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多孔質シリカ粒子は、マクロ多孔質粒子を得るためにいくつかの変更を加えたゾルゲル法によって調製されました。これらの粒子は、N-フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート（PMI）およびスチレンを用いた可逆付加フラグメンテーション連鎖移動（RAFT）重合によって誘導体化され、ポリスチレン（PMP）固定相のN-フェニルマレイミドインターカレーションを調製しました。細孔ステンレス鋼カラム（100×1.8 mm id）は、スラリー充填。5 つのペプチド (Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン) クロマトグラフィー性能) とヒト血清アルブミン (HAS) のトリプシン消化で構成されるペプチド混合物の PMP カラム分離を評価しました。最適な溶出条件下で、ペプチド混合物の理論段数は次のようになります。開発したカラムの分離性能を市販の Ascentis Express RP-Amide カラムと比較すると、分離効率と分離能の点で PMP カラムの分離性能が市販のカラムよりも優れていることがわかりました。
近年、バイオ医薬品産業は、市場シェアが大幅に増加し、拡大する世界市場となっています。バイオ医薬品産業の爆発的な成長に伴い、ペプチドやタンパク質の分析が強く望まれています。目的のペプチドに加えて、ペプチド合成中にいくつかの不純物が生成されるため、目的の純度のペプチドを得るにはクロマトグラフィー精製が必要です。体液、組織、細胞中のタンパク質の分析と特性評価は、単一サンプル中に多数の潜在的に検出可能な種があるため、非常に困難な作業です。質量分析はペプチドおよびタンパク質の配列決定には効果的なツールですが、そのようなサンプルを 1 回のパスで質量分析計に注入すると、分離は理想的ではありません。この問題は、MS 分析の前に液体クロマトグラフィー (LC) 分離を実施することで軽減でき、一定時間に質量分析計に入る分析物の数が減ります 4,5,6。さらに、液相分離中、分析狭い領域に分析物を集中させることができるため、これらの分析物が濃縮され、MS 検出感度が向上します。液体クロマトグラフィー (LC) は、過去 10 年間で大幅に進歩し、プロテオミクス分析で一般的な技術になりました 7、8、9、10。
逆相液体クロマトグラフィー (RP-LC) は、オクタデシル修飾シリカ (ODS) を固定相として使用するペプチド混合物の精製と分離に広く使用されています 11,12,13。ただし、RP 固定相では、その複雑な構造と両親媒性の性質により、ペプチドとタンパク質の満足のいく分離ができません 14,15 。したがって、極性のあるペプチドとタンパク質を分析するには、特別に設計された固定相が必要です。混合モードクロマトグラフィーは、マルチモーダルな相互作用を提供するため、ペプチド、タンパク質、その他の複雑な混合物の分離において RP-LC の代替手段となります。いくつかの混合モード固定相が用意されており、これらの相が充填されたカラムがペプチドとタンパク質の分離に使用されています 17、18、19、20、21。混合モード固定相 (W) AX/RPLC、HILIC/RPLC、極性インターカレーション/RPLC) は、極性基と非極性基の両方が存在するため、ペプチドとタンパク質の分離に適しています 22,23,24,25,26,27,28。同様に、分離は分析物と固定相の間の相互作用に依存するため、極性基が共有結合した極性インターカレーション固定相は、極性分析物と非極性分析物に対して優れた分離力と独自の選択性を示します。多峰性相互作用 29、30、31、32。最近、Zhang et al.30 は、ドデシル末端ポリアミン固定相を調製し、炭化水素、抗うつ薬、フラボノイド、ヌクレオシド、エストロゲン、およびその他のいくつかの分析物の分離に成功しました。極性インターカレーターには極性基と非極性基の両方があるため、疎水性部分と親水性部分の両方を持つペプチドとタンパク質の分離に使用できます。極性包埋カラム (アミド包埋 C18 カラムなど) は以下で市販されています。商品名は Ascentis Express RP-Amide カラムですが、これらのカラムはアミン 33 の分析のみに使用されます。
