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鳥の繁殖力は、精子貯蔵管（SST）に長期間、生存可能な精子を十分に貯蔵できるかどうかにかかっています。精子がSSTに入り、そこに留まり、そしてSSTから出ていく正確なメカニズムは、いまだ議論の的となっています。サメバチの雌の精子は凝集傾向が強く、多くの細胞を含む可動性の糸状の束を形成します。不透明な卵管内での精子の運動性と挙動を観察することは困難であるため、我々は精子の断面に類似したマイクロチャネル断面を持つマイクロ流体デバイスを使用して、精子の凝集と運動性を調べました。本研究では、精子束がどのように形成され、どのように動き、SST内で精子の滞留期間を延長させるのに精子が果たす役割について考察します。我々は、マイクロ流体チャネル内に静水圧（流量 = 33 µm/s）によって流体の流れが生成されたときの精子の速度とレオロジー挙動を調査しました。精子は流れに逆らって泳ぐ傾向があり（正のレオロジー）、精子束の速度は単独精子に比べて著しく低下します。精子束は螺旋状に移動し、より多くの単独精子が集まるにつれて長さと太さが増加することが観察されています。 精子束は、33 µm/s を超える流体速度で流されるのを避けるために、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着しているのが観察されました。 精子束は、33 µm/s を超える流体速度で流されるのを避けるために、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着しているのが観察されました。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, Їтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. 精子束は、流体の流速が 33 µm/s を超えると流されないように、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着することが観察されています。３３μｍ／秒を超える流体流速の通過を避けるために、ビームが微小流体通路の側壁に接近して付着しているのが観察された。33 μm/s で通過。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала,時刻は 33 分/秒です。 精子束は、>33 µm/s の流体の流れによって流されるのを避けるために、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着することが観察されています。走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡による観察により、精子束は豊富な緻密質によって支えられていることが明らかになりました。得られたデータは、シャルカジ鶏精子の独特な運動性と、精子が凝集して可動束を形成する能力を示しており、SMTにおける精子の長期保存に関する理解を深める上で貢献します。
ヒトやほとんどの動物において受精が成立するには、精子と卵子が適切なタイミングで受精部位に到達する必要があります。そのため、交尾は排卵前または排卵時に行う必要があります。一方、イヌなどの一部の哺乳類や、昆虫、魚類、爬虫類、鳥類などの非哺乳類種は、卵子が受精の準備ができるまで、精子を生殖器官内に長期間貯蔵します（非同期受精1）。鳥類は、卵子を受精させることができる精子の生存能力を2～10週間維持することができます2。
これは鳥類を他の動物と区別する独自の特徴であり、交尾と排卵が同時に起こることなく、1回の授精で数週間にわたって高い受精率が得られるという特徴があります。精子貯蔵管（SST）と呼ばれる主要な精子貯蔵器官は、子宮膣接合部の内粘膜襞に位置しています。現在まで、精子が精子バンクに入り、留まり、そして排出するメカニズムは完全には解明されていません。過去の研究に基づいて多くの仮説が提唱されていますが、どれも確証されていません。
Forman4 は、精子が SST 上皮細胞にあるタンパク質チャネルを通る流体の流れの方向と反対の連続的な振動運動によって SST 腔内に留まるという仮説を立てました (レオロジー)。精子を SST 腔内に留めるために必要な鞭毛の持続的な活動によって ATP が枯渇し、運動性が最終的に低下して、精子は流体の流れによって精子バンクから運び出され、上行卵管を下って受精するための新たな旅を開始します。卵 (Forman4)。この精子貯蔵モデルは、SST 上皮細胞に存在するアクアポリン 2、3、および 9 の免疫細胞化学による検出によって裏付けられています。現在まで、ニワトリ精液レオロジーと SST 貯蔵、膣精子選択、および精子競合におけるその役割に関する研究は不足しています。ニワトリでは、精子は自然交配後に膣に入りますが、80% 以上の精子は交尾後すぐに膣から排出されます。このことは、鳥類において膣が精子選別の主要な場であることを示唆しています。さらに、膣内で受精した精子のうち、SSTに到達するのは1%未満であると報告されています2。ヒナの膣内人工授精では、授精後24時間でSSTに到達する精子数が増加する傾向があります。これまでのところ、この過程における精子選別のメカニズムは不明であり、精子の運動性がSST精子の取り込みにおいて重要な役割を果たしている可能性があります。しかし、鳥類の卵管の壁は厚く不透明であるため、卵管内の精子の運動性を直接観察することは困難です。そのため、受精後に精子がSSTに移行する仕組みに関する基礎的な知見が不足しています。
