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鳥の繁殖力は、十分な量の生存可能な精子を精子貯蔵細管 (SST) に長期間貯蔵できるかどうかに依存します。精子が SST に侵入し、そこに存在し、SST から出る正確なメカニズムについては、依然として議論の余地があります。シャルカシ雌鶏の精子は凝集する傾向が高く、多くの細胞を含む可動性の糸状束を形成していました。不透明な卵管内の精子の運動性と挙動を観察することは難しいため、精子の凝集と運動性を研究するために、精子の断面と同様のマイクロチャネル断面を備えたマイクロ流体デバイスを使用しました。この研究では、精子束がどのように形成され、どのように移動し、SST内での精子の滞留を延長する際のそれらの役割の可能性について議論しています。静水圧（流速 = 33 µm/s）によってマイクロ流体チャネル内で流体の流れが生成されたときの精子の速度とレオロジー挙動を調査しました。精子は流れに逆らって泳ぐ傾向があり（正のレオロジー）、精子束の速度は単一の精子に比べて大幅に低下します。より多くの単一精子が補充されるにつれて、精子束はらせん状に動き、長さと厚さが増加することが観察されています。 精子束は、33μm/sを超える流体流速で掃引されるのを避けるために、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着していることが観察された。 精子束は、33μm/sを超える流体流速で掃引されるのを避けるために、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着していることが観察された。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтоб избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. 精子束は、流体流量が 33 µm/s を超えると流されないようにするために、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着することが観察されています。３３μｍ／秒を超える流速の通過を避けるために、マイクロ流体通路の側壁にビームが接近して付着しているのが観察された。33 μm/s で通過。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтоб時間は 33 分/秒を超えます。 精子束は、>33 μm/s の流体の流れによって押し流されるのを避けるために、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着することが観察されています。走査電子顕微鏡および透過電子顕微鏡により、精子束が豊富な高密度物質によって支えられていることが明らかになった。得られたデータは、シャルカジニワトリの精子の独特の可動性と、精子が凝集して可動束を形成する能力を実証しており、SMTにおける精子の長期保存のより良い理解に貢献します。
人間やほとんどの動物が受精するには、精子と卵子が適切なタイミングで受精部位に到着する必要があります。したがって、交尾は排卵前または排卵時に行われなければなりません。一方、犬などの一部の哺乳類や、昆虫、魚、爬虫類、鳥類などの非哺乳類は、卵子が受精の準備が整うまで、長期間精子を生殖器官に保存します（非同期受精 1 ）。鳥は、卵子を受精させることができる精子の生存能力を 2 ～ 10 週間維持することができます2。
これは鳥類を他の動物と区別する独特の特徴であり、同時に交尾と排卵を行わずに、数週間にわたる 1 回の授精で高い確率で受精することができます。精子貯蔵管（SST）と呼ばれる主要な精子貯蔵器官は、子宮膣接合部の内部粘膜ひだに位置しています。現在までのところ、精子が精子バンクに出入りするメカニズムは完全には理解されていません。これまでの研究に基づいて、多くの仮説が提唱されてきましたが、どれも確認されていません。
Forman4 は、精子は SST 上皮細胞上にあるタンパク質チャネルを通る流体の流れの方向に逆らった連続的な振動運動によって SST 腔内での滞留を維持していると仮説を立てました (レオロジー)。SST内腔内に精子を維持するために必要な一定の鞭毛活動によりATPが枯渇し、最終的には精子が体液の流れによって精子バンクから運び出され、精子を受精させるために上行卵管を下って新たな旅を始めるまで運動性が低下します。エッグ (Forman4)。この精子貯蔵モデルは、SST 上皮細胞に存在するアクアポリン 2、3、および 9 の免疫細胞化学による検出によって裏付けられています。現在までのところ、ニワ​​トリの精液レオロジーと、SST の保存、膣内の精子の選択、および精子の競争におけるその役割に関する研究は不足しています。ニワトリでは、精子は自然交尾後に膣に入りますが、精子の80％以上は交尾直後に膣から排出されます。これは、膣が鳥類の精子選択の主要な場所であることを示唆しています。さらに、膣内で受精した精子の 1% 未満が SST に到達することが報告されています2。ヒナへの膣内人工授精では、授精後 24 時間で SST に達する精子の数が増加する傾向があります。これまでのところ、このプロセス中の精子選択のメカニズムは不明であり、精子の運動性がSST精子の取り込みに重要な役割を果たしている可能性があります。卵管の壁は厚く不透明であるため、鳥の卵管内の精子の運動性を直接監視することは困難です。したがって、受精後に精子がどのようにSSTに移行するかについての基礎的な知識が不足しています。
