Nature.com をご覧いただきありがとうございます。使用しているブラウザのバージョンでは、CSS サポートが制限されています。最高のエクスペリエンスを実現するには、更新されたブラウザを使用することをお勧めします (または Internet Explorer の互換モードを無効にする)。それまでの間、継続的なサポートを確保するために、サイトはスタイルと JavaScript なしでレンダリングされます。
アングスティフォリウス・ルピナス（NLL、Lupinus angustifolius L.）は、食糧生産や土壌改良に使用されるマメ科の植物です。作物としての NLL の世界的な拡大により、壊滅的な炭疽病を引き起こすルピナス炭疽病を含む多くの病原性真菌が引き寄せられています。耐性の増加を与える 2 つの対立遺伝子、Lanr1 と AnMan が NLL 育種に使用されていますが、根底にある分子機構は依然として不明です。この研究では、Lanr1 マーカーと AnMan マーカーを使用してヨーロッパの NLL サンプルをスクリーニングしました。制御された環境でのワクチンのテストにより、両方の耐性ドナーの有効性が確認されました。示差的遺伝子発現プロファイリングを、代表的な耐性株および感受性株に対して実施した。炭疽病耐性は、遺伝子オントロジー用語「GO:0006952 防御反応」、「GO:0055114 酸化還元プロセス」、および「GO:0015979 光合成」の過剰発現と関連していました。さらに、Lanr1(83A:476) 株は接種後急速に顕著なトランスクリプトーム再プログラミングを示しましたが、他の株はこの応答に約 42 時間の遅延を示しました。防御反応は、TIR-NBS、CC-NBS-LRR、NBS-LRR 遺伝子、病因に関与する 10 種類のタンパク質、脂質輸送タンパク質、エンドグルカン-1,3-β-グルコシダーゼ、グリシン豊富な細胞壁タンパク質、および酸素の反応経路の遺伝子と関連しています。光合成に関連する遺伝子の慎重な抑制を含む、83A:476 に対する初期の反応は、真菌生物学の栄養増殖期における保護の成功と一致しており、エフェクターが免疫を誘発することを示唆しています。全体的な水平抗力と同様に、マンデループの反応が遅くなります。
狭葉ルピナス (NLL、Lupinus angustifolius L.) は、地中海西部地域が原産の高タンパク質の穀物です 1,2。現在では動物や人間の食用作物として栽培されています。また、共生窒素固定細菌による窒素固定と土壌構造全体の改善により、輪作システムにおける緑肥とも考えられています。NLL は前世紀に急速な家畜化の過程を経ており、依然として高い繁殖圧力にさらされています 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。NLL の広範な栽培に伴い、次々と病原菌が新たな農業ニッチを開発し、新たな作物を破壊する病気を引き起こしました。 ルピナス栽培農家や育種家にとって最も注目すべきは、病原性真菌であるColletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagesorn13によって引き起こされる炭疽病の出現でした。 ルピナス栽培農家や育種家にとって最も注目すべきは、病原性真菌であるColletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagesorn13によって引き起こされる炭疽病の出現でした。 Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler、Hagesorn13. ルピナス栽培農家や育種家にとって最も注目に値したのは、病原性真菌コレトトリクム・ルピニ (ボンダール) ニーレンバーグ、フェイラー、ハーゲドルン 13 によって引き起こされる炭疽病の出現でした。羽扇豆類およびハゲドーンに関して最も注目すべきは、病原菌コレトトリクム・ルピニ（ボンダール）・ニーレンバーグ、フェイラーおよびハーゲドーンによって引き起こされる炭疽病の発生である13。羽扇豆類およびハイヤードに関して最も注目されるのは、病原菌コレトトリクム・ルピニ（ボンダール）による炭疽病の発生である。 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным гриб ком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler & Hagesorn13. ルピナス栽培農家や育種家にとって最も衝撃的なのは、病原性真菌であるColletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagesorn13によって引き起こされる炭疽病の出現です。この病気に関する最初の報告はブラジルと米国から行われ、それぞれ 1912 年と 1929 年に典型的な症状が現れました。しかし、約 30 年後、この病原体は Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz と指定されました。 & 嚢、テレオモルフ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & 嚢、テレオモルフ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld のテレオモルフ。 & Sacc.、目的の形の Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、目的の形の Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии。 & 嚢、標的形態学における Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & H. シュレンク、 & H. シュレンク、とH.シュレンク。 & H.エピック、。 & H.エピック、。および H. シュレンク、20世紀半ばに行われた予備的な病気の表現型検査では、NLLおよび黄色ルピナス（L. luteus L.）系統ではある程度の耐性が示されましたが、試験されたすべての白色ルピナス（L. albus L.）系統は非常に感受性が高かった15,16。研究によると、炭疽病の発症は降水量（空気湿度）と温度（12～28℃の範囲）の増加に関連しており、高温では耐性の違反につながることが示されています17、18。実際、分生子が発芽して病気が始まるまでに必要な時間は、高湿度条件下では12℃（16時間）よりも24℃（4時間）の方が4倍短かった19。このように、進行中の地球温暖化は炭疽病の蔓延を引き起こしています。しかし、この病気は差し迫った脅威の前兆としてフランス (1982 年) とウクライナ (1983 年) で観察されましたが、当時のルピナス業界では明らかに無視されていました 20,21。数年後、この壊滅的な病気は世界中に広がり、オーストラリア、ポーランド、ドイツなどの主要なルピナス生産国にも影響を及ぼしました22、23、24。1990 年代半ばに炭疽病が発生した後、大規模なスクリーニングの結果、NLL19 サンプルから数人の耐性ドナーが特定されました。炭疽病に対する NLL 耐性は、異なる生殖源に見出される 2 つの別個の優性対立遺伝子、つまり品種 Tanjil および Wonga の Lanr1 と品種 AnMan によって制御されます。Mandalay 25、26。これらの対立遺伝子は、育種プログラムにおける耐性生殖質の選択をサポートする分子マーカーを補完します 25、26、27、28、29、30。Lanr1 対立遺伝子を持つ耐性育種系統 83A:476 を感受性野生系統 P27255 と交配して、炭疽病耐性について分離する RIL 集団を取得しました。これにより、染色体 NLL-1131、32、33 に Lanr1 遺伝子座を割り当てることが可能になりました。ゲノムフレームワークを使用して、隣接する耐性遺伝子座から炭疽病までの連鎖マップマーカーを整列させると、NLL はすべての遺伝子座の位置を明らかにしました。同じ染色体 (NLL-11) 上に 3 つの対立遺伝子がありますが、位置は異なります 29、34、35。しかし、RIL の数が少なく、マーカーと対応する対立遺伝子間の遺伝的距離が大きいため、その基礎となる遺伝子について信頼できる結論を引き出すことはできません。一方で、ルピナスは再生能力が非常に低いため、逆遺伝学の利用は困難であり、遺伝子操作が煩雑なものとなっている 37 。
83A:476 (Lanr1) やマンデラップ (AnMan) など、ホモ接合状態で目的の対立遺伝子を保持する家畜化された生殖質の開発は、野生集団における対立遺伝子の反対の組み合わせの存在に直面して、炭疽病耐性の研究への扉を開きました。分子機構の可能性。特定の遺伝子型によって生成される防御反応を比較します。この研究では、C. ルピニワクチン接種に対する NLL の初期トランスクリプトーム応答を評価しました。まず、215 系統を含むヨーロッパの NLL 生殖質パネルが、Lanr1 および AnMan 対立遺伝子をマークする分子マーカーを使用してスクリーニングされました。次に、制御された条件下で、分子マーカーとして事前に選択された 50 の NLL 系統に対して炭疽病の表現型解析を実行しました。これらの実験に基づいて、ハイスループット RNA シーケンスとリアルタイム PCR 定量という 2 つの相補的なアプローチを使用した示差防御遺伝子発現プロファイリングのために、炭疽病耐性と Lanr1/AnMan 対立遺伝子構成が異なる 4 系統が選択されました。