近年、レオロジーは哺乳類の生殖器における精子輸送を制御する重要な因子であることが認識されています。運動精子が逆流して移動する能力に基づき、Zaferaniら8はCorraマイクロ流体システムを用いて、ペンで採取した精液サンプルから運動精子を受動的に分離しました。このタイプの精液選別は、不妊治療や臨床研究に不可欠であり、時間と労力を要し、精子の形態や構造の完全性を損なう可能性のある従来の方法よりも優れています。しかしながら、これまで、ニワトリの生殖器からの分泌物が精子の運動性に及ぼす影響に関する研究は行われていません。
SSTに精子が保存されるメカニズムが何であれ、多くの研究者が、ニワトリ9, 10、ウズラ2、七面鳥11のSSTにおいて、定住精子が頭部同士で凝集し、凝集精子束を形成することを観察しています。著者らは、この凝集とSSTにおける精子の長期保存との間に関連があると示唆しています。
ティンガリとレイク12は、ニワトリの受精腺における精子間の強い関連性を報告し、鳥類の精子が哺乳類の精子と同じように凝集するかどうかを疑問視しました。彼らは、精管における精子間の深いつながりは、狭い空間に多数の精子が存在することによるストレスに起因する可能性があると考えています。
新鮮な吊り下げ式スライドガラス上で精子の挙動を評価すると、特に精液滴の縁に一時的な凝集の兆候が見られます。しかし、凝集は連続的な運動に伴う回転運動によってしばしば阻害され、これがこの現象の一時的な性質を説明しています。研究者らはまた、精液に希釈液を加えると、細長い「糸状」の細胞凝集体が出現することにも気づきました。
精子を模倣する初期の試みは、精液滴から細い針金を取り除くことで行われ、その結果、精液滴から突き出た細長い精子のような小胞が得られました。精子はすぐに小胞内で平行に並びましたが、3D の制限により全体はすぐに消失しました。そのため、精子の凝集を研究するためには、単離した精子貯蔵細管内で精子の運動性と挙動を直接観察する必要がありますが、これは困難です。そのため、精子の運動性および凝集挙動の研究をサポートするために、精子を模倣する機器の開発が必要です。Brillard ら13 は、成鳥のニワトリの精子貯蔵細管の平均長さは 400～600 µm ですが、一部の SST は 2000 µm に達することもあると報告しています。 Mero と Ogasawara14 は精細管を拡張した精子貯蔵細管と拡張していない精子貯蔵細管に分類しました。どちらも長さ (約 500 µm) と首の幅 (約 38 µm) は同じでしたが、細管の平均内腔径はそれぞれ 56.6 µm と 56.6 µm でした。 . 、それぞれ 11.2 µm。現在の研究では、チャネルサイズが 200 µm × 20 µm (W × H) のマイクロ流体デバイスを使用しました。その断面積は増幅された SST の断面積に多少近いです。さらに、流れる流体中での精子の運動性と凝集挙動を調べましたが、これは SST 上皮細胞によって生成された流体が内腔内で精子を逆流 (レオロジー) 方向に保持するという Foreman の仮説と一致しています。
本研究の目的は、卵管における精子の運動性を観察する際の問題点を克服し、動的環境における精子のレオロジーと挙動を研究する際の困難を回避することであった。ニワトリの生殖器における精子の運動性をシミュレートするために、静水圧を発生させるマイクロ流体デバイスが使用された。
希釈精子サンプル（1:40）をマイクロチャネルデバイスに滴下したところ、2種類の精子運動性（遊離精子と結合精子）が識別されました。さらに、精子は流れに逆らって泳ぐ傾向を示しました（正のレオロジー特性；ビデオ1、2）。 精子束の速度は単独精子より低かったものの（p < 0.001）、陽性走流性を示す精子の割合が増加しました（p < 0.001、表2）。 精子束の速度は単独精子より低かったものの（p < 0.001）、陽性走流性を示す精子の割合が増加しました（p < 0.001、表2）。 Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они (p < 0,001; таблица 2)。 精子束の速度は単独精子より低かったものの（p < 0.001）、陽性走流性を示す精子の割合が増加した（p < 0.001、表2）。ストリームの速度は孤立したストリームの速度よりも遅いが（p < 0.001）、顕著な流動性を示すピクセルの百分率は増加しています（p < 0.001; 表 2）。チューブ束の速度は孤独の速度よりも低い (p <0.001) が、示されるアルカリ性流動性のアイコンの百分率が増加しました (p <0.001 ; 2。。。。。))))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали (p < 0,001; таблица 2)。 精子束の速度は単一精子よりも低かったものの（p < 0.001）、陽性レオロジーを有する精子の割合が増加しました（p < 0.001、表2）。単一精子および精子房の陽性レオロジーは、それぞれ約 53% および 85% と推定されます。