現在の研究では、極性包埋固定相 (N-フェニルマレイミド包埋ポリスチレン) を調製し、HSA のペプチドとトリプシン消化物の分離について評価しました。固定相は次の戦略を使用して調製しました。多孔質シリカ粒子は、調製プロトコールにいくつかの変更を加えて、以前の出版物に記載の手順に従って調製しました。尿素、ポリエチレングリコール (PEG)、TMOS、水酢酸の比率を調整してシリカ粒子を調製しました。 2 番目に、新しいリガンドであるフェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネートを合成し、シリカ粒子を誘導体化して極性埋め込み固定相を調製するために使用しました。得られた固定相を、最適化された充填スキームを使用してステンレス鋼カラム (100 × 1.8 mm id) に充填しました。カラムの充填は機械的振動によって補助され、カラム内に均一な床が確実に形成されます。5 つのペプチドからなるペプチド混合物の充填カラム分離を評価します。ペプチド;(Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシン エンケファリン) およびヒト血清アルブミン (HAS) のトリプシン消化物。HSA のペプチド混合物とトリプシン消化物が良好な分離能と効率で分離されることが観察されました。PMP カラムの分離性能を Ascentis Express RP-Amide カラムの分離性能と比較しました。両方のペプチドPMP カラムでは、ides とタンパク質が十分に分離され効率的であることが観察され、Ascentis Express RP-Amide カラムよりも効率的でした。
PEG（ポリエチレングリコール）、尿素、酢酸、トリメトキシオルトケイ酸（TMOS）、トリメチルクロロシラン（TMCS）、トリプシン、ヒト血清アルブミン（HSA）、塩化アンモニウム、尿素、ヘキサンメチルジシラザン（HMDS）、メタクリロイルクロリド（MC）、スチレン、4-ヒドロキシ-TEMPO、過酸化ベンゾイル（BPO） )、HPLC グレードのアセトニトリル (ACN)、メタノール、2-プロパノール、およびアセトン Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州、米国) から購入。
尿素（８ｇ）、ポリエチレングリコール（８ｇ）および０．０１Ｎ酢酸８ｍＬの混合物を１０分間撹拌し、氷冷条件下でこれにＴＭＯＳ２４ｍＬを加えた。反応混合物をステンレス鋼製オートクレーブ中で４０℃で６時間、次いで１２０℃で８時間加熱した。水を捨て、残留物を７０℃で乾燥した。乾燥した柔らかい塊をオーブンで滑らかに粉砕し、550℃で12時間焼成しました。粒子サイズ、細孔サイズ、表面積の再現性を調べるために3つのバッチを調製し、特性を調べました。
事前に合成した配位子フェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート (PCMP) でシリカ粒子の表面を修飾し、続いてスチレンとラジアル重合することにより、極性基含有化合物を調製しました。凝集体とポリスチレン鎖の固定相。調製プロセスを以下に説明します。
N-フェニルマレイミド（200 mg）とメチルビニルイソシアネート（100 mg）を乾燥トルエンに溶解し、0.1 mLの2,2'-アゾイソブチロニトリル（AIBN）を反応フラスコに加えて、フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネートコポリマー（PMCP）を調製しました。混合物を60℃で3時間加熱し、濾過し、40℃のオーブンで乾燥させました。 3時間。
乾燥シリカ粒子 (2 g) を乾燥トルエン (100 mL) に分散させ、500 mL 丸底フラスコ内で 10 分間撹拌および超音波処理しました。PMCP (10 mg) をトルエンに溶解し、滴下漏斗を介して反応フラスコに滴下しました。混合物を 100 ℃ で 8 時間還流し、濾過し、アセトンで洗浄し、60 ℃ で 3 時間乾燥しました。その後、PM ＣＰ結合シリカ粒子（１００ｇ）をトルエン（２００ｍｌ）に溶解し、触媒としてジブチルスズジラウレート１００μＬの存在下、４－ヒドロキシ－ＴＥＭＰＯ（２ｍＬ）を加えた。混合物を５０℃で８時間撹拌し、濾過し、５０℃で３時間乾燥した。
