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ゾルゲル法にいくつかの改良を加えて多孔質シリカ粒子を調製し、マクロポーラス粒子を得た。これらの粒子を、N-フェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート（PMI）およびスチレンを用いて可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合により誘導体化し、N-フェニルマレイミドインターカレーションポリスチレン（PMP）固定相を調製した。細口径ステンレス鋼カラム（100×1.8mm id）にスラリー充填法で充填した。5種類のペプチド（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン）からなるペプチド混合物のPMPカラム分離（クロマトグラフィー性能）とヒト血清アルブミン（HAS）のトリプシン消化を評価した。最適な溶出条件下では、ペプチド混合物の理論段数は280,000段/m²にも達する。開発したカラムと市販の Ascentis Express RP-Amide カラムの分離性能を比較したところ、分離効率と分解能の点で PMP カラムの分離性能が市販のカラムよりも優れていることが観察されました。
近年、バイオ医薬品産業は世界的に拡大しており、市場シェアも大幅に拡大しています。バイオ医薬品産業の爆発的な成長1,2,3に伴い、ペプチドやタンパク質の分析が強く求められています。ペプチド合成時には、目的のペプチドに加えて様々な不純物が生成されるため、所望の純度のペプチドを得るにはクロマトグラフィーによる精製が必要です。体液、組織、細胞中のタンパク質の分析と特性評価は、単一サンプル中に検出可能な種が多数存在するため、非常に困難な作業です。質量分析法はペプチドやタンパク質の配列決定に効果的なツールですが、このようなサンプルを一度に質量分析計に注入すると、分離は理想的ではありません。この問題は、質量分析分析の前に液体クロマトグラフィー（LC）分離を実施することで軽減できます。これにより、一定時間内に質量分析計に入る分析対象物質の数を減らすことができます4,5,6。さらに、液相分離では、分析対象物質を狭い領域に集中させることができるため、これらの分析対象物を濃縮し、MS 検出感度を向上させます。液体クロマトグラフィー (LC) は過去 10 年間で大幅に進歩し、プロテオーム分析で人気の手法となっています7,8,9,10。
逆相液体クロマトグラフィー（RP-LC）は、オクタデシル修飾シリカ（ODS）を固定相として用いてペプチド混合物の精製および分離に広く使用されています11,12,13。しかし、RP固定相は、その複雑な構造と両親媒性のため、ペプチドとタンパク質の分離が不十分です14,15。そのため、極性および非極性部分を持つペプチドやタンパク質を分析するには、これらの分析対象物と相互作用して保持するために特別に設計された固定相が必要です16。マルチモーダル相互作用を提供する混合モードクロマトグラフィーは、ペプチド、タンパク質、およびその他の複雑な混合物の分離においてRP-LCの代替手段となり得ます。いくつかの混合モード固定相が調製されており、これらの相を充填したカラムがペプチドおよびタンパク質の分離に使用されています17,18,19,20,21。混合モード固定相（WAX/RPLC、HILIC/RPLC、極性インターカレーション/RPLC)は、極性基と非極性基の両方が存在するため、ペプチドとタンパク質の分離に適しています22,23,24,25,26,27,28 。同様に、共有結合した極性基を持つ極性インターカレーション固定相は、分析対象物と固定相との相互作用によって分離が行われるため、極性および非極性分析対象物に対して優れた分離力と独自の選択性を示します。マルチモーダル相互作用29, 30, 31, 32。最近、Zhang et al. 30 は、ドデシル末端ポリアミン固定相を調製し、炭化水素、抗うつ薬、フラボノイド、ヌクレオシド、エストロゲン、およびその他のいくつかの分析対象物を分離することに成功しました。極性インターカレーターには極性基と非極性基の両方があるため、疎水性部分と親水性部分の両方を持つペプチドとタンパク質の分離に使用できます。極性埋め込みカラム (アミド埋め込み C18 カラムなど) は、Ascentis Express RP-Amide カラムという商標で市販されていますが、これらのカラムはアミン 33 の分析にのみ使用されます。
