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薬物試験のために、心臓の生理学的環境を正確に再現できる信頼性の高いin vitroシステムが必要とされています。ヒト心臓組織培養システムの利用可能性が限られているため、心臓に対する薬物効果の解釈が不正確になっています。本研究では、心臓切片を電気機械的に刺激し、心拍周期の収縮期および拡張期に生理学的伸張を起こす心臓組織培養モデル（CTCM）を開発しました。12日間の培養後、このアプローチにより心臓切片の生存率は部分的に改善しましたが、構造的完全性は完全には維持されませんでした。そこで、低分子スクリーニングを行った結果、培地に100 nMトリヨードチロニン（T3）と1 μMデキサメタゾン（Dex）を添加することで、切片の微細構造が12日間維持されることが分かりました。T3/Dex処理と組み合わせることで、CTCMシステムは転写プロファイル、生存率、代謝活性、および構造的完全性を12日間、新鮮心臓組織と同等に維持しました。さらに、培養された心臓組織を過度に伸張させると、肥大性心臓シグナル伝達が誘導されることから、CTCMが心臓伸張によって引き起こされる肥大状態を模倣できるというエビデンスが得られました。結論として、CTCMは長期にわたり培養された心臓の生理機能と病態生理をモデル化することができ、信頼性の高い薬物スクリーニングを可能にします。
臨床研究に先立ち、ヒト心臓の生理学的環境を正確に再現できる信頼性の高いin vitroシステムが必要です。このようなシステムは、変化した機械的伸張、心拍数、および電気生理学的特性を模倣する必要があります。動物モデルは心臓生理学のスクリーニングプラットフォームとして一般的に使用されていますが、ヒト心臓における薬物の効果を反映する信頼性には限界があります1,2。最終的に、理想的な心臓組織培養実験モデル（CTCM）は、様々な治療および薬理学的介入に対して高い感度と特異性を備え、ヒト心臓の生理機能と病態生理を正確に再現するモデルです3。このようなシステムの欠如は、心不全の新しい治療法の発見を制限し4,5、薬物の心毒性が市場からの撤退の主な理由となっています6。
過去 10 年間で、心血管系以外の 8 種類の薬剤が QT 間隔の延長を引き起こし、心室性不整脈や突然死につながることから臨床使用から撤退しました7。そのため、心血管系の有効性と毒性を評価するための信頼性の高い前臨床スクリーニング戦略の必要性が高まっています。 近年、薬剤スクリーニングや毒性試験においてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞 (hiPS-CM) が使用されるようになり、この問題は部分的に解決されています。 しかし、hiPS-CM の未熟な性質と心臓組織の多細胞複雑性の欠如が、この方法の主な限界となっています。 最近の研究では、自発収縮の開始直後に初期の hiPS-CM を使用して心臓組織ハイドロゲルを形成し、時間の経過とともに徐々に電気刺激を増やすことで、この限界を部分的に克服できることが示されています。 しかし、これらの hiPS-CM 微小組織は、成人の心筋のような成熟した電気生理学的特性や収縮特性を備えていません。さらに、ヒト心臓組織はより複雑な構造を有し、内皮細胞、ニューロン、間質線維芽細胞など、異なる種類の細胞が特定の細胞外マトリックスタンパク質によって相互に連結された不均一な混合物から構成されています。成体哺乳類心臓における心筋細胞以外の細胞集団11,12,13のこの不均一性は、個々の細胞種を用いて心臓組織をモデル化する上で大きな障壁となっています。これらの大きな制約は、生理学的および病理学的条件下で無傷の心筋組織を培養する方法の開発の重要性を浮き彫りにしています。
培養されたヒト心臓の薄い（300 µm）切片は、完全なヒト心筋の有望なモデルであることが証明されています。この方法により、ヒト心臓組織に類似した完全な3D多細胞システムへのアクセスが提供されます。しかし、2019年まで、培養心臓切片の使用は培養生存期間が短い（24時間）という制限がありました。これは、物理的・機械的伸張の欠如、気液界面、心臓組織のニーズをサポートしない単純な培地の使用など、いくつかの要因によるものです。2019年には、いくつかの研究グループが、心臓組織培養システムに機械的因子を取り入れることで、培養寿命を延ばし、心臓の発現を改善し、心臓病理を模倣できることを実証しました。2つの優れた研究17と18では、一軸機械的負荷が培養中の心臓表現型にプラスの影響を与えることが示されています。しかし、これらの研究では、心臓切片に等尺性張力 17 または線形筋増生負荷 18 が負荷されたため、心周期の動的な3次元物理機械的負荷を使用していませんでした。これらの組織伸張方法は、多くの心臓遺伝子の抑制、または異常な伸張反応に関連する遺伝子の過剰発現をもたらしました。特に、Pitoulis ら 19 は、力変換器フィードバックと張力駆動を使用して、心周期再構築用の動的心臓スライス培養槽を開発しました。このシステムにより、より正確なin vitro心周期モデリングが可能になりますが、方法の複雑さと低いスループットがこのシステムの適用を制限します。当研究室では最近、電気刺激と最適化された培地を使用した簡素化された培養システムを開発し、ブタとヒトの心臓組織切片の生存率を最大6日間維持できるようになりました20,21。
本稿では、ブタ心臓切片を用いた心臓組織培養モデル（CTCM）について述べる。このモデルは、体液性シグナルを組み込むことで、心拍周期中の三次元的な心臓生理と病態生理学的膨張を再現する。このCTCMは、前臨床薬物試験において哺乳類心臓の生理／病態生理を模倣する、費用対効果の高いミッドスループット心臓システムを提供することで、前臨床薬物予測の精度をこれまでにないレベルまで向上させることができる。
血行動態の機械信号は、in vitro での心筋細胞の機能維持に重要な役割を果たしている 22,23,24。本稿では、生理的周波数 (1.2 Hz、72 回/分) で電気的刺激と機械的刺激の両方を誘導することで、成人の心臓環境を模倣できる CTCM (図 1a) を開発した。拡張期中の組織の過度な伸張を回避するために、3D プリント デバイスを使用して組織のサイズを 25% 増加させた (図 1b)。C-PACE システムによって誘導される電気ペーシングは、データ取得システムを使用して心拍周期を完全に再現し、収縮期の 100 ms 前に開始するようにタイミングが調整された。組織培養システムでは、プログラム可能な空気圧アクチュエータ (LB Engineering、ドイツ) を使用して柔軟なシリコン膜を周期的に拡張し、上腔内の心臓スライスを拡張させる。システムは圧力トランスデューサーを介して外部の空気ラインに接続され、圧力 (± 1 mmHg) と時間 (± 1 ms) を正確に調整することが可能になりました (図 1c)。
a 組織切片を、デバイスの培養チャンバー内にある7mmのサポートリング（青色で表示）に取り付けます。培養チャンバーは、薄くて柔軟なシリコン膜によってエアチャンバーと仕切られています。各チャンバーの間にはガスケットを配置し、漏れを防ぎます。デバイスの蓋には、電気刺激を提供するグラファイト電極が内蔵されています。b 大型組織デバイス、ガイドリング、サポートリングの概略図。組織切片（茶色）は、ガイドリングをデバイスの外縁にある溝に挿入した状態で、大型デバイス上に配置されます。ガイドリングを使用して、組織用アクリル接着剤でコーティングされたサポートリングを心臓組織切片の上に慎重に配置します。c プログラマブル空気圧アクチュエータ（PPD）によって制御されるエアチャンバー圧力の関数として、電気刺激の時間を示すグラフ。データ取得装置を使用して、圧力センサーを用いて電気刺激を同期させました。培養チャンバー内の圧力が設定閾値に達すると、パルス信号がC-PACE-EMに送信され、電気刺激がトリガーされます。d インキュベーター棚に置かれた4つのCTCMの画像。 1台のPPDには空気圧回路を介して4台のデバイスが接続されており、止血弁には圧力センサーが挿入されており、空気圧回路内の圧力を監視しています。各デバイスには6つの組織切片が含まれています。
単一の空気圧アクチュエータを使用して、それぞれが6つの組織切片を保持できる4つのCTCMデバイスを制御することができました（図1d）。CTCMでは、空気チャンバー内の空気圧が流体チャンバー内の同期圧力に変換され、心臓スライスの生理的拡張を誘発します（図2aおよび補足ムービー1）。80 mmHgでの組織伸張の評価。Art。は、組織切片が25％伸張することを示しました（図2b）。この伸張率は、正常な心臓切片収縮力の生理的サルコメア長2.2～2.3 µmに相当することが示されています17,19,25。組織の動きは、カスタムカメラ設定を使用して評価しました（補足図1）。組織の動きの振幅と速度（図2c、d）は、心周期中の伸張と収縮期および拡張期の時間に対応していました（図2b）。培養下12日間、心臓組織の収縮および弛緩時の伸張と速度は一定であった（図2f）。培養中の収縮力に対する電気刺激の影響を評価するため、シェーディングアルゴリズムを用いて能動変形を判定する手法を開発し（補足図2a、b）、電気刺激の有無による変形を区別することができた。心臓の同じ部分（図2f）。切片の可動領域（R6-9）では、電気刺激中の電圧は電気刺激なしの場合よりも20%高くなっており、電気刺激が収縮機能に寄与していることがわかる。
気室圧、流体室圧、および組織の動きの測定結果の代表的なトレースは、室圧が流体室圧を変化させ、それに応じて組織切片が動くことを示しています。b 組織切片の伸び率 (青) の代表的なトレースは伸び率 (オレンジ) に相当します。c 心臓切片の測定された動きは、測定された動きの速度と一致しています。(d) 心臓の切片における周期的動きの代表的な軌跡 (青線) と速度 (オレンジの点線)。e 周期時間 (n = 19 スライス/グループ、異なる豚)、収縮時間 (n = 19 スライス/グループ、異なる豚)、緩和時間 (n = 19 スライス/グループ、異なる豚)、組織の動き (n = 25) の定量化。電気刺激あり（赤）となし（青）の組織切片の代表的な歪み分析トレース、同じ切片からの10の領域。下のパネルは、異なる切片からの10の領域で電気刺激ありとなしの組織切片の歪みのパーセンテージ差を定量化して表示しています。 （n = 8スライス/グループ、異なる豚から、両側スチューデントt検定を実行；****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05）。 （n = 8スライス/グループ、異なる豚から、両側スチューデントt検定を実行；****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001、**p<0,01、*p<0,05)。 （n = 異なる豚からの8セクション/グループ、両側スチューデントt検定、****p<0.0001、**p<0.01、*p<0.05）。 （n = 8 枚/グループ、異なるブタ由来、双尾動物試験を実施；****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05）。 （n = 8 枚/グループ、異なるブタ由来、双尾動物試験を実施；****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001、**p <0,01、*p <0,05)。 （n = 8セクション/グループ、異なる豚から、両側スチューデントt検定、****p<0.0001、**p<0.01、*p<0.05）。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
