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薬物検査のために心臓の生理学的環境を正確に再現できる、信頼性の高い in vitro システムが必要です。ヒト心臓組織培養システムの利用可能性が限られているため、心臓の薬の効果が不正確に解釈されています。今回我々は、心臓スライスを電気機械的に刺激し、心周期の収縮期および拡張期に生理学的ストレッチを行う心臓組織培養モデル（CTCM）を開発しました。12 日間の培養後、このアプローチにより心臓切片の生存率は部分的に改善されましたが、構造的完全性は完全には保存されませんでした。したがって、小分子スクリーニングの後、100 nM トリヨードチロニン (T3) と 1 μM デキサメタゾン (Dex) を培地に添加すると、切片の微細構造が 12 日間維持されることがわかりました。T3/Dex 治療と組み合わせた CTCM システムは、転写プロファイル、生存率、代謝活性、および構造的完全性を新鮮な心臓組織と同じレベルに 12 日間維持しました。さらに、培養中の心臓組織の過剰な伸張は肥大性心臓シグナル伝達を誘導し、心臓の伸張によって誘発される肥大状態を模倣するCTCMの能力の証拠を提供する。結論として、CTCM は長期にわたって培養中の心臓の生理機能と病態生理機能をモデル化し、信頼性の高い薬物スクリーニングを可能にします。
臨床研究の前に、人間の心臓の生理学的環境を正確に再現できる信頼性の高い in vitro システムが必要です。このようなシステムは、機械的ストレッチ、心拍数、および電気生理学的特性の変化を模倣する必要があります。動物モデルは心臓生理学のスクリーニング プラットフォームとして一般的に使用されますが、人間の心臓における薬物の影響を反映する信頼性は限られています 1,2。最終的に、理想的な心臓組織培養実験モデル (CTCM) は、さまざまな治療的および薬理学的介入に対して高感度かつ特異的であり、人間の心臓の生理機能と病態生理学を正確に再現するモデルです3。このようなシステムが存在しないため、心不全の新しい治療法の発見が制限され4,5、薬物の心毒性が市場から撤退する主な理由となっています6。
過去 10 年間で、QT 間隔の延長を引き起こし、心室性不整脈や突然死を引き起こすため、8 種類の非心臓血管薬が臨床使用から中止されました 7。したがって、心血管の有効性と毒性を評価するための信頼できる前臨床スクリーニング戦略の必要性が高まっています。最近、薬物スクリーニングおよび毒性試験におけるヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞 (hiPS-CM) の使用により、この問題の部分的な解決策が提供されます。ただし、hiPS-CM の未熟な性質と心臓組織の多細胞の複雑さの欠如が、この方法の大きな制限です。最近の研究では、初期の hiPS-CM を使用して自発収縮の開始直後に心臓組織ヒドロゲルを形成し、時間の経過とともに電気刺激を徐々に増加させることで、この制限を部分的に克服できることが示されています。しかし、これらの hiPS-CM 微小組織には、成人の心筋の成熟した電気生理学的特性と収縮特性が欠けています。さらに、ヒトの心臓組織はより複雑な構造をしており、内皮細胞、ニューロン、間質線維芽細胞などの異なる細胞種の不均一な混合物からなり、特定の細胞外マトリックスタンパク質のセットによって相互接続されています。成体哺乳動物の心臓における非心筋細胞集団のこの不均一性 11、12、13 は、個々の細胞タイプを使用して心臓組織をモデル化する際の大きな障壁となっています。これらの大きな制限は、生理学的および病理学的条件下で無傷の心筋組織を培養する方法を開発することの重要性を強調しています。
人間の心臓の培養された薄い (300 μm) 切片は、無傷の人間の心筋の有望なモデルであることが証明されています。この方法では、人間の心臓組織と同様の完全な 3D 多細胞システムへのアクセスが提供されます。しかし、2019年までは、培養生存期間が短い（24時間）ため、培養心臓切片の使用は制限されていました。これは、物理的機械的伸縮の欠如、気液界面、心臓組織のニーズをサポートしない単純な媒体の使用など、多くの要因によるものです。2019年、いくつかの研究グループは、心臓組織培養システムに機械的要因を組み込むことで、培養寿命を延長し、心臓発現を改善し、心臓病理を模倣できることを実証しました。2 つの優れた研究 17 および 18 は、一軸性の機械的負荷が培養中の心臓の表現型にプラスの影響を与えることを示しています。しかし、心臓切片には等尺性引張力 17 または線形自己緊張性負荷 18 のいずれかが負荷されているため、これらの研究では心周期の動的な三次元物理機械的負荷は使用されていません。これらの組織伸張方法は、多くの心臓遺伝子の抑制、または異常な伸張反応に関連する遺伝子の過剰発現をもたらしました。特に、ピトゥーリスら。19 は、力変換器フィードバックと張力ドライブを使用して心周期を再構築するための動的心臓スライス培養槽を開発しました。このシステムにより、より正確なインビトロ心周期モデリングが可能になりますが、方法の複雑さとスループットの低さにより、このシステムの適用が制限されます。私たちの研究室は最近、電気刺激と最適化された培地を使用して、ブタとヒトの心臓組織の切片の生存率を最大 6 日間維持するための簡略化された培養システムを開発しました 20,21。
現在の原稿では、心周期中の 3 次元の心臓生理学と病態生理学的な拡張を再現するために体液性の合図を組み込んだブタ心臓の切片を使用した心臓組織培養モデル (CTCM) について説明します。この CTCM は、前臨床薬物検査用に哺乳動物の心臓の生理機能/病態生理学を模倣した、費用対効果の高いミッドスループットの心臓システムを提供することにより、前臨床薬物予測の精度をこれまで達成できなかったレベルまで高めることができます。
血行力学的機械信号は、インビトロでの心筋細胞機能の維持に重要な役割を果たします 22、23、24。現在の原稿では、生理学的周波数 (1.2 Hz、毎分 72 拍) で電気的刺激と機械的刺激の両方を誘発することで成人の心臓環境を模倣できる CTCM (図 1a) を開発しました。拡張期中の組織の過剰な伸張を避けるために、3D プリント装置を使用して組織サイズを 25% 増加させました (図 1b)。C-PACE システムによって誘導される電気ペーシングは、心臓周期を完全に再現するためにデータ収集システムを使用して収縮期の 100 ミリ秒前に開始するようにタイミングが調整されました。組織培養システムは、プログラム可能な空気圧アクチュエータ (LB Engineering、ドイツ) を使用して、柔軟なシリコン膜を周期的に拡張し、上部チャンバー内の心臓スライスを拡張します。このシステムは圧力変換器を介して外部の空気ラインに接続されており、圧力（±1 mmHg）と時間（±1 ms）を正確に調整することができました（図1c）。
