589 cm-1 (NH 屈曲)、1157 cm-1 (ブリッジ伸縮 O-)、1067 cm-1 (伸縮 C-O、二級ヒドロキシル) ）、９９３ｃｍ−１（ストレッチＣＯ、Ｂｏ−ＯＨ）５２．５３．５４。補足表S1は、キトサン（レポーター）、純粋なキトサン、Cm、Ch、およびCpのFTIR NFRCS吸収スペクトル値を示しています。すべての NFRCS (Cm、Ch、および Cp) の FTIR スペクトルは、大きな変化がなく、純粋なキトサンと同じ特徴的な吸収バンドを示しました (図 2A)。FTIR の結果により、NFRCS の開発に使用したポリマー間に化学的または物理的相互作用がないことが確認され、使用したポリマーが不活性であることが示されました。
Cm NFRCS、Ch NFRCS、Cp NFRCS および Cs の in vitro 特性評価。(A)は、圧縮下のキトサンとCm NFRCS、Ch NFRCS、およびCp NFRCSの組成物の組み合わされたFTIRスペクトルを表す。(B) a) NFRCS Cm、Ch、Cp、および Cg の全血取り込み率 (n = 3)。綿棒の吸収効率が高いため、Ct サンプルはより高い BAR を示しました。b) 血液吸収後の血液 吸収されたサンプルの図。テストサンプル C の BCT のグラフ表示 (Cp NFRCS が最良の BCT を示しました (15 秒、n = 3))。 C、D、E、および G のデータは平均 ± SD として示され、エラーバーは SD を表します、***p < 0.0001。 C、D、E、および G のデータは平均 ± SD として示され、エラーバーは SD を表します、***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрезностей представляют стандартное откло нение、***p <0,0001。 C、D、E、および G のデータは平均 ± 標準偏差として表示され、エラーバーは標準偏差を表します (***p<0.0001)。 Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ中のデータは、平均値±ＳＤを示し、差線はＳＤを表し、***ｐ＜０．０００１である。 Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ中のデータは、平均値±ＳＤを示し、差線はＳＤを表し、***ｐ＜０．０００１である。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрезностей представляют стандартное о тклонение、***p <0,0001。 C、D、E、および G のデータは平均 ± 標準偏差として示され、エラーバーは標準偏差を表します、***p<0.0001。