我々の以前の静的生体模倣心臓スライス培養システム [20, 21] では、電気刺激を加え、培地組成を最適化することで、心臓スライスの生存率、機能、構造的完全性を 6 日間維持しました。しかし、10 日後、これらの数値は急激に低下しました。ここでは、以前の静的生体模倣培養システム 20, 21 で培養した切片をコントロール条件 (Ctrl) と呼び、以前に最適化した培地を使用して MC 条件とし、同時機械的電気刺激 (CTCM) 下での培養を行います。と呼ばれる。まず、電気刺激なしの機械的刺激では、6 日間組織の生存率を維持するのに不十分であると判断しました (補足図 3a、b)。興味深いことに、STCM を使用した生理機械的および電気刺激の導入により、12 日目心臓切片の生存率は、MTT 分析で示されるように、Ctrl 条件下では新鮮心臓切片と同じままでした (図 1)。3a)。これは、機械的な刺激と心拍周期のシミュレーションにより、組織切片を、私たちの以前の静的培養システムで報告されたものの 2 倍の期間生存させることができることを示唆しています。しかし、心筋トロポニン T とコネキシン 43 の免疫標識による組織切片の構造的完全性の評価により、コネキシン 43 の発現は、12 日目に MC 組織で同日のコントロールよりも有意に高かったことが示されました。しかし、均一なコネキシン 43 の発現と Z ディスクの形成は完全には維持されませんでした (図 3b)。私たちは、組織の構造的完全性を定量化するために人工知能 (AI) フレームワーク26 を使用し、トロポニン T とコネキシン染色43 に基づく画像ベースのディープラーニング パイプラインを使用して、心臓切片の構造的完全性と蛍光を局在の強度の観点から自動的に定量化します。この方法では、参考文献に記載されているように、畳み込みニューラル ネットワーク (CNN) とディープラーニング フレームワークを使用して、心臓組織の構造的完全性を自動的かつ偏りなく確実に定量化します。 26. MC組織は、培養0日目の静的コントロール切片と比較して、構造的類似性が向上しました。さらに、マッソントリクローム染色では、培養12日目のMS条件下ではコントロール条件と比較して線維化率が有意に低下していることが明らかになりました（図3c）。CTCMは12日目の心臓組織切片の生存率を新鮮心臓組織と同程度まで向上させましたが、心臓切片の構造的完全性には有意な改善は見られませんでした。
棒グラフは、新鮮な心臓切片（D0）または静置培養（D12 Ctrl）もしくはCTCM（D12 MC）で12日間培養した心臓切片のMTT生存率の定量化を示しています（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl）、12（D12 MC）切片/グループ、異なる豚、一元配置分散分析テストを実行、####p < 0.0001（D0と比較）、**p < 0.01（D12 Ctrlと比較）。 棒グラフは、新鮮な心臓切片（D0）または静置培養（D12 Ctrl）もしくはCTCM（D12 MC）で12日間培養した心臓切片のMTT生存率の定量化を示しています（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl）、12（D12 MC）切片/グループ、異なる豚、一元配置分散分析テストを実行、####p < 0.0001（D0と比較）、**p < 0.01（D12 Ctrlと比較）。このヒストグラムは、MTT新鮮心臓切片（D0）または静置培養（D12コントロール）もしくはCTCM（D12 MC）で12日間培養した心臓切片の生存率の定量化を示しています（n = 18（D0）、15（D12コントロール）。）、異なる豚からの12（D12 MC）切片/グループで、一元配置分散分析テストを実行します。####p < 0,0001 по сравнению с D0 または **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)。 #### D0 と比較した p < 0.0001、および ** D12 Ctrl と比較した p < 0.01。 静的培養（D12 Ctrl）またはCTCM（D12 MC）（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl）中の新しい心脛切片（D0）または心芬切片培養12天のMTTの生存量の量化）を示す、異なるブタ12（D12 MC）由来の帯状図。切片／組織について、単方向分散分析を行った；Ｄ０との比較、＃＃＃ｐ＜０．０００１、Ｄ１２ Ｃｔｒｌとの比較、**ｐ＜０．０１）。 静的培養 (D12 Ctrl) または CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl) 中の新しい心脏切片 (D0) 、異なる雄豚からの 12 (D12 MC) 切片 / 集団での単一方向分散分析を示す縞模様の図試験；D0 との比較、####p < 0.0001、D12 Ctrl との比較、**p。)新鮮な心臓切片（D0）または静置培養で12日間培養した心臓切片（D12コントロール）またはCTCM（D12 MC）におけるMTT生存率の定量化を示すヒストグラム（n = 18（D0）、15（D12コントロール））、異なる豚からの12（D12 MC）切片/グループ、一元配置分散分析検定。####p < 0,0001 по сравнению с D0、**p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)。 #### D0 と比較した p < 0.0001、** D12 Ctrl と比較した p < 0.01。b 新鮮な心臓切片（D0）または静的条件（Ctrl）またはCTCM条件（MC）で12日間培養した心臓切片のトロポニンT（緑）、コネキシン43（赤）、およびDAPI（青）の代表的な免疫蛍光画像（ブランクスケール＝100µm）。 心臓組織の構造的完全性の人工知能による定量化 (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス/グループ、それぞれ異なる豚から、一元配置分散分析テストを実行; D0 と比較して ####p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して ****p < 0.0001)。 心臓組織の構造的完全性の人工知能による定量化 (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス/グループ、それぞれ異なる豚から、一元配置分散分析テストを実行; D0 と比較して ####p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して ****p < 0.0001)。 Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по Савнению с D12 Ctrl)。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化 (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) の異なる豚からのセクション/グループ、一元配置分散分析テストを実行; D0 と比較して ####p < 0.0001、D12 Ctrl と比較した ****p < 0.0001)。人工知能化心臓組織の構造の完全性（異なるブタの各グループ当たり n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス、一元配置 ANOVA 検定;####p < 0.0001 対 D0 相対比、****p < 0.0001 対 D12 Ctrl 相対比)。人工知能化心臓組織構造の完全性（n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス/グループ、それぞれ異なるブタ、一元配置分散分析試験;####p < 0.0001 と D0 の比較、****p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較)。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по最高 D12 Ctrl キーを押します。 心臓組織の構造的完全性を定量化する人工知能 (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) セクション/グループ、それぞれ異なる豚、一元配置分散分析テスト; ####p<0.0001 vs .D0 比較のため ****p < 0.0001 を D12 Ctrl と比較)。 c マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表画像（​​左）と定量化（右）（スケールベア = 500 µm）（n = 異なる豚からの各グループ 10 スライス、一元配置分散分析テストを実行、#### p < 0.0001（D0 と比較）、***p < 0.001（D12 Ctrl と比較）。 c マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表画像（​​左）と定量化（右）（スケールベア = 500 µm）（n = 異なる豚からの各グループ 10 スライス、一元配置分散分析テストを実行; #### D0 と比較して p < 0.0001、***D12 Ctrl と比較して p < 0.001）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окразенных трихромным красителем Массона (маслняется односторонний) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний)分散分析 #### p < 0,0001 по сравнению с D0 または ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)。 c マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表画像（​​左）と定量化（右）（未コーティングスケール = 500 µm）（n = 異なる豚からの 10 切片/グループ、一元配置分散分析テストを実施; #### p < 0.0001（D0 と比較）、***p < 0.001（D12 Ctrl と比較）。 c マッソン三色染料で染色した心臓切片の代表的な画像（左）と量化（右）（尺度= 500 μm）（n = 10 枚/組、各組は異なるブタからのものであり、単方向分散分析を行った。#### p < 0.0001 と D0相対比、***p < 0.001 と D12 Ctrl の相対比）。 C マッソン三色染料を使用した心脏切片の代表性 （左 左） 量化 （右） 裸度尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 μm） （n = 10 枚の切片群を異なる猪から単方向分散分析したもの）試験；#### p < 0.0001 と D0 の比較、***p < 0.001 と D12 Ctrl の比較）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окразенных трихромным красителем Массона (чистая зкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)。 c マッソントリクローム染色（ブランク = 500 µm）で染色した心臓切片の代表画像（​​左）と定量（右）（n = 10 切片/グループ、それぞれ異なる豚から採取、一元配置分散分析により検定；### # D0 と比較して p < 0.0001、***D12 Ctrl と比較して p < 0.001）。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
培養液に低分子化合物を添加することで、心筋細胞の完全性が向上し、CTCM培養中の線維化の進行を抑制できるという仮説を立てました。そこで、交絡因子が少ないことから、静的コントロール培養20,21を用いて低分子化合物のスクリーニングを行いました。スクリーニングには、デキサメタゾン（Dex）、トリヨードチロニン（T3）、およびSB431542（SB）を選択しました。これらの低分子化合物は、これまでにhiPSC-CM培養において、サルコメア長、T管、および伝導速度を増加させることで心筋細胞の成熟を誘導するために使用されています。さらに、Dex（グルココルチコイド）とSBはどちらも炎症を抑制することが知られています29,30。そこで、これらの低分子化合物を1つまたは複数添加することで、心臓切片の構造的完全性が向上するかどうかを検証しました。初期スクリーニングでは、各化合物の用量は、細胞培養モデルで一般的に用いられる濃度（1μM Dex27、100nM T327、および2.5μM SB31）に基づいて選択された。12日間の培養後、T3とDexの併用により、心筋細胞の構造的完全性が最適化され、線維性リモデリングは最小限に抑えられた（補足図4および5）。さらに、これらの濃度の2倍または2倍のT3とDexを使用した場合、通常濃度と比較して有害な影響が認められた（補足図6a、b）。
最初のスクリーニングの後、4 つの培養条件を直接比較しました (図 4a)。Ctrl: 以前説明した静置培養で最適化した培地を使用して培養した心臓切片。TD: 水曜日に T3 と Ctrl に Dex を追加。MC: 以前に最適化した培地を使用して CTCM で培養した心臓切片。MT: 培地に T3 と Dex を追加した CTCM。12 日間の培養後、MS 組織と MT 組織の生存率は、MTT アッセイで評価した新鮮組織と同じままでした (図 4b)。興味深いことに、トランスウェル培養 (TD) に T3 と Dex を追加しても、Ctrl 条件と比較して生存率の大幅な改善は見られませんでした。これは、心臓切片の生存率の維持における機械的刺激の重要な役割を示しています。
12 日間にわたる機械的刺激と培地への T3/Dex 補給の効果を評価するために使用された 4 つの培養条件を示す実験設計図。 b 棒グラフは、培養 12 日後の生存率を、4 つの培養条件すべて (Ctrl、TD、MC、および MT) で定量化し、新鮮な心臓スライス (D0) と比較したものです (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD、D12 MT)、12 (D12 MC) スライス/グループ、異なる豚から、一元配置分散分析テストを実行、####p < 0.0001、###p < 0.001 (D0 と比較)、**p < 0.01 (D12 Ctrl と比較))。 b 棒グラフは、培養 12 日後の生存率を、4 つの培養条件すべて (Ctrl、TD、MC、および MT) で定量化し、新鮮な心臓スライス (D0) と比較したものです (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD、D12 MT)、12 (D12 MC) スライス/グループ、異なる豚から、一元配置分散分析テストを実行、####p < 0.0001、###p < 0.001 (D0 と比較)、**p < 0.01 (D12 ctrl と比較))。 b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 dayней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD) и D12 MT)、12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001、###p < 0,001 по сравнению с D0 または **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)。 b 棒グラフは、培養後 12 日目にすべての 4 つの培養条件 (コントロール、TD、MC、および MT) で得られた生存率を、新鮮な心臓切片 (D0) と比較した数値を示しています (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD、および D12 MT)、12 (D12 MC) の切片/グループ、異なる豚から採取、一元配置分散分析テスト、####p < 0.0001、###p < 0.001 vs. D0、および **p < 0.01 by comparison of D12 Ctrl)。 b ストライプ図は、4 つの培養条件すべて (Ctrl、TD、MC、MT) と新しい心臓切片 (D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD および D12 MT)、異なる雄牛の 12 (D12 MC) 切片/群からの単一方向分散分析を示しています)試験；####p < 0.0001、###p < 0.001 と D0 の比較、**p < 0.01 と D12 制御）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001、###p <0,001 по сравнению с D0、**p <0,01 по сравнению с контролем D12)。 b 4つの培養条件すべて（コントロール、TD、MC、MT）を新鮮な心臓切片（D0）と比較したヒストグラム（n = 18（D0）、15（D12 コントロール、D12 TD、D12 MT）、異なる豚から採取、12（D12 MC）切片/グループ、一元配置分散分析テスト、####p<0.0001、###p<0.001 vs. D0、**p<0.01 vs. コントロール D12）。 c 棒グラフは、培養 12 日後のグルコース フラックスの定量化を、4 つの培養条件すべて (Ctrl、TD、MC、および MT) で、新鮮な心臓スライス (D0) と比較したものです (n = 異なる豚からの 6 スライス/グループ、一元配置分散分析テストを実行、###p < 0.001、D0 と比較、***p < 0.001、D12 Ctrl と比較)。 c 棒グラフは、培養 12 日後のグルコース フラックスの定量化を、4 つの培養条件すべて (Ctrl、TD、MC、および MT) で、新鮮な心臓スライス (D0) と比較したものです (n = 異なる豚からの 6 スライス/グループ、一元配置分散分析テストを実行、###p < 0.001、D0 と比較、***p < 0.001、D12 Ctrl と比較)。 c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 dayней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от)ロシア、 односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 または ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)。 c ヒストグラムは、培養後 12 日目に、4 つの培養条件 (コントロール、TD、MC、MT) すべてにおいて、新鮮な心臓切片 (D0) と比較したグルコース フラックスの定量化を示しています (n = 異なる豚からの 6 切片/グループ、一元配置分散分析テストを実行; ### p < 0.001 (D0 と比較)、***p < 0.001 (D12 Ctrl と比較))。 c 棒グラフは、4 つのすべての培養条件 (Ctrl、TD、MC および MT) と新しい心臓切片 (D0) との比較、培養後の 12 日間のブドウ糖通量の定量化を示しています (n = 6 枚/群、異なるブタから、単方向分散分析を実行; ###p < 0.001、D0 との比較、***p < 0.001、D12 Ctrl との比較）。 C の線図は 4 つの条件すべてを示します ((ctrl 、 td 、 mc 、 mt) 新心経切片 切片 切片 比較、培養後 12 日の通量定量 (n = 6 枚/群、豚由来、 、 、 、 、 、 、ブタは単独で分散分析を実行した；###p < 0.001、D0 との比較、***p < 0.001、D12 Ctrl との比較）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 dayней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней、односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0、***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль)。 c 培養後 12 日目のグルコース フラックスの定量化を示すヒストグラムは、4 つの培養条件すべて (コントロール、TD、MC、および MT) について、新鮮な心臓切片 (D0) と比較しています (n = 6 切片/グループ、異なる豚から採取、片側)。ANOVA テストを実行したところ、D0 と比較して ###p < 0.001、D12 (コントロール) と比較して ***p < 0.001。d 新鮮組織（青）、12日目MC組織（緑）、12日目MT組織（赤）の10箇所の局所組織切片におけるひずみ解析プロット（n = 4スライス/群、一元配置分散分析；群間有意差なし）。e 新鮮心臓切片（D0）と、10～12日間、静的条件（Ctrl）またはMT条件（MT）で培養した心臓切片を比較したボルケーノプロット。f 各培養条件下で培養した心臓切片のサルコメア遺伝子のヒートマップ。エラーバーは平均±標準偏差を表す。