a デバイスの培養チャンバー内の、青で示されている 7 mm サポート リングに組織切片を取り付けます。培養チャンバーは、薄い柔軟なシリコン膜によって空気チャンバーから分離されています。漏れを防ぐために各チャンバーの間にガスケットを置きます。デバイスの蓋には、電気刺激を提供するグラファイト電極が含まれています。b 大型組織デバイス、ガイド リング、サポート リングの概略図。組織切片 (茶色) は、ガイド リングがデバイスの外縁の溝に配置された状態で、特大デバイス上に配置されます。ガイドを使用して、組織アクリル接着剤でコーティングされたサポート リングを心臓組織のセクション上に慎重に配置します。c プログラム可能な空気圧アクチュエータ (PPD) によって制御される空気室圧力の関数として電気刺激の時間を示すグラフ。データ収集デバイスを使用して、圧力センサーを使用して電気刺激を同期させました。培養チャンバー内の圧力が設定された閾値に達すると、パルス信号が C-PACE-EM に送信され、電気刺激がトリガーされます。d インキュベーターの棚に置かれた 4 つの CTCM の画像。4 つのデバイスが空気圧回路を介して 1 つの PPD に接続され、止血弁に圧力センサーが挿入されて空気圧回路内の圧力を監視します。各デバイスには 6 つの組織切片が含まれています。
単一の空気圧アクチュエータを使用して、それぞれ 6 つの組織切片を保持できる 4 つの CTCM デバイスを制御することができました (図 1d)。CTCM では、空気室の空気圧が流体室の同期圧力に変換され、心臓スライスの生理学的拡張を引き起こします (図 2a および補足ムービー 1)。80 mm Hg での組織の伸びの評価。美術。は、組織切片が 25% 伸びることを示しました (図 2b)。この伸長率は、正常な心臓切片の収縮性における生理学的サルコメアの長さ 2.2 ～ 2.3 μm に相当することが示されています 17、19、25。組織の動きは、カスタム カメラ設定を使用して評価されました (補足図 1)。組織運動の振幅と速度（図2c、d）は、心周期中の伸長と収縮期および拡張期の時間（図2b）に対応しました。収縮および弛緩中の心臓組織の伸張および速度は、培養中で12日間一定のままでした（図2f）。培養中の収縮性に対する電気刺激の影響を評価するために、シェーディングアルゴリズムを使用して活動的な変形を決定する方法を開発し（補足図2a、b）、電気刺激の有無による変形を区別することができました。心臓の同じ部分（図 2f）。切断の可動領域 (R6-9) では、電気刺激中の電圧は電気刺激がない場合より 20% 高く、これは電気刺激が収縮機能に寄与していることを示しています。
空気室の圧力、流体室の圧力、および組織の動きの測定の代表的なトレースにより、室の圧力が流体室の圧力を変化させ、それに対応して組織スライスの動きが引き起こされることが確認されます。b 伸び率 (オレンジ) に対応する組織切片の伸び率 (青) の代表的なトレース。c 心臓スライスの測定された動きは、測定された動きの速度と一致しています。(d) 心臓のスライスにおける周期運動 (青線) と速度 (オレンジ色の点線) の代表的な軌跡。e サイクル時間（異なるブタからのグループあたり n = 19 スライス）、収縮時間（グループあたり n = 19 スライス）、弛緩時間（異なるブタからのグループあたり n = 19 スライス）、組織運動（n = 25）の定量化。異なるブタからのスライス）/グループ）、ピーク収縮速度（異なるブタからの n = 24（D0）、25（D12）スライス/グループ）、およびピーク弛緩速度（異なるブタからの n = 24（D0）、25（D12）スライス/グループ）。両側スチューデント t 検定では、どのパラメータにも有意差は示されませんでした。f 電気刺激あり（赤）およびなし（青）の組織切片の代表的なひずみ解析トレース、同じ切片からの組織切片の 10 個の領域。下のパネルは、異なる切片の 10 個の領域で電気刺激を行った場合と行わなかった組織切片のひずみのパーセンテージ差の定量化を示しています。 (異なるブタからの n = 8 スライス/グループ、両側スチューデント t 検定を実行します; ****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05)。 (異なるブタからの n = 8 スライス/グループ、両側スチューデント t 検定を実行します; ****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05)。 (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001、**p<0,01、*p<0,05)。 (n = 異なるブタからの 8 切片/グループ、両側スチューデント t 検定; ****p<0.0001、**p<0.01、*p<0.05)。 （n = 8 枚/グループ、異なるブタ由来、双尾動物試験を実施；****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05）。 （n = 8 枚/グループ、異なるブタ由来、双尾動物試験を実施；****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001、**p <0,01、*p <0,05)。 (n = 8 切片/グループ、異なるブタから、両側スチューデント t 検定; ****p<0.0001、**p<0.01、*p<0.05)。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
私たちの以前の静的生体模倣心臓スライス培養システム [20、21] では、電気刺激を加え培地組成を最適化することにより、心臓スライスの生存率、機能、および構造的完全性を 6 日間維持しました。しかし、10日後、これらの数値は急激に減少しました。以前の静的生体模倣培養システム 20、21 制御条件 (Ctrl) で培養した切片を参照し、以前に最適化した培地を MC 条件として使用し、機械的および電気的同時刺激 (CTCM) の下で培養します。と呼ばれる。まず、電気刺激を伴わない機械的刺激では組織の生存率を6日間維持するには不十分であると判断しました（補足図3a、b）。興味深いことに、MTT 分析で示されているように、STCM を使用した物理機械的および電気的刺激の導入により、12 日間の心臓切片の生存率は MS 条件下では新鮮な心臓切片と同じままでしたが、Ctrl 条件下ではそうではありませんでした (図 1)。3a)。これは、機械的刺激と心周期のシミュレーションにより、組織切片を以前の静置培養システムで報告されている期間の 2 倍の期間生存し続けることができることを示唆しています。しかし、心筋トロポニン T およびコネキシン 43 の免疫標識による組織切片の構造的完全性の評価では、コネキシン 43 の発現が 12 日目の MC 組織で同日の対照よりも有意に高いことが示されました。しかし、均一なコネキシン 43 発現と Z ディスク形成は完全には維持されませんでした (図 3b)。私たちは人工知能 (AI) フレームワークを使用して組織の構造的完全性 26 を定量化し、トロポニン T とコネキシン染色 43 に基づいた画像ベースの深層学習パイプラインを使用して、局在化の強さの観点から心臓切片の構造的完全性と蛍光を自動的に定量化します。この方法は、参考文献で説明されているように、畳み込みニューラル ネットワーク (CNN) と深層学習フレームワークを使用して、自動かつ公平な方法で心臓組織の構造的完全性を確実に定量化します。ＭＣ組織は、静的対照切片と比較して、０日目との改善された構造的類似性を示した。さらに、マッソントリクローム染色により、培養12日目の対照条件と比較して、MS条件下では線維症の割合が有意に低いことが明らかになりました（図3c）。CTCM は、12 日目の心臓組織切片の生存率を新鮮な心臓組織と同様のレベルまで増加させましたが、心臓切片の構造的完全性を大幅に改善することはありませんでした。