レオロジーは、哺乳類の生殖器における精子の輸送を制御する重要な要素として最近認識されています。運動精子が向流に移動する能力に基づいて、Zaferani et al8 は corra マイクロ流体システムを使用して、収容された精液サンプルから運動精子を受動的に分離しました。このタイプの精液選別は、医学的不妊治療や臨床研究には不可欠であり、時間と労力がかかり、精子の形態や構造の完全性を損なう可能性がある従来の方法よりも好まれています。しかし、今日まで、鶏の生殖器からの分泌物が精子の運動性に及ぼす影響についての研究は行われていません。
SST に保存された精子を維持するメカニズムに関係なく、多くの研究者は、ニワトリ 9、10、ウズラ 2、および七面鳥 11 の SST 内で常在精子が向かい合って凝集し、凝集した精子束を形成することを観察しています。著者らは、この凝集と SST での精子の長期保存との間に関連があると示唆しています。
Tingari と Lake12 は、ニワトリの精子受容腺における精子間の強い関連性を報告し、鳥類の精子が哺乳類の精子と同じように凝集するかどうかを疑問視しました。彼らは、精管内の精子間の深いつながりは、狭い空間に多数の精子が存在することによって引き起こされるストレスによるものである可能性があると考えています。
新鮮な吊り下げガラススライド上で精子の挙動を評価すると、特に精液滴の端に一時的な凝集の兆候が見られることがあります。しかし、凝集は連続運動に伴う回転作用によって妨げられることが多く、これがこの現象の一時的な性質を説明しています。研究者らはまた、希釈剤を精液に添加すると、細長い「糸状」の細胞凝集体が現れることにも気づいた。
精子を模倣する初期の試みは、垂れ下がった滴から細いワイヤーを取り除くことによって行われ、その結果、精液の滴から細長い精子のような小胞が突き出ました。精子はすぐに小胞内に平行に並びましたが、3D の制限によりユニット全体がすぐに消えてしまいました。したがって、精子の凝集を研究するには、単離された精子貯蔵細管内で精子の運動や挙動を直接観察する必要がありますが、これは困難です。したがって、精子の運動性や凝集挙動の研究を支援するために、精子を模倣した機器を開発する必要があります。Brillard ら 13 は、成鳥の精子貯蔵細管の平均長は 400 ～ 600 μm ですが、一部の SST は 2000 μm にもなる可能性があると報告しました。Mero と Ogasawara 14 は、精腺を拡張した精子貯蔵細管と拡張していない精子貯蔵細管に分けました。どちらも長さ (約 500 μm) と首の幅 (約 38 μm) は同じでしたが、細管の平均内腔直径は 56.6 μm と 56.6 μm でした。。、それぞれ１１．２μｍ。今回の研究では、チャネルサイズが200μm×20μm（W×H）で、その断面が増幅SSTの断面にある程度近いマイクロ流体デバイスを使用しました。さらに、我々は流れる液体中での精子の運動性と凝集挙動を調べた。これは、SST 上皮細胞によって生成される液体が精子を内腔内で逆流（レオロジー）方向に保つというフォアマンの仮説と一致する。
この研究の目的は、卵管内の精子の運動性を観察する際の問題を克服し、動的環境における精子のレオロジーと挙動を研究する際の困難を回避することでした。ニワトリの生殖器における精子の運動性をシミュレートするために静水圧を生成するマイクロ流体デバイスが使用されました。
希釈した精子サンプル (1:40) を 1 滴マイクロチャネル デバイスにロードすると、2 種類の精子の運動性 (分離精子と結合精子) を識別できました。さらに、精子は流れに逆らって泳ぐ傾向がありました (ポジティブレオロジー; ビデオ 1、2)。 精子束の速度は孤独な精子の速度よりも遅いものの (p < 0.001)、陽性のレオタキシスを示す精子の割合が増加しました (p < 0.001; 表 2)。 精子束の速度は孤独な精子の速度よりも遅いものの (p < 0.001)、陽性のレオタキシスを示す精子の割合が増加しました (p < 0.001; 表 2)。 Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали п (p < 0,001; таблица 2)。 精子束は単一精子の速度よりも遅い速度を示しましたが (p < 0.001)、正のレオタキシスを示す精子の割合は増加しました (p < 0.001; 表 2)。ストリームの速度は孤立したストリームの速度よりも遅いが（p < 0.001）、顕著な流動性を示すピクセルの百分率は増加しています（p < 0.001; 表 2）。チューブ束の速度は孤独の速度よりも低い (p <0.001) が、示されるアルカリ性流動性のアイコンの百分率が増加しました (p <0.001 ; 2。。。。。))))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент (p < 0,001; таблица 2)。 精子束の速度は単一精子の速度よりも低かったが（p < 0.001）、正のレオロジーを有する精子の割合は増加しました（p < 0.001; 表 2）。単一の精子と房の正のレオロジーは、それぞれ約 53% と 85% と推定されます。