シャルカシ鶏の精子は、射精直後に数十個の精子からなる線状の束を形成することが観察されています。これらの束は時間とともに長さと厚みを増し、体外で数時間存在してから消失することがあります（ビデオ3）。これらの糸状の束は、精巣上体の末端に形成されるハリモグラの精子に似た形状をしています。シャルカシ鶏の精液は、採取後1分以内に凝集し、網状の束を形成する傾向が高いことが分かっています。これらの束は動的であり、近くの壁や静止した物体に付着することができます。精子束は精子細胞の速度を低下させますが、肉眼的には精子の直線性を高めることは明らかです。束の長さは、束に採取された精子の数によって異なります。束は、凝集した精子の自由頭部を含む最初の部分と、尾部および精子の遠位端全体を含む末端部分の2つの部分に分けられました。高速度カメラ（950 fps）を用いて、凝集した精子の遊離頭部が束の先端部に観察されました。この遊離頭部は振動運動によって束の動きを担い、残りの精子を螺旋運動で束に引き込みます（動画4）。しかし、長い房状の精子では、一部の遊離頭部が精子の胴体に付着し、房の末端部が羽根のように機能して房の推進を助けていることが観察されています。
ゆっくりとした流体の流れの中では、精子の束は互いに平行に動きますが、流速が増すにつれて、流れに流されないように、重なり合い、静止しているものすべてに付着し始めます。束は、少数の精子細胞が互いに接近し、同期して動き始め、互いに巻き付き、粘着性のある物質に付着することで形成されます。図1と図2は、精子が互いに接近し、尾部が互いに巻き付き、接合部を形成する様子を示しています。
研究者らは、精子のレオロジーを研究するため、静水圧を用いてマイクロチャネル内に流体の流れを作り出した。幅200µm×高さ20µm、長さ3.6µmのマイクロチャネルを用いた。両端に注射器を取り付けた容器の間にマイクロチャネルを設けた。チャネルを視認性を高めるため、食品着色料を使用した。
相互接続ケーブルと付属品を壁に固定します。この動画は位相差顕微鏡で撮影されました。各画像には、位相差顕微鏡画像とマッピング画像が示されています。(A) 2つのストリーム間の接続部は、らせん運動により流れに抵抗します（赤矢印）。(B) チューブ束とチャネル壁間の接続部（赤矢印）。同時に、チューブ束は他の2つの束（黄矢印）に接続されます。(C) マイクロ流体チャネル内の精子束が互いに接続し始め（赤矢印）、精子束のメッシュを形成します。(D) 精子束のネットワークの形成。
希釈した精子を一滴マイクロ流体デバイスに注入し、流れを作り出すと、精子のビームが流れの方向と逆方向に移動する様子が観察されました。束はマイクロチャネルの壁にぴったりと密着し、束の最初の部分にある自由端も壁にぴったりと密着します（動画5）。また、束はデブリなどの経路上の静止粒子に付着することで、流れに流されないように抵抗します。時間の経過とともに、これらの束は長いフィラメントとなり、他の精子や短い束を捕捉します（動画6）。流れが遅くなり始めると、長い精子の列が精子の列のネットワークを形成し始めます（動画7、図2）。
流速が高い場合 (V > 33 µm/s)、糸の螺旋運動が増加し、流れの漂流力に抵抗する束を形成する多くの個々の精子を捕捉する試みが行われます。 流速が高い場合 (V > 33 µm/s)、糸の螺旋運動が増加し、流れの漂流力に抵抗する束を形成する多くの個々の精子を捕捉する試みが行われます。 При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучзе противостоят дрейфующей силе 。 流速が高い場合 (V > 33 µm/s)、精子束が多数の個々の精子を捕らえようとするため、精子束のらせん運動が増加し、流れの漂流力に抵抗する能力が高まります。流速が高い場合（Ｖ＞３３μｍ／ｓ）、スクリューの螺旋運動が増加して、形成された単一の液体をより多く捕捉して、流動の漂流にさらに対抗する。高い流速（v>33μm/s）では、らせん運動が増加し、図に示すように、より広範囲に浮遊力に対抗するための束状の描画が形成される。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов、образующих пучки、чтобы лучзе сопротивляться силам дрейфа потока。 流量が高い場合 (V > 33 µm/s)、流れの漂流力に抵抗するために、多くの個々の精子を捕獲しようとフィラメントのらせん運動が増加し、束を形成します。彼らはまた、側壁にマイクロチャネルを取り付けることも試みました。