棒グラフは、新鮮な心臓スライス (D0) または静置培養 (D12 Ctrl) または CTCM (D12 MC) で 12 日間培養した心臓スライスの MTT 生存率の定量化を示します (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl)、12 (D12 MC) スライス/グループ、異なるブタから、一元配置 ANOVA 検定を実行; D0 と比較して ####p < 0.0001 **D12 Ctrl と比較して p < 0.01)。 棒グラフは、新鮮な心臓スライス (D0) または静置培養 (D12 Ctrl) または CTCM (D12 MC) で 12 日間培養した心臓スライスの MTT 生存率の定量化を示します (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl )、12 (D12 MC) スライス/グループ、異なるブタから、一元配置 ANOVA 検定を実行; D0 と比較して ####p < 0.0001および **D12 Ctrl と比較して p < 0.01)。ヒストグラムは、MTT 新鮮心臓切片 (D0) または静置培養 (D12 対照) または CTCM (D12 MC) のいずれかで 12 日間培養した心臓切片の生存率の定量化を示します (n = 18 (D0)、15 (D12 対照)。))、異なるブタからの 12 (D12 MC) 切片/グループ、一元配置 ANOVA 検定が実行されます。####p < 0,0001 по сравнению с D0 または **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)。 D0 と比較して ####p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して **p < 0.01)。 静的培養（D12 Ctrl）またはCTCM（D12 MC）（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl）中の新しい心脛切片（D0）または心脛切片培養12天のMTT活力の量化）における、異なるブタの12（D12 MC）切片/群からのストリップ図。 、単方向分散分析を行った；D0との比較、#### p < 0.0001、D12 Ctrlとの比較、** p < 0.01）。 縞模様の図は、静的培養 (D12 Ctrl) または CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl) 中の新しい心脏切片 (D0) 、異なる豚からの 12 (D12 MC) 切片 / 群での単一方向分散分析の実行を示しています。相対比、####p < 0.0001、D12 Ctrl との相対比、**p。)新鮮な心臓切片（D0）、または静置培養（D12 対照）またはCTCM（D12 MC）で12日間培養した心臓切片（D12 MC）（n = 18（D0）、15（D12 対照））、異なるブタからの12（D12 MC）切片/グループ、一元配置ANOVA検定におけるMTT生存率の定量化を示すヒストグラム。####p < 0,0001 по сравнению с D0、**p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)。 D0 と比較して ####p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して **p < 0.01)。b 代表的な免疫蛍光画像（ブランクスケール = 100 μm）の、新しく単離された心臓切片（D0）または静的条件（Ctrl）またはCTCM条件（MC）下で12日間培養された心臓切片におけるトロポニン-T（緑色）、コネキシン43（赤色）およびDAPI（青色）。 心臓組織の構造的完全性の人工知能による定量化（異なるブタからそれぞれ n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス/グループ、一元配置分散分析テストを実行; D0 と比較して ####p < 0.0001、および D12 Ctrl と比較して ****p < 0.0001)。 心臓組織の構造的完全性の人工知能による定量化 (異なるブタからそれぞれ n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス/グループ、一元配置 ANOVA 検定を実行; D0 と比較して ####p < 0.0001、および D12 Ctrl と比較して ****p < 0.0001)。 Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению D12 Ctrl)。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化（異なるブタからの n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) 切片/グループ、一元配置分散分析試験を実施; ####p < 0.0001 対 D0 および ****p < 0.0001、D12 Ctrl と比較)。人工知能化心臓組織の構造の完全性（異なるブタの各グループ当たり n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス、一元配置 ANOVA 検定;####p < 0.0001 対 D0 相対比、****p < 0.0001 対 D12 Ctrl 相対比)。人工知能化心臓組織構造の完全性（n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス/グループ、それぞれ異なるブタ、一元配置分散分析試験;####p < 0.0001 と D0 の比較、****p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較)。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12) MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D1 2 Ctrl)。 心臓組織の構造的完全性を定量化する人工知能 (異なるブタのそれぞれ n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) 切片/グループ、一元配置分散分析検定; ####p<0.0001 vs .D0 比較用 ****D12 Ctrl と比較して p < 0.0001)。 