射精直後のシャルカシ鶏の精子は、数十個の個体からなる線状の束を形成していることが観察されています。これらの房は時間の経過とともに長さと厚さが増加し、消失するまで数時間生体外に残る場合があります (ビデオ 3)。これらの糸状の束は、精巣上体の端に形成されるハリモグラの精子のような形をしています。シャーカシ鶏の精液は、採取後 1 分以内に凝集して網状の束を形成する傾向が高いことがわかっています。これらのビームは動的であり、近くの壁や静的な物体に貼りつくことができます。精子束は精子細胞の速度を低下させますが、巨視的には精子束の直線性が向上することは明らかです。束の長さは、束に収集された精子の数に応じて異なります。束の 2 つの部分が分離されました。凝集した精子の自由頭部を含む最初の部分と、精子の尾および遠位端全体を含む末端部分です。高速カメラ (950 fps) を使用して、凝集精子の自由頭が束の最初の部分で観察され、振動運動による束の動きを担っており、残りの精子を螺旋運動で束の中に引きずり込んでいます (ビデオ 4)。しかし、長い房では、いくつかの自由精子頭が体に付着しており、房の末端部分が羽根として機能し、房の推進を助けることが観察されている。
液体のゆっくりとした流れの中では、精子の束は互いに平行に動きますが、流速が増加するにつれて流れに押し流されないように、精子の束は重なり始め、静止しているものすべてにくっつきます。束は、少数の精細胞が互いに近づくと形成され、同期して動き始め、互いに巻きつき、粘着性の物質にくっつきます。図 1 と 2 は、精子がどのように互いに接近し、尾部が互いに巻きつきながら接合部を形成するかを示しています。
研究者らは、精子のレオロジーを研究するために静水圧を加えてマイクロチャネル内に流体の流れを作り出した。マイクロ流路はサイズ200μm×20μm(W×H)、長さ3.6μmのものを使用した。端に注射器を取り付けた容器間のマイクロチャネルを使用します。チャネルをより見やすくするために食品着色料が使用されました。
相互接続ケーブルとアクセサリを壁に結び付けます。ビデオは位相差顕微鏡で撮影されました。各画像には、位相差顕微鏡画像とマッピング画像が表示されます。(A) 2 つの流れの間の接続は、らせん運動 (赤い矢印) による流れに抵抗します。(B) チューブ束とチャネル壁の間の接続 (赤い矢印)、同時に他の 2 つの束 (黄色の矢印) にも接続されています。(C) マイクロ流体チャネル内の精子束は互いに接続し始め (赤い矢印)、精子束のメッシュを形成します。(D) 精子束のネットワークの形成。
希釈された精子の滴がマイクロ流体デバイスにロードされ、流れが生成されると、精子ビームが流れの方向に逆らって移動することが観察された。束はマイクロチャネルの壁にぴったりとフィットし、束の最初の部分の自由ヘッドはマイクロチャネルの壁にぴったりとフィットします (ビデオ 5)。また、流れに押し流されないように、破片などの経路上にある静止粒子にも付着します。時間の経過とともに、これらの房は他の単一の精子を捕捉する長いフィラメントになり、より短い房になります（ビデオ6）。流れが遅くなり始めると、長い精子の列が精子のネットワークを形成し始めます (ビデオ 7; 図 2)。
高い流速（V > 33 µm/s）では、多くの個々の精子を捕らえて束を形成し、流れの漂流力によく抵抗しようとして、糸の螺旋運動が増加します。 高い流速（V > 33 µm/s）では、多くの個々の精子を捕らえて束を形成し、流れの漂流力によく抵抗しようとして、糸の螺旋運動が増加します。 При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать мно жество отдельных сперматозоидов、образующих пучки、которые лучзе противостоят дрейфующей силе потока. 高流速（V > 33 µm/s）では、流れの漂流力によく抵抗できる束を形成する多くの個々の精子を捕らえようとするため、ストランドの螺旋運動が増加します。流速が高い場合（Ｖ＞３３μｍ／ｓ）、スクリューの螺旋運動が増加して、形成された単一の液体をより多く捕捉して、流動の漂流にさらに対抗する。高い流速（v>33μm/s）では、らせん運動が増加し、図に示すように、より広範囲に浮遊力に対抗するための束状の描画が形成される。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество от дельных сперматозоидов、образующих пучки、чтобы лучзе сопротивляться силам дрейфа потока。 高流速（V > 33 µm/s）では、流れの漂流力によく抵抗するために束を形成する多くの個々の精子を捕捉しようとして、フィラメントの螺旋運動が増加します。彼らはまた、マイクロチャネルを側壁に取り付けることも試みた。
光学顕微鏡 (LM) を使用して、精子束は精子頭部とカールした尾部のクラスターとして同定されました。さまざまな凝集体を持つ精子束も、ねじれた頭部と鞭毛凝集体、複数の融合した精子尾部、尾部に付着した精子頭部、および複数の融合核として曲がった核を持つ精子頭として同定されています。透過型電子顕微鏡 (TEM)。走査電子顕微鏡 (SEM) により、精子束は精子頭部の鞘に覆われた集合体であり、精子集合体には包まれた尾部のネットワークが付着していることが示されました。
精子の形態と超微細構造、精子束の形成は、光学顕微鏡（半切片）、走査型電子顕微鏡（SEM）、透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して研究され、精子塗抹標本はアクリジンオレンジで染色され、落射蛍光顕微鏡を使用して検査されました。