本研究では、極性埋め込み固定相（N-フェニルマレイミド埋め込みポリスチレン）を調製し、HSAのペプチドとトリプシン消化物の分離について評価しました。固定相は、次の戦略を使用して調製しました。多孔質シリカ粒子は、以前の刊行物で示した手順に従って、調製プロトコルにいくつかの変更を加えて調製しました。尿素、ポリエチレングリコール（PEG）、TMOS、水酢酸の比率を調整して、細孔径の大きいシリカ粒子を調製しました。次に、新しいリガンドであるフェニルマレイミドメチルビニルイソシアネートを合成し、シリカ粒子を誘導体化して極性埋め込み固定相を調製しました。得られた固定相を、最適化された充填スキームを使用してステンレス鋼カラム（100 × 1.8 mm id）に充填しました。カラム充填は、機械振動によって補助され、カラム内に均一なベッドが形成されるようにします。 (Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン) およびヒト血清アルブミン (HAS) のトリプシン消化物です。ペプチド混合物と HSA のトリプシン消化物は、良好な分解能と効率で分離することが観察されました。PMP カラムの分離性能を、Ascentis Express RP-Amide カラムの分離性能と比較しました。ペプチドとタンパク質の両方が PMP カラムで良好に分離され、効率的であることが観察され、Ascentis Express RP-Amide カラムよりも効率的でした。
PEG (ポリエチレングリコール)、尿素、酢酸、トリメトキシオルトシリケート (TMOS)、トリメチルクロロシラン (TMCS)、トリプシン、ヒト血清アルブミン (HSA)、塩化アンモニウム、尿素、ヘキサンメチルジシラザン (HMDS)、メタクリロイルクロリド (MC)、スチレン、4-ヒドロキシ-TEMPO、過酸化ベンゾイル (BPO)、HPLC グレードアセトニトリル (ACN)、メタノール、2-プロパノール、アセトン、Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入。
尿素（8g）、ポリエチレングリコール（8g）、および0.01N酢酸8mLの混合物を10分間撹拌し、次いで氷冷下でTMOS 24mLを添加した。反応混合物をステンレス製オートクレーブ中で40℃で6時間加熱し、次いで120℃で8時間加熱した。水を注ぎ出し、残留物を70℃で12時間乾燥させた。乾燥した柔らかい塊をオーブンで滑らかに粉砕し、550℃で12時間焼成した。粒子サイズ、細孔サイズおよび表面積の再現性を調べるために、3つのバッチを調製し、特性を評価した。
シリカ粒子の表面を、予め合成した配位子フェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート（PCMP）で修飾し、続いてスチレンとのラジアル重合を行うことで、極性基含有化合物を調製した。凝集体およびポリスチレン鎖の固定相として用いる。調製プロセスを以下に説明する。
N-フェニルマレイミド（200 mg）とメチルビニルイソシアネート（100 mg）を乾燥トルエンに溶解し、2,2'-アゾイソブチロニトリル（AIBN）0.1 mLを反応フラスコに加えてフェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート共重合体（PMCP）を調製した。混合物を60°Cで3時間加熱し、濾過し、オーブンで40°Cで3時間乾燥させた。
乾燥したシリカ粒子 (2 g) を乾燥トルエン (100 mL) に分散させ、500 mL 丸底フラスコで 10 分間撹拌および超音波処理しました。PMCP (10 mg) をトルエンに溶解し、滴下漏斗を使用して反応フラスコに滴下しました。混合物を 100°C で 8 時間還流し、濾過し、アセトンで洗浄し、60°C で 3 時間乾燥させました。次に、PMCP 結合シリカ粒子 (100 g) をトルエン (200 ml) に溶解し、触媒としてジブチルスズジラウレート 100 µL の存在下で 4-ヒドロキシ-TEMPO (2 mL) を加えました。混合物を 50°C で 8 時間撹拌し、濾過し、50°C で 3 時間乾燥させました。