c マッソントリクローム染色で染色した心臓スライスの代表的な画像（左）と定量化（右）（スケールベア = 500 μm）（異なるブタからそれぞれ n = 10 スライス/グループ、一元配置分散分析検定を実行します;####p < 0.0001 D0 と比較して、***p < 0.001 D12 Ctrl と比較して）。 c マッソントリクローム染色で染色した心臓スライスの代表的な画像（左）と定量化（右）（スケールベア = 500 μm）（異なるブタからそれぞれ n = 10 スライス/グループ、一元配置分散分析検定を実行します。#### D0 と比較して p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して ***p < 0.001）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окразенных трихромным красител ем Массона (масbolняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0, 0001 は сравнению с D0 または ***p < 0,001 は сравнению с D12 Ctrl)。 c マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表的な画像（左）と定量化（右）（コーティングされていないスケール = 500 μm）（異なるブタからの n = 10 切片/グループ、一元配置分散分析検定を実行; #### D0 と比較して p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して ***p < 0.001）。 c マッソン三色染料で染色した心臓切片の代表的な画像（左）と量化（右）（尺度 = 500 μm）（n = 10 枚の切片/組、各組は異なるブタに由来し、単方向分散分析を行った。#### p < 0.0001 対 D0 相比、***p < 0。 001 と D12 Ctrl の比較）。 C マッソン三色染料を使用した心脏切片の代表性 （左 左） 量化 （右） 裸度 裸尺度 裸尺度 = 500 μm） （n = 10 枚の切片群を異なる猪から、単方向分散分析を行った。 # p < 0.0001 と D0 の比較、***p < 0.001 と D12 Ctrl の比較）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окраленных трихромным красителе м Массона (чистая зкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторног о дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)。 c マッソントリクローム染色で染色した心臓切片の代表的な画像（左）と定量（右）（ブランク = 500 μm）（n = 10 切片/グループ、それぞれ異なるブタから、一元配置分散分析によってテスト;### # D0 と比較して p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して ***p < 0.001）。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
私たちは、小分子を培地に添加することにより、CTCM 培養中に心筋細胞の完全性が改善され、線維症の発生が減少する可能性があると仮説を立てました。したがって、交絡因子の数が少ないため、静的制御培養物 20,21 を使用して小分子をスクリーニングしました。このスクリーニングには、デキサメタゾン (Dex)、トリヨードチロニン (T3)、および SB431542 (SB) が選択されました。これらの小分子は、サルコメアの長さ、T 細管、および伝導速度を増加させることによって心筋細胞の成熟を誘導するために、hiPSC-CM 培養で以前に使用されてきました。さらに、Dex (糖質コルチコイド) と SB は両方とも炎症を抑制することが知られています 29,30。したがって、これらの小分子を 1 つまたは組み合わせて含めることで心臓切片の構造的完全性が改善されるかどうかをテストしました。最初のスクリーニングでは、各化合物の用量は、細胞培養モデルで一般的に使用される濃度 (1 μM Dex27、100 nM T327、および 2.5 μM SB31) に基づいて選択されました。12日間の培養後、T3とDexの組み合わせにより、最適な心筋細胞の構造的完全性と最小限の線維リモデリングが得られました（補足図4および5）。さらに、これらの濃度のT3およびDexを2倍または2倍に使用すると、通常の濃度と比較して有害な影響が生じました（補足図6a、b）。
最初のスクリーニングの後、4 つの培養条件の直接比較を実行しました (図 4a): Ctrl: 最適化された培地を使用して前述の静的培養で培養した心臓切片。20.21 TD: T3 と Ctrl s 水曜日に Dex を追加。MC: 事前に最適化された培地を使用して CTCM で培養された心臓切片。MT: T3 および Dex を培地に添加した CTCM。12日間の培養後、MSおよびMT組織の生存率は、MTTアッセイで評価した新鮮組織と同じままでした（図4b）。興味深いことに、トランスウェル培養物 (TD) への T3 および Dex の添加は、Ctrl 条件と比較して生存率の有意な改善をもたらさず、心臓切片の生存率の維持における機械的刺激の重要な役割を示しています。
12日間の培地に対する機械的刺激とT3/Dex補給の効果を評価するために使用した4つの培養条件を示す実験設計図。 b 棒グラフは、新鮮な心臓スライス（D0）と比較した、4つの培養条件（Ctrl、TD、MC、およびMT）すべてでの培養12日後の生存率の定量化を示しています（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TDおよびD12 MT）、12（D12 MC）スライス/グループ、異なるブタから、一元配置ANOVAテストを実行します; ####p < 0.0001、 D0 と比較して ###p < 0.001、D12 Ctrl と比較して **p < 0.01)。 b 棒グラフは、新鮮な心臓スライス（D0）と比較した、4つの培養条件（Ctrl、TD、MC、およびMT）すべてでの培養12日後の生存率の定量化を示しています（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TDおよびD12 MT）、12（D12 MC）スライス/グループ、異なるブタから、一元配置ANOVAテストを実行します; ####p < 0.0001、 D0 と比較して ###p < 0.001、D12 コントロールと比較して **p < 0.01)。 b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 dayней после культивирования во всех 4 услов иях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 1 2 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,0 1 つ сравнению с D12 Ctrl)。 