アクリジンオレンジによる精子塗抹標本染色 (図 3B) は、精子頭部が互いにくっついて分泌物質で覆われ、大きな房の形成につながっていることを示しました (図 3D)。精子束は、尾部のネットワークが付着した精子の集合体から構成されていました (図 4A ～ C)。精子束は、多数の精子の尾部がくっついて構成されています (図 4D)。秘密 (図 4E、F) は精子束の頭部を覆っていました。
精子束の形成 位相差顕微鏡法とアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本を使用すると、精子の頭部が互いにくっついていることがわかりました。(A) 初期の精子房の形成は、1 個の精子 (白丸) と 3 個の精子 (黄色の丸) から始まり、螺旋は尾部から始まり頭部で終わります。(B) アクリジン オレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。付着した精子頭部 (矢印) を示します。分泌物が頭を覆います。倍率 × 1000。(C) マイクロ流体チャネル内の流れによって輸送される大きなビームの開発 (950 fps の高速カメラを使用)。(D) 大きな房 (矢印) を示す、アクリジン オレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。倍率：×200。
アクリジン オレンジで染色した精子ビームと精子塗抹標本の走査型電子顕微鏡写真。(A、B、D、E) は精子のデジタル カラー走査型電子顕微鏡写真であり、C と F は尾部網を包む複数の精子の付着を示すアクリジン オレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真です。(AC) 精子凝集体は、付着した尾部 (矢印) のネットワークとして示されています。(D) 尾の周りに巻き付いたいくつかの精子の接着 (接着物質、ピンク色の輪郭、矢印付き)。(E および F) 接着剤 (ポインター) で覆われた精子頭部の集合体 (ポインター)。精子は、いくつかの渦状構造を持つ束を形成しました (F)。(C) ×400 および (F) ×200 倍率。
透過型電子顕微鏡を使用して、精子束に尾が付着していること（図6A、C）、尾に頭部が付着していること（図6B）、または尾に頭部が付着していること（図6D）を発見しました。束内の精子の頭部は湾曲しており、断面では 2 つの核領域が存在します (図 6D)。切開束では、精子は 2 つの核領域と複数の鞭毛領域を備えたねじれた頭部を持っていました (図 5A)。
精子束の接続尾部と精子頭部を接続する凝集物質を示すデジタルカラー電子顕微鏡写真。(A) 多数の精子の尾部が付着しています。縦投影 (矢印) と横投影 (矢印) の両方で尾がどのように見えるかに注目してください。(B) 精子の頭部 (矢印) は尾部 (矢印) に接続されています。(C) いくつかの精子の尾（矢印）が付いています。(D) 凝集物質 (AS、青色) は 4 つの精子頭部 (紫色) を接続します。
走査型電子顕微鏡を使用して、分泌物または膜で覆われた精子束内の精子頭部を検出しました (図 6B)。これは、精子束が細胞外物質によって固定されていることを示しています。凝集した物質は精子の頭部（クラゲの頭のような集合体；図５Ｂ）に集中し、遠位方向に拡大し、アクリジンオレンジで染色すると蛍光顕微鏡下で鮮やかな黄色の外観を与えた（図６Ｃ）。この物質は走査型顕微鏡ではっきりと見ることができ、結合剤であると考えられます。半薄切片 (図 5C) およびアクリジン オレンジで染色した精子塗抹標本では、密集した頭部とカールした尾部を含む精子束が示されました (図 5D)。
さまざまな方法を使用した精子の頭部と折り畳まれた尾部の凝集を示すさまざまな顕微鏡写真。(A) 精子束の断面デジタル カラー透過電子顕微鏡写真。2 つの部分からなる核 (青) といくつかの鞭毛部分 (緑) を持つコイル状の精子頭部を示しています。(B) 覆われているように見えるクラゲのような精子の頭のクラスター (矢印) を示すデジタル カラー走査型電子顕微鏡写真。(C) 凝集した精子の頭部 (矢印) とカールした尾部 (矢印) を示す半薄切片。(D) アクリジン オレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。精子頭部 (矢印) とカールした付着尾部 (矢印) の凝集体が示されています。精子の頭部を粘着性の物質 (S) が覆っていることに注意してください。(D) × 1000 倍率。
透過型電子顕微鏡法（図7A）を使用すると、アクリジンオレンジで染色し、蛍光顕微鏡法を使用して検査した精子塗抹標本によって確認されたように（図7B）、精子頭部がねじれ、核がらせん状をしていることもわかりました。
(A) デジタルカラー透過型電子顕微鏡写真、および (B) コイル状の頭部と精子の頭部と尾部の付着を示すアクリジン オレンジ染色した精子塗抹標本 (矢印)。(B) × 1000 倍率。
興味深い発見は、シャルカジの精子が凝集して可動性の糸状束を形成していることである。これらの束の特性により、SST における精子の吸収と貯蔵におけるそれらの考えられる役割を理解することができます。
交尾後、精子は膣に入り、激しい選択プロセスを経て、限られた数の精子のみが SST に入る15、16。現在までのところ、精子が SST に出入りするメカニズムは不明です。家禽の場合、精子は種に応じて 2 ～ 10 週間の長期間 SST に保存されます6。SST での保管中の精液の状態については議論が続いています。彼らは動いていますか、それとも静止していますか?言い換えれば、精子細胞はどのようにして SST 内で長期間その位置を維持するのでしょうか?