スチレン (1 mL)、過酸化ベンゾイル BPO (0.5 mL)、および TEMPO-PMCP 結合シリカ粒子 (1.5 g) をトルエンに分散させ、窒素でパージしました。スチレンの重合を 100℃で 12 時間実行しました。得られた生成物をメタノールで洗浄し、60℃で一晩乾燥しました。全体の反応スキームを図 1 に示します。
サンプルを 393 K で 1 時間脱気して、10-3 Torr 未満の残留圧力を得ました。相対圧力 P/P0 = 0.99 で吸着した N2 の量を使用して、全細孔容積を決定しました。裸のシリカ粒子およびリガンド結合したシリカ粒子の形態を走査型電子顕微鏡 (日立ハイテクノロジーズ、東京、日本) で調べました。乾燥したサンプル (裸のシリカおよびリガンド結合したシリカ粒子) を配置しました。粘着カーボンテープを使用してアルミニウムカラム上に金をメッキしました。Q150T スパッタコーターを使用してサンプルに金をめっきし、サンプル上に 5 nm の Au 層を堆積しました。これにより、低電圧を使用してプロセス効率が向上し、微粒子のコールドスパッタリングが実現しました。元素分析には Thermo Electron (米国マサチューセッツ州ウォルサム) Flash EA1112 元素分析装置を使用しました。Malvern (英国ウースターシャー) の Mastersizer 2000 粒度分析装置を使用しました。裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子 (それぞれ 5 mg) を 5 mL のイソプロパノールに分散し、10 分間超音波処理し、5 分間ボルテックスし、マスターサイザーの光学ベンチに置きました。 30 ～ 800 °C の温度範囲にわたって 1 分あたり 5 °C の速度で熱重量分析を実行しました。
寸法（内径 100 × 1.8 mm）のグラスライニングされたステンレス鋼の細口径カラムを、参考文献で使用したのと同じ手順を適用して、スラリー充填法を使用して充填しました。31. 1 µm フリットを含む出口フィッティングを備えたステンレス鋼カラム (ガラスライニング、内径 100 × 1.8 mm) をスラリーパッカー (Alltech Deerfield、イリノイ州、米国) に接続しました。150 mg の固定相を 1.2 mL のメタノールに懸濁して固定相スラリーを調製し、保管カラムに送ります。メタノールはプロ用溶媒と同様にスラリー溶媒として使用されました。溶媒をペリングします。100 MP で 10 分間、80 MP で 15 分間、60 MP で 30 分間、順番にカラムを充填します。充填中、カラムを均一に充填するために、2 台の GC カラムシェーカー (Alltech、米国イリノイ州ディアフィールド) で機械的振動を加えました。スラリーパッカーを閉じ、ゆっくりと圧力を解放して、カラム内の損傷を防ぎます。カラムをスラリー充填ユニットから外し、別のフィッティングを接続します。注入口と LC システムに接続してその性能をチェックします。
LC ポンプ (10AD Shimadzu、日本)、50nL 注入ループを備えたインジェクター (Valco (USA) C14 W.05)、メンブレン脱気装置 (島津 DGU-14A)、UV-VIS キャピラリー ウィンドウを構築しました。特別な µLC デバイス検出器 (UV-2075) とガラスライニングされたマイクロカラム。余分なカラム バンドの広がりの影響を最小限に抑えるために、非常に狭くて短い接続チューブを使用します。パッケージング後、キャピラリー (5)内径 0 μm 365 および還元ユニオン キャピラリー (50 μm) を還元ユニオンの 1/16 インチ出口に取り付けました。データ収集とクロマトグラフィー処理は、Multichro 2000 ソフトウェアを使用して行いました。254 nm でのモニタリング分析対象物の UV 吸光度をテストしました。クロマトグラフィー データは、OriginPro8 (マサチューセッツ州ノーサンプトン) によって分析しました。
ヒト血清由来のアルブミン、凍結乾燥粉末、96% 以上 (アガロースゲル電気泳動) 3 mg をトリプシン (1.5 mg)、4.0 M 尿素 (1 mL)、および 0.2 M 重炭酸アンモニウム (1 mL) と混合しました。溶液を 10 分間撹拌し、37°C​​ の水浴中に 6 時間保持した後、1 mL の 0.1% TFA でクエンチしました。溶液を4℃以下で保存してください。