b 棒グラフは、異なるブタからの新鮮心臓切片（D0）（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TD、および D12 MT）、12（D12 MC）切片/グループ、一元配置 ANOVA 検定）と比較した、4 つすべての培養条件（コントロール、TD、MC、および MT）における培養後 12 日目の生存率の定量化を示します。####p < 0.0001、###p D0 に対して < 0.001、D12 Ctrl との比較により **p < 0.01)。 b ストライプ図は、4 つの培養条件すべて (Ctrl、TD、MC、MT) と新しい心腓切片 (D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD および D12 MT)、異なる雄牛の 12 (D12 MC) 切片/群からの単一方向分散分析を示しています)実験；####p < 0.0001、###p < 0.001 と D0 の比較、**p < 0.01 と D12 制御）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца ( D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD および D12 MT)、от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа、односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12)。 b 新鮮な心臓切片（D0）と比較した4つの培養条件すべて（コントロール、TD、MC、およびMT）を示すヒストグラム（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TDおよびD12 MT）、異なるブタ12（D12 MC）切片/グループ由来、一元配置分散分析試験; ####p<0.0001、###p<0.001 vs. D0、**p<0.01対対照 D12)。 c 棒グラフは、新鮮な心臓スライス（D0）と比較した、4つの培養条件すべて（Ctrl、TD、MC、およびMT）での培養後12日目のグルコースフラックスの定量化を示しています（異なるブタからのn = 6スライス/グループ、一元配置分散分析検定を実行します;D0と比較して###p < 0.001、およびD12 Ctrlと比較して***p < 0.001）。 c 棒グラフは、新鮮な心臓スライス（D0）と比較した、4つの培養条件すべて（Ctrl、TD、MC、およびMT）での培養後12日目のグルコースフラックスの定量化を示しています（異なるブタからのn = 6スライス/グループ、一元配置分散分析検定を実行します;D0と比較して###p < 0.001、およびD12 Ctrlと比較して***p < 0.001）。 c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 dayней после культивирования во всех 4 условия х культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, о) дносторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)。 c ヒストグラムは、新鮮な心臓切片（D0）と比較した、4つの培養条件すべて（コントロール、TD、MC、およびMT）での培養後12日目のグルコースフラックスの定量化を示しています（異なるブタからのn = 6切片/グループ、一元配置ANOVAテストを実行しました; D0と比較して###p < 0.001およびD12 Ctrlと比較して***p < 0.001）。 c 棒グラフは、4 つのすべての培養条件 (Ctrl、TD、MC、MT) と新しい心臓切片 (D0) との比較を示しています。培養後の 12 日間のブドウ糖通量を定量化しました (n = 6 枚/群、異なるブタから、単方向分散分析を実行しました。###p < 0.001、D0 との比較、 ***p < 0.001 と D12 Ctrl の比較）。 C の線図は 4 つの条件すべてを表示します ((ctrl 、 td 、 mc および mt) 新心経切片 切片 切片 比較、培養後 12 日の通量定量 (n = 6 枚/群、豚由来、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ＡＮＯＶＡ試験を単方向に実行した；###p < 0.001、D0 との比較、***p < 0.001、D12 Ctrl との比較）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 dayней после культивирования для всех 4 у словий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свин) ей, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль)。 c 新鮮な心臓切片（D0）と比較した、4つの培養条件すべて（コントロール、TD、MC、およびMT）の培養後12日目のグルコースフラックスの定量化を示すヒストグラム（n = 6切片/グループ、異なるブタから、片側Were ANOVAテストを実行しました、D0と比較して###p < 0.001、D12と比較して***p < 0.001（コントロール））。d 10の局所組織切片ポイントにおける新鮮（青）、12日目MC（緑）、および12日目MT（赤）組織のひずみ分析プロット（n = 4スライス/グループ、一元配置ANOVAテスト;グループ間に有意差はありませんでした）。e 静的条件（Ctrl）またはMT条件（MT）で10〜12日間培養した心臓切片と比較して、新鮮な心臓切片（D0）で差次的に発現された遺伝子を示す火山プロット。f 各培養条件下で培養された心臓切片のサルコメア遺伝子のヒートマップ。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
脂肪酸酸化から解糖への切り替えに対する代謝依存は、心筋細胞の脱分化の特徴です。未熟な心筋細胞は主に ATP 産生にグルコースを使用し、クリステがほとんどない低形成ミトコンドリアを持っています 5,32。グルコース利用分析により、MCおよびMT条件下では、グルコース利用が0日目の組織と同様であることが示されました(図4c)。ただし、Ctrl サンプルでは、​​新鮮な組織と比較してグルコース利用の大幅な増加が示されました。これは、CTCM と T3/Dex の組み合わせが組織の生存率を高め、12 日間培養した心臓切片の代謝表現型を保存することを示しています。さらに、ひずみ分析により、MTおよびMS条件下で12日間、ひずみレベルが新鮮な心臓組織と同じままであることが示されました（図4d）。