光学顕微鏡（LM）を用いた観察では、精子束は精子頭部と巻き上がった尾部の集合体として同定された。また、様々な凝集体を持つ精子束は、ねじれた頭部と鞭毛の集合体、複数の融合した精子尾部、尾部に付着した精子頭部、そして複数の融合した核として曲がった核を持つ精子頭部として同定された。透過型電子顕微鏡（TEM）を用いた観察では、精子束は精子頭部の鞘に包まれた集合体であり、精子集合体は巻き付いた尾部のネットワーク構造を呈していることが示された。
精子の形態と超微細構造、精子束の形成を光学顕微鏡（半切片）、走査型電子顕微鏡（SEM）、透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して研究し、精子塗抹標本をアクリジンオレンジで染色し、落射蛍光顕微鏡を使用して検査しました。
アクリジンオレンジ染色（図3B）では、精子の頭部が癒着し、分泌物質に覆われて大きな房状構造を形成していることが示された（図3D）。精子束は、尾部がネットワーク状に付着した精子の集合体で構成されていた（図4A-C）。精子束は、多数の精子の尾部が癒着して構成されている（図4D）。分泌物質（図4E、F）が精子束の頭部を覆っていた。
精子束の形成 位相差顕微鏡とアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本を使用して、精子の頭部が互いにくっついていることが示されました。 (A) 初期の精子の房形成は、精子 (白丸) と 3 つの精子 (黄丸) から始まり、螺旋は尾部から始まり頭部で終わります。 (B) アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。付着した精子の頭部 (矢印) を示しています。排出物が頭部を覆っています。倍率 × 1000。 (C) マイクロ流体チャネル内の流れによって輸送される大きなビームの開発 (950 fps の高速カメラを使用)。 (D) 大きな房 (矢印) を示すアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。倍率: ×200。
精子束とアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の走査型電子顕微鏡写真。(A、B、D、E) は精子のデジタルカラー走査型電子顕微鏡写真、C と F はアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真で、尾部ウェブを巻き付ける複数の精子の付着が示されています。(AC) 精子凝集体は、付着した尾部 (矢印) のネットワークとして示されています。(D) 尾部に巻き付く複数の精子 (接着物質付き、ピンク色の輪郭、矢印) の付着。(E と F) 接着物質 (ポインター) で覆われた精子頭部凝集体 (ポインター)。精子は、いくつかの渦巻き状の構造を持つ束を形成しています (F)。(C) ×400 と (F) ×200 の拡大率。
透過型電子顕微鏡を用いて、精子束には尾部が付着している（図6A、C）、尾部に頭部が付着している（図6B）、または頭部が尾部に付着している（図6D）ことが確認された。束内の精子の頭部は湾曲しており、切片では2つの核領域が認められた（図6D）。切開束内の精子は、2つの核領域と複数の鞭毛領域を持つねじれた頭部を有していた（図5A）。
精子束内の連結尾部と、精子頭部を連結する凝集物質を示すデジタルカラー電子顕微鏡写真。(A) 多数の精子の付着尾部。縦向き（矢印）と横向き（矢印）の両方の投影で尾部がどのように見えるかに注目してください。(B) 精子の頭部（矢印）が尾部（矢印）に連結されています。(C) 複数の精子尾部（矢印）が付着しています。(D) 凝集物質（AS、青）が4つの精子頭部（紫）を連結しています。
走査型電子顕微鏡を用いて、分泌物または膜で覆われた精子束（図6B）内の精子頭部を検出しました。これは、精子束が細胞外物質によって固定されていることを示しています。凝集物質は精子頭部（クラゲの頭部のような集合体；図5B）に集中しており、遠位方向に拡大しています。アクリジンオレンジで染色すると、蛍光顕微鏡下で鮮やかな黄色を呈します（図6C）。この物質は走査型顕微鏡下で明瞭に観察でき、結合物質と考えられます。半薄切片（図5C）とアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本では、密集した頭部とカールした尾部を含む精子束が観察されました（図5D）。
様々な方法を用いて精子の頭部と折り畳まれた尾部の凝集を示す様々な顕微鏡写真。（A）精子束の断面デジタルカラー透過型電子顕微鏡写真。2つの部分に分かれた核（青）といくつかの鞭毛部分（緑）を持つコイル状の精子頭部を示しています。（B）覆われているように見えるクラゲのような精子頭部（矢印）のクラスターを示すデジタルカラー走査型電子顕微鏡写真。（C）凝集した精子頭部（矢印）とカールした尾部（矢印）を示す半薄切片。（D）アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。精子頭部（矢印）とカールした付着尾部（矢印）の凝集体を示しています。粘着性物質（S）が精子の頭部を覆っていることに注目してください。（D）×1000の倍率。