ペプチド混合物と HSA トリプシン消化物の分離は、PMP カラムで個別に評価されました。PMP カラムによるペプチド混合物と HSA のトリプシン消化物の分離を確認し、結果を Ascentis Express RP-Amide カラムと比較してください。理論段数は次のように計算されます。
裸のシリカ粒子およびリガンド結合シリカ粒子のＳＥＭ画像を図１に示す。2. 裸のシリカ粒子 (A、B) の SEM 画像は、我々のこれまでの研究とは対照的に、これらの粒子は粒子が細長い球形であるか、不規則な対称性を持っていることを示しています。配位子結合シリカ粒子 (C、D) の表面は裸のシリカ粒子の表面より滑らかであり、これはシリカ粒子の表面にポリスチレン鎖がコーティングされているためと考えられます。
裸のシリカ粒子 (A、B) とリガンド結合したシリカ粒子 (C、D) の走査型電子顕微鏡画像。
裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の粒径分布を図 3(A) に示します。体積ベースの粒径分布曲線は、化学修飾後にシリカ粒子のサイズが増加したことを示しました (図 3A)。今回の研究と以前の研究からのシリカ粒子の粒径分布データを表 1(A) に比較します。PMP の体積ベースの粒径 d(0.5) は、ad(0.5) を使用した前回の研究と比較して 3.36 μm です。 ) 値 3.05 μm (ポリスチレン結合シリカ粒子)34。このバッチは、反応混合物中の PEG、尿素、TMOS、および酢酸の比率が異なるため、以前の研究と比較して狭い粒径分布を持っていました。PMP 相の粒径は、以前に研究したポリスチレン結合シリカ粒子相の粒子サイズよりわずかに大きいです。これは、スチレンによるシリカ粒子の表面官能化によってポリスチレン層のみが堆積したことを意味します (シリカ表面では層の厚さは 0.97 μm) でしたが、PMP 段階では層の厚さは 1.38 μm でした。
裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の粒径分布 (A) と細孔径分布 (B)。
現在の研究のシリカ粒子の細孔サイズ、細孔容積および表面積を表 1(B) に示します。裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の PSD プロファイルを図 3(B) に示します。結果は以前の研究と比較できます。裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の細孔サイズはそれぞれ 310 と 241 であり、表 1(B) に示すように、化学修飾後に細孔サイズが 69 小さくなることがわかります。 ）、曲線の変化を図3（B）に示します。同様に、化学修飾後のシリカ粒子の細孔容積は0.67から0.58 cm3/gに減少しました。現在研究されているシリカ粒子の比表面積は116 m2/gであり、これは以前の研究（124 m2/g）に匹敵します。表1（B）に示すように、シリカ粒子の表面積（m2/g）も11から減少しました。化学修飾後は 6 m2/g ～ 105 m2/g。
固定相の元素分析の結果を表 2 に示します。現在の固定相の炭素負荷は 6.35% であり、これは以前の研究 (ポリスチレン結合シリカ粒子、それぞれ 7.93%35 および 10.21%) の炭素負荷よりも低いです。イミド-メチルビニルイソシアネート (PCMP) と 4-ヒドロキシ-TEMPO を使用しました。現在の固定相の窒素重量パーセントは、以前の研究ではそれぞれ 0.1735 と 0.85 重量パーセントであったのに対し、2.21% です。これは、フェニルマレイミドにより現在の固定相の窒素重量パーセントがより高いことを意味します。同様に、製品 (4) と (5) の炭素負荷は 2.7% と 2 でした。表 2 に示すように、最終生成物 (6) の炭素負荷は 6.35% でした。重量損失は PMP 固定相でチェックし、TGA 曲線を図 4 に示します。TGA 曲線は 8.6% の重量損失を示し、配位子には C だけでなく N、O、および H も含まれているため、炭素負荷 (6.35%) とよく一致しています。
フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート配位子は、極性のフェニルマレイミド基とビニルイソシアネート基を持っているため、シリカ粒子の表面修飾に選択されました。ビニルイソシアネート基は、リビングラジカル重合によってさらにスチレンと反応することができます。2番目の理由は、検体と適度な相互作用を持ち、フェニルマレイミド部分は通常のpHでは仮想電荷を持たないため、検体と固定相の間に強い静電相互作用がない基を挿入するためです。極性固定相の性質は、スチレンの最適量とフリーラジカル重合の反応時間によって制御できます。反応の最後のステップ (フリーラジカル重合) は重要であり、固定相の極性を変えることができます。これらの固定相の炭素負荷を確認するために元素分析を実行しました。スチレンの量と反応時間を増やすと固定相の炭素負荷が増加し、その逆も同様であることが観察されました。異なる濃度のスチレンで調製された SP は異なる炭素負荷を持ちます。再度、これらの固定相をステンレス鋼カラムにロードし、そのクロマトグラフィー性能 (選択性、分離能、N 値など) を確認します。これらの実験に基づいて、制御された極性と良好な分析物の保持を確保するために PMP 固定相を調製するための最適化された配合が選択されました。
5 つのペプチド混合物 (Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシン エンケファリン) も、移動相を使用する PMP カラムを使用して評価されました。60/40 (v/v) アセトニトリル/水 (0.1% TFA)、流速 80 μL/min。最適な溶出条件下では、カラム (100 × 1.8 mm id) あたりの理論段数 (N) は 20,000 ± 100 (200,000 プレート/m²) です。表 3 に 3 つの PMP カラムの N 値とクロマトグラムを示します。図 5A では、高流速 (700 μL/分) での PMP カラムでの高速分析、1 分以内に 5 つのペプチドが溶出されました、N 値は非常に良好で、カラム (100 × 1.8 mm id) あたり 13,500 ± 330、135,000 プレート/m に相当します (図 5B)。3 つの同じサイズのカラム (100 × 1.8 mm id) を使用しました。各カラムの分析対象物濃度は、各カラムで同じテスト混合物を分離するための最適な溶出条件、理論段数 N および保持時間を使用して記録されました。PMP カラムの再現性データを表 4 に示します。表 3 に示すように、PMP カラムの再現性は非常に低い %RSD 値とよく相関しています。
PMP カラム (B) および Ascentis Express RP-Amide カラム (A) でのペプチド混合物の分離。移動相 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)、PMP カラム寸法 (100 × 1.8 mm id);分析化合物の溶出順序: 1 (Gly-Tyr)、2 (Gly-Leu-Tyr)、3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)、4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)、および 5 (ロイシン) 酸エンケファリン)。
PMP カラム (100 × 1.8 mm id) を、高速液体クロマトグラフィーにおけるヒト血清アルブミンのトリプシン消化物の分離について評価しました。図 6 のクロマトグラムは、サンプルが十分に分離され、分離能が非常に優れていることを示しています。HSA 消化物は、流速 100 µL/min、移動相 70/30 アセトニトリル/水および 0.1% TFA を使用して分析されました。クロマトグラムに示すように (図 6) 、HSA 消化は、17 のペプチドに対応する 17 のピークに分割されています。HSA 消化の各ピークの分離効率を計算し、その値を表 5 に示します。
HSA のトリプシン消化物 (内径 100 × 1.8 mm) を PMP カラムで分離しました。流速（100 μL/分）、移動相 60/40 アセトニトリル/水（0.1% TFA 含む）。