スチレン（1 mL）、過酸化ベンゾイルBPO（0.5 mL）、およびTEMPO-PMCP結合シリカ粒子（1.5 g）をトルエンに分散させ、窒素置換した。スチレンの重合は100°Cで12時間行った。得られた生成物をメタノールで洗浄し、60°Cで一晩乾燥させた。全体的な反応スキームを図1に示します。
サンプルは393 Kで1時間脱気され、残留圧力が10-3 Torr未満になりました。相対圧力P/P0 = 0.99で吸着されたN2の量を使用して、総細孔容積を決定しました。裸シリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の形態は、走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ、東京、日本）で検査されました。乾燥したサンプル（裸シリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子）は、粘着性カーボンテープを使用してアルミニウムカラムに配置されました。Q150Tスパッタコーターを使用してサンプルに金メッキが施され、5 nmのAu層がサンプル上に堆積されました。これにより、低電圧でプロセス効率が向上し、微粒子のコールドスパッタリングが実現します。元素分析には、Thermo Electron（米国マサチューセッツ州ウォルサム）のFlash EA1112元素分析装置を使用しました。粒度分布を取得するには、Malvern（英国ウースターシャー）のMastersizer 2000粒度分析装置を使用しました。裸シリカ粒子およびリガンド結合シリカ粒子（各5mg）を5mLのイソプロパノールに分散させ、10分間超音波処理し、5分間ボルテックスにかけた後、マスターサイザーの光学ベンチに置いた。熱重量分析は、30～800℃の温度範囲で毎分5℃の速度で実施した。
寸法（100 × 1.8 mm id）のガラスライニングステンレス鋼製狭孔カラムに、文献で使用されたのと同じ手順を適用して、スラリー充填法を使用して充填しました。 31. 1 µm フリットを含む出口フィッティングを備えたステンレス鋼カラム (ガラスライニング、内径 100 × 1.8 mm) をスラリーパッキング装置 (Alltech Deerfield、イリノイ州、米国) に接続しました。1.2 mL のメタノールに 150 mg の固定相を懸濁して固定相スラリーを調製し、それを貯蔵カラムに送ります。メタノールはスラリー溶媒および推進溶媒として使用しました。100 MP で 10 分間、80 MP で 15 分間、60 MP で 30 分間の圧力を順次加えてカラムに充填します。充填中は、2 つの GC カラムシェーカー (Alltech、Deerfield、イリノイ州、米国) を使用して機械的な振動を加え、カラムへの均一な充填を確実にしました。スラリーパッキング装置からカラムを外し、別のフィッティングを入口と LC システムに接続して、その性能を確認します。
LCポンプ（10AD Shimadzu、日本）、50nL注入ループ付きインジェクター（Valco（米国）C14 W.05）、膜脱気装置（Shimadzu DGU-14A）、UV-VISキャピラリーウィンドウが、特別なµLCデバイス検出器（UV-2075）およびグラスライニングマイクロカラムで構成されました。余分なカラムバンドの広がりの影響を最小限に抑えるため、非常に狭く短い接続チューブを使用します。パッケージング後、キャピラリー（内径50μm 365）と還元ユニオンキャピラリー（50μm）を還元ユニオンの1/16インチ出口に取り付けました。データ収集とクロマトグラフィー処理は、Multichro 2000ソフトウェアを使用して行いました。254 nmでモニタリングし、分析対象物質のUV吸光度をテストしました。クロマトグラフィーデータは、OriginPro8（マサチューセッツ州ノーサンプトン）で分析しました。
ヒト血清由来アルブミン、凍結乾燥粉末、≥ 96% (アガロースゲル電気泳動) 3 mg をトリプシン (1.5 mg)、4.0 M 尿素 (1 mL)、および 0.2 M 重炭酸アンモニウム (1 mL) と混合します。溶液を 10 分間撹拌し、37 °C のウォーターバスで 6 時間保持した後、1 mL の 0.1% TFA でクエンチします。溶液を濾過し、4 °C 未満で保管します。