透過型電子顕微鏡（図 7A）を使用すると、精子の頭部がねじれており、核が螺旋状になっていることも確認されました。これは、アクリジンオレンジで染色し、蛍光顕微鏡で検査した精子塗抹標本によって確認されました（図 7B）。
(A) デジタルカラー透過型電子顕微鏡写真と (B) アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本。コイル状の頭部と精子の頭部および尾部の付着部（矢印）が見える。(B) 1000 倍の倍率。
興味深い発見は、シャルカジの精子が集合して可動性のある糸状の束を形成することです。この束の特性から、SSTにおける精子の吸収と貯蔵における役割を推測することができます。
交尾後、精子は膣に入り、厳しい淘汰を受け、SST15,16に入る精子の数は限られます。現在まで、精子がSSTに出入りするメカニズムは解明されていません。家禽類では、精子は種によって異なりますが、2週間から10週間という長期間SST内に保存されます6。SST内での精液の状態については、依然として議論が続いています。精子は動いているのでしょうか、それとも静止しているのでしょうか？言い換えれば、精子細胞はどのようにしてSST内で長期間その位置を維持できるのでしょうか？
Forman4 は、SST の停留と放出は精子の運動性によって説明できると示唆した。著者らは、精子は SST 上皮によって作り出される流体の流れに逆らって泳ぐことで位置を維持し、エネルギー不足により精子が後退し始める速度を下回ると SST から放出されると仮説を立てている。Zaniboni5 は、SST 上皮細胞の頂端部分にアクアポリン 2、3、9 が存在することを確認しており、これは Foreman の精子貯蔵モデルを間接的に裏付ける可能性がある。本研究では、Sharkashi の精子のほぼ半数が流動体中で陽性レオロジーを示し、凝集した精子束は陽性レオロジーを示す精子の数を増加させるが、凝集によって速度が低下することを明らかにした。鳥類の卵管を精子がどのように受精部位まで移動するかは、まだ完全には解明されていない。哺乳類では、卵胞液が精子を化学誘引する。しかし、化学誘引物質は精子を遠くまで近づけると考えられています7。したがって、精子の輸送には他のメカニズムが関与しています。交尾後に放出される卵管液に逆らって精子が配向して流れる能力は、マウスで精子を標的とする主な要因であると報告されています。パーカー17は、鳥類や爬虫類の精子は繊毛流に逆らって泳いで卵管を横断すると示唆しました。鳥類での実験的実証はありませんが、アドルフィ18は、カバーガラスとスライドの間に濾紙のストリップで薄い液体の層を作ると鳥類の精子が陽性の結果をもたらすことを初めて発見しました。レオロジー。日野と柳町[19]は、マウスの卵巣-卵管-子宮複合​​体を灌流リングに配置し、1µlのインクを峡部に注入して卵管内の液体の流れを可視化しました。彼らは卵管内で非常に活発な収縮と弛緩の動きを観察しました。その中で、すべてのインクボールは着実に卵管膨大部に向かって移動していました。著者らは、精子の上昇と受精には、下部卵管から上部卵管への卵管液の流れが重要であることを強調しています。Brillard20 は、ニワトリと七面鳥では、精子は貯蔵されている膣口から貯蔵されている子宮膣接合部まで、能動的な動きによって移動すると報告しました。しかし、子宮膣接合部と漏斗の間では、精子は受動的な移動によって輸送されるため、この動きは必要ありません。これらの以前の推奨事項と本研究で得られた結果を踏まえると、精子の上流への移動能力（レオロジー）は、選択プロセスの基盤となる特性の 1 つであると推測できます。これにより、精子が膣を通過し、貯蔵のために CCT に入るかどうかが決まります。 Forman4 が示唆したように、これは精子が一定期間 SST とその生息地に入り、その後速度が低下し始めると出て行くプロセスを促進する可能性もあります。
一方、松崎と笹浪 21 は、鳥類の精子は雄雌の生殖管内で休眠状態から運動状態へと運動性を変化させると示唆している。精子がSST内で長期間貯蔵され、その後SSTを離れた後に若返るのは、SSTにおける常在精子の運動性の抑制が原因であると提案されている。松崎ら 1 は、低酸素条件下ではSSTで乳酸の産生と放出が亢進し、これが常在精子の運動性の抑制につながる可能性があると報告している。この場合、精子レオロジーの重要性は精子の貯蔵ではなく、選択と吸収に反映されていると考えられる。