心臓切片組織の全体的な転写状況に対するCTCMおよびT3 / Dexの全体的な影響を分析するために、4つの異なる培養条件すべてからの心臓切片に対してRNAseqを実行しました（補足データ1）。興味深いことに、MT 切片は新鮮な心臓組織と高い転写類似性を示し、13,642 個の遺伝子のうち差次的に発現したのは 16 個のみでした。ただし、以前に示したように、Ctrlスライスは、培養10〜12日後に1,229個の差次的に発現された遺伝子を表示しました（図4e）。これらのデータは、心臓および線維芽細胞遺伝子のqRT-PCRによって確認されました（補足図7a〜c）。興味深いことに、Ctrl セクションでは、心臓遺伝子と細胞周期遺伝子の下方制御、および炎症遺伝子プログラムの活性化が示されました。これらのデータは、通常、長期培養後に起こる脱分化が、MT条件下では完全に減衰することを示唆しています（補足図8a、b）。サルコメア遺伝子の慎重な研究により、MT条件下でのみサルコメア（図4f）およびイオンチャネル（補足図9）をコードする遺伝子が保存され、Ctrl、TD、およびMC条件下での抑制から保護されることが示されました。これらのデータは、機械的刺激と体液性刺激 (T3/Dex) の組み合わせにより、心臓切片のトランスクリプトームが培養 12 日後でも新鮮な心臓切片と同様の状態を維持できることを示しています。
これらの転写所見は、無傷で局在化したコネキシン43によって示されるように、心臓切片における心筋細胞の構造的完全性がMT条件下で12日間最もよく保存されるという事実によって裏付けられています（図5a）。さらに、MT条件下の心臓切片の線維症は、Ctrlと比較して、新鮮な心臓切片と同様に大幅に減少しました（図5b）。これらのデータは、機械的刺激と T3/Dex 治療の組み合わせにより、培養中の心臓切片の心臓構造が効果的に保存されることを示しています。
a 新たに単離された心臓切片（D0）、または 4 つの心臓切片培養条件すべてで 12 日間培養されたトロポニン T（緑）、コネキシン 43（赤）、および DAPI（青）の代表的な免疫蛍光画像（スケールバー = 100 μm）。）。 心臓組織の構造的完全性の人工知能による定量化 (n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、異なるブタからの 5 (D12 TD、D12 MC および D12 MT) スライス/グループ、一元配置 ANOVA 検定を実行; D0 と比較して ####p < 0.0001 および *p < 0.05、または ****p < 0.0001 D12 Ctrl と比較)。 心臓組織の構造的完全性の人工知能による定量化 (異なるブタからの n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC および D12 MT) スライス/グループ、一元配置 ANOVA 検定を実行; #### D0 と比較して p < 0.0001 および *p < 0.05、または ****p < 0.0001 D12 Ctrl と比較)。 Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC および D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,0 5 または ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 人工知能を使用した心臓組織の構造的完全性の定量化（異なるブタからの n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC および D12 MT) 切片/グループ、一元配置分散分析テストを実行; #### D0 と比較して p < 0.0001、および *p < 0.05 または ****p < 0.0001 D12 Ctrl と比較)。異なる猪の心臓組織構造の完全性（n = 7（D0 および D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC および D12 MT）切片/集団）に対して、手動智能量化を実行し、単方向分散分析を実行；#### p < 0.0001 および D0 および*p < 0.05 相対比、または ***p < 0.0001 (D12 Ctrl との相対比)。異なる猪の心構造完全性 （n = 7 （d0 および d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc および d12 mt） 組） 人工智能量化実行 单方向 单方向 测试 ; ########## p < 0.000 1 と D0 および *p < 0.05 の比較、または ***p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較）。人工知能を使用した、一元配置分散分析テストによるさまざまなブタ (n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC および D12 MT) 切片/グループ) における心臓組織の構造的完全性の定量化。#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 #### D0 と比較して p < 0.0001、および D12 Ctrl と比較して *p < 0.05 または ****p < 0.0001)。 b マッソントリクローム染色で染色された心臓スライスの代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 μm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、およびD12 MC）、異なるブタからの9（D12 MT）スライス/グループ、一元配置ANOVA検定が実行されます; ####D0と比較してp < 0.0001および***p < 0.001、または*** *D12 Ctrl と比較して p < 0.0001)。 b マッソントリクローム染色で染色された心臓スライスの代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 μm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、およびD12 MC）、異なるブタからの9（D12 MT）スライス/グループ、一元配置ANOVA検定が実行されます; ####D0と比較してp < 0.0001および***p < 0.001、または*** *D12 Ctrl と比較して p < 0.0001)。