脂肪酸酸化から解糖への切り替えに対する代謝依存は、心筋細胞の脱分化の特徴です。未熟な心筋細胞は、ATP産生に主にグルコースを使用し、クリステがほとんどない低形成のミトコンドリアを有しています5,32。グルコース利用分析により、MCおよびMT条件下では、グルコース利用は0日目の組織と同様であることが示されました（図4c）。しかし、Ctrlサンプルでは、​​新鮮組織と比較してグルコース利用が著しく増加しました。これは、CTCMとT3/Dexの組み合わせが組織生存率を高め、12日間培養された心臓切片の代謝表現型を維持することを示しています。さらに、歪み分析により、MTおよびMS条件下では、歪みレベルは12日間新鮮心臓組織と同じままであることが示されました（図4d）。
CTCM と T3/Dex が心臓切片組織の全体的な転写ランドスケープに及ぼす全体的な影響を分析するために、4 つの異なる培養条件から得た心臓切片に対して RNAseq を実行しました (補足データ 1)。興味深いことに、MT 切片は新鮮な心臓組織と高い転写類似性を示し、13,642 個の遺伝子のうち、わずか 16 個の差次的発現を示した。しかし、先に示したように、Ctrl 切片では培養 10～12 日後に 1229 個の差次的発現遺伝子を示した (図 4e)。これらのデータは、心臓および線維芽細胞遺伝子の qRT-PCR によって確認されました (補足図 7a-c)。興味深いことに、Ctrl 切片では、心臓および細胞周期遺伝子のダウンレギュレーションと、炎症遺伝子プログラムの活性化が示されました。これらのデータは、通常長期培養後に発生する脱分化が、MT 条件下では完全に減弱することを示唆しています (補足図 8a、b)。サルコメア遺伝子の綿密な研究により、MT条件下でのみサルコメア（図4f）およびイオンチャネル（補足図9）をコードする遺伝子が保存され、Ctrl、TD、MC条件下での抑制から保護されることが示されました。これらのデータは、機械的刺激と体液性刺激（T3/Dex）を組み合わせることで、心臓切片のトランスクリプトームが培養12日後も新鮮心臓切片と類似した状態を維持できることを示しています。
これらの転写研究の知見は、心臓切片中の心筋細胞の構造的完全性がMT条件下で12日間最も良好に保たれているという事実によって裏付けられています。これは、コネキシン43が完全かつ局所的に局在していることからも明らかです（図5a）。さらに、MT条件下での心臓切片における線維化は、対照群と比較して有意に減少し、新鮮心臓切片と同程度でした（図5b）。これらのデータは、機械的刺激とT3/Dex処理の組み合わせが、培養心臓切片において心臓構造を効果的に維持することを示しています。
新鮮に単離された心臓切片（D0）または4つすべての心臓切片培養条件で12日間培養されたトロポニンT（緑）、コネキシン43（赤）、およびDAPI（青）の代表的な免疫蛍光画像（スケールバー= 100 µm）。 心臓組織の構造的完全性の人工知能による定量化 (n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC、および D12 MT) スライス/グループ、異なる豚から、一元配置分散分析テストを実行; D0 と比較して ####p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して *p < 0.05、または ****p < 0.0001)。 心臓組織の構造的完全性の人工知能による定量化 (n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC、および D12 MT) スライス/グループ、異なる豚から、一元配置分散分析テストを実行; #### D0 と比較して p < 0.0001、*p < 0.05、または ****D12 Ctrl と比較して p < 0.0001)。 Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12) Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC および D12 MT) срезов/группу от разных свиней、проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 人工知能を使用した心臓組織の構造的完全性の定量化 (n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、異なる豚からの 5 (D12 TD、D12 MC、および D12 MT) セクション/グループ、一元配置分散分析テストを実行; D0 と比較して #### p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して *p < 0.05 または ****p < 0.0001)。異なる猪の心臓組織構造の完全性（n = 7（D0 および D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC および D12 MT）切片/組）に対して、手動智能量化を実行し、一方向分散分析を実行；#### p < 0.0001 および D0 (*p < 0.05 相対比、または ***p < 0.0001 と D12 Ctrl 相対比)。異なる猪の心脏構造の完全性 (n = 7 (d0 および d12 ctrl) (5 (d12 td 、 d12 mc および d12 mt) 組） 人工智能量化進行 单方向 单方向 测试 ; ########## p < 0.0001 と D0 および *p < 0.05 の比較、または ****p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較）。人工知能を使用して、異なる豚（n = 7（D0 および D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC、および D12 MT）セクション/グループ）の心臓組織の構造的完全性を一元配置分散分析テストで定量化。#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 #### D0 と比較した p < 0.0001、D12 Ctrl と比較した *p < 0.05 または ****p < 0.0001)。 b マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表画像と定量化（スケールバー = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、およびD12 MC）、9（D12 MT）切片/グループ、異なる豚、一元配置分散分析テストを実施、####p < 0.0001（D0と比較）、***p < 0.001、または****p < 0.0001（D12 Ctrlと比較）。 b マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表画像と定量化（スケールバー = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、およびD12 MC）、9（D12 MT）切片/グループ、異なる豚、一元配置分散分析テストを実施、####p < 0.0001（D0と比較）、***p < 0.001、または****p < 0.0001（D12 Ctrlと比較）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окраленных трихромным красителем Массона (маслытабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний分散分析; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 または ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 b マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表画像と定量化（スケールバー = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、およびD12 MC）、9（D12 MT）切片/グループ、異なる豚から、一元配置分散分析を実行；####p < 0.0001 vs. D0および***p < 0.001または****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl）。 b マッソン三色染料で染色した心臓切片の代表的な画像と量化（比尺 = 500 μm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD および D12 MC）、異なる雄豚の 9 頭（D12 MT）切片/群からの単因方位差分析を実施；####p < 0.0001 と D0 の比較、***p < 0.001、または ***p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較）。 