精子の凝集パターンは、家禽における精子滞留の一般的なパターンであるため、SST における精子の長期保存の妥当な説明と考えられています2,22,23。Bakst ら 2 は、ウズラの CCM ではほとんどの精子が互いに接着して束状の凝集体を形成し、単独の精子はほとんど見られないことを観察しました。一方、Wen ら 24 は、ニワトリの SST 腔内では、より散在した精子とより少ない精子房を観察しました。これらの観察に基づいて、精子凝集の傾向は鳥間および同じ射精精子内の精子間で異なると推測できます。さらに、Van Krey ら 9 は、凝集した精子のランダムな解離が、精子が卵管腔に徐々に侵入する原因であると示唆しました。この仮説によれば、凝集能の低い精子がSSTから最初に排出されるはずです。この文脈において、精子の凝集能は、汚れた鳥における精子競争の結果に影響を与える要因である可能性があります。さらに、凝集した精子が解離する時間が長いほど、繁殖能力が長く維持されます。
精子の凝集および束への凝集は、いくつかの研究2,22,24で観察されているものの、SSTにおける運動学的観察の複雑さのため、詳細に記述されてこなかった。精子の凝集をin vitroで研究する試みは数多く行われてきた。垂れ下がった種子滴から細いワイヤーを外すと、広範囲かつ一時的な凝集が観察された。これにより、種子滴から精液腺を模倣した細長い気泡が突出する。3次元的な制約と短い滴下乾燥時間のため、塊全体がすぐに劣化した9。本研究では、シャーカシ鶏とマイクロ流体チップを用いることで、これらの塊がどのように形成され、どのように移動するかを記述することができた。精子束は精液採取直後に形成され、螺旋状に移動し、流動状態にある際に正のレオロジー特性を示すことがわかった。さらに、肉眼で観察すると、精子束は単独の精子と比較して運動性の直線性を高めることが観察されている。これは、精子の凝集が SST 侵入前に起こる可能性があり、精子の生成が、以前に示唆されたようにストレスによる狭い領域に限定されないことを示唆しています (Tingari および Lake12)。 房形成中、精子は結合部を形成するまで同期して遊泳し、次に尾部が互いに巻き付き、精子の頭部は自由のままですが、精子の尾部と遠位部は粘着性物質で固まります。したがって、靭帯の自由頭部が動きを担い、靭帯の残りの部分を引きずります。 精子束の走査型電子顕微鏡検査では、付着した精子の頭部が大量の粘着性物質で覆われていることが示され、精子の頭部が休止束に付着していることが示唆され、これは貯蔵部位 (SST) に到達した後に発生した可能性があります。
精子塗抹標本をアクリジンオレンジで染色すると、蛍光顕微鏡下で精子細胞の周囲に細胞外接着物質が観察されます。この物質は精子束を周囲の表面や粒子に接着・密着させ、周囲の流れに流されないようにします。このように、私たちの観察は精子接着が移動束という形で機能していることを示しています。精子は流れに逆らって泳ぎ、近くの表面に張り付く能力によって、SST内でより長く留まることができます。
Rothschild25は、血球計算カメラを用いて、懸濁液中のウシ精液の浮遊分布を研究しました。顕微鏡の垂直光軸と水平光軸の両方を備えたカメラを通して顕微鏡写真を撮影しました。その結果、精子がチャンバーの表面に引き寄せられていることが示されました。著者らは、精子と表面の間に流体力学的相互作用がある可能性を示唆しています。これに加え、シャーカシヒヨコの精液が粘着性のある塊を形成する性質を考慮すると、精液がSSTの壁に付着して長期間保存される可能性が高まる可能性があります。
BccettiとAfzeliu26は、精子のグリコカリックスが配偶子の認識と凝集に必要であると報告した。Forman10は、鳥類の精液をノイラミニダーゼで処理することにより、糖タンパク質-糖脂質コーティングのα-グリコシド結合を加水分解すると、精子の運動性には影響を与えずに受精率が低下することを観察した。著者らは、グリコカリックスに対するノイラミニダーゼの作用が子宮膣接合部における精子の隔離を阻害し、それによって受精率を低下させると示唆している。彼らの観察は、ノイラミニダーゼ処理が精子と卵母細胞認識を低下させる可能性を無視できない。FormanとEngel10は、ノイラミニダーゼ処理した精液を鶏に膣内授精すると受精率が低下することを発見した。しかし、ノイラミニダーゼ処理した精子を用いた体外受精は、対照鶏と比較して受精率に影響を与えなかった。著者らは、精子膜周囲の糖タンパク質-糖脂質コーティングの変化により、子宮膣接合部での精子の隔離が損なわれて精子の受精能力が低下し、その結果、子宮膣接合部の速度による精子損失が増加したが、精子と卵子の認識には影響しないと結論付けた。
七面鳥では、Bakst と Bauchan 11 が SST の内腔に小胞と膜断片を発見し、これらの顆粒の一部が精子膜と融合しているのを観察した。著者らは、これらの関係が SST における精子の長期保存に寄与している可能性を示唆している。しかし、研究者らはこれらの粒子の出所、すなわち CCT 上皮細胞から分泌されたものなのか、男性の生殖系で生成・分泌されたものなのか、あるいは精子自体で生成されたものなのかを特定していない。また、これらの粒子は凝集を担っている。Grützner ら 27 は、精巣上体上皮細胞が単孔精管の形成に必要な特定のタンパク質を生成・分泌すると報告している。著者らはまた、これらの束の分散は精巣上体タンパク質の相互作用に依存すると報告している。Nixon ら 28 は、付属器が酸性のシステインに富むオステオネクチンというタンパク質を分泌することを発見した。 SPARCは、ハリモグラとカモノハシの精子房の形成に関与しています。これらのビームの散乱は、このタンパク質の喪失と関連しています。
