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ゾルゲル法に若干の改良を加えて多孔質シリカ粒子を調製し、広孔径粒子を得た。これらの粒子を、逆連鎖移動開裂（RAFT）重合によりN-フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート（PMI）およびスチレンで誘導体化し、N-フェニルマレイミド挿入ポリアミドを製造した。固定相はスチレン（PMP）。細孔径ステンレス鋼カラム（内径100×1.8 mm）にスラリー充填剤を充填した。PMPカラムのクロマトグラフィー性能を評価し、5種類のペプチド（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Leuアミノ酸エンケファリン）からなる合成ペプチドとヒト血清アルブミン（HAS）のトリプシン加水分解物の混合物を分離した。最適な溶出条件下では、ペプチド混合物の理論段数は280,000段/平方メートルに達しました。開発したカラムと市販のAscentis Express RP-Amideカラムの分離性能を比較したところ、分離効率と分解能の点でPMPカラムの分離効率が市販カラムよりも優れていることが確認されました。
バイオ医薬品産業は、近年市場シェアが大幅に増加し、世界的に拡大する市場となっています。バイオ医薬品産業の爆発的な成長1,2,3に伴い、ペプチドおよびタンパク質分析の需要が高まっています。ペプチド合成時には、目的のペプチドに加えて様々な不純物が形成されるため、所望の純度のペプチドを得るにはクロマトグラフィーによる精製が必要です。体液、組織、細胞中のタンパク質の分析と特性評価は、単一サンプル中に検出可能な種が多数存在するため、非常に困難な作業です。質量分析法はペプチドやタンパク質の配列決定に効果的なツールですが、このようなサンプルを質量分析計に直接導入すると、分離が不十分になります。この問題は、質量分析の前に液体クロマトグラフィー（LC）を実施することで解決できます。これにより、一定時間内に質量分析計に入る分析対象物質の量を減らすことができます4,5,6。さらに、液相分離により分析対象物質が狭い領域に集中するため、これらの分析対象物質が濃縮され、MS検出の感度が向上します。液体クロマトグラフィー（LC）は過去10年間で大きく進歩し、プロテオーム解析において広く用いられる手法となっています7,8,9,10。
逆相液体クロマトグラフィー（RP-LC）は、オクタデシル修飾シリカ（ODS）を固定相として用いてペプチドの混合物を精製・分離するために広く用いられている11,12,13。しかし、その複雑な構造と両性の性質のため14,15、RP固定相ではペプチドとタンパク質を十分に分離することができない。そのため、極性および非極性フラグメントを含むペプチドとタンパク質の分析には、これらの分析対象物と相互作用して保持するために特別に設計された固定相が必要である16。多様な相互作用を提供する混合クロマトグラフィーは、ペプチド、タンパク質、その他の複雑な混合物を分離するためのRP-LCの代替となり得る。いくつかの混合型固定相が調製され、これらの固定相を充填したカラムがペプチドとタンパク質の分離に用いられた17,18,19,20,21。極性基と非極性基の存在により、混合モード固定相（WAX / RPLC、HILIC / RPLC、極性インターカレーション/ RPLC）は、ペプチドとタンパク質の分離に適しています22,23,24,25,26,27,28。共有結合した極性基を持つ極性インターカレーション固定相は、分析対象物と固定相との相互作用に依存するため、極性および非極性分析対象物に対して優れた分離能力と独自の選択性を示しますマルチモーダル相互作用29,30,31,32。最近、Zhang et al。30は、ポリアミンのベヘニル末端固定相を取得し、炭化水素、抗うつ薬、フラボノイド、ヌクレオシド、エストロゲン、およびその他の分析対象物を正常に分離しました。極性埋め込み固定物質は極性基と非極性基の両方を持っているため、ペプチドとタンパク質を疎水性部分と親水性部分に分離するために使用できます。極性インラインカラム（例：アミドがインラインに組み込まれた C18 カラム）は Ascentis Express RP-Amide カラムという商品名で入手可能ですが、これらのカラムはアミン 33 の分析にのみ使用されています。