マーカー Lanr1 (Anseq3 および Anseq4)、AnMan (Anseq4)、および AnMan (AnManM1) を使用した一連の NLL 生殖質 (N = 215) のスクリーニングでは、1 つの系統 (95726、サラマンカ b 付近) のみがすべてのマーカーについて「耐性」対立遺伝子を増幅することが示されましたが、「「感受性」対立遺伝子の存在」では 158 のすべてのマーカーの割合が見つかりました。 (~73.5%) ライン。13 系統は Lanr1 マーカーの 2 つの「耐性」対立遺伝子を生成し、8 系統は Lanr1 の「耐性」対立遺伝子を生成しました。マーカー。AnMan マーカーの「耐性」対立遺伝子 (補足表 S1)。2 系統は Anseq3 マーカーについてヘテロ接合性であり、1 系統は AnManM1 マーカーについてヘテロ接合性でした。42 系統 (19.5%) が Anseq3 および Anseq4 対立遺伝子の逆相を保有しており、これら 2 つの遺伝子座間の組換え頻度が高いことを示しています。制御された条件下での炭疽病の表現型（補足表S2）は、テストされた遺伝子型の耐性の変動を明らかにし、これは炭疽病の重症度に反映されました。平均スコアの差は 1.8 (中等度抵抗性) から 6.9 (感受性) の範囲であり、植物重量の差は 0.62 (感受性) から 4.45 g (抵抗性) の範囲でした。 実験の 2 つの反復で観察された値の間 (病気の重症度スコアについては 0.51、P = 0.00017、植物重量については 0.61、P < 0.0001)、およびこれら 2 つのパラメーターの間には (-0.59 と - 0.77、P < 0.0001)、有意な相関がありました。 実験の 2 つの反復で観察された値 (病気の重症度スコアについては 0.51、P = 0.00017、植物重量については 0.61、P < 0.0001) の間、およびこれら 2 つのパラメーターの間には (- 0.59 と - 0.77、P < 0.0001)、有意な相関がありました。 Выявлена достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов) тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001)。 実験の 2 回の繰り返しで観察された値の間 (病気の重症度スコアについては 0.51、P = 0.00017、植物重量については 0.61、P < 0.0001)、およびこれら 2 つのパラメーターの間 (-0.59 と -0.77、P < 0.0001)、有意な相関関係が見つかりました。2 回の反復実験で観察された値の間には、関連性 (疾患の重度の分別は 0.51、P = 0.00017、植物は 0.61、P < 0.0001) およびこの 2 つのパラメータの間 (- 0.59 と - 0.77、P < 0.0001)。2 回の反復実験中に観察された値の間には相関性 (疾患の重篤度の認定分数は 0.51 、p = 0.00017、植物は 0.61、p <0.0001) および 2 つのパラメータが存在します。その間（（（- 0.59 および – 0.59 および – 0.59 および – 0.59 および – 0.77、P < 0.0001）。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболева)例 0,51、P = 0,00017 および масса растения 0,61, P <0,0001)、および между этими двумя параметрами (-0,59 および -0,0001) 0,77, P <0,0001。 二重に観察された値（病気の重症度スコア 0.51、P = 0.00017 および植物重量 0.61、P < 0.0001）と、これら 2 つのパラメーター（-0.59 および -0.0001）の間には 0.77、P<0.0001 という有意な相関がありました。 ).感受性のある植物に見られる典型的な症状には、「羊飼いの弓」構造に似た茎のねじれやねじれ、それに続くオレンジ/ピンクのスポロゾイトを伴う楕円形の病変が含まれます（補足図1）。Lanr1 (83A:476 および Tanjil) および AnMan (Mandelup) 遺伝子を保有するオーストラリアのアクセッションは、中程度の耐性 (0.0331 および 0.0036) を示します。「耐性」の Lanr1 および/または AnMan 対立遺伝子も持つ一部の系統では、病気の症状が見られます。
興味深いことに、「耐性」マーカー対立遺伝子を欠くいくつかの NLL 系統では、Boregine (両方のパラメーターの P 値 < 0.0001)、Bojar (スコアの P 値 < 0.0001、植物重量の P 値 < 0.001) および集団 B-549/79b (P 値 < 0.0001) など、高レベルの炭疽病耐性 (Lanr1 または AnMan 遺伝子型と同等またはそれ以上) が明らかになりました。スコアと体重には有意ではありません）。 興味深いことに、「耐性」マーカー対立遺伝子を欠くいくつかの NLL 系統では、Boregine (両方のパラメーターの P 値 < 0.0001)、Bojar (スコアの P 値 < 0.0001、植物重量の P 値 < 0.001) および集団 B-549/79b (P 値 < 0.0001) など、高レベルの炭疽病耐性 (Lanr1 または AnMan 遺伝子型と同等またはそれ以上) が明らかになりました。スコアと体重には有意ではありません）。 Интересно, что несколько линий NLL, лизенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень уст ойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для о) боих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 дл) я оценки и незначимо для массы)。 興味深いことに、「耐性」マーカー対立遺伝子を欠くいくつかの NLL 系統は、炭疽病に対する高レベルの耐性 (Lanr1 または AnMan 遺伝子型と同等またはそれ以上) を示しました。たとえば、Boregine (両方のパラメーターで P 値 < 0.0001)、Bojar (評価の P 値 < 0.0001、植物重量の P 値 < 0.001) および個体群 B-549/79b (P 値 < 0.000) です。評価では 1 であり、重量では重要ではありません）。興味深いことに、Boregine（2 つのパラメータの P 値 < 0.0001）、Bojar（P 値 < 0.0001、植物重量 0 .001）および群B-549/79b（分P値<0.0001が得られ、重量は変化しなかった）。 興味深いのは、Boregine (両方のパラメーター P < 0.0001)、Bojar (P 値 < 0.0001、植物重量 0.001)、および B-549/79b 株 (P 値 < 0.0001、重量は有意ではない) など、「抗原」マーカーを持たない一部の NLL 系が高い水平抵抗性 (Lanr1 または AnMan 遺伝子と同等以上) を示すことです。 Интересно、что некоторые линии NLL、лизенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности»、показали высокие уровни уст ойчивости к антракнозу (сравнимые или выге, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,000) 1)、ボジャール (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна)。 興味深いことに、「耐性」マーカー対立遺伝子を欠くいくつかの NLL 系統は、Boregine (両方のパラメーターの P 値 < 0.0001)、Bojar (P 値 < 0.0001、植物重量 0.001) および個体群 B-549/79b (P 値 < 0.0001、重量は重要ではありません）。この現象は、新たな耐性の遺伝的原因の可能性を示唆しており、マーカー遺伝子型と疾患表現型の間に相関関係が観察されていないことを説明しています（P 値は約 0.42 から約 0.98 まで）。したがって、コルモゴロフ-スミルノフ検定は、炭疽病耐性に関するデータがスコア(P値0.25および0.11)および植物質量(P値0.47および0.55)に関してほぼ正規分布していることを示し、Lanr1およびAnManよりも多くの対立遺伝子が関与しているという仮説を示唆しています。