本研究では、電子顕微鏡を用いた超微細構造解析により、精子が大量の緻密な物質に付着していることが示された。これらの物質は、付着した頭部の間および周囲に凝縮する凝集の原因であると考えられているが、尾部領域ではその濃度は低い。射精時に精液がリンパ液および精漿から分離するのをしばしば観察することから、この凝集物質は精液とともに雄の生殖器系（精巣上体または精管）から排出されるものと推測される。鳥類の精子が精巣上体および精管を通過する際に、タンパク質結合能および血漿外膜関連糖タンパク質獲得能を支える成熟関連変化を受けることが報告されている。SSTにおける常在精子膜上のこれらのタンパク質の持続性は、これらのタンパク質が精子膜安定性の獲得30 および受精能31 の決定に影響を与える可能性を示唆している。 Ahammad ら32 は、男性の生殖器系のさまざまな部分 (精巣から遠位精管まで) から採取した精子は、保存温度に関係なく、液体保存条件下で生存率が徐々に増加し、ニワトリの生存率も人工授精後に卵管内で増加したと報告しました。
シャーカシ鶏の精子房は、ハリモグラ、カモノハシ、ヤマネ、シカネズミ、モルモットといっ​​た他の種とは異なる特徴と機能を有する。シャーカシ鶏では、精子房の形成により、単独精子と比較して遊泳速度が低下した。しかし、これらの房はレオロジー陽性精子の割合を増加させ、動的な環境における精子の自己安定化能力を高めた。したがって、我々の研究結果は、SSTにおける精子凝集が精子の長期保存と関連しているというこれまでの示唆を裏付けるものである。また、精子の房形成傾向がSSTにおける精子損失率を制御し、精子競争の結果を変化させる可能性があるという仮説も立てている。この仮説によれば、凝集能の低い精子が最初にSSTを放出し、凝集能の高い精子が子孫の大部分を生み出す。単孔精子房の形成は有益であり、親子比に影響を与えるが、そのメカニズムは異なる。ハリモグラやカモノハシでは、精子はビームの前進速度を高めるために互いに平行に並んでいます。ハリモグラの精子の束は、単独の精子よりも約3倍速く移動します。ハリモグラのこのような精子の房の形成は、メスが乱交性で複数のオスと交尾することから、優位性を維持するための進化的適応であると考えられています。そのため、異なる射精精子が卵子の受精をめぐって激しく競争するのです。
シャーカシ鶏の凝集精子は位相差顕微鏡で簡単に観察でき、これは精子の挙動を体外で簡単に研究できるため有利だと考えられている。シャーカシ鶏で精子房形成が繁殖を促進するメカニズムは、協力的な精子行動を示す一部の胎盤哺乳類（例えば、ヤマネなど）とも異なっており、ヤマネでは一部の精子が卵子に到達し、他の近縁個体が卵子に到達して傷つけるのを助ける。自己証明のため。利他的行動。自家受精34。精子の協力行動の別の例は、シカネズミで発見され、精子は遺伝的に最も近縁の精子を識別して結合し、協力的なグループを形成して、無関係の精子に比べて速度を上げることができた35。
この研究で得られた結果は、SWSにおける精子の長期保存に関するFomanの理論と矛盾しない。研究者らは、精子細胞がSSTの内層を覆う上皮細胞の流れの中で長期間動き続け、一定期間が経過すると精子細胞のエネルギー貯蔵が枯渇して速度が低下し、低分子量物質の排出が可能になると報告している。SSTの内腔からの流体の流れと精子のエネルギー。卵管の空洞。本研究では、単一精子の半数が流動体に対して泳ぐ能力を示し、束内でのそれらの接着により正のレオロジーを示す能力が増加することが観察された。さらに、我々のデータは、SSTでの乳酸分泌の増加が常在精子の運動性を阻害する可能性があると報告したMatsuzaki et al. 1のデータと一致している。しかしながら、本研究の結果は、マイクロチャネル内の動的環境下における精子運動靭帯の形成とそれらのレオロジー挙動を記述しており、SSTにおけるそれらの挙動を解明する試みです。今後の研究では、凝集剤の化学組成と起源の特定に焦点を当てる可能性があり、これは間違いなく、液状精液の保存方法や受胎期間の延長のための新たな方法の開発に役立つでしょう。
本研究では、30週齢の裸頸雄サルカシ（ホモ接合優性、Na Na）15羽を精子ドナーとして選定した。これらの鳥は、エジプト・アシト県アシト大学農学部研究養鶏場で飼育された。鳥は個別のケージ（30 x 40 x 40 cm）に収容され、照明プログラム（16時間明期、8時間暗期）の下で飼育された。餌は、粗タンパク質160g、代謝エネルギー2800kcal、カルシウム35g、飼料1kgあたり有効リン5gを含むものであった。