b マッソン三色染料を使用した心脛切片の代表性と量化 （比寸法 = 500 μm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td および d12 mc） 異なる 9 枚からの d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 / グループを対象に、要素方差分析を実行します；####p < 0.0001 対 D0 相対比、***p < 0.001、または ***p < 0.0001 対 D12 Ctrl 相対比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окраленных трихромом Массона (масbolичественная) линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0、D12 Ctrl、D12 TD および D12 MC)、9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 ポンドсравнению с D0、***p < 0,001 または ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 b マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表画像と定量化（スケールバー = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、D12 MC）、9（D12 MT）異なる豚/グループの切片、1つのANOVA法、D0と比較して####p < 0.0001、D12 Ctrlと比較して***p < 0.001または****p < 0.0001）。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
最後に、心臓組織の伸張を増加させることで、CTCM の心臓肥大を模倣する能力を評価しました。CTCM では、最大気室圧が 80 mmHg から 80 mmHg Art. (通常伸張) に増加し、最大 140 mmHg Art. になりました (図 6a)。これは、32% の伸張の増加に相当します (図 6b)。これは、心臓切片が肥大で見られるのと同様のサルコメア長を達成するために必要な対応する伸張率として以前に示されていました。収縮および弛緩中の心臓組織の伸張と速度は、6 日間の培養中一定でした (図 6c)。MT 条件の心臓組織を、6 日間、通常伸張 (MT (通常)) または過剰伸張条件 (MT (OS)) にさらしました。培養 4 日後には、肥大バイオマーカー NT-ProBNP が、MT (通常) 条件と比較して、MT (OS) 条件の培地で有意に増加していました (図 7a)。さらに、培養6日後、MT（OS）（図7b）の細胞サイズは、MT心臓（正常）の切片と比較して有意に増加しました。さらに、過伸展組織ではNFATC4の核転座が有意に増加していました（図7c）。これらの結果は、過伸展後の病理学的リモデリングの進行を示しており、CTCMデバイスが伸展誘発性心肥大シグナル伝達を研究するためのプラットフォームとして使用できるという概念を裏付けています。
エアチャンバー圧力、流体チャンバー圧力、および組織移動の測定値の代表的なトレースは、チャンバー圧力が流体チャンバー圧力を変化させ、それに応じて組織スライスが動くことを裏付けています。b 通常に伸長した (オレンジ) 組織切片と過度に伸長した (青) 組織切片の代表的な伸長率と伸長率曲線。c 棒グラフは、周期時間 (n = 19 スライス/グループ、異なる豚)、収縮時間 (n = 18～19 スライス/グループ、異なる豚)、緩和時間 (n = 19 スライス/グループ、異なる豚)、組織移動の振幅 (n = 14 スライス/グループ、異なる豚)、最大収縮期速度 (n = 14 スライス/グループ、異なる豚)、および最大緩和率 (n = 14 (D0)、15 (D6) ) 切片/グループ) を示しています。両側 Student t 検定では、どのパラメーターにも有意差は見られませんでしたエラーバーは平均±標準偏差を表します。
MT通常伸展（Norm）または過伸展（OS）条件下で培養された心臓切片の培養液中のNT-ProBNP濃度を定量化した棒グラフ（n = 4（D2 MTNorm）、3（D2 MTOS、D4 MTNorm、およびD4 MTOS）切片/グループ、異なる豚、二元配置分散分析を実行、**通常伸展と比較してp < 0.01）。 MT通常伸張（Norm）または過剰伸張（OS）条件下で培養された心臓切片の培養液中のNT-ProBNP濃度を定量化した棒グラフ（n = 4（D2 MTNorm）、3（D2 MTOS、D4 MTNorm、およびD4 MTOS）切片/グループ、異なる豚、二元配置分散分析を実行、**通常伸張と比較してp < 0.01）。通常の MT ストレッチ (norm) または過剰ストレッチ (OS) の条件下で培養された心臓スライスの培養液中の NT-ProBNP 濃度の定量ヒストグラム (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm、および D4 MTOS) スライス/グループ、異なる豚から、2 因子分散分析を実行しました。**p < 0,01 は сравнению с нормальным растяжением)。 **通常のストレッチと比較したp < 0.01。 a MT 正常伸長 (Norm) または過度伸長 (OS) 条件下で培養した心臓切片培養基における NT-ProBNP 濃度の縞状図量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm および D4) MTOS）異なるブタの切片/集合から採取し、双方向差分析を実施；** 正常伸長との比較、p < 0.01）。 a MT ノーマルストレッチ (Norm) またはオーバーストレッチ (OS) 条件下で培養した心臓切片中の NT-ProBNP 濃度の定量化 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm および D4 MTOS)、異なる豚の切片/グループから、双方向に発信可能; **通常のストレッチと比較、p < 0.01)。ヒストグラム 正常な MT ストレッチ (norm) または過剰ストレッチ (OS) の条件下で培養された心臓スライス内の NT-ProBNP 濃度の定量化 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm)、および D4 MTOS) スライス/グループ、異なる豚から、二元配置分散分析。**p < 0,01 は сравнению с нормальным растяжением)。 **通常のストレッチと比較したp < 0.01。 b トロポニンTおよびWGAで染色した心臓切片の代表画像（​​左）と細胞サイズの定量化（右）（n = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/グループ、異なる豚の10つの異なる切片から、両側スチューデントt検定を実行、****通常の伸長と比較してp < 0.0001）。 b トロポニンTおよびWGAで染色した心臓切片の代表画像（​​左）と細胞サイズの定量化（右）（n = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/グループ、異なる豚の10つの異なる切片から、両側スチューデントt検定を実行、****p < 0.0001、通常伸長と比較）。 b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрагенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 は сравнению с нормальным растяжением)。 b トロポニンTおよびAZPで染色した心臓切片の代表画像（​​左）と細胞サイズの定量化（右）（n = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/群、異なる豚の10の異なる切片、両側スチューデントt検定を実施、****正常株と比較してp < 0.0001）。 b 筋肉タンパク質-TおよびWGA（左）および細胞サイズ化（右）で染色した心臓切片の代表的な画像（n = 330（D6 MTOS）、異なる豚の10個の異なる切片からの369（D6 MTNorm）細胞/グループ、2つは尾学生を含む）検査；通常の伸長との比較、****p < 0.0001）。 b カルカレインTおよびWGAで染色した心臓切片の代表画像（​​左）と細胞サイズ（右）（n = 330（D6 MTOS）、10の異なる切片から369（D6 MTNorm））細胞/組、両方法でt検定を実施；通常の伸張と比較、****p < 0.0001）。 b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрагенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 は сравнению с нормальным растяжением)。 b トロポニンTおよびAZPで染色した心臓切片の代表画像（​​左）と細胞サイズの定量化（右）（n = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）、異なる豚の10の異なる切片から）細胞/グループ、両側基準Student t; ****p < 0.0001（通常株と比較）。 c トロポニンTおよびNFATC4で免疫標識した0日目および6日目MTOS心臓スライスの代表画像と、CMの核へのNFATC4の転座の定量化（異なる豚からのn = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ、両側スチューデントt検定を実行；*p < 0.05）。 c トロポニンTおよびNFATC4で免疫標識した0日目および6日目MTOS心臓スライスの代表画像と、CMの核へのNFATC4の転座の定量化（異なる豚からのn = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ、両側スチューデントt検定を実行、*p < 0.05）。 c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 dayней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных Свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0.05)。 c 0日目と6日目の心臓切片の代表画像。トロポニンTとNFATC4の免疫標識と、海綿体細胞の核におけるNFATC4転座の定量化（異なる豚からn = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ）、両側スチューデントt検定を実行；*p < 0.05）。 c 筋肉タンパク質-TおよびNFATC4免疫標識に使用される第0天および第6天MTOS心臓切片の代表的な画像、および異なるブタ由来のNFATC4のCM細胞核への容易な量化（n = 4（D0）、3（D6 MTOS）切片/組、双尾研究を実施）検査；*p < 0.05)。 c カルカニン T および NFATC4 免疫標識の 0 日目および 6 日目の MTOS 心臓スライス、および異なる NFATC4 からの NFATC4 の CM 細胞核への容易な定量化の代表的な画像 (n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切礼/組織、時間双尾学生電影；*p < 0.05)。 c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0.05)。 c トロポニンTおよびNFATC4の免疫標識と、異なる豚のCMの核におけるNFATC4転座の定量化のための0日目と6日目のMTOS心臓スライスの代表画像（​​n = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ、両側t基準スチューデント; *p < 0.05）。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