炭疽菌耐性スクリーニングの結果に基づいて、トランスクリプトーム解析のために 4 系統、83A:476、Boregine、Mandelup、および Population 22660 が選択されました。これらの系統は、前回の試験と同じであることを条件として、RNA 配列決定による接種実験で炭疽菌耐性について再試験されました。スコア値は次のとおりでした:Boregin (1.71 ± 1.39)、83A: 476 (2.09 ± 1.38)、Mandelup (3.82 ± 1.42)、および母集団 22660 (6.11 ± 1.29)。
Illumina NovaSeq 6000 プロトコルは、サンプルあたり平均 40.5 Mread ペア (29.7 ～ 54.4 Mread) を達成しました (補足表 S3)。参照配列のアライメント スコアは 75.5% ～ 88.6% の範囲でした。生物学的複製間の実験バリアント間のリードカウントデータの平均相関は、0.812 ～ 0.997 (平均 0.959) の範囲でした。 分析された 35,170 個の遺伝子のうち、2917 個では発現が見られず、他の 4785 個の遺伝子は無視できるレベルで発現されていました (塩基平均 < 5)。 分析された 35,170 個の遺伝子のうち、2917 個では発現が見られず、他の 4785 個の遺伝子は無視できるレベルで発現されていました (塩基平均 < 5)。 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначи тельном уровне (базовое среднее <5)。 分析された 35,170 個の遺伝子のうち、2917 個は発現を示さず、残りの 4785 個の遺伝子は無視できるレベルで発現されました (塩基平均 <5)。分析された35,170個の遺伝子のうち、2917個は発現がなく、他の4785個の遺伝子の発現はわずかに観察されなかった（基本平均値<5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспресси ю (базовое среднее значение <5)。 分析された 35,170 個の遺伝子のうち、2917 個は発現されず、残りの 4785 個の遺伝子の発現は無視できる程度でした (塩基平均 <5)。したがって、実験中に発現したと考えられる遺伝子の数（基本平均≧5）は27,468（78.1％）でした（補足表S4）。
最初の時点から、すべての NLL 系統はトランスクリプトームを再プログラムすることによって C. ルピニ (Col-08 株) の接種に応答しました (表 1)。しかしながら、系統間で有意な差が観察されました。したがって、耐性株 83A:476 (Lanr1 遺伝子を持つ) は、最初の時点 (6 hpi) で顕著なトランスクリプトーム再プログラミングを示し、この時点で他の時点と比較して単離されたアップ遺伝子およびダウン遺伝子の数が 31 ～ 69 倍増加しました。さらに、2 番目の時点 (12 hpi) では少数の遺伝子の発現のみが大幅に変化したままであるため、このピークは短命でした。興味深いことに、移植試験でも高いレベルの耐性を示したボレジンは、実験中にそのような大規模な転写再プログラミングを受けませんでした。しかし、示差的に発現された遺伝子（DEG）の数は、Boregine と 83A:12 HPI で 476 で同じでした。マンデラップと集団 22660 はどちらも最後の時点 (48 l/s) で DEG ピークを示し、防御反応の相対的な遅れを示しています。
83A:476 は他のすべての系統と比較して 6 HPI で C. ルピニに応答して大規模なトランスクリプトーム再プログラミングを受けたため、この時点で観察された DEG の約 91% は系統特異的でした (図 1)。しかし、Boregine、Mandelup、および集団 22660 のそれぞれ 68.5%、50.9%、および 52.6% DEG は、特定の時点で 83A:476 で見つかったものと重複していたため、研究系統間の初期応答にはある程度の重複がありました。ただし、これらの DEG は、現在 83A:476 を使用して検出されているすべての DEG のほんの一部 (0.97 ～ 1.70%) にすぎません。さらに、この時点では、すべての系統からの11 DEGが一貫していました（補足表S4〜S6）。これには、植物防御応答の共通成分が含まれます：脂質転移タンパク質（TanjilG_32225）、エンドグルカン-1,3-β-グルコシド酵素（TanjilG_23384）、SAM22のよ​​うな2つのストレス誘導性タンパク質（TanjilG_31528およびTanjilG_315） 31)、塩基性ラテックスタンパク質 (TanjilG_32352)、および 2 つのグリシンに富んだ構造細胞壁タンパク質 (TanjilG_19701 および TanjilG_19702)。また、24 HPI での 83A:476 と Boregine の間 (合計 16 ～ 38% DEG)、および 48 HPI での Mandelup と Population 22660 (合計 14 ～ 20% DEG) のトランスクリプトーム応答の重複が比較的高かった。
Colletotrichum lupini (ポーランド、ヴィエルジェニツェのルピナス畑から得られた株 Col-08) を接種した狭葉ルピナス (NLL) 系統における示差的に発現された遺伝子 (DEG) の数を示すベン図。分析された NLL 系統は、83A:476 (耐性、Lanr1 対立遺伝子を持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、Mandelup (中等度の耐性、AnMan 対立遺伝子を持つ)、および集団 22660 (非常に感受性が高い) でした。hpi の略語は、ワクチン接種後の時間を表します。グラフを簡素化するためにゼロ値が削除されています。
6 hpi で過剰発現された遺伝子のセットを、標準的な R 遺伝子ドメインの存在について分析しました (補足表 S7)。この研究により、83A:476 にのみ NBS-LRR ドメインを持つ古典的な病害抵抗性遺伝子のトランスクリプトーム誘導が明らかになりました。このセットは、1 つの TIR-NBS-LRR 遺伝子 (tanjilg_05042)、5 つの CC-NBS-LRR 遺伝子 (tanjilg_06165、tanjilg_06162、tanjilg_22773、tanjilg_22640、および Tanjilg_16162)、および 4 つの NBS-LR、Tanjilg_16162)、および 4 つの NBS- で構成されていました。 LRRE (tanjilg_16162)、Four NBS-Lrr (tanjilg_16162)、および Four NBS-LRR (TANJILG_16162)。これらの遺伝子はすべて、保存された配列で配置された標準ドメインを持っています。NBS-LRR ドメイン遺伝子に加えて、いくつかの RLL キナーゼが 6 hpi で活性化されました。すなわち、Boregine で 1 つ (TanjilG_19877)、Mandelup で 2 つ (TanjilG_07141 および TanjilG_19877)、および集団 22660 (TanjilG_09014 および TanjilG_10361) で 2 つ、および 83A 27 で 2 つです。 476.
C. ルピニ (Col-08 株) の接種に応答して発現が大幅に変化した遺伝子を、ジーン オントロジー (GO) 濃縮分析に供しました (補足表 S8)。 最も頻繁に過剰表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御反応」で、16 (時間×ライン) の組み合わせのうち 6 個に有意性が高く現れました (P 値 < 0.001) (図 2)。 最も頻繁に過剰表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御反応」で、16 (時間×ライン) の組み合わせのうち 6 個に有意性が高く現れました (P 値 < 0.001) (図 2)。 Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который прыл биологического процесса был оявлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2)。 最も頻繁に過剰表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御反応」で、これは 16 個の (時間 × 系統) 組み合わせのうち 6 個に高い有意性を持って出現しました (P 値 < 0.001) (図 2)。最も代表的な生体プロセスは「GO:0006952 防御反応」で、16 個（時間×直線）の組み合わせのうち 6 個に出現し、高い定着性（P 値 < 0.001）を示します（図 2）。 