Forman4 は、SST の滞留と排出は精子の運動性の観点から説明できる可能性があると示唆しました。著者らは、精子はSST上皮によって作られる流体の流れに逆らって泳ぐことでその位置を維持し、精子の速度がエネルギー不足により後退し始める点を下回るとSSTから排出されるのではないかと仮説を立てている。Zaniboni5 は、SST 上皮細胞の頂端部分にアクアポリン 2、3、および 9 が存在することを確認しました。これは、フォアマンの精子貯蔵モデルを間接的に裏付ける可能性があります。今回の研究では、シャーカシの精子のほぼ半数が流れる液体中で正のレオロジーを示し、凝集により速度が低下するものの、凝集した精子束により正のレオロジーを示す精子の数が増加することが判明した。精子細胞が鳥の卵管をどのようにして受精部位まで移動するのかは完全には理解されていません。哺乳類では、卵胞液が精子を化学誘引します。しかし、化学誘引物質は精子を長距離に近づけるよう誘導すると考えられています7。したがって、他のメカニズムが精子の輸送を担当します。精子が交尾後に放出される卵管液に向かって配向し、流れる能力が、マウスの精子を標的とする主要な要因であることが報告されている。Parker 17は、鳥類や爬虫類では精子が毛様体流に逆らって泳いで卵管を通過するのではないかと示唆した。鳥類では実験的に実証されていないが、Adolphi18 は、濾紙を使ってカバーガラスとスライドの間に液体の薄い層を作ると、鳥類の精子が肯定的な結果をもたらすことを初めて発見した。レオロジー。日野と柳町 [19] は、マウスの卵巣・卵管・子宮複合体を灌流リングに配置し、峡部に 1 μl のインクを注入して、卵管内の体液の流れを視覚化しました。彼らは、卵管内で非常に活発な収縮と弛緩の動きがあり、すべてのインクボールが卵管膨大部に向かって着実に移動していることに気づきました。著者らは、精子の上昇と受精には卵管の下部から上部への卵管液の流れの重要性を強調しています。Brillard20 は、ニワトリと七面鳥において、精子は、精子が蓄えられている膣入口から、蓄えられている子宮と膣の接合部まで、活発な動きによって移動することを報告しました。ただし、精子は受動的移動によって輸送されるため、子宮膣接合部と漏斗の間ではこの動きは必要ありません。これらの以前の推奨事項と現在の研究で得られた結果を知ると、精子が上流に移動する能力 (レオロジー) が、選択プロセスの基礎となる特性の 1 つであると想定できます。これにより、精子が膣を通過し、保存のために CCT に入ることが決まります。Forman4 が示唆したように、これは精子が SST とその生息地に一定期間侵入し、速度が低下し始めると退出するプロセスを促進する可能性もあります。
一方、松崎と佐々波 21 は、鳥類の精子は雄と雌の生殖管内で休眠から運動性への運動性変化を起こすことを示唆しました。SST 内に存在する精子の運動性の阻害は、精子の長期保存とその後の SST 離脱後の若返りを説明するために提案されています。低酸素条件下では、松崎ら。1 人は、SST における乳酸の生成と放出が高く、これが常在精子の運動性の阻害につながる可能性があると報告しました。この場合、精子レオロジーの重要性は、精子の保存ではなく、精子の選択と吸収に反映されます。
精子の凝集パターンは、家禽における精子の貯留の一般的なパターンであるため、SST での精子の長期保存の妥当な説明であると考えられています 2,22,23。バクストら。2 は、ほとんどの精子が互いに付着して束状凝集体を形成し、ウズラ CCM では単一の精子がほとんど見つからないことを観察しました。一方、Wen らは、24 人は、ニワトリの SST 管腔内でより多くの精子が散在し、より少ない精子房を観察しました。これらの観察に基づいて、精子凝集の傾向は鳥間で、また同じ射精液内の精子間で異なると推測できます。さらに、Van Krey et al.9 は、凝集した精子のランダムな解離が、卵管の内腔への精子の漸進的な侵入の原因であることを示唆しました。この仮説によれば、凝集能の低い精子が最初に SST から排出されるはずです。これに関連して、精子の凝集能力は、汚い鳥の精子競争の結果に影響を与える要因である可能性があります。さらに、凝集精子の解離が長くなるほど、生殖能力はより長く維持されます。