ペプチド混合物と HSA トリプシン消化物の分離を PMP カラムで個別に評価しました。PMP カラムによるペプチド混合物と HSA のトリプシン消化物の分離を確認し、その結果を Ascentis Express RP-Amide カラムの結果と比較します。理論段数は次のように計算されます。
図 2 に、裸シリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の SEM 画像を示します。裸シリカ粒子の SEM 画像 (A、B) は、これまでの研究とは対照的に、これらの粒子が球形で、細長いか不規則な対称性を持っていることを示しています。リガンド結合シリカ粒子 (C、D) の表面は裸シリカ粒子よりも滑らかですが、これはシリカ粒子の表面にポリスチレン鎖がコーティングされているためと考えられます。
裸シリカ粒子 (A、B) とリガンド結合シリカ粒子 (C、D) の走査型電子顕微鏡画像。
図3(A)に、未修飾シリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の粒径分布を示す。体積基準の粒径分布曲線から、化学修飾後にシリカ粒子のサイズが増大したことがわかった（図3A）。本研究と前回研究で得られたシリカ粒子の粒径分布データを表1(A)に比較する。PMPの体積基準の粒径d(0.5)は3.36μmで、前回研究のd(0.5)値は3.05μm（ポリスチレン結合シリカ粒子）34であった。このバッチは、反応混合物中のPEG、尿素、TMOS、および酢酸の比率が変化したため、前回研究と比較して粒径分布が狭かった。PMP相の粒径は、前回研究したポリスチレン結合シリカ粒子相の粒径よりもわずかに大きい。これは、スチレンによるシリカ粒子の表面官能基化によって、シリカ表面にポリスチレン層（0.97μm）のみが堆積されたのに対し、PMP相では層の厚さは1.38µmであった。
裸シリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の粒度分布 (A) と細孔径分布 (B)。
本研究のシリカ粒子の細孔径、細孔容積および表面積を表1(B)に示す。裸のシリカ粒子およびリガンド結合シリカ粒子のPSDプロファイルを図3(B)に示す。結果は前回の研究と匹敵する。裸のシリカ粒子およびリガンド結合シリカ粒子の細孔径はそれぞれ310および241であり、表1(B)に示すように化学修飾後に細孔径が69減少することを示す。曲線の変化を図3(B)に示す。同様に、シリカ粒子の細孔容積は化学修飾後に0.67 cm3/gから0.58 cm3/gに減少した。現在研究されているシリカ粒子の比表面積は116 m2/gであり、これは前回の研究（124 m2/g）と匹敵する。表1(B)に示すように、シリカ粒子の表面積（m2/g）も116 m2/gから化学修飾後105 m2/g。
固定相の元素分析の結果を表2に示す。現在の固定相の炭素負荷は6.35％で、前回研究（ポリスチレン結合シリカ粒子、それぞれ7.93％35と10.21％）の炭素負荷よりも低い。現在の固定相の炭素負荷が低いのは、現在のSPの調製では、スチレンに加えて、フェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート（PCMP）や4-ヒドロキシ-TEMPOなどの極性リガンドが使用されているためです。現在の固定相の窒素重量パーセントは2.21％で、前回研究の窒素の重量パーセントはそれぞれ0.1735と0.85％でした。これは、フェニルマレイミドのために、現在の固定相の窒素の重量パーセントが高くなっていることを意味します。同様に、製品（4）と（5）の炭素負荷はそれぞれ2.7％と2.9％でしたが、最終生成物（6）の炭素負荷量は、表2に示すように6.35％であった。重量減少はPMP固定相で確認し、TGA曲線を図4に示す。TGA曲線は8.6％の重量減少を示しており、これは炭素負荷量（6.35％）とよく一致している。これは、配位子にCだけでなく、N、O、Hも含まれているからである。
フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート配位子は、極性フェニルマレイミド基とビニルイソシアネート基を有するため、シリカ粒子の表面修飾に選択されました。ビニルイソシアネート基は、リビングラジカル重合によってスチレンとさらに反応します。2つ目の理由は、フェニルマレイミド基は通常のpHでは仮想電荷を持たないため、分析対象物と適度な相互作用を持ち、分析対象物と固定相との間に強い静電相互作用を持たない基を挿入するためです。固定相の極性は、最適なスチレン量とフリーラジカル重合の反応時間によって制御できます。反応の最終段階（フリーラジカル重合）は重要であり、固定相の極性を変化させる可能性があります。これらの固定相の炭素負荷量を確認するために、元素分析を実施しました。スチレン量と反応時間の増加は、固定相の炭素負荷量を増加させ、逆もまた同様であることが観察されました。異なるスチレン濃度で調製したSPは、炭素負荷量が異なります。これらの固定相を再びステンレス鋼に充填します。カラムをテストし、クロマトグラフィー性能（選択性、分解能、N 値など）を確認します。これらの実験に基づいて、極性の制御と良好な分析対象物の保持を確保するために、PMP 固定相を調製するための最適化された配合が選択されました。
5 つのペプチド混合物 (Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン) も移動相を用いた PMP カラムで評価されました。 60/40（v/v）アセトニトリル/水（0.1％TFA）、流速80μL/分。最適な溶出条件下では、カラム（100×1.8mm id）あたりの理論段数（N）は20,000±100（200,000段/m²）です。表3は、3つのPMPカラムのN値を示し、クロマトグラムは図5Aに示されています。高流量（700μL/分）でのPMPカラムの高速分析では、5つのペプチドが1分以内に溶出され、N値は非常に良好で、カラム（100×1.8mm id）あたり13,500±330で、135,000段/mに相当します（図5B）。3つの同一サイズのカラム（100×1.8mm id）に、3つの異なるロットのPMPを充填しました。再現性を確認するために固定相を調整しました。各カラムの分析対象物質の濃度は、最適な溶出条件と、各カラムで同じテスト混合物を分離するための理論段数 N および保持時間を使用して記録されました。PMP カラムの再現性データは表 4 に示されています。表 3 に示すように、PMP カラムの再現性は非常に低い %RSD 値とよく相関しています。
PMP カラム (B) と Ascentis Express RP-Amide カラム (A) によるペプチド混合物の分離。移動相 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)、PMP カラム寸法 (100 × 1.8 mm id)。分析化合物の溶出順序: 1 (Gly-Tyr)、2 (Gly-Leu-Tyr)、3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)、4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)、および 5 (ロイシン) (酸性エンケファリン)。
PMPカラム（100 × 1.8 mm id）を、高速液体クロマトグラフィーでヒト血清アルブミンのトリプシン消化物の分離について評価しました。図6のクロマトグラムは、サンプルが適切に分離されており、分解能が非常に優れていることを示しています。HSA消化物は、流量100µL/分、移動相70/30アセトニトリル/水、0.1% TFAを使用して分析しました。クロマトグラム（図6）に示すように、HSA消化物は17のペプチドに対応する17のピークに分割されています。HSA消化物の各ピークの分離効率を計算し、その値を表5に示します。
HSA のトリプシン消化物 (100 × 1.8 mm id) を PMP カラムで分離しました。流量は 100 µL/分、移動相は 0.1% TFA を含む 60/40 アセトニトリル/水でした。