最も代表的な生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御反応」で、16 (時間×線) の組み合わせのうち 6 つに出現し、有意性が高くなります (P 値 < 0.001) (図 2)。 Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2)。 最も頻繁に過剰表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 Defense Response」で、16 の組み合わせ (時間 × ライン) のうち 6 に出現し、有意性が高かった (P 値 < 0.001) (図 2)。この用語は、83A では 476 と Boregine (6 hpi と 24 hpi) の 2 つの時点で、また Mandelup と Population 22660 では 1 つの時点 (それぞれ 12 と 6 hpi) で過剰に表現されました。これは予想された結果であり、耐性株の抗真菌応答を強調しています。さらに、83A:476 は、「GO:0055114 酸化還元プロセス」という用語で表される酸化バーストに関連する遺伝子を迅速に誘導することによって C. ルピニに応答し、特異的な防御応答を示しました。一方、Boregine は、「GO」という用語に関連した特異的な防御応答を明らかにしました。:0006950 ストレス反応」。集団 22660 は二次代謝産物を含む水平抵抗反応を活性化し、過剰な数の用語「GO:0016104 トリテルペン生合成のプロセス」および「GO:0006722 トリテルペン代謝のプロセス」(両方の用語は同じ遺伝子セットに属します) を強調し、GO 用語濃縮分析の結果を考慮すると、マンデラップ反応の安定性はボレジンと集団 22660 の間でした。また、初期反応 83A :476 (6 hpi) および遅延反応 Mandelup および Population 22660 には、GO:0015979 '光合成' およびその他の関連する生物学的プロセスという用語が含まれています。
炭疽菌ルピナスを接種した狭葉ルピナス（NLL）（ポーランド、ヴィエルジェニツェのルピナス畑から1999年に得たCol-08株）のトランスクリプトーム応答中に差次的に発現する遺伝子のアノテーションで選択されたバイオプロセス遺伝子オントロジーの用語は、大幅に誇張されています。分析された NLL 系統は、83A:476 (耐性、ホモ接合型 Lanr1 対立遺伝子を持つ)、ボレジン (耐性、遺伝的背景不明)、マンデラップ (中等度の耐性、ホモ接合型 AnMan 対立遺伝子を持つ)、および集団 22660 (感受性) でした。
この研究は炭疽病耐性に寄与する遺伝子を同定することを目的としたため、ベースラインは少なくとも 1 行で 30 以上を意味するため、GO「GO: 0006952 防御反応」および「GO: 0055114 酸化還元プロセス」という用語に割り当てられた遺伝子をカットオフで分析しました。× log2 の統計的に有意な値を組み合わせた時点 (変化倍数)。これらの基準を満たす遺伝子の数は、GO:0006952 では 65 個、GO:0055114 では 524 個でした。
８３Ａ：４７６は、ＧＯ：０００６９５２という用語で注釈が付けられた２つのＤＥＧピークを明らかにし、最初のものは１インチ当たり６遺伝子（６４遺伝子、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーション）であり、２番目は１インチ当たり２４遺伝子（１５遺伝子、アップレギュレーションのみ）であった。Boregine は、GO:0006952 が同じ時点でピークに達したが、DEG (11 および 8) が低く、優先的に活性化されたことも示しました。マンデループは、12 および 48 HPI で GO:0006952 の 2 つのピークを示し、両方とも 12 個の遺伝子を保有していました (1 つ目は活性化遺伝子を含み、2 つ目は抑制遺伝子のみを含みました)。一方、6 HPI (13 遺伝子) の 22660 集団は増加ピークのより大きな優位性を持っていました。規制。これらのピークの GO:0006952 DEG の 96.4% が同じタイプの応答 (上または下) を示し、関与する遺伝子の数の違いにもかかわらず、防御応答が大幅に重複していることを示していることに注意してください。GO:0006952 という用語に関連する配列の最大のグループは、クラス 10 病因関連タンパク質 (PR-10) タンパク質クレードおよびコアタンパク質ラテックスに属する飢餓ストレス関連メッセージタンパク質 22 (SAM22 様) をコードします。類似の（MLP 様）タンパク質）タンパク質（図 3）。2 つのグループは表現の性質と反応の方向が異なりました。SAM22 様タンパク質をコードする遺伝子は、初期の時点 (6 または 12 hpi) で一貫した有意な誘導を示し、実験終了時 (48 hpi) には一般に無反応でしたが、MLP 様タンパク質は 6 hpi で協調を示しました。ヒピ。83A:476 および 48 hp/in のマンデラップでは、他のほとんどすべてのデータ ポイントが応答しませんでした。さらに、耐性株の方が感受性の高い遺伝子よりもこれらの遺伝子を有意に誘導する時点が多いため、SAM22 様タンパク質遺伝子の発現プロファイルの違いは、炭疽病耐性の観察された変動に続きました。別の L1R18A/B 様 PR-10 遺伝子は、SAM22 様タンパク質遺伝子と非常によく似た発現パターンを示しました。
生物学的プロセス用語「GO:0006952 Defense Response」の主な構成要素と、Lanr1 および AnMan 対立遺伝子の候補遺伝子の発現パターンが特定されました。Log2 スケールは、同じ時点における接種植物 (Colletotrichum lupini、Col-08 株、ポーランド、ウィジェニツァのルピナス畑から入手、1999 年) と対照 (擬似接種) 植物の間の log2 値 (倍率変化) を表します。以下の狭葉ルピナス系統を分析した：83A:476 (耐性、ホモ接合性 Lanr1 対立遺伝子を持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、Mandelup (中等度の耐性、ホモ接合性 AnMan 対立遺伝子を持つ)、および集団 22660 (感受性)。
さらに、RNA-seq 候補遺伝子 Lanr1 (TanjilG_05042) および AnMan (TanjilG_12861) の発現プロファイルを評価しました (図 3)。TanjilG_05042 遺伝子は、最初の時点 (6 hpi) のみ 83A:476 で有意な応答 (活性化) を示しましたが、TanjilG_12861 は、マンデループでは 6 hpi (ダウンレギュレーション) と 24 hpi (6 hpi) の 2 つの時点でのみ有意でした。と。）。調整可能））。
GO:0055114「酸化還元プロセス」という用語で最も過剰発現された遺伝子は、シトクロム P450 タンパク質とペルオキシダーゼをコードする遺伝子でした (図 4)。6 HPI で 83A:476 から分離されたサンプルの場合、最大または最小の log2 (倍数変化) 値 (遺伝子の 86.6% について) が接種植物と対照植物の間で一般に観察され、接種性別に対するこの遺伝子型の高い応答が強調されました。８３Ａ：４７６は、６ｈｐｉで最も有意なＧＯ：００５５１１４°（５０３遺伝子）を示し、一方、残りの系統は４８ｈｐｉで示した（Ｂｏｒｅｇｉｎｅ、３１遺伝子；Ｍａｎｄｅｌｕｐ、８５遺伝子；および集団２２６６０、７８遺伝子））。GO:0055114 ファミリーのほとんどの遺伝子では、ワクチン接種に対する 2 種類の応答 (活性化と阻害) が観察されました。興味深いことに、48 hp のマンデループでは、用語 GO: 0055114 に対して DEG の最大 97.6% が同定されました。 これらの観察は、大幅に小さいスケール (すなわち、変異酸化還元遺伝子の数、85 対 503) にもかかわらず、炭疽病に対するマンデループの遅延トランスクリプトーム応答のパターンが 83A:476 の初期応答と類似していることを示唆しています。Boregine と Population 22660 では、この収束はそれぞれ 51.6% と 75.6% と低くなります。
生物学的プロセス「GO:0055114 酸化還元プロセス」という用語の主要成分の発現パターンが明らかになりました。Log2 スケールは、同じ時点における接種植物 (Colletotrichum lupini、Col-08 株、ポーランド、ウィジェニツァのルピナス畑から入手、1999 年) と対照 (擬似接種) 植物の間の log2 値 (倍率変化) を表します。以下の狭葉ルピナス系統を分析した：83A:476 (耐性、ホモ接合性 Lanr1 対立遺伝子を持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、Mandelup (中等度の耐性、ホモ接合性 AnMan 対立遺伝子を持つ)、および集団 22660 (感受性)。