本研究では、極性包埋固定相（N-フェニルマレイミド、包埋ポリスチレン）を調製し、ペプチド分離およびトリプシンHSA分解におけるその有効性を評価しました。固定相の調製には、以下の戦略を用いました。多孔質シリカ粒子は、以前の発表文献に記載されている手順に従い、調製スキーム31、34、35、36、37、38、39に若干の変更を加えて調製しました。尿素、ポリエチレングリコール（PEG）、TMOS、および水性酢酸の比率を調整することで、大きな細孔径を持つシリカ粒子を得ました。次に、新規フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネートリガンドを合成し、その誘導体化シリカ粒子を用いて極性包埋固定相を調製しました。得られた固定相は、最適化された充填方法に従ってステンレス鋼カラム（内径100 × 1.8 mm）に充填しました。カラム充填は、カラム内の均一な層を確保するために機械的振動によって促進されました。充填カラムを用いて、5種類のペプチド（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリンペプチド）とヒト血清アルブミン（HSA）のトリプシン加水分解物からなるペプチド混合物の分離を評価しました。ペプチド混合物とHSAトリプシン消化物は、良好な分解能と効率で分離することが確認されました。PMPカラムの分離効率をAscentis Express RP-Amideカラムの分離効率と比較しました。ペプチドとタンパク質はPMPカラム上で良好な分解能と高い分離効率を示し、PMPカラムの分離効率はAscentis Express RP-Amideカラムよりも高いことが確認されました。
PEG（ポリエチレングリコール）、尿素、酢酸、トリメトキシオルトシリケート（TMOS）、トリメチルクロロシラン（TMCS）、トリプシン、ヒト血清アルブミン（HSA）、塩化アンモニウム、尿素、ヘキサメチルメタクリロイルジシラザン（HMDS）、メタクリロイルクロリド（MC）、スチレン、4-ヒドロキシ-TEMPO、過酸化ベンゾイル（BPO）、HPLC用アセトニトリル（ACN）、メタノール、2-プロパノール、アセトン。シグマアルドリッチ社（米国ミズーリ州セントルイス）。
尿素（8g）、ポリエチレングリコール（8g）、および0.01N酢酸8mlの混合物を10分間撹拌し、氷冷下でTMOS 24mlを加えた。反応混合物をステンレス製オートクレーブで40℃で6時間、続いて120℃で8時間加熱した。水をデカンテーションし、残留物を70℃で12時間乾燥させた。乾燥した軟質ブロックを滑らかに粉砕し、オーブンで550℃で12時間焼成した。粒子サイズ、細孔径、および表面積の再現性を試験するため、3バッチを調製し、特性を評価した。
ポリスチレン鎖の極性基と固定相。調製手順は以下のとおりです。
N-フェニルマレイミド（200 mg）とメチルビニルイソシアネート（100 mg）を無水トルエンに溶解し、2,2'-アゾイソブチロニトリル（AIBN）0.1 mlを反応フラスコに加えて、フェニルマレイミドとメチルビニルイソシアネートの共重合体（PMCP）を得た。）混合物を60℃で3時間加熱し、濾過し、オーブンで40℃で3時間乾燥させた。
乾燥したシリカ粒子（2g）を乾燥トルエン（100ml）に分散させ、500ml丸底フラスコ中で10分間撹拌および超音波処理した。PMCP（10mg）をトルエンに溶解し、滴下漏斗を用いて反応フラスコに滴下した。混合物を100℃で8時間還流し、濾過し、アセトンで洗浄し、60℃で3時間乾燥させた。次に、PMCPと会合したシリカ粒子（100g）をトルエン（200ml）に溶解し、触媒としてジブチルスズジラウレート100μlの存在下で4-ヒドロキシ-TEMPO（2ml）を添加した。混合物を50℃で8時間撹拌し、濾過し、50℃で3時間乾燥させた。
スチレン（1 ml）、過酸化ベンゾイル（BPO）（0.5 ml）、およびTEMPO-PMCP（1.5 g）に結合したシリカ粒子をトルエンに分散させ、窒素置換した。スチレンの重合は100℃で12時間行った。得られた生成物はメタノールで洗浄し、60℃で一晩乾燥させた。反応の概略図を図1に示す。
サンプルは、残留圧力が 10–3 Torr 未満になるまで 393 K で 1 時間脱ガスされました。相対圧力 P/P0 = 0.99 で吸着された N2 の量を使用して、全細孔容積を決定しました。純粋およびリガンド結合シリカ粒子の形態は、走査型電子顕微鏡 (日立ハイテクノロジーズ、東京、日本) を使用して検査されました。乾燥サンプル (純粋シリカおよびリガンド結合シリカ粒子) は、カーボンテープを使用してアルミニウム棒上に配置しました。Q150T スパッタリング装置を使用してサンプル上に金が蒸着され、厚さ 5 nm の Au 層がサンプル上に蒸着されました。これにより、低電圧プロセスの効率が向上し、微細コールドスプレーが可能になります。元素分析は、Thermo Electron (Waltham、MA、USA) Flash EA1112 元素組成分析装置を使用して実施しましたコーティングされていないシリカ粒子およびリガンド結合シリカ粒子（各5mg）を5mlのイソプロパノールに分散させ、10分間超音波処理した後、5分間撹拌し、マスターサイザー光学ベンチに設置した。熱重量分析は、30～800℃の温度範囲で毎分5℃の速度で行った。