精子の凝集と束への凝集はいくつかの研究で観察されています 2,22,24 が、SST 内での運動学的観察の複雑さのため、詳細には記載されていません。インビトロでの精子の凝集を研究するためにいくつかの試みがなされてきた。垂れ下がった種子の滴から細いワイヤーを取り外すと、広範囲ではあるが一時的な凝集が観察されました。これは、精液腺を模倣した細長い泡が液滴から突き出るという事実につながります。3D の制限とドリップ乾燥時間が短いため、ブロック全体がすぐに壊れてしまいました9。今回の研究では、シャーカシニワトリとマイクロ流体チップを使用して、これらの房がどのように形成され、どのように動くかを説明することができました。精子束は精液採取直後に形成され、流れの中に存在すると正のレオロジーを示し、らせん状に動くことが判明した。さらに、肉眼的に観察すると、精子束は分離された精子と比較して運動性の直線性が増加することが観察されています。これは、精子の凝集が SST の侵入前に起こる可能性があり、以前に示唆されたように精子の生産がストレスにより狭い領域に限定されないことを示唆しています (Tingari および Lake12)。房の形成中、精子は結合部を形成するまで同期して泳ぎ、その後尾は互いに巻きつき、精子の頭部は自由なままですが、尾と精子の遠位部分は粘着性の物質でくっつきます。したがって、靱帯の自由頭が動きの責任を負い、靱帯の残りの部分を引きずります。精子束の走査型電子顕微鏡検査では、付着した精子頭部が多くの粘着性物質で覆われていることが示され、精子頭部が静止している束に付着していることが示唆され、これは保管場所（SST）に到達した後に発生した可能性がある。
精子塗抹標本をアクリジン オレンジで染色すると、蛍光顕微鏡で精子細胞の周囲の細胞外接着物質を見ることができます。この物質により、精子束が周囲の表面や粒子に付着して付着し、周囲の流れとともに漂流することがなくなります。したがって、我々の観察は、可動束の形での精子の接着の役割を示しています。流れに逆らって泳ぎ、近くの表面に付着する能力により、精子は SST 内に長く留まることができます。
Rothschild25 は血球計数カメラを使用して懸濁液滴中のウシ精液の浮遊分布を研究し、顕微鏡の垂直光軸と水平光軸の両方を備えたカメラを通して顕微鏡写真を撮影しました。結果は、精子がチャンバーの表面に引き寄せられたことを示しました。著者らは、精子と表面の間に流体力学的相互作用がある可能性があると示唆しています。これを考慮すると、シャーカシ雛の精液が粘着性の房を形成する能力と合わせて、精液が SST 壁に付着して長期間保存される可能性が高まる可能性があります。
Bccetti と Afzeliu26 は、精子の糖衣が配偶子の認識と凝集に必要であると報告しました。Forman10 は、鳥の精液をノイラミニダーゼで処理することにより、糖タンパク質-糖脂質コーティングの α-グリコシド結合が加水分解され、精子の運動性に影響を与えることなく生殖能力が低下することを観察しました。著者らは、糖衣に対するノイラミニダーゼの影響により、子宮膣接合部での精子隔離が損なわれ、それによって生殖能力が低下すると示唆しています。彼らの観察は、ノイラミニダーゼ処理が精子と卵母細胞の認識を低下させる可能性を無視することはできません。フォーマンとエンゲル10は、ノイラミニダーゼで処理した精液を雌鶏に膣内授精すると生殖能力が低下することを発見した。しかし、ノイラミニダーゼ処理した精子を用いた体外受精は、対照鶏と比較して生殖能力に影響を与えなかった。著者らは、精子膜の周囲の糖タンパク質と糖脂質のコーティングの変化は、子宮膣接合部での精子の隔離を損なうことにより精子の受精能力を低下させ、その結果、子宮膣接合部の速度により精子の喪失が増加するが、精子と卵子の認識には影響を及ぼさないと結論づけた。
Bakst と Bauchan 11 は七面鳥で SST の内腔に小さな小胞と膜の断片を発見し、これらの顆粒の一部が精子膜と融合していることを観察しました。著者らは、これらの関係がSSTにおける精子の長期保存に寄与している可能性があると示唆している。しかし研究者らは、これらの粒子がCCT上皮細胞によって分泌されるのか、男性の生殖器系によって生成および分泌されるのか、または精子自体によって生成されるのか、これらの粒子の供給源を特定しなかった。また、これらの粒子は凝集の原因となります。Grützner ら 27 は、精巣上体上皮細胞が単孔精管の形成に必要な特定のタンパク質を産生および分泌することを報告しました。著者らは、これらのバンドルの分散が精巣上体タンパク質の相互作用に依存していることも報告しています。Nixon ら 28 は、付属器が酸性のシステインに富むオステオネクチンというタンパク質を分泌していることを発見しました。SPARC は、ハリモグラやカモノハシの精子房の形成に関与しています。これらのビームの散乱は、このタンパク質の損失に関連しています。
今回の研究では、電子顕微鏡を用いた超微細構造分析により、精子が大量の緻密な物質に付着していることが示された。これらの物質は、付着した頭部の間および周囲で凝縮する凝集の原因であると考えられていますが、尾部領域では濃度が低くなります。射精中に精液がリンパ液や精漿から分離するのがよく観察されることから、この凝集物質は精液とともに男性の生殖器系（精巣上体または精管）から排泄されると考えられます。鳥類の精子は精巣上体と精管を通過する際に、タンパク質に結合して血漿補液関連糖タンパク質を獲得する能力をサポートする成熟関連変化を受けることが報告されています。SST 内の常在精子膜上にこれらのタンパク質が残留することは、これらのタンパク質が精子膜の安定性の獲得に影響を与え 30 、その生殖能力を決定する可能性があることを示唆しています 31 。Ahammad ら 32 は、男性の生殖器系のさまざまな部分 (精巣から精管遠位まで) から得られた精子は、保管温度に関係なく液体保存条件下で生存率の漸進的な増加を示し、ニワトリの生存率も人工授精後の卵管内で増加することを報告しました。