心血管トランスレーショナル研究には、心臓環境を正確に再現する細胞モデルが必要です。本研究では、心臓の超薄切片を刺激できるCTCMデバイスを開発し、その特性を評価しました。CTCMシステムには、生理学的に同期した電気機械刺激と、T3およびDexによる体液エンリッチメントが含まれています。ブタ心臓切片をこれらの因子に曝露したところ、培養12日後でも、生存率、構造的完全性、代謝活性、および転写発現は新鮮な心臓組織と同等でした。さらに、心臓組織を過度に伸展させると、過伸展による心臓肥大を引き起こす可能性があります。全体として、これらの結果は、正常な心臓表現型の維持における生理的培養条件の重要性を裏付け、薬剤スクリーニングのためのプラットフォームを提供します。
心筋細胞の機能と生存にとって最適な環境を作り出すには、多くの因子が寄与しています。これらの因子の中で最も顕著なものは、(1)細胞間相互作用、(2)電気機械的刺激、(3)体液性因子、(4)代謝基質です。生理的な細胞間相互作用は、細胞外マトリックスに支えられた複数の細胞種からなる複雑な三次元ネットワークを必要とします。このような複雑な細胞間相互作用は、個々の細胞種をin vitroで共培養することで再現することは困難ですが、心臓切片の器官型特性を利用することで容易に実現できます。
心筋細胞の機械的ストレッチと電気刺激は、心臓の表現型を維持するために重要です33,34,35。機械的刺激は hiPSC-CM の調整と成熟に広く使用されていますが、最近、いくつかの優れた研究で、培養中の心臓スライスに一軸荷重を使用して機械的刺激が試みられました。これらの研究は、2D 一軸機械的荷重が培養中の心臓の表現型にプラスの影響を与えることを示しています。これらの研究では、心臓の切片に等尺性張力17、線形緊張増加荷重18 を負荷するか、力変換器フィードバックと張力駆動を使用して心周期を再現しました。しかし、これらの方法は環境の最適化なしに一軸組織ストレッチを使用するため、多くの心臓遺伝子の抑制や異常なストレッチ応答に関連する遺伝子の過剰発現が生じます。ここで説明するCTCMは、心拍周期と生理学的伸張（伸張25%、収縮40%、拡張60%、毎分72拍）に関して自然な心周期を模倣した3次元電気機械刺激を提供します。この3次元機械刺激だけでは組織の完全性を維持するのに十分ではありませんが、組織の生存率、機能、および完全性を適切に維持するには、体液性刺激とT3/Dexを用いた機械刺激の組み合わせが必要です。
体液性因子は、成体心臓の表現型の調節に重要な役割を果たしています。これは、細胞成熟を促進するために培養培地に T3 と Dex を添加した HiPS-CM 研究で強調されました。T3 は、細胞膜を介したアミノ酸、糖、カルシウムの輸送に影響を及ぼす可能性があります36。さらに、T3 は MHC-α の発現と MHC-β のダウンレギュレーションを促進し、胎児 CM の遅筋原線維と比較して、成熟心筋細胞での速筋原線維の形成を促進します。甲状腺機能低下症患者の T3 欠乏は、筋原線維バンドの消失と緊張発達速度の低下をもたらします37。Dex はグルココルチコイド受容体に作用し、単離灌流心臓の心筋収縮力を高めることが示されています。38 この改善は、カルシウム沈着駆動性流入 (SOCE) への影響に関連していると考えられています39,40。さらに、Dex は受容体に結合し、免疫機能と炎症を抑制する広範な細胞内反応を引き起こします30。
我々の研究結果は、物理的機械的刺激 (MS) により Ctrl と比較して全体的な培養パフォーマンスが向上したものの、培養 12 日間で生存率、構造的完全性、および心臓発現を維持できなかったことを示している。Ctrl と比較して、CTCM (MT) 培養に T3 および Dex を添加すると、12 日間新鮮な心臓組織で生存率が向上し、同様の転写プロファイル、構造的完全性、および代謝活動が維持された。さらに、組織の伸展の程度を制御することで、STCM を使用して過伸展誘発性心臓肥大モデルが作成され、STCM システムの多用途性が示された。心臓リモデリングと線維化には通常、循環細胞が適切なサイトカイン、貪食作用、およびその他のリモデリング因子を提供できる無傷の臓器が関与しているが、心臓の一部はストレスや外傷に反応して線維化プロセスを模倣できることに留意すべきである。 CTCMのパラメータは、圧力／電気振幅および周波数を変化させることで調整可能であり、頻脈、徐脈、機械的循環補助（機械的無負荷心臓）など、様々な状態をシミュレートできることに留意すべきである。これにより、本システムは薬物試験において中程度のスループットを実現できる。CTCMが過労誘発性心肥大をモデル化できることは、個別化治療に向けた本システムの試験への道を開くものである。結論として、本研究は、機械的伸展と体液刺激が心臓組織切片の培養維持に不可欠であることを実証した。
ここで提示されたデータは、CTCM が健常心筋のモデル化に非常に有望なプラットフォームであることを示唆していますが、この培養法にはいくつかの限界があります。CTCM 培養の主な限界は、スライスに継続的に動的な機械的ストレスをかけるため、各サイクルで心臓スライスの収縮を能動的に監視することができないことです。さらに、心臓切片のサイズが小さい (7 mm) ため、従来の力センサーを使用して培養システム外で収縮機能を評価する能力は限られています。現在の原稿では、収縮機能の指標として光電圧を評価することで、この限界を部分的に克服しました。ただし、この限界にはさらなる研究が必要であり、カルシウムや電圧感受性色素を使用した光学マッピングなど、培養中の心臓スライスの機能を光学的に監視する方法を導入することで将来的に対処できる可能性があります。CTCM のもう 1 つの限界は、作業モデルが生理学的ストレス (前負荷および後負荷) を操作できないことです。 CTCMでは、非常に大きな組織において、拡張期（完全伸展）と収縮期（電気刺激中の収縮の長さ）における25%の生理的伸展を再現するために、反対方向に圧力を印加していました。将来のCTCM設計では、心臓組織に両側から適切な圧力を加え、心腔内で発生する圧力と容積の関係を正確に適用することで、この制限は解消されるはずです。
本稿で報告されている過伸展誘発性リモデリングは、肥大性過伸展シグナルの模倣に限定されています。したがって、このモデルは、体液性因子や神経性因子（本システムには存在しない）を必要とせずに、伸展誘発性肥大シグナル伝達の研究に役立つ可能性があります。CTCMの多様性を高めるには、例えば免疫細胞との共培養、循環血漿中の体液性因子、神経細胞との共培養における神経支配など、さらなる研究が必要です。これらの研究は、CTCMを用いた疾患モデル化の可能性を高めるでしょう。
本研究では13頭のブタを用いた。すべての動物実験は施設ガイドラインに従って実施され、ルイビル大学動物実験委員会の承認を得た。大動脈弓をクランプし、心臓に滅菌心筋保護液（110 mM NaCl、1.2 mM CaCl₂、16 mM KCl、16 mM MgCl₂、10 mM NaHCO₂、5 U/mLヘパリン、pH 7.4まで）1Lを灌流した。 心臓は、通常 10 分未満で氷上で研究室に輸送されるまで、氷冷した心停止液中で保存されました。 心臓は、通常 10 分未満で氷上で研究室に輸送されるまで、氷冷した心停止液中で保存されました。 Лердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно所要時間 <10 分 心臓は、氷上で研究室に輸送されるまで、氷冷した心停止液中で保存されました。輸送には通常 10 分未満しかかかりません。心臓は、実験室に送られるまで、通常１０分未満の間、冷たい心臓滞留液中に保存される。心臓は、実験室に送られるまで、通常１０分未満の間、冷たい心臓滞留液中に保存される。 所要時間は 10 分以内です。 心臓を氷上で心停止させ、研究室に搬送するまで、通常 10 分未満で氷上に保ちます。
CTCMデバイスは、SolidWorksコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して開発されました。培養チャンバー、仕切り、エアチャンバーはCNC加工された透明アクリル樹脂製です。直径7mmのバックアップリングは中央に高密度ポリエチレン（HDPE）製で、下部の培地を密閉するためのシリコンOリングを装着するためのOリング溝が設けられています。培養チャンバーと分離プレートは薄いシリカ膜で仕切られています。シリコン膜は厚さ0.02インチのシリコンシートからレーザーカットされており、硬度は35Aです。底部と上部のシリコンガスケットは厚さ1/16インチのシリコンシートからレーザーカットされており、硬度は50Aです。ブロックの固定と気密シールには、316Lステンレス鋼製のネジと蝶ナットが使用されています。
C-PACE-EMシステムと統合するために、専用のプリント基板（PCB）が設計されています。PCB上のスイス製コネクタソケットは、銀メッキ銅線と、電極にねじ込まれた青銅製の0-60ネジによってグラファイト電極に接続されています。プリント基板は3Dプリンターのカバー内に配置されています。