寸法（ID 100 × 1.8 mm）のガラス繊維ライニング狭口径ステンレス鋼カラムを、文献31と同じ手順に従ってスラリー充填法で充填した。ステンレス鋼カラム（ガラスライニング、ID 100 × 1.8 mm）および1 µmフリットを含む出口をスラリー包装機（Alltech Deerfield、イリノイ州、米国）に接続した。固定相150 mgをメタノール1.2 mlに懸濁し、リザーバーカラムに供給して固定相懸濁液を調製した。メタノールは、スラリー溶媒およびコントロール溶媒として使用した。100 MPで10分間、80 MPで15分間、および60 MPで30分間の圧力シーケンスを適用してカラムを充填した。充填プロセスでは、機械振動用にガスクロマトグラフィーカラムバイブレーター（Alltech、Deerfield、イリノイ州、米国）を2つ使用して、均一なカラム充填を確保した。カラムをスラリーノズルから取り外し、別のフィッティングを入口に取り付けて LC システムに接続し、動作をテストしました。
カスタムMLCは、LCポンプ（10AD Shimadzu、日本）、50 nL注入ループ付きサンプラー（Valco（米国）C14 W.05）、膜脱ガッサー（Shimadzu DGU-14A）、およびUV-VISキャピラリーウィンドウを使用して構築されました。検出器デバイス（UV-2075）とエナメルマイクロカラム。追加のカラム膨張の影響を最小限に抑えるため、非常に細く短い接続チューブを使用してください。カラムを充填した後、1/16インチ還元接合部の出口にキャピラリー（内径50 µm 365）を取り付け、還元接合部のキャピラリー（50 µm）を取り付けます。データ収集とクロマトグラム処理は、Multichro 2000ソフトウェアを使用して実行されます。254 nmで、対象の分析物のUV吸光度を0でモニターしました。クロマトグラフィーデータは、OriginPro8（マサチューセッツ州ノーサンプトン）を使用して分析しました。
ヒト血清アルブミン（凍結乾燥粉末、アガロースゲル電気泳動による純度96%以上）3mgをトリプシン1.5mg、4.0M尿素1ml、0.2M重炭酸アンモニウム1mlと混合した。溶液を10分間撹拌し、37℃のウォーターバス中で6時間保温した後、0.1% TFA 1mlでクエンチした。溶液を濾過し、4℃以下で保存する。
PMPカラムを用いたペプチドとトリプシン消化物HSAの混合物の分離を別途評価しました。PMPカラムで分離したペプチドとHSAの混合物のトリプシン加水分解を確認し、Ascentis Express RP-Amideカラムの結果と比較しました。理論段数は以下の式で計算されます。
図2に、純粋シリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子のSEM像を示す。純粋シリカ粒子（A、B）のSEM像は、これまでの研究と比較して、粒子が細長く、不規則な対称性を示す球状を示している。リガンド結合シリカ粒子（C、D）の表面は純粋シリカ粒子よりも滑らかであり、これはシリカ粒子表面を覆うポリスチレン鎖によるものと考えられる。
純粋なシリカ粒子 (A、B) とリガンド結合シリカ粒子 (C、D) の走査型電子顕微鏡写真。
純粋シリカ粒子およびリガンド結合シリカ粒子の粒度分布を図 2.3(A) に示します。体積粒度分布曲線は、化学修飾後にシリカ粒子サイズが増加したことを示していました (図 3A)。現在の研究と以前の研究からのシリカ粒度分布データを表 1(A) に比較します。PMP の体積粒子径 d(0.5) は 3.36 µm で、以前の研究 (ポリスチレン結合シリカ粒子)34 の ad(0.5) 値 3.05 µm と比較します。反応混合物中の PEG、尿素、TMOS、および酢酸の比率の変化により、このバッチの粒度分布は以前の研究と比較して狭くなりました。PMP 相の粒子サイズは、以前に研究したポリスチレン結合シリカ粒子相の粒子サイズよりもわずかに大きくなっています。これは、スチレンによるシリカ粒子の表面機能化により、シリカ表面にポリスチレン層 (0.97 µm) のみが堆積され、PMP 相では層の厚さが 1.38 µm であったことを意味します。
純粋シリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の粒度分布 (A) と細孔径分布 (B)。
本研究で使用したシリカ粒子の細孔径、細孔容積および表面積を表1（B）に示す。純粋シリカ粒子およびリガンド結合シリカ粒子のPSDプロファイルを図3（B）に示します。この結果は、前回の研究34と比較可能でした。純粋およびリガンド結合シリカ粒子の細孔径はそれぞれ310Åと241Åであり、表1（B）に示すように、化学修飾後に細孔径が69Å減少したことを示しています。シフト曲線を図に示します。本研究のシリカ粒子の比表面積は116 m2 / gで、これは前回の研究（124 m2 / g）と同等です。表1（B）に示すように、化学修飾後のシリカ粒子の表面積（m2 / g）も116 m2 / gから105 m2 / gに減少しました。