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окраленных трихромным красителем Массона (мас) втабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0、D12 Ctrl、D12 TD および D12 MC)、9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней、выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 b マッソントリクローム染色で染色された心臓切片の代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 μm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TDおよびD12 MC）、異なるブタからの9（D12 MT）切片/グループ、一元配置分散分析を実行; ####p < 0.0001 vs. D0および***p < 0.001または****p < 0.0 001 対 D12 Ctrl)。 b マッソン三色染料で染色した心臓切片の代表的な画像と量化（比尺 = 500 μm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD および D12 MC）、異なる豚の 9 枚（D12 MT）切片/グループから、単因方差分析を実施；####p < 0.0001 と D0相対比、***p < 0.001、または ***p < 0.0001 (D12 Ctrl との相対比)。 b マッソン三色染料を使用した心脛切片の代表性と量化 （比寸法 = 500 μm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td および d12 mc） 異なる 9 枚からの d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 / グループを対象に、要素方差分析を実行します；####p < 0.0001 と D0 の比較、***p < 0.001、または ***p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окраленных трихромом Массона (масbolичественная лине) йка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравн ению с D0、***p < 0,001 または ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 b マッソントリクロームで染色された心臓切片の代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 μm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TDおよびD12 MC）、異なるブタ/グループからの9（D12 MT）切片、1つのANOVA法; ####p < 0.0001、D0と比較して、***p < 0.001または****p < 0.0001 D12 Ctrl と比較)。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
最後に、心肥大を模倣する CTCM の能力を、心臓組織の伸張を増加させることによって評価しました。CTCM では、空気室のピーク圧力が 80 mmHg から 80 mmHg に増加しました。美術。(通常のストレッチ) 140 mmHg まで Art.(図6a)。これは、伸長の 32% 増加に相当します (図 6b)。これは、心臓切片が肥大で見られるのと同様のサルコメア長を達成するために必要な対応する伸長率として以前に示されました。収縮および弛緩時の心臓組織の伸張および速度は、6日間の培養中一定のままでした（図6c）。MT 条件の心臓組織を 6 日間、通常の伸長条件 (MT (Normal)) または過剰な伸長条件 (MT (OS)) にさらしました。培養4日後、すでに肥大性バイオマーカーNT-ProBNPは、MT（正常）条件と比較してMT（OS）条件下の培地中で有意に上昇しました（図7a）。さらに、6日間の培養後、MT（OS）の細胞サイズ（図7b）は、MT心臓（正常）の切片と比較して有意に増加しました。さらに、NFATC4の核移行は、過度に伸長した組織で有意に増加しました（図7c）。これらの結果は、過膨張後の病理学的リモデリングの進行性の発達を示しており、CTCM デバイスが伸張誘発性心肥大シグナル伝達を研究するためのプラットフォームとして使用できるという概念を裏付けています。
空気室の圧力、流体室の圧力、および組織の動きの測定の代表的なトレースにより、室の圧力が流体室の圧力を変化させ、それに対応して組織スライスの動きが引き起こされることが確認されます。b 通常伸長した組織切片（オレンジ色）と過度に伸長した組織セクション（青色）の代表的な伸長率曲線と伸長率曲線。c サイクル時間（異なるブタからのグループあたり n = 19 スライス）、収縮時間（グループあたり n = 18-19 スライス、異なるブタから）、弛緩時間（グループあたり n = 19 スライス、異なるブタから））、組織運動の振幅（n = 14 スライス/グループ、異なるブタから）、ピーク収縮速度（n = 14 スライス/グループ、異なるブタから）およびピーク弛緩率（n = 14）を示す棒グラフ。異なるブタからの (D0)、15 (D6) 切片/グループ)、両側スチューデント t 検定では、どのパラメーターにも有意差は示されず、これらのパラメーターは過電圧下での 6 日間の培養中に一定のままであることが示されました。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
MT 正常伸長 (Norm) または過剰伸長 (OS) 条件下で培養した心臓スライスの培地中の NT-ProBNP 濃度の棒グラフ定量化 (異なるブタからの n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm、および D4 MTOS) スライス/グループ、二元配置分散分析を実行します。**正常伸長と比較して p < 0.01)。 a MT通常伸長（Norm）または過剰伸長（OS）条件下で培養した心臓スライスからの培地中のNT-ProBNP濃度の棒グラフ定量化（異なるブタからのn = 4（D2 MTNorm）、3（D2 MTOS、D4 MTNorm、およびD4 MTOS）スライス/グループ、二元配置分散分析を実行します。**正常伸長と比較してp < 0.01）。異なるブタからの通常の MT ストレッチ (標準) または過剰ストレッチ (OS) の条件下で培養した心臓切片の培地中の NT-ProBNP 濃度の定量的ヒストグラム (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm、および D4).MTOS) スライス/グループ、2 因子分散分析が実行されます。**p < 0,01 は сравнению с нормальным растяжением)。 **通常のストレッチと比較して p < 0.01)。 a MT 正常伸長 (Norm) または過度伸長 (OS) 条件下で培養した心臓切片培養基中の NT-ProBNP 濃度の縞模様の定量化 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm および D4 MTOS)) 異なるブタの切片/群から得た、双方向差分析を実施；**正常な伸長との比較、p < 0.01）。 