ここで、L はカラムの長さ、η は移動相の粘度、ΔP はカラムの背圧、u は移動相の線速度です。PMP カラムの透過性は 2.5 × 10-14 m2、流速は 25 μL/min、60/40 v/v ACN/水が使用されました。PMP カラム (100 × 1.8 mm id) の透過性は、表面多孔質粒子を充填したカラムの透過率は、1.3 μm 粒子の場合は 1.7 × 10-15、1.7 μm 粒子の場合は 3.1 × 10-15、2.6 μm 粒子の場合は 5.2 × 10-15 および 2.5 × 10-14 m2、5 μm 粒子の場合は 43 です。したがって、PM の透過率はP 相は 5 μm のコアシェル粒子の相と同様です。
ここで、Wx はクロロホルムが充填されたカラムの重量、Wy はメタノールが充填されたカラムの重量、ρ は溶媒の密度です。メタノール (ρ = 0.7866) とクロロホルム (ρ = 1.484) の密度。以前に調査した SILICA PARTICLES-C18 カラム (100 × 1.8 mm id) 34 と C18-尿素カラム 31 の総気孔率は、それぞれ0.63と0.55でした。これは、尿素リガンドの存在によって固定相の透過性が低下することを意味します。一方、PMPカラム（内径100×1.8mm）の全気孔率は0.60です。PMPカラムの透過性は、C18結合シリカ粒子が充填されたカラムよりも低くなります。これは、C18タイプの固定相では、C18リガンドがシリカ粒子に結合しているためです。ポリスチレンタイプの固定相では、その周りに比較的厚いポリマー層が形成されます。典型的な実験では、カラムの空隙率は次のように計算されます。
図 7A、B は、同じ溶出条件 (つまり、60/40 ACN/H2O および 0.1% TFA) を使用した PMP カラム (100 × 1.8 mm id) と Ascentis Express RP-Amide カラム (100 × 1.8 mm id) を示しています。) のファン ディームター プロット。選択したペプチド混合物 (Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシン エンケファリン) を 20 μL で調製しました。両方のカラムの最小流量は 800 μL/分です。PMP カラムと Ascentis の最適流量 (80 μL/分) での最小 HETP 値Express RP-Amide カラムはそれぞれ 2.6 μm と 3.9 μm でした。HETP 値は、PMP カラム (100 × 1.8 mm id) の分離効率が市販の Ascentis Express RP-Amide カラム (100 × 1.8 mm id) よりもはるかに優れていることを示しています。図 7(A) の van Deemter プロットは、流量の増加に伴う N 値の減少が以前の研究と比較して有意ではないことを示しています。 Ascentis Express RP-Amide カラムと比較して PMP カラム (100 × 1.8 mm id) の高い分離効率は、現在の研究で使用されている粒子の形状、サイズ、および複雑なカラム充填手順の改善に基づいています。
(A) 0.1% TFA を含む 60/40 ACN/H2O 中で PMP カラム (100 × 1.8 mm id) を使用して得られた van Deemter プロット (HETP 対移動相の線速度)。(B) 0.1% TFA を含む 60/40 ACN/H2O 中で Ascentis Express RP-Amide カラム (100 × 1.8 mm id) を使用して得られた van Deemter プロット (HETP 対 移動相の線速度) .1% TFA。
極性包埋ポリスチレン固定相を調製し、高速液体クロマトグラフィーにおける合成ペプチド混合物とヒト血清アルブミン (HAS) のトリプシン消化物の分離について評価しました。ペプチド混合物に対する PMP カラムのクロマトグラフィー性能は、分離効率と分離能の点で優れています。PMP カラムの分離性能の向上は、シリカ粒子の粒子サイズと細孔サイズ、固定相の合成制御、複雑なカラム充填などのさまざまな理由によるものです。高い分離効率、高流量での低いカラム背圧もこの固定相の利点です。PMP カラムは良好な再現性を示し、ペプチド混合物の分析やさまざまなタンパク質のトリプシン消化に使用できます。私たちはこのカラムを、液体クロマトグラフィーによる天然物、薬用植物からの生理活性化合物、菌類抽出物の分離に使用する予定です。将来的には、PMP カラムはタンパク質とモノクローナル抗体の分離でも評価される予定です。
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