シャーカシニワトリの精子房は、ハリモグラ、カモノハシ、キラネズミ、シカネズミ、モルモットなどの他の種とは異なる特徴と機能を持っています。シャルカシニワトリでは、精子の束が形成されると、単一の精子に比べて遊泳速度が低下しました。しかし、これらの束はレオロジー的に陽性の精子の割合を増加させ、動的環境において精子自体を安定させる能力を増加させた。したがって、我々の結果は、SSTにおける精子の凝集が精子の長期保存と関連しているという以前の示唆を裏付けるものである。また、精子が房を形成する傾向がS​​STにおける精子の喪失速度を制御し、それが精子の競争の結果を変える可能性があるという仮説も立てている。この仮定によれば、凝集能の低い精子が最初に SST を放出し、凝集能の高い精子がほとんどの子孫を生み出すことになります。単孔精子束の形成は有益であり、親子比に影響を与えますが、別のメカニズムが使用されます。ハリモグラとカモノハシでは、精子はビームの前進速度を高めるために互いに平行に配置されています。ハリモグラの束は単一の精子よりも約 3 倍速く移動します。メスは乱婚であり、通常複数のオスと交尾するため、ハリモグラにおけるこのような精子房の形成は、優位性を維持するための進化的適応であると考えられています。したがって、異なる射精物からの精子は卵子の受精をめぐって激しく競争します。
シャルカシニワトリの凝集精子は、位相差顕微鏡を使用して容易に視覚化でき、これにより、インビトロでの精子の挙動を簡単に研究できるため、有利であると考えられています。シャルカシニワトリの精子房の形成が生殖を促進するメカニズムも、キネズミなど協力的な精子行動を示す一部の有胎盤哺乳類で見られるメカニズムとは異なっており、一部の精子が卵子に到達し、他の近縁個体が卵子に到達して損傷するのを助けている。自分自身を証明するために。利他的な行動。自家受精 34. 精子の協力行動の別の例はシカマウスで発見されており、精子は遺伝的に最も関連性の高い精子を特定して結合し、協力的なグループを形成して無関係な精子と比較して速度を高めることができました35。
この研究で得られた結果は、SWS における精子の長期保存に関するフォーマンの理論と矛盾するものではありません。研究者らは、精細胞はSSTの内側を覆う上皮細胞の流れの中で長期間動き続け、一定時間が経過すると精細胞のエネルギー貯蔵量が枯渇し、その結果速度が低下し、低分子量物質の排出が可能になると報告している。SST の内腔からの液体の流れによる精子のエネルギー。卵管の腔。今回の研究では、単一の精子の半分が流れる液体に逆らって泳ぐ能力を示し、束内での付着により正のレオロジーを示す能力が増加したことを観察しました。さらに、我々のデータは松崎らのデータと一致しています。彼は、SST における乳酸分泌の増加が常在精子の運動性を阻害する可能性があると報告しました。しかし、我々の結果は、SSTにおけるそれらの挙動を解明することを目的として、マイクロチャネル内の動的環境の存在下での精子運動性靱帯の形成とそのレオロジー的挙動を記述している。将来の研究は、凝集剤の化学組成と起源の特定に焦点を当てる可能性があり、これは間違いなく、研究者が液体精液を保存し、受胎可能期間を延長する新しい方法を開発するのに役立つでしょう。
この研究では、15頭の生後30週の首のない雄のシャーカシ（ホモ接合性優性；Na Na）が精子提供者として選ばれた。この鳥は、エジプトのアシット県にあるアシット大学農学部の研究養鶏場で飼育されました。鳥を個別のケージ (30 x 40 x 40 cm) に入れ、光プログラム (16 時間の明るい時間と 8 時間の暗闇) にさらし、それぞれ 160 g の粗タンパク質、2800 kcal の代謝エネルギー、35 g のカルシウムを含む餌を与えました。飼料1kg当たり有効リンは5g。
データ36、37によると、腹部マッサージによって男性から精液が採取されました。3 日間にわたって 15 人の男性から合計 45 個の精液サンプルが収集されました。精液 (n = 15/日) を、二リン酸カリウム (1.27 g)、グルタミン酸ナトリウム一水和物 (0.867 g)、フルクトース (0.5 d) 無水ナトリウムを含むベルズビル家禽精液希釈剤で直ちに 1:1 (v:v) に希釈しました。酢酸塩（0.43 g）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（0.195 g）、クエン酸カリウム一水和物（0.064 g）、一リン酸カリウム（0.065 g）、塩化マグネシウム（0.034 g）および H2O（100 ml）、pH = 7、5、浸透圧 333 mOsm/kg38。希釈した精液サンプルは、まず光学顕微鏡で検査して精液の品質（水分）が良好であることを確認し、採取後 30 分以内に使用するまで 37°C のウォーターバスに保管しました。