ここで、Lはカラム長さ、ηは移動相の粘度、ΔPはカラムの背圧、uは移動相の線速度である。PMPカラムの透過率は2.5 × 10-14 m2、流量は25 μL/分、60/40 v/v ACN/水を使用した。PMPカラム（100 × 1.8 mm id）の透過率は、以前の研究Ref.34のものと同様であった。表面多孔質粒子を充填したカラムの透過率は、1.3 μm粒子の場合は1.7 × 10-15、1.7 μm粒子の場合は3.1 × 10-15、2.6 μm粒子の場合は5.2 × 10-15および2.5 × 10-14 m2である。5 μm粒子の場合は43。したがって、PMP相の透過率は、 5μmのコアシェル粒子。
ここで、Wxはクロロホルムを充填したカラムの重量、Wyはメタノールを充填したカラムの重量、ρは溶媒の密度である。メタノールの密度（ρ = 0.7866）とクロロホルムの密度（ρ = 1.484）。私たちが以前に研究したSILICA PARTICLES-C18カラム（100 × 1.8 mm id）34とC18-尿素カラム31の全多孔度は、それぞれ0.63と0.55であった。これは、尿素リガンドの存在が固定相の透過性を低減することを意味する。一方、PMPカラム（100 × 1.8 mm id）の全多孔度は0.60である。PMPカラムの透過性は、C18結合シリカ粒子を充填したカラムの透過性よりも低い。これは、C18型固定相では、C18リガンドがシリカ粒子に直鎖として結合しているためである。一方、ポリスチレンタイプの固定相では、その周囲に比較的厚いポリマー層が形成されます。典型的な実験では、カラムの多孔度は次のように計算されます。
図 7A、B は、同じ溶出条件 (つまり、60/40 ACN/H2O および 0.1% TFA) を使用した PMP カラム (100 × 1.8 mm id) と Ascentis Express RP-Amide カラム (100 × 1.8 mm id) を示しています。 ) は、van Deemter プロットの。選択されたペプチド混合物（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン）は、20 µL/分で調製されました。両方のカラムの最小流量は800 µL/分です。PMPカラムとAscentis Express RP-Amideカラムの最適流量（80 µL/分）での最小HETP値は、それぞれ2.6 µmと3.9 µmでした。HETP値は、PMPカラム（100 × 1.8 mm id）の分離効率が市販のAscentis Express RP-Amideカラム（100 × 1.8 mm id）よりもはるかに優れていることを示しています。図7（A）のvan Deemterプロットは、流量の増加に伴うN値の減少が、以前の研究と比較して有意ではないことを示しています。 PMPカラム（100 × 1.8 mm id）とAscentis Express RP-Amideカラムの優れた比較は、粒子の形状、サイズ、および現在の研究で使用されている複雑なカラム充填手順の改善に基づいています34。
(A) 0.1% TFA を含む 60/40 ACN/H2O で PMP カラム (100 × 1.8 mm id) を使用して得られた van Deemter プロット (HETP と移動相の線速度の関係)。(B) 0.1% TFA を含む 60/40 ACN/H2O で Ascentis Express RP-Amide カラム (100 × 1.8 mm id) を使用して得られた van Deemter プロット (HETP と移動相の線速度の関係)。
極性包埋ポリスチレン固定相を調製し、高速液体クロマトグラフィーにおける合成ペプチド混合物とヒト血清アルブミン（HAS）のトリプシン消化物の分離について評価しました。ペプチド混合物に対するPMPカラムのクロマトグラフィー性能は、分離効率と分解能に優れています。PMPカラムの分離性能の向上は、シリカ粒子の粒子サイズと細孔サイズ、固定相の制御された合成、複雑なカラム充填など、さまざまな理由によるものです。高い分離効率に加えて、高流速でのカラム背圧が低いことも、この固定相のもう1つの利点です。PMPカラムは再現性に優れ、ペプチド混合物の分析やさまざまなタンパク質のトリプシン消化に使用できます。私たちは、液体クロマトグラフィーにおける天然物、薬用植物および真菌抽出物からの生物活性化合物の分離にこのカラムを使用する予定です。将来的には、PMPカラムはタンパク質とモノクローナル抗体の分離についても評価される予定です。
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