CTCM装置は、心拍周期に類似した制御された循環圧を生成するプログラム可能な空気圧アクチュエータ（PPD）によって制御されます。気室内の圧力が上昇すると、柔軟なシリコン膜が上方に膨張し、組織部位の下に媒体を押し込みます。この液体の排出によって組織領域が伸張し、拡張期における心臓の生理的拡張を模倣します。弛緩のピーク時に、グラファイト電極を介して電気刺激が印加され、気室内の圧力が低下し、組織片が収縮します。パイプ内には、空気システム内の圧力を検出するための圧力センサーを備えた止血弁があります。圧力センサーによって感知された圧力は、ラップトップに接続されたデータコレクターに送られます。これにより、気室内の圧力を継続的に監視できます。最大チャンバー圧力（標準 80 mmHg、OS 140 mmHg）に達すると、データ収集デバイスは C-PACE-EM システムに信号を送信し、4 V に設定された 2 ms の二相性電圧信号を生成するように指示されました。
心臓切片を作製し、6つのウェルでの培養条件を以下のように実施した：採取した心臓を移送容器から冷（4℃）心筋保護液の入ったトレイに移す。左心室を滅菌刃で分離し、1～2cm3の断片に切断する。これらの組織ブロックを組織接着剤で組織支持体に取り付け、タイロード液を含み持続的に酸素供給された振動式ミクロトーム組織浴（3g/L 2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）、140mM NaCl（8.18g）、6mM KCl（0.447g）、10mM D-グルコース（1.86g）、10mM HEPES（2.38g）、1mM MgCl2（1M溶液1ml）、1.8mM CaCl2（1M溶液1.8ml）、最大1L ddH2O）に入れた。振動ミクロトームは、周波数 80 Hz、水平振動振幅 2 mm、前進速度 0.03 mm/s で 300 µm の厚さのスライスを切断するように設定されました。組織槽は溶液を冷却するために氷で囲まれており、温度は 4°C に維持されていました。ミクロトーム槽から、氷上で継続的に酸素化されたタイロード溶液を含むインキュベーション槽に組織切片を移し、1 枚の培養プレートに十分な切片が得られるまで続けます。トランスウェル培養の場合、組織切片を滅菌した 6 mm 幅のポリウレタン サポートに取り付け、6 ml の最適化された培地 (199 培地、1x ITS サプリメント、10% FBS、5 ng/ml VEGF、10 ng/ml FGF-アルカリ性、2X 抗生物質抗真菌) に置きました。電気刺激 (10 V、周波数 1.2 Hz) を C-Pace を通じて組織切片に適用しました。 TD条件では、培地交換のたびに新鮮なT3とDexを100 nMと1 μM添加した。培地は1日3回交換前に酸素で飽和させた。組織切片は37℃、5% CO2のインキュベーター内で培養した。
CTCM培養では、組織切片を、修正タイロード溶液の入ったペトリ皿内の特注3Dプリンターに置きました。この装置は、心臓のスライスのサイズをサポートリングの面積の25%増やすように設計されています。これは、心臓の切片がタイロード溶液から培地に移された後、および拡張期に伸びないようにするためです。ヒストアクリル接着剤を使用して、厚さ300µmの切片を直径7mmのサポートリングに固定しました。組織切片をサポートリングに取り付けた後、余分な組織切片を切り取り、取り付けた組織切片を氷上（4°C）のタイロード溶液の浴槽に戻し、1つの装置に十分な切片が作成されるまで置きます。すべての装置の合計処理時間は2時間を超えてはなりません。6つの組織切片をサポートリングに取り付けた後、CTCM装置を組み立てました。CTCM培養チャンバーには、21mlの酸素化培地が事前に充填されています。組織切片を培養チャンバーに移し、ピペットで気泡を慎重に除去します。次に、組織切片を穴に導き、軽く押し付けて固定します。最後に、電極キャップをデバイスに取り付け、デバイスをインキュベーターに移します。次に、CTCMをエアチューブとC-PACE-EMシステムに接続します。空気圧アクチュエータが開き、エアバルブがCTCMを開きます。C-PACE-EMシステムは、2msの二相性ペーシング中に1.2Hzで4Vを供給するように設定されました。電極へのグラファイトの蓄積を避けるため、培地は1日2回交換し、電極は1日1回交換しました。必要に応じて、組織切片を培養ウェルから取り出し、ウェルの下に落ちた可能性のある気泡を排出することができます。MT処理条件では、培地交換ごとに100nM T3および1μM Dexを含むT3/Dexを新鮮添加しました。CTCMデバイスは、37°C​​、5% CO2のインキュベーターで培養しました。
心臓スライスの伸張した軌跡を取得するために、特別なカメラシステムが開発されました。SLRカメラ（Canon Rebel T7i、Canon、東京、日本）をNavitar Zoom 7000 18-108mmマクロレンズ（Navitar、サンフランシスコ、カリフォルニア州）とともに使用しました。培地を新しい培地に交換した後、可視化を室温で実行しました。カメラは51°の角度で配置され、ビデオは30フレーム/秒で録画されます。最初に、オープンソースソフトウェア（MUSCLEMOTION43）をImage-Jで使用して、心臓スライスの動きを定量化しました。ノイズを避けるために、拍動する心臓スライスの関心領域を定義するマスクは、MATLAB（MathWorks、ネイティック、マサチューセッツ州、米国）を使用して作成されました。手動でセグメント化されたマスクは、フレームシーケンス内のすべての画像に適用され、その後、MUSCLEMOTIONプラグインに渡されます。Muscle Motionは、各フレームのピクセルの平均強度を使用して、参照フレームに対する動きを定量化します。データは記録、フィルタリングされ、心拍周期中の周期時間を定量化し、組織の伸張を評価するために使用されました。記録されたビデオは、一次零位相デジタルフィルタを用いて後処理されました。組織の伸張（ピークツーピーク）を定量化するために、記録された信号のピークと谷を区別するためにピークツーピーク解析が行われました。さらに、信号ドリフトを除去するために、6次多項式を用いたトレンド除去が行われました。MATLABでプログラムコードを作成し、組織全体の動き、周期時間、緩和時間、収縮時間を求めました（補足プログラムコード44）。
ひずみ解析では、機械的伸張評価用に作成したのと同じ動画を用いて、まずMUSCLEMOTIONソフトウェアを用いて、運動のピーク（運動の最高点（上側）と最低点（下側））を表す2枚の画像をトレースしました。次に、組織領域をセグメント化し、セグメント化した組織にシェーディングアルゴリズムを適用しました（補足図2a）。セグメント化した組織は10個のサブサーフェスに分割され、各サーフェスの応力は次の式を用いて計算されました：ひずみ = (Sup-Sdown)/Sdown。ここで、SupとSdownは、それぞれ布地の上部と下部の影からの形状までの距離です（補足図2b）。
心臓切片を4%パラホルムアルデヒドで48時間固定した。固定した組織は10%および20%ショ糖で1時間脱水し、その後30%ショ糖で一晩脱水した。切片は最適切断温度コンパウンド（OCTコンパウンド）に包埋し、イソペンタン/ドライアイス浴中で徐々に凍結した。OCT包埋ブロックは分離するまで-80℃で保存した。スライドは厚さ8μmの切片として作製した。
心臓切片からOCTを除去するには、スライドを加熱ブロック上で95℃、5分間加熱します。各スライドにPBS 1 mlを加え、室温で30分間インキュベートします。その後、0.1% Triton-Xを含むPBS溶液を切片に15分間浸漬し、OCTを浸透させます。非特異的抗体がサンプルに結合するのを防ぐため、3% BSA溶液1 mlをスライドに加え、室温で1時間インキュベートします。その後、BSAを除去し、スライドをPBSで洗浄します。各サンプルに鉛筆で印を付けます。一次抗体（1% BSAで1:200に希釈）（コネキシン43（Abcam; 番号AB11370）、NFATC4（Abcam; 番号AB99431）およびトロポニンT（Thermo Scientific; 番号MA5-12960）を90分かけて加え、次にマウスAlexa Fluor 488（Thermo Scientific; 番号A16079）に対する二次抗体（1% BSAで1:200に希釈）およびウサギAlexa Fluor 594（Thermo Scientific; 番号T6391）に対する二次抗体をさらに90分間加え、PBSで3回洗浄しました。標的の染色をバックグラウンドから区別するために、二次抗体のみをコントロールとして使用しました。最後に、DAPI核染色を加え、スライドをベクターシールド（Vector Laboratories）に配置してマニキュアで密封しました。-倍の倍率）および40倍の倍率のKeyence顕微鏡。
WGA染色には、PBSで希釈した5μg/mlのWGA-Alexa Fluor 555（Thermo Scientific; #W32464）を用い、固定切片に室温で30分間染色した。その後、スライドをPBSで洗浄し、各スライドにスーダンブラックを添加して30分間インキュベートした。さらに、スライドをPBSで洗浄し、ベクターシールド包埋剤を添加した。スライドはKeyence社製顕微鏡で40倍の倍率で観察した。
上述の通り、サンプルからOCTを除去しました。OCTを除去後、スライドをブアン溶液に一晩浸しました。その後、スライドを蒸留水で1時間すすぎ、ビブリッヒアロエ酸フクシン溶液に10分間浸しました。次に、スライドを蒸留水で洗浄し、5%リンモリブデン/5%リンタングステン酸溶液に10分間浸しました。すすぎをせずに、スライドをアニリンブルー溶液に直接移し、15分間浸しました。次に、スライドを蒸留水で洗浄し、1%酢酸溶液に2分間浸しました。スライドを200 Nエタノールで乾燥させ、キシレンに移しました。染色したスライドは、10倍対物レンズを装着したKeyence顕微鏡で観察しました。線維化面積の割合は、Keyence Analyzerソフトウェアを使用して定量化しました。
CyQUANT™ MTT細胞生存能アッセイ（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）、カタログ番号V13154を、製造元のプロトコルに若干の改変を加えて実施した。特に、MTT分析中に組織サイズを均一に保つため、直径6 mmの外科用パンチを使用した。組織は、製造元のプロトコルに従い、MTT基質を含む12ウェルプレートのウェルに個別に播種した。切片を37℃で3時間インキュベートすると、生体組織はMTT基質を代謝して紫色のホルマザン化合物を生成する。心臓切片から紫色のホルマザンを抽出するため、MTT溶液を1 mlのDMSOに置換し、37℃で15分間インキュベートした。サンプルは96ウェル透明底プレートでDMSOで1:10に希釈し、Cytationプレートリーダー（BioTek）を用いて570 nmで紫色の発色強度を測定した。測定値は心臓の各切片の重量に標準化した。