精子の運動学とレオロジーは、マイクロ流体デバイスのシステムを使用して説明されます。精液サンプルをさらに Beltsville Avian Semen Diluent で 1:40 に希釈し、マイクロ流体デバイス (下記参照) にロードし、マイクロ流体特性評価用に以前に開発されたコンピューター精液分析 (CASA) システムを使用して速度論的パラメーターを決定しました。液体培地における精子の移動性に関する研究（エジプト、アシュート大学工学部機械工学科）。プラグインは http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39 からダウンロードできます。曲線速度（ＶＣＬ、μｍ／ｓ）、線速度（ＶＳＬ、μｍ／ｓ）および平均弾道速度（ＶＡＰ、μｍ／ｓ）を測定した。精子のビデオは、Tucson ISH1000 カメラに接続された倒立 Optika XDS-3 位相差顕微鏡 (対物レンズ 40 倍) を使用して、30 fps で 3 秒間撮影されました。CASA ソフトウェアを使用して、サンプルごとに少なくとも 3 つの領域と 500 個の精子の軌跡を研究します。録画したビデオは自家製 CASA を使用して処理されました。CASA プラグインの運動性の定義は、流速と比較した精子の遊泳速度に基づいており、体液の流れではこの方が信頼性が高いことが判明しているため、左右の動きなどの他のパラメーターは含まれていません。レオロジー運動は、流体の流れの方向に逆らう精細胞の動きとして説明されます。レオロジー特性を持つ精子を運動精子の数で割った。静止している精子と対流運動する精子はカウントから除外されました。
使用した化学物質はすべて、特に断りのない限り、Elgomhoria Pharmaceuticals (エジプト、カイロ) から入手しました。このデバイスは、El-sherry et al. の記載に従って製造されました。40に若干の変更を加えたもの。マイクロチャネルの製造に使用される材料には、ガラス プレート (Howard Glass、マサチューセッツ州ウースター)、SU-8-25 ネガ レジスト (MicroChem、カリフォルニア州ニュートン)、ジアセトン アルコール (Sigma Aldrich、ドイツ、シュタインハイム)、およびポリアセトンが含まれます。-184、ダウコーニング、ミシガン州ミッドランド）。マイクロチャネルはソフトリソグラフィーを使用して製造されます。まず、所望のマイクロチャネル設計を有する透明な保護フェイスマスクを高解像度プリンタ（エジプト、カイロのPrismaticおよびオンタリオ州マーカムのPacific Arts and Design）で印刷した。マスターは基板としてガラス板を使用して作成されました。プレートをアセトン、イソプロパノール、脱イオン水で洗浄し、スピン コーティング (3000 rpm、1 分) によって SU8-25 の 20 μm 層でコーティングしました。次いで、ＳＵ－８層を穏やかに乾燥させ（６５℃、２分間および９５℃、１０分間）、ＵＶ放射線に５０秒間曝露した。65°C および 95°C で 1 分間および 4 分間露光後ベークして、露光した SU-8 層を架橋し、続いてジアセトン アルコールで 6.5 分間現像します。ワッフルをハードベーク (200°C で 15 分間) して、SU-8 層をさらに固めます。
PDMS は、モノマーと硬化剤を 10:1 の重量比で混合して調製し、真空デシケーター内で脱気して SU-8 メインフレームに流し込みました。PDMS をオーブン (120°C、30 分) で硬化させた後、チャネルを切り出し、マスターから分離し、マイクロチャネルの入口と出口にチューブを取り付けられるように穴を開けました。最後に、他の場所で説明されているように、ポータブル コロナ プロセッサー (Electro-Technic Products、イリノイ州シカゴ) を使用して、PDMS マイクロチャネルを顕微鏡スライドに永久的に取り付けました。この研究で使用されたマイクロチャネルのサイズは 200 μm × 20 μm (幅 × 高さ)、長さは 3.6 cm です。
マイクロチャネル内の静水圧によって引き起こされる流体の流れは、入口リザーバーの流体レベルを出口リザーバーの高さの差 Δh39 より上に維持することによって達成されます (図 1)。
ここで、f は摩擦係数で、長方形のチャネル内の層流の f = C/Re として定義されます。C はチャネルのアスペクト比に応じた定数、L はマイクロチャネルの長さ、Vav はマイクロチャネル内の平均速度、Dh はチャネルの水力直径、g – 重力加速度です。この式を使用すると、次の式で平均チャネル速度を計算できます。