８３Ａ：４７６ C. ルピニ（Col-08株）の接種に対するトランスクリプトーム応答には、GO:0015979の用語「光合成」および他の関連する生物学的プロセスに起因すると考えられる遺伝子の協調的サイレンシングも含まれた（図５）。このGO:0015979 DEGセットには、6 hpiで83A:476で有意に抑制された105個の遺伝子が含まれていた。このサブセットでは、マンデラップでは 48 HPI で 37 個の遺伝子がダウンレギュレートされ、22660 集団では同じ時点で 35 個の遺伝子が下方制御されており、これには両方の遺伝子型に共通する 19 個の DEG が含まれます。用語 GO: 0015979 に関連する DEG は、どの組み合わせ (行 x 時間) でも有意に活性化されませんでした。
生物学的プロセスの用語「GO:0015979 光合成」の主要成分の発現パターンが明らかになりました。Log2 スケールは、同じ時点における接種植物 (Colletotrichum lupini、Col-08 株、ポーランド、ウィジェニツァのルピナス畑から入手、1999 年) と対照 (擬似接種) 植物の間の log2 値 (倍率変化) を表します。以下の狭葉ルピナス系統を分析した：83A:476 (耐性、ホモ接合性 Lanr1 対立遺伝子を持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、Mandelup (中等度の耐性、ホモ接合性 AnMan 対立遺伝子を持つ)、および集団 22660 (感受性)。
差次的発現分析の結果に基づいて、おそらく病原性真菌に対する防御応答に関与しているこの7つの遺伝子セットが、リアルタイムPCRによる発現プロファイルの定量化のために選択されました(補足表S9)。
推定タンパク質遺伝子 TanjilG_10657 は、対照 (模倣) 植物と比較して、研究されたすべての系統および時点で有意に誘導されました (補足表 S10、S11)。さらに、TanjilG_10657 の発現プロファイルは、すべての系統で実験の過程で増加傾向を示しました。集団22660は、114倍の活性化による接種に対するTanjilG_10657の最も高い感受性と、24 HPIで最も高い相対発現レベル(4.4±0.4)を示した(図6a)。PR10 LlR18Aタンパク質遺伝子TanjilG_27015も、すべての系統および時点にわたって活性化を示し、ほとんどのデータ点で統計的有意性を示した(図6b)。TanjilG_10657と同様に、TanjilG_27015の最も高い相対発現レベルは、22660接種集団において24 HPI(19.5±2.4)で観察された。酸エンドキチナーゼ遺伝子 TanjilG_04706 は、Boregine 6 hpi を除くすべての系統およびすべての時点で有意に上方制御されました (図 6c)。これは、83A:476 の最初の時点 (6 HPI) で強く誘導され (10.5 倍)、他の系統では中程度に増加しました (6.6 ～ 7.5 倍)。実験中、TanjilG_04706 の発現は、83A:476 と Boregine では同様のレベルに留まりましたが、Mandelup と Population 22660 では大幅に増加し、比較的高い値 (それぞれ 5.9 ± 1.5 および 6.2 ± 1.5) に達しました。エンドグルカン-1,3-β-グルコシダーゼ様遺伝子 TanjilG_23384 は、集団 22660 を除くすべての系統で最初の 2 つの時点 (6 および 12 hpi) で高い活性化を示しました (図 6d)。TanjilG_23384 の最も高い相対発現レベルは、マンデラップ (2.7 ± 0.3) および 83A:476 (1.5 ± 0.1) の 2 番目の時点 (12 hpi) で観察されました。24 HPI では、TanjilG_23384 発現はすべての研究系統で比較的低かった (0.04 ± 0.009 ～ 0.44 ± 0.12)。
定量的 PCR によって明らかにされた、選択された遺伝子 (ag) の発現プロファイル。6、12、24 という数字はワクチン接種後の時間を表します。LanDExH7 および LanTUB6 遺伝子は正規化に使用され、LanTUB6 はシリーズ間キャリブレーションに使用されました。エラーバーは、3 つの生物学的反復に基づいた標準偏差を表し、それぞれが 3 つの技術的反復の平均です。 接種植物（ポーランド、ヴィエルゼニツァのルピナス畑から1999年に入手したColletotrichum lupini、Col-08株）と対照植物（模擬接種）との間の発現レベルの差の統計的有意性は、データ点の上にマークされています（*P値<0.05、**P値≤0.01、***P値≤0.001）。 接種植物（ポーランド、ヴィエルゼニツァのルピナス畑から1999年に入手したColletotrichum lupini、Col-08株）と対照植物（模擬接種）との間の発現レベルの差の統計的有意性は、データ点の上にマークされています（*P値<0.05、**P値≤0.01、***P値≤0.001）。 Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, øтамм Col-08, получен в 19) 99 г. с поля люпина в Верженице, Польза) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками дан (*значение P < 0,05、**значение P ≤ 0,01、***значение P ≤ 0,001)。 接種植物（ポーランド、ヴィエルジェニツェのルピナス畑から1999年に入手したColletotrichum lupini、Col-08株）と対照植物（擬似接種）との間の発現レベルにおける統計的に有意な差がデータポイントの上に示されている（*P値<0.05、**P値≤0.01、***P値≤0.001）。接（Colletotrichum lupini、Col-08 株、1999 年波兰 Wierzenica の羽扇豆田入手）と対照（模倣接）植物間のレベル差を示すデータポイント上にある（*P 値 < 0.05、**P 値） ≤ 0.01、***P 値≤ 0.001)。接 (colletotrichum lupini 、 color-08 株、 1999 年波兰 wierzenica の羽扇取得) および对照 (接植物間の水平差の構造的着性評価データポイント 上方*p 値 <0.0) 5、**P ≤ 0.01、***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, øтамм Col-08, полученный с по) лей люпина в Верженице, Польза, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками д (* значение P < 0,05、** P-значение ≤ 0,01、***P-значение ≤ 0,001)。 接種植物（1999年にポーランド、ヴェルジェニツェのルピナス畑から得られたコレトトリクム・ルピニ、Col-08株）と対照植物（擬似接種）との間の発現レベルにおける統計的に有意な差がデータ点の上に示されている（*P値<0.05、**P値≤0.01、***P値≤0.001）。分析された NLL 系統は、83A:476 (耐性、ホモ接合型 Lanr1 対立遺伝子を持つ)、マンデラップ (中程度の耐性、ホモ接合型 AnMan 対立遺伝子を持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、および集団 22660 (感受性) でした。
Lanr1遺伝子座の候補遺伝子TanjilG_05042は、RNA-seq研究から得られたプロファイルとは著しく異なる発現パターンを示しました（図6e）。この遺伝子の有意な活性化がマンデラップおよび 22660 集団で観察され (それぞれ最大 39.7 倍および 11.7 倍)、比較的高い発現レベル (それぞれ最大 1.4 ± 0.14 および 7.2 ± 1.3) をもたらしました。83A:476は、TanjilG_05042遺伝子のいくらかのアップレギュレーション(最大3.8倍)も明らかにしたが、達成された相対発現レベル(0.044±0.002)は、マンデラップおよび22660集団で観察されたレベルよりも30倍以上低かった。qPCR で分析した結果、偽ワクチン接種 (対照) 変異体の遺伝子型間の発現レベルの有意な差が示され、集団 22660 と 83A:476 の間、および集団 22660 と 22660 の間では 58 倍の差に達しました。ボレジンとマンダラップの間では 2 倍の差が達成されました。
AnMan 遺伝子座の候補遺伝子 TanjilG_12861 は、83A:476 および Mandelup ではワクチン接種に応答して活性化され、22660 集団では中立であり、Boregine では下方制御されました（図 6f）。TanjilG_12861 遺伝子の相対発現は、接種した 83A: 476 (0.14±0.01) で最も高かった。17.4 kDaのクラスI熱ショックタンパク質遺伝子TanjilG_05080 HSP17.4は、研究したすべての株および時点でより低い相対発現レベルを示しました（図6g）。最高値は、22660 集団の 24 HPI で観察されました (0.14 ± 0.02、ワクチン接種に応じて 8 倍増加)。