心臓切片培地を、前述の通りグルコース利用アッセイのために1 μCi/mlの[5-3H]-グルコース（Moravek Biochemicals、カリフォルニア州ブレア、米国）を含む培地に交換した。4時間培養後、100 μlの培地を、0.2 N HCl 100 μlを含む開放型マイクロ遠心チューブに加えた。次に、チューブを500 μlのdH2Oを含むシンチレーションチューブに移し、37℃で72時間[3H]2Oを蒸発させた。その後、シンチレーションチューブからマイクロ遠心チューブを取り出し、シンチレーション液10 mlを加えた。シンチレーションカウントは、Tri-Carb 2900TR液体シンチレーションアナライザー（Packard Bioscience Company、コネチカット州メリデン、米国）を用いて行った。次に、[5-3H]-グルコースの比活性、不完全平衡およびバックグラウンド、[5-3H]-グルコースの非標識グルコースへの希釈、およびシンチレーションカウンターの効率を考慮してグルコース利用率を計算した。データは心臓切片の質量で正規化されている。
Trizolで組織をホモジェナイズした後、Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874を用いてメーカーのプロトコルに従い心臓切片からRNAを単離した。RNAsecライブラリの調製、シーケンシング、およびデータ解析は以下のように実施した。
RNAライブラリ調製の開始材料として、サンプルあたり1μgのRNAを使用しました。シーケンスライブラリは、メーカーの推奨に従って、NEBNext UltraTM RNAライブラリ調製キット for Illumina (NEB、米国) を使用して生成し、各サンプルの属性シーケンスにインデックスコードを追加しました。簡単に説明すると、ポリTオリゴヌクレオチドを結合させた磁気ビーズを使用して、total RNAからmRNAを精製しました。断片化は、NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X)中で、高温で二価カチオンを使用して行いました。第1鎖cDNAは、ランダムヘキサマープライマーとM-MuLV逆転写酵素（RNase H-）を使用して合成しました。次に、第2鎖cDNAは、DNAポリメラーゼIとRNase Hを使用して合成しました。残りのオーバーハングは、エキソヌクレアーゼ/ポリメラーゼ活性によって平滑末端に変換されました。 DNA断片の3'末端をアデニル化した後、ヘアピンループ構造を持つNEBNextアダプターを付加してハイブリダイゼーションの準備を整えます。好ましい長さ150～200 bpのcDNA断片を選択するために、AMPure XPシステム（Beckman Coulter、米国ビバリー）を使用してライブラリ断片を精製しました。次に、サイズ選択されたcDNAをアダプターと連結した3μlのUSER酵素（米国NEB）を、PCRの前に37°Cで15分間、続いて95°Cで5分間使用しました。次に、Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ、ユニバーサルPCRプライマー、およびIndex（X）プライマーを使用してPCRを実行しました。最後に、PCR産物を精製し（AMPure XPシステム）、Agilent Bioanalyzer 2100システムでライブラリの品質を評価しました。次に、cDNAライブラリをNovaseqシーケンサーを使用してシーケンスしました。 Illumina の Raw イメージファイルは、CASAVA Base Calling を使用して Raw リードに変換されました。Raw データは、リード配列と対応する塩基品質を含む FASTQ(fq) 形式のファイルに保存されます。フィルタリングされたシーケンスリードを Sscrofa11.1 リファレンスゲノムと一致させるには、HISAT2 を選択します。HISAT2 は、40 億塩基を超えるゲノムを含むあらゆるサイズのゲノムをサポートし、ほとんどのパラメータにデフォルト値が設定されています。RNA Seq データからのスプライシングリードは、現在利用可能な最速システムである HISAT2 を使用して効率的にアライメントでき、他のどの方法と同等以上の精度が得られます。
転写産物の量は、遺伝子発現レベルを直接反映します。遺伝子発現レベルは、ゲノムまたはエクソンに関連する転写産物の量（シーケンシングカウント）によって評価されます。リード数は、遺伝子発現レベル、遺伝子長、およびシーケンシング深度に比例します。DESeq2パッケージを用いて、FPKM（シーケンシングされた転写産物の1000塩基対あたりのフラグメント数）を計算し、差次的発現のP値を決定しました。次に、組み込みR関数「p.adjust」に基づくBenjamini-Hochberg法9を用いて、各P値に対する偽発見率（FDR）を計算しました。
心臓切片から単離したRNAを、Thermo社のSuperScript IV Vilo Master mix（Thermo社、カタログ番号11756050）を用いて、濃度200 ng/μlのcDNAに変換した。定量的RT-PCRは、Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384ウェル透明反応プレート（Thermo社、カタログ番号4483319）およびMicroamp光学接着剤（Thermo社、カタログ番号4311971）を用いて実施した。反応混合物は、ウェルあたり5μlのTaqman Fast Advanced Master mix（Thermo社、カタログ番号4444557）、0.5μlのTaqman Primer、および3.5μlのH2Oを混合したものであった。標準qPCRサイクルを実行し、Applied Biosystems Quantstudio 5リアルタイムPCR装置（384ウェルモジュール、製品番号A28135）を用いてCT値を測定した。 TaqmanプライマーはThermoより購入しました（GAPDH（Ss03375629_u1）、PARP12（Ss06908795_m1）、PKDCC（Ss06903874_m1）、CYGB（Ss06900188_m1）、RGL1（Ss06868890_m1）、ACTN1（Ss01009508_mH）、GATA4（Ss03383805_u1）、GJA1（Ss03374839_u1）、COL1A2（Ss03375009_u1）、COL3A1（Ss04323794_m1）、ACTA2（Ss04245588_m1）。全サンプルのCT値はハウスキーピング遺伝子GAPDHに正規化しました。
NT-ProBNPの培地からの放出は、NT-ProBNPキット（ブタ）（カタログ番号MBS2086979、MyBioSource）を用いて、製造元のプロトコルに従って評価しました。簡単に説明すると、各サンプルおよび標準物質250µlを各ウェルに2連で添加しました。サンプル添加後すぐに、アッセイ試薬A 50µlを各ウェルに加えます。プレートを軽く振ってシーラントで密封します。その後、錠剤を37°Cで1時間インキュベートしました。その後、溶液を吸引し、ウェルを1倍洗浄液350µlで4回洗浄し、洗浄液を毎回1～2分間インキュベートしました。その後、ウェルあたりアッセイ試薬B 100µlを加え、プレートシーラントで密封しました。錠剤を軽く振って、37°C​​で30分間インキュベートしました。溶液を吸引し、1倍希釈の洗浄液350µLでウェルを5回洗浄する。各ウェルに基質溶液90µLを加え、プレートをシールする。プレートを37℃で10～20分間インキュベートする。各ウェルに反応停止液50µLを加える。プレートは直ちにCytation（BioTek社製）プレートリーダーを用いて450 nmに設定した波長で測定した。
検出力分析を実行して、タイプ I のエラー率 5% でパラメータの絶対値 10% の変化を検出するために 80% を超える検出力を提供するグループ サイズを選択しました。 検出力分析を実行して、タイプ I のエラー率 5% でパラメータの絶対値 10% の変化を検出する検出力が 80% を超えるグループ サイズを選択しました。 Анализ мощности был выполнен для выбора размеров группп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой обсток типа I. 検出力分析を実行して、5% のタイプ I エラー率で 10% の絶対パラメータ変化を検出するために 80% を超える検出力を提供するグループ サイズを選択しました。性能分析を行って、測定パラメータ中の１０％の変化および５％のＩ型試薬率で８０％を超える電力を提供するものを選択した。性能分析を行って、測定パラメータ中の１０％の変化および５％のＩ型試薬率で８０％を超える電力を提供するものを選択した。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты озибок типа I. 10% の絶対パラメータ変化と 5% のタイプ I エラー率を検出するために 80% を超える検出力を提供するグループ サイズを選択するために、検出力分析が実行されました。組織切片は実験前にランダムに選択された。すべての解析は条件盲検で行われ、サンプルは全データの解析後にのみデコードされた。すべての統計解析はGraphPad Prismソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて行われた。 すべての統計において、p 値は 0.05 未満の値で有意であると判断されました。 すべての統計において、p値は0.05未満の値で有意であるとみなされました。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. すべての統計において、p値は0.05未満の値で有意であるとみなされました。すべての記録データについて、p 値は値 < 0.05 であると見なされます。すべての記録データについて、p 値は値 < 0.05 であると見なされます。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. すべての統計において、p値は0.05未満の値で有意であるとみなされました。比較が2回のみのデータに対して、両側スチューデントt検定を実施しました。複数群間の有意差判定には、一元配置分散分析または二元配置分散分析を使用しました。事後検定では、多重比較を考慮するためにTukeyの補正を適用しました。RNAsecデータについては、「方法」セクションに記載されているように、FDRとp.adjustの計算において特別な統計的考慮事項があります。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research Report の概要を参照してください。