データ36、37によると、腹部マッサージにより雄から精液を採取した。3日間で15人の雄から合計45の精液サンプルを採取した。精液（n = 15/日）は、ベルズビル家禽精液希釈液で直ちに1：1（v：v）に希釈された。この希釈液には、二リン酸カリウム（1.27 g）、グルタミン酸ナトリウム一水和物（0.867 g）、フルクトース（0.5 d）、無水酢酸ナトリウム（0.43 g）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（0.195 g）、クエン酸カリウム一水和物（0.064 g）、一リン酸カリウム（0.065 g）、塩化マグネシウム（0.034 g）、H2O（100 ml）が含まれており、pH = 7、5、浸透圧333 mOsm/kg38。希釈された精液サンプルは、まず光学顕微鏡で検査して精液の品質（水分）が良好であることを確認し、その後、採取後30分以内に使用するまで37°Cのウォーターバスで保管しました。
マイクロ流体デバイスシステムを用いて、精子の運動学とレオロジーについて記述する。精液サンプルはBeltsville Avian Semen Diluentで1:40に希釈され、マイクロ流体デバイス（下記参照）に装填された。そして、マイクロ流体特性評価用に以前に開発されたComputerized Semen Analysis (CASA) システムを用いて運動パラメータを測定した。液体培地中の精子の運動性に関する研究（エジプト、アシュート大学工学部機械工学科）。プラグインはhttp://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39からダウンロードできる。曲線速度（VCL、μm/s）、線速度（VSL、μm/s）、平均軌跡速度（VAP、μm/s）を測定した。精子の動画は、Tucson ISH1000 カメラに接続された倒立型 Optika XDS-3 位相差顕微鏡 (40 倍対物レンズ) を使用して、30 fps で 3 秒間撮影されました。CASA ソフトウェアを使用して、サンプルごとに少なくとも 3 つの領域と 500 本の精子の軌跡を調べます。録画された動画は、自家製の CASA を使用して処理されました。CASA プラグインにおける運動性の定義は、流速と比較した精子の遊泳速度に基づいており、左右の動きなどの他のパラメーターは含まれていません。これは、流体の流れにおいて、左右の動きの方が信頼性が高いことがわかっているためです。レオロジー運動は、流体の流れの方向と逆らう精子細胞の動きとして説明されます。レオロジー特性を持つ精子は、運動精子の数で割られ、静止している精子と対流運動している精子はカウントから除外されました。
使用した化学物質はすべて、特に記載がない限り、Elgomhoria Pharmaceuticals (カイロ、エジプト) から入手しました。デバイスは、El-sherry ら 40 が説明したとおりに、いくつかの変更を加えて製造しました。マイクロチャネルの製造に使用した材料は、ガラス板 (Howard Glass、ウースター、マサチューセッツ州)、SU-8-25 ネガレジスト (MicroChem、ニュートン、カリフォルニア州)、ジアセトンアルコール (Sigma Aldrich、シュタインハイム、ドイツ)、およびポリアセトン (Dow Corning、ミッドランド、ミシガン州) です。マイクロチャネルはソフトリソグラフィーを使用して製造されます。まず、高解像度プリンター (Prismatic、カイロ、エジプトおよび Pacific Arts and Design、マーカム、オンタリオ州) で、目的のマイクロチャネル設計を備えた透明な保護フェイスマスクを印刷しました。マスターはガラス板を基板として使用して作成しました。プレートをアセトン、イソプロパノール、脱イオン水で洗浄し、スピンコート（3000 rpm、1分）によりSU8-25を20µmの厚さで塗布した。SU-8層はその後、穏やかに乾燥（65℃、2分および95℃、10分）し、50秒間UV照射した。露光後ベークを65℃、95℃でそれぞれ1分および4分行い、露光したSU-8層を架橋させた後、ジアセトンアルコール中で6.5分間現像した。ワッフルをハードベーク（200℃、15分）し、SU-8層をさらに固めた。
PDMSは、モノマーと硬化剤を重量比10:1で混合して調製し、真空デシケーターで脱気した後、SU-8メインフレームに流し込んだ。PDMSはオーブン（120℃、30分）で硬化させた後、チャネルを切り出し、マスターから分離し、マイクロチャネルの入口と出口にチューブを接続できるように穿孔した。最後に、別記の通り、ポータブルコロナプロセッサ（Electro-Technic Products、イリノイ州シカゴ）を用いて、PDMSマイクロチャネルを顕微鏡スライドに恒久的に固定した。本研究で使用したマイクロチャネルの寸法は200µm×20µm（幅×高さ）、長さは3.6cmである。
マイクロチャネル内の静水圧によって誘発される流体の流れは、入口リザーバ内の流体レベルを出口リザーバ内の高低差 Δh39 より上に維持することによって実現されます (図 1)。
ここで、f は摩擦係数で、長方形チャネル内の層流では f = C/Re と定義されます。C はチャネルのアスペクト比に依存する定数、L はマイクロチャネルの長さ、Vav はマイクロチャネル内の平均速度、Dh はチャネルの水力直径、g は重力加速度です。この式を用いて、平均チャネル速度は次の式で計算できます。