遺伝子発現プロファイルの比較（図7）により、TanjilG_10657と他の4つの遺伝子：TanjilG_27015（r = 0.89）、TanjilG_05080（r = 0.85）、TanjilG_05042（r = 0.80）、およびTanjilG_04706（r = 0.79）との間の高い相関関係が明らかになりました。このような結果は、防御反応中にこれらの遺伝子が共制御されていることを示している可能性があります。TanjilG_12861 遺伝子と TanjilG_23384 遺伝子は、他の遺伝子と比較して、より低いピアソン相関係数値 (それぞれ 0.08 から 0.43 および -0.19 から 0.28) の異なる発現プロファイルを示しました。
遺伝子発現プロファイル間の相関関係は、定量的 PCR を使用して検出されました。次の狭葉ルピナス系統を分析しました:83A:476 (耐性、ホモ接合型 Lanr1 対立遺伝子を持つ)、マンデラップ (中程度の耐性、ホモ接合型 AnMan 対立遺伝子を持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景は不明)、および集団 22660 (感受性)。接種植物（ポーランド、ヴィエルジェニツェのルピナス畑から1999年に入手したColletotrichum lupini、Col-08株）および対照植物（偽接種）を含む3つの時点（接種後6、12および24時間）を計算した。スケールはピアソン相関係数の値を示します。
インチあたり 6 馬力で得られたデータに基づいて、初期の防御反応に焦点を当てるために、接種植物と対照植物を比較することによって特定された 9981 DEG に対して WGCNA を実行しました (補足表 S12)。22 の遺伝子モジュール (クラスター) が、遺伝子型と実験的変異体の間で相関のある (陽性または陰性) 発現プロファイルを持って見つかりました。 平均して、遺伝子発現レベルは、83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 の順に降下していました (ただし、両方の変異体において、この傾向は対照植物でより強かった)。 平均して、遺伝子発現レベルは、83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 の順に降下していました (ただし、両方の変異体において、この傾向は対照植物でより強かった)。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенде) нция была сильнее у контрольных растений)。 平均して、遺伝子発現レベルは、83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 の順に減少しました (ただし、両方の変異体において、この傾向は対照植物でより強かった)。平均すると、遺伝子発現レベルは、83A:476 > マンデラップ > ボレジン > 集団 22660 の順に減少した(ただし、この傾向は、2 つの個体において、対照植物においてより顕著であった)。平均すると、遺伝子レベルは 83a:476 > マンデルアップ > ボレジン > 集団 22660 の順序で降下します (植物中ではさらに)。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция) была сильнее у контрольных растений)。 平均して、遺伝子発現レベルは、シリーズ 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 で減少しました (ただし、両方の変異体において、この傾向は対照植物でより強かった)。ワクチン接種により、特にモジュール 18、19、14、6 および 1 (効果の降順) で遺伝子発現の上方制御、負の制御 ​​(例: モジュール 9 および 20)、または中立的な効果 (例: モジュール 11、22、8、および 13) が生じました。GO 用語濃縮分析 (補足表 S13) により、qPCR によって分析された遺伝子 (TanjilG_04706、TanjilG_23384、TanjilG_10657 および TanjilG_27015) および多くの最も抑制された光合成モジュール (9) を接種したモジュール (18) の最大活性化を伴う接種モジュール (18) の「GO: 0006952 保護反応」が明らかになりました。モジュール 18 コンセントレーター (図 8) は PR-10 様 LlR18B タンパク質をコードする TanjilG_26536 遺伝子として同定され、モジュール 9 コンセントレーターは光化学系 II PsbQ タンパク質をコードする TanjilG_28955 遺伝子として同定されました。候補炭疽病耐性遺伝子 Lanr1、TanjilG_05042 はモジュール 22 (図 9) で見つかり、TanjilG_01212 ハブを含む用語「GO:0044260 細胞高分子代謝プロセス」および「GO:0006355 転写制御、DNA テンプレート」に関連付けられています。この遺伝子は熱ストレス転写因子 A-4a (HSFA4a) をコードしています。
生物学的プロセス用語「GO: 0006952 防御反応」が過剰に表現されているモジュールの遺伝子共発現の加重ネットワーク分析。ライゲーションは、qPCR によって分析された 4 つの遺伝子 (TanjilG_04706、TanjilG_23384、TanjilG_10657、および TanjilG_27015) を強調するために簡略化されました。
過剰に発現する生物学的プロセス用語「GO: 0006355: 転写制御、DNA テンプレート」を持ち、炭疽病耐性候補遺伝子 Lanr1 TanjilG_05042 を保有するモジュールの遺伝子共発現の加重ネットワーク解析。TanjilG_05042 遺伝子と中央の TanjilG_01212 遺伝子を単離するためにライゲーションが簡略化されました。
オーストラリアで収集された炭疽病耐性スクリーニングでは、初期にリリースされた品種のほとんどが感受性があることが示されました。Kalya、Coromup、および Mandelup は中程度の耐性があると記載されていますが、Wonga、Tanjil および 83A:476 は非常に耐性があると記載されています 26、27、31。コロムプとマンデラップは、AnMan10、26、39 と呼ばれる異なる対立遺伝子を持っていましたが、Kalya は異なる対立遺伝子を受け継ぎました。、ランr2。ドイツでの炭疽病耐性のスクリーニングにより、Lanr1 以外の候補対立遺伝子を持つ耐性株 Bo7212 が同定され、LanrBo36 と命名されました。
私たちの研究では、検査された生殖質における Lanr1 対立遺伝子の頻度が非常に低い (約 6%) ことが明らかになりました。この観察は、Anseq3 および Anseq4 マーカーを使用した東ヨーロッパの生殖質のスクリーニング結果と一致しており、Lanr1 対立遺伝子は 2 つのベラルーシ系統にのみ存在することが示されました。これは、Lanr1 対立遺伝子がマーカー支援育種の重要な対立遺伝子の 1 つであるオーストラリアとは異なり、地元の育種プログラムではまだ広く使用されていないことを示唆しています。これは、オーストラリアの報告と比較して、ヨーロッパの野外条件において Lanr1 対立遺伝子によってもたらされる耐性のレベルが低いためである可能性があります。さらに、オーストラリアの降雨量の多い地域における炭疽病の研究では、Lanr1 対立遺伝子によって媒介される耐性反応は、病原体の成長と急速な発達に有利な気象条件では効果がない可能性があることが示されています 19,42。実際、本研究では、炭疽病の症状の一部が Lanr1 対立遺伝子を持つ遺伝子型でも観察されており、C. ルピニの発生に最適な条件下では耐性が消失する可能性があることが示唆されています。さらに、Lanr1 遺伝子座から約 1 cM の位置にある Anseq3 および Anseq4 マーカーの存在の偽陽性解釈が可能です 28、30、43 。