固定相の元素分析の結果を表 2 に示す。現在の固定相の炭素含有量は 6.35% で、前回の研究 (ポリスチレンと結合したシリカ粒子、それぞれ 7.93%35 および 10.21%) 42 よりも低い。SP の調製では、スチレンに加えて、フェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート (PCMP) や 4-ヒドロキシ-TEMPO などの極性リガンドが使用されているため、現在の固定相の炭素含有量は以下に示すとおりである。現在の固定相中の窒素の重量パーセンテージは、前回の研究 0.1735 および 0.85% と比較して 2.21% である42。これは、フェニルマレイミドのために、現在の固定相では窒素の重量パーセンテージが高いことを意味します。同様に、生成物（4）と（5）の炭素含有量はそれぞれ2.7％と2.9％であるが、最終生成物（6）の炭素含有量は表2に示すように6.35％である。 PMPの固定相に対して熱重量分析（TGA）を使用して重量減少を試験し、TGA曲線を図4に示す。 TGA曲線は8.6％の重量減少を示しており、これは炭素含有量（6.35％）とよく一致する。これは、配位子にCだけでなく、N、O、およびHも含まれているからである。
シリカ粒子の表面修飾には、極性フェニルマレイミド基とビニルイソシアネート基を有する配位子フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネートが選択されました。ビニルイソシアネート基は、リビングラジカル重合によってスチレンとさらに反応することができます。2つ目の理由は、フェニルマレイミド基は通常のpHでは仮想電荷を持たないため、分析対象物と適度に相互作用し、分析対象物と固定相との間に強い静電相互作用を及ぼさない基を挿入するためです。固定相の極性は、最適なスチレン量とフリーラジカル重合の反応時間によって制御できます。反応の最終段階（フリーラジカル重合）は、固定相の極性を変化させるため非常に重要です。これらの固定相中の炭素含有量を確認するために、元素分析を実施しました。スチレン量と反応時間の増加は固定相の炭素含有量を増加させ、逆もまた同様であることが観察されています。異なるスチレン濃度で調製したSPは、炭素負荷量が異なります。同様に、これらの固定相をステンレス製カラムに装着し、クロマトグラフィー特性（選択性、分離能、N値など）を確認しました。これらの実験に基づき、極性を制御し、分析対象物質の良好な保持を実現するために、PMP固定相の調製に最適な組成が選択されました。
PMPカラムは、移動相の容量を使用して、5種類のペプチド混合物（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン）の分析でも評価されました。 60/40（v/v）ACN/水（0.1％TFA）、流速80µl/分。最適な溶出条件（200,000段/ m）では、カラム（100×1.8mm）あたりの理論段数（N）は20,000±100です。 3つのPMPカラムのN値を表3に示し、クロマトグラムを図5Aに示します。 PMPカラムでの高流量（700µl/分）での高速分析、1分以内に5つのペプチドが溶出、カラム（100 x 1.8mm径）あたり13,500±330という優れたN値、つまり135,000段/mに相当（図5B）。同じサイズ（内径100 x 1.8mm）のカラム3本に、異なるバッチのPMP固定相を充填し、再現性をテストしました。最適な溶出条件、理論段数N、および保持時間を使用して、各カラムで同じテスト混合物を分離することにより、各カラムの分析対象物を記録しました。PMPカラムの再現性データを表4に示します。表3に示すように、PMPカラムの再現性は非常に低い％RSD値とよく相関していました。
PMP カラム (B) と Ascentis Express RP-Amide カラム (A) によるペプチド混合物の分離、移動相 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)、PMP カラム寸法 (100 x 1.8 mm id)、分析化合物の溶出順序: 1 (Gly-Tyr)、2 (Gly-Leu-Tyr)、3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)、4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) および 5 (ロイシン酸エンケファリン)。