a MT ノーマルストレッチ (Norm) またはオーバーストレッチ (OS) 条件下で培養した心臓切片中の NT-ProBNP 濃度の定量化 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm および D4 MTOS)、異なる豚の切片/グループから、双方向に発信可能; **通常のストレッチと比較、p < 0.01)。ヒストグラム 異なるブタからの正常な MT ストレッチ (ノルム) またはオーバーストレッチ (OS) の条件下で培養された心臓スライス内の NT-ProBNP 濃度の定量化 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm)、および D4 MTOS) スライス/グループ、異なるブタからの二元配置分散分析。**p < 0,01 は сравнению с нормальным растяжением)。 **通常のストレッチと比較して p < 0.01)。 b トロポニン-TおよびWGAで染色された心臓スライスの代表的な画像（左）および細胞サイズの定量化（右）（異なるブタからの10の異なるスライスからのn = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/グループ、両側スチューデントt検定が実行されます。通常のストレッチと比較して****p < 0.0001）。 b トロポニン-TおよびWGAで染色した心臓スライスの代表的な画像（左）および細胞サイズの定量化（右）（異なるブタからの10の異なるスライスからのn = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/グループ、両側スチューデントt検定を実行します。通常のストレッチと比較して****p < 0.0001）。 b Репрезентативные изображения срезов сердца, окраленных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хв остовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением)。 b トロポニン-TおよびAZPで染色された心臓切片の代表的な画像（左）および細胞サイズの定量化（右）（異なるブタからの10の異なる切片からのn = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/グループ、両側スチューデントt検定を実行しました。正常な株と比較して****p < 0.0001）。 b 筋肉タンパク質-TおよびWGA（左）および細胞サイズ化（右）で染色した心臓切片の代表的な画像（n = 330（D6 MTOS）、異なるブタの10枚の異なる切片からの369（D6 MTNorm）細胞/集団、2つは尾学生検査を実施；正常伸長と比較，****p < 0.0001）。 b カルカレイン-TおよびWGAで染色された心臓スライスの代表的な画像（左）および細胞サイズ（右）（n = 330（D6 MTOS）、10の異なるスライスからの369（D6 MTNorm））細胞/組織、二方法有尾学生tテスト；通常のストレッチと比較、****p < 0.0001）。 b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрагенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка разме ра клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критер ий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением)。 b トロポニン-TおよびAZPで染色された心臓切片の代表的な画像（左）および細胞サイズの定量化（右）（異なるブタからの10の異なる切片からのn = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm））細胞/グループ、両側基準スチューデントのt。****正常株と比較して p < 0.0001)。 c トロポニン-TおよびNFATC4について免疫標識された0日目および6日目のMTOS心臓スライスの代表的な画像、およびCMの核へのNFATC4の転座の定量化（異なるブタからのn = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ、両側スチューデントt検定を実行します; * p < 0.05）。 c トロポニン T および NFATC4 で免疫標識された 0 日目および 6 日目の MTOS 心臓スライスの代表的な画像、および CM の核への NFATC4 の転座の定量化 (異なるブタからの n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) スライス/グループ、両側スチューデント t 検定を実行します; *p < 0.05)。 c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 dayней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественн NFATC4 と кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполнется дв усторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05)。 c トロポニン-TおよびNFATC4について免疫標識した0日目および6日目のMTOSの心臓切片の代表的な画像、および海綿体細胞の核におけるNFATC4転座の定量化（異なるブタからのn = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ）は、両側スチューデントt検定を実行しました。*p < 0.05)。 c 筋肉タンパク質-TおよびNFATC4免疫標識に使用される第0天および第6天MTOS心臓切片の代表的な画像、および異なるブタ由来のNFATC4のCM細胞核への容易な量化（n = 4（D0）、3（D6 MTOS）切片/組、双尾学生検査を実施；*p） < 0.05)。 c カルカニン T および NFATC4 免疫標識の 0 日目および 6 日目の MTOS 心臓スライス、および異なる NFATC4 からの NFATC4 の CM 細胞核への容易な定量化の代表的な画像 (n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切礼/組織、時間双尾学生電影；*p < 0.05)。 c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественна я оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