私たちの研究では、Lanr1 対立遺伝子を持つ 83A:476 は、最初の分析時点 (6 hpi) で C. ルピニの接種に対して大規模なトランスクリプトーム再プログラミングに応答したが、AnMan 対立遺伝子を持つマンデラップでは、トランスクリプトーム応答がずっと後に観察されたことが示されました。(24 馬力から 48 馬力まで)。防御反応のこれらの一時的な変動は疾患の症状の違いに関連しており、耐性に対する反応を成功させるには早期の病原体認識の重要性が強調されています。植物組織に感染するには、炭疽菌の胞子は宿主表面で発芽、細胞分裂、付着器の形成などのいくつかの発育段階を経る必要があります。付属器は宿主の表面に付着し、宿主組織への侵入を促進する感染性構造です。したがって、エンドウ豆抽出物中のC. gloeosporioidesの胞子は、75〜90分のインキュベーション後に核の最初の分裂を示し、90〜120分後に発芽管の形成を示し、4時間後に抑制を示した。マンゴー C. グロエオスポリオイデスは、3 時間のインキュベーション後に 40% 以上の分生子発芽を示し、4 時間後に約 20% の圧着子の形成を示しました。C. gloeosporioides の病原性関連 CAP20 遺伝子は、アボカド表面ワックス中で高濃度の CAP20 タンパク質とともに 3.5 時間インキュベートした後、4 時間 46 分後に着生植物形成分生子において転写活性を示しました。同様に、C. trifolii のメラニン生合成遺伝子の活性は 2 時間のインキュベーション中に誘導され、1 時間後に付着器が形成されました。葉組織の研究では、C. acutatum を接種したイチゴは 8 hpi で最初の抑制が見られるのに対し、C. coccode を接種したトマトは 4 hpi で最初の抑制が見られることが示されています 48,49。これは、Colletotrichum spp.の時間スケールとほぼ一致しています。感染プロセス。83A:476 に対する急速な防御応答は、この系統における植物抵抗性およびエフェクター誘発免疫 (ETI) 遺伝子の関与を示唆していますが、マンデラップの遅延応答は微小関連分子パターン誘発免疫 (MTI) 仮説を裏付けています 50。 83A: 476 およびマンデラップに対する初期応答。ETIは多くの場合、アナフィラキシーショックとして知られる感染部位でのプログラム細胞死に至る、加速され強化されたMTI反応であると考えられているため、遅延応答における上方制御または下方制御される遺伝子間の部分的な重複もこの概念を裏付けています 51,52 。
Gene Ontology GO:0006952「Defence Response」という過剰に表現されている用語に起因する遺伝子のほとんどは、ストレス誘発性絶食メッセージ 22 タンパク質 (SAM22 に類似) の 11 個の相同体と 7 つの主要なラテックスタンパク質様 (MLP) です。様タンパク質 31、34、43、および 423 は配列類似性を示しました。SAM22 様遺伝子は、長期間持続する顕著な活性化を示し、炭疽病耐性レベルの増加を示しました (83A:476 および Boregine)。しかし、MLP 様遺伝子は、候補耐性対立遺伝子 (6 hpi の 83A:476/Lanr1 および 24 hpi の Mandelup/AnMan) を保有する系統でのみ下方制御されました。同定されたすべてのSAM22様相同体は約105kbにわたる遺伝子クラスターに由来するのに対し、MLP様遺伝子はゲノムの別の領域に由来することに留意すべきである。このようなSAM22様遺伝子の協調的な活性化は、ディアポルセトキシカ接種に対するNLL耐性に関する我々の以前の研究でも見出されており、それらが防御反応の水平成分に関与していることが示唆されている。この結論は、サリチル酸、真菌誘導物質、または過酸化水素による傷害または治療に対する SAM22 様遺伝子の陽性反応の報告によっても裏付けられています。
MLP 様遺伝子は、多くの植物種における細菌、ウイルス、病原性真菌感染などのさまざまな非生物的および生物的ストレスに応答することが示されています 55。植物と病原体間の特定の相互作用に対する反応の方向は、大幅な増加（つまり、ワタへの Verticillium dahliae 感染中）から大幅な減少（つまり、リンゴの木の Alternaria spp. 感染後）まで多岐にわたりました 56,57。MLP 様 423 遺伝子の有意なダウンレギュレーションは、F. ニガー感染に対するアボカドの防御中およびリンゴの木 Botryosphaeria berengeriana f. の感染中に観察されています。CN。piricola と Alternaria alternata はリンゴの病型です 58,59。さらに、MLP 様 423 遺伝子を過剰発現するリンゴカルスは、耐性関連遺伝子の発現が低く、真菌感染に対してより敏感でした 59。Fusarium oxysporum f に続いて、耐性のあるインゲン生殖質でも MLP 様 423 遺伝子が抑制されました。CN。マメ感染症60．
我々のRNA-seq研究で同定されたPR-10ファミリーの他のメンバーは、上方制御に応答するLlR18AおよびLlR18B遺伝子、ならびに脂質輸送タンパク質DIR1の上方制御される（1遺伝子）または下方制御される（3遺伝子）遺伝子であった。。さらに、WGCNA は、このモジュールのハブとして、ワクチン接種に対して非常に感受性が高く、いくつかの防御応答遺伝子を保有する LlR18B 遺伝子を強調しています。LlR18A および LlR18B 遺伝子は、病原性細菌に反応して黄色のルピナスの葉、および D. toxica 接種後の NLL 茎で誘導されましたが、これらの遺伝子のイネ相同体 RSOsPR10 は、おそらくジャスモン酸シグナル伝達経路に関与すると考えられる真菌感染によって急速に誘導されました 53,61,62。 DIR1 遺伝子は、全身性獲得抵抗性（SAR）の始まり。防御反応の発達に伴い、DIR1 タンパク質は感染巣から師部を通って輸送され、離れた臓器で SAR を誘導します。興味深いことに、TanjilG_02313 DIR1 遺伝子は系統 84A:476 および集団 22660 の最初の時点で有意に誘導されましたが、炭疽病耐性は系統 84A:476 でのみうまく発現しました。残りの 3 つのホモログは 6 hpi の 83A:476 系統でのみ接種に反応し、この反応は下向きであったため、これは NLL における DIR1 遺伝子の機能低下を示している可能性があります。
私たちの研究では、「GO:0055114 酸化還元プロセス」と呼ばれる生物学的プロセスに対応する最も一般的な成分は、シトクロム P450 タンパク質、ペルオキシダーゼ、リノール酸 9S-/13S-リポキシゲナーゼ、および 1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸オキシダーゼでした。さらに、当社の WGCNA は、HSFA4a ホモログを、Lanr1 耐性遺伝子候補 TanjilG_05042 などのモジュールを運ぶハブとして定義しています。HSFA4a は、植物における核転写の酸化還元依存性調節の構成要素です。
シトクロム P450 タンパク質は、生体異物、ホルモン、脂肪酸、ステロール、細胞壁成分、生体高分子、保護化合物の生合成などの代謝を含む一次および二次代謝における NADPH および/または O2 依存性の水酸化反応を触媒する酸化還元酵素です 69。 私たちの研究では、植物のチトクロム P450 機能の変動は -10.6 log2 (倍) から減少しました。変更) は、多数の変更されたホモログ (37) と特定の遺伝子間の応答パターンの違いにより 5.7 に変更され、上方修正を反映しています。。このような大きなタンパク質スーパーファミリーにおける NLL 遺伝子の推定上の生物学的機能を解明するために RNA-seq データのみを使用することは、非常に推測的です。しかし、一部のシトクロム P450 遺伝子は、アレルギー反応への寄与を含め、病原性真菌または細菌に対する耐性の増加に関連していることは注目に値します69、70、71。
クラス III ペルオキシダーゼは、塩分、干ばつ、高照度、病原体の攻撃などの環境ストレスに応答するだけでなく、植物の成長および発育中の幅広い代謝プロセスに関与する多機能植物酵素です 72。ペルオキシダーゼは、Stylosanthes humilis と C. gloeosporioides、Lens culinaris と C. truncatum、Phaseolus vulgaris と C. lindemuthianum、Cucumis sativus と C. lagenarium を含むいくつかの植物種と炭疽菌との相互作用に関与しています73、74、75、76。反応は非常に速く、真菌が植物組織に浸透する前に、場合によっては 4 HPI でさえも発生します 73。ペルオキシダーゼ遺伝子は D. toxica NLL 接種にも反応しました。ペルオキシダーゼは、酸化バーストを調節したり酸化ストレスを除去したりする典型的な機能に加えて、木化、サブユニット、または特定の化合物の架橋中に細胞壁の強化に基づいて物理的障壁を作成することにより、病原体の増殖を妨げることができます。この機能は、コンピュータ内で、推定上のリグニン形成アニオンペルオキシダーゼをコードする TanjilG_03329 遺伝子に起因すると考えられます。この遺伝子は、我々の研究では 6 HPI の 83A:476 耐性株で有意に上方制御されましたが、応答しなかった他の株および時点では上方制御されませんでした。