PMPカラム（内径100 x 1.8 mm）を用いて、ヒト血清アルブミンのトリプシン加水分解物のHPLC分離を評価した。図6のクロマトグラムは、サンプルが非常に良好な分離能で良好に分離されていることを示す。HSA溶液は、流速100 μl/分、移動相としてアセトニトリル/水（70/30）および0.1% TFAを用いて分析した。HSAの分解物は、クロマトグラム（図6）に示すように、17個のペプチドに対応する17個のピークに分割された。HSA加水分解物からの各ピークの分離効率を計算し、その値を表5に示した。
HSA トリプシン加水分解物は、PMP カラム (内径 100 x 1.8 mm)、流量 (100 μl/分)、移動相 60/40 アセトニトリル/水、および 0.1% TFA で分離されました。
ここで、L はカラムの長さ、η は移動相の粘度、ΔP はカラムの背圧、u は移動相の線速度です。 PMP カラムの透過性は 2.5 × 10–14 m2、流量は 25 µl/分、60/40 v/v を使用しました。ACN/水。 PMP カラム (ID 100 × 1.8 mm) の透過性は、以前の文献 34 の研究と同様でした。 表面多孔質粒子を充填したカラムの透過性は 1.7×10 .6 µm、5 µm 粒子の場合は 2.5×10–14 m2 です43。 したがって、PMP 相の透過性は、サイズが 5 μm のコアシェル粒子の透過性と同様です。
ここで、Wx はクロロホルムを充填したカラムの質量、Wy はメタノールを充填したカラムの質量、ρ は溶媒の密度である。メタノールの密度（ρ = 0.7866）とクロロホルムの密度（ρ = 1.484）。シリカ-C18 粒子カラム（内径 100 × 1.8 mm）34 と以前に研究した C18-尿素31 カラムの全多孔度は、それぞれ 0.63 と 0.55 であった。これは、尿素リガンドの存在により固定相の透過性が低下することを意味する。一方、PMP カラム（内径 100 × 1.8 mm）の全多孔度は 0.60 である。 PMP カラムは、C18 結合シリカ粒子を充填したカラムよりも透過性が低くなります。これは、C18 タイプの固定相では C18 リガンドがシリカ粒子に線状鎖で結合しているのに対し、ポリスチレン タイプの固定相では粒子の周囲に比較的厚いポリマーが形成されるためです。層 A。一般的な実験では、カラムの多孔度は次のように計算されます。
図7A、Bは、PMPカラム（内径100 x 1.8 mm）とAscentis Express RP-Amideカラム（内径100 x 1.8 mm）のVan Deemterプロットを、両カラムとも60/40 ACN/H2Oおよび0.1% TFA、20 µl/分～800 µl/分で示しています。最適流量（80 µl/分）での最小HETP値は、PMPカラムで2.6 µm、Ascentis Express RP-Amideカラムで3.9 µmでした。HETP値は、PMPカラム（内径100 x 1.8 mm）の分離効率が市販のAscentis Express RP-Amideカラム（内径100 x 1.8 mm）よりもはるかに高いことを示しています。図7(A)のvan Deemterグラフは、流量の増加に伴うN値の減少が、前回研究と比較してそれほど大きくないことを示しています。PMPカラム（内径100×1.8 mm）がAscentis Express RP-Amideカラムと比較して高い分離効率を示したのは、本研究で採用されている改良された粒子形状とサイズ、そして洗練されたカラム充填手順によるものです34。
(A) PMP カラム (内径 100 x 1.8 mm) で 60/40 ACN/H2O および 0.1% TFA 中で得られた Van Deemter プロット (HETP 対移動相線速度)。 (B) Ascentis Express RP-Amide カラム (内径 100 x 1.8 mm) で 60/40 ACN/H2O および 0.1% TFA 中で得られた Van Deemter プロット (HETP 対移動相線速度)。
インターカレートされたポリスチレンを極性固定相として調製し、高速液体クロマトグラフィーにおける合成ペプチドとヒト血清アルブミン（HSA）のトリプシン加水分解物の分離について評価しました。ペプチド混合物に対するPMPカラムのクロマトグラフィー性能は、分離効率と分解能の点で優れています。PMPカラムの分離効率の向上は、シリカ粒子径と細孔径、固定相の合成制御、複雑なカラム充填材など、いくつかの理由によるものです。高い分離効率に加えて、この固定相のもう一つの利点は、高流量でのカラム背圧が低いことです。PMPカラムは再現性が高く、ペプチド混合物や様々なタンパク質のトリプシン消化物の分析に使用できます。私たちは、このカラムを液体クロマトグラフィーにおける天然物、薬用植物、キノコの抽出物からの生理活性化合物の分離に使用する予定です。将来的には、タンパク質やモノクローナル抗体の分離についてもPMPカラムを評価する予定です。
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