リノール酸の 9S-/13S-リポキシゲナーゼは、脂質生合成の酸化経路の最初のステップです 78。この経路の生成物は、カロースとペクチン沈着物の形成による細胞壁の強化や、活性酸素種の生成による酸化ストレスの制御など、植物の防御において複数の機能を持っています79、80、81、82、83。本研究では、リノール酸 9S-/13S-リポキシゲナーゼの発現がすべての株で変化しましたが、感受性集団 22660 では異なる時点で上方制御が優勢であったのに対し、耐性 Lanr1 および AnMan 対立遺伝子を保有する株では、これらの遺伝子型間の炭疽防御反応におけるオキシリピン層の多様化が強調されています。
1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸オキシダーゼ (ACO) 相同体は、ルピナスを接種すると有意に上方制御 (9 遺伝子) または下方制御 (2 遺伝子) されました。2 つの例外を除いて、これらの応答はすべて 6 馬力で発生しました。83A:476で。ACO タンパク質によって媒介される酵素反応はエチレン生成の律速段階であるため、高度に制御されています 84。エチレンは、植物の発育と非生物的および生物的ストレス条件への反応の制御においてさまざまな役割を果たす植物ホルモンです。ACO転写の誘導とエチレンシグナル伝達経路の活性化は、活性酸素種とファイトアレキシンの生成を調節することにより、半生物栄養性真菌であるイネオリゼに対するイネの抵抗性を高めることに関与しています。この研究で報告された 83A:476 系統における ACO ホモログの有意な上方制御を背景に、M. オリゼと C. ルピニの間で見出された非常に類似した葉感染プロセス 88,89 は、分子経路のシグナル伝達の中心段階である NLL 炭疽病エチレンに対する耐性を付与する可能性をシフトさせます 。
本研究では、光合成に関連する多くの遺伝子の大規模な抑制が、83A:476 では 6 hpi で、マンデループと 22660 集団では 48 hpi で観察されました。これらの変化の範囲と進行はレベルに比例します。この実験では炭疽病耐性が観察されました。最近、病原性細菌や真菌を含む植物と病原体の相互作用のいくつかのモデルにおいて、光合成関連転写物の強力かつ早期の抑制が報告されています。感染に応答した光合成に関連する遺伝子の速攻（一部の相互作用における 2 HPI による）と全体的な抑制は、活性酸素種の展開と、アレルギー反応を媒介するサリチル酸経路との相互作用に基づいて植物免疫を引き起こす可能性があります 90,94。
結論として、最も耐性のある系統（83A:476）に対して提案されている防御応答機構には、R遺伝子（おそらくTIR-NBS-LRR TanjilG_05042）による迅速な病原体認識と、アレルギー応答を介したサリチル酸およびエチレンシグナル伝達、その後の長距離SARの確立が含まれます。この作用は DIR-1 タンパク質によってサポートされています。C. ルピニ感染の生物栄養期間は非常に短く (約 2 日)、その後に壊死性増殖が続くことに注意する必要があります 95。これらの段階間の移行は、宿主植物の過敏反応の引き金として機能するエチレン誘導性タンパク質の壊死と発現に関連している可能性があります。したがって、生物栄養段階での C. ルピニの捕獲に成功するまでの時間枠は非常に狭いです。6 hpi の 83A:476 で観察された酸化還元と光合成に関連する遺伝子の再プログラム化は、真菌の菌糸の進行と一致しており、生物栄養段階での防御反応の発達が成功する前兆です。マンデラップおよび 22660 集団のトランスクリプトーム応答は、壊死増殖に切り替わる前に真菌を捕捉するには遅すぎる可能性がありますが、PR-10 タンパク質の比較的速い制御が水平抵抗性を促進するため、マンデラップは 22660 集団よりも効果的である可能性があります。
標準的な R 遺伝子によって駆動される ETI は、炭疽病に対する豆の抵抗性の一般的なメカニズムであると考えられます。したがって、モデルマメ科植物 Medicago truncatula では、炭疽病に対する耐性は、TIR-NBS-LRR97 植物 R 遺伝子クラスのメンバーである RCT1 遺伝子によって付与されます。この遺伝子はまた、感受性植物に導入された場合、アルファルファに広範囲の炭疽病耐性を与えます。インゲンマメ (P. vulgaris) では、これまでに 20 を超える炭疽病耐性遺伝子が同定されています。これらの遺伝子の一部は標準的な R 遺伝子が欠如した領域に見られますが、他の多くの遺伝子は TIR-NBS-LRRs99 などの NBS-LRR 遺伝子クラスターを持つ染色体の端に位置しています。ゲノムワイドな SSR 研究では、NBS-LRR 遺伝子とインゲンマメの炭疽病耐性との関連性も確認されました。正規の R 遺伝子は、白いルピナス 101 の主要な炭疽病耐性遺伝子座を保持するゲノム領域にも見つかりました。
私たちの研究は、植物感染の初期段階（できれば12 hpiまで）に活性化される即時耐性反応が、病原性真菌コレロトリクム・ルピニによって引き起こされる炭疽病から狭葉ルピナスを効果的に保護することを示しています。ハイスループットシークエンシングを使用して、Lanr1 および AnMan 耐性遺伝子によって媒介される NLL 植物における炭疽病耐性遺伝子の差次的発現プロファイルを実証しました。防御を成功させるには、植物が病原体と最初に接触してから数時間以内に、酸化還元、光合成、病因形成に関与するタンパク質の遺伝子を注意深く設計する必要があります。同様の保護反応は、時間が経つと植物を病気から守る効果がはるかに低くなります。Lanr1 遺伝子によって媒介される炭疽菌耐性は、R 遺伝子の典型的な迅速な応答 (エフェクター誘発免疫) に似ていますが、AnMan 遺伝子は水平応答 (微生物関連の分子パターンによって誘発される免疫) を提供する可能性が高く、中程度の持続可能性をもたらします。
炭疽病マーカーのスクリーニングに使用された 215 の NLL 系統は、74 の品種、交雑または育種によって得られた 60 系統、5 つの突然変異体、および 76 の野生または元の生殖質で構成されていました。ラインは17か国から来ており、主にポーランド（58）、スペイン（47）、ドイツ（27）、オーストラリア（26）、ロシア（19）、ベラルーシ（7）、イタリア（5）などからのラインでした。10か国から。このセットには、参照耐性系統、83A:476、Lanr1 対立遺伝子を持つ Tanjil、Wonga、および AnMan 対立遺伝子を持つ Mandelup も含まれます。この系統は、ポーランド、ウィアトロボのポズナン・プラント・ブリーディング社が管理する欧州ルピナス遺伝資源データベースから入手した（補足表S1）。
植物は制御された条件（光周期16時間、温度日中25℃、夜間18℃）下で生育させた。2 つの生物学的複製を分析しました。プロトコルに従って、DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して、生後 3 週間の葉から DNA を単離しました。単離された DNA の品質と濃度は、分光測光法 (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) によって評価されました。炭疽病耐性遺伝子 AnMan (品種 Mandelup 由来) をマークする AnManM1 マーカーと、遺伝子 Lanr1 (品種 Tanjil 由来) に隣接するマーカー Anseq3 および Anseq4 を分析しました 11、26、28。耐性対立遺伝子のホモ接合体は「1」、感受性は「0」、ヘテロ接合体は0.5とスコア付けされました。
マーカー AnManM1、AnSeq3、および AnSeq4 のスクリーニング結果と、最終追跡実験用の種子の利用可能性に基づいて、炭疽病耐性表現型解析のために 50 の NLL 系統が選択されました。分析は、日中 22℃、夜間 19℃の温度範囲で、日長 14 時間のコンピューター制御温室で 2 回実行されました。種皮が硬すぎることによる休眠を防ぎ、均一な発芽を確保するために、播種前に種子に傷を付けます（胚の反対側の種皮を鋭利な刃物で切り取ります）。植物は、滅菌土壌（TS-1 REC 085 Medium Basic、Klasmann-Deilmann Polska、ワルシャワ、ポーランド）を入れたポット（11 × 11 × 21 cm）で生育させました。接種は、ポーランド大都市ヴェルジェニツァ（北緯52度27分42秒、東経17度04分05秒）の畑で栽培された狭葉ルピナス植物の茎から1999年に栽培されたコレトトリクム・ルピニCol-08株を用いて行われた。エリアを取得します。単離株をSNA培地中で20℃、ブラックライト下で21日間培養して胞子形成を誘導した。播種から４週間後、植物が４〜６葉期に達したときに、１ｍｌ当たり０．５×１０ ６ 個の分生子の濃度で分生子懸濁液を噴霧することによって接種を行った。接種後、分生子の発芽と感染プロセスを促進するために、植物を湿度約98%、温度25℃の暗所に24時間保管した。次に植物を、昼22℃/夜19℃、湿度70%、14時間の光周期下で生育させた。病気スコアは接種後 22 日目に作成され、茎と葉の壊死性病変の有無に応じて 0 (免疫) から 9 (非常に感受性) の範囲でした。また、スコア付け後、植物の重量を測定した。マーカー遺伝子型と疾患表現型の間の関係は、点 2 配列相関 (炭疽病耐性表現型の分析用の系統セットにおけるヘテロ接合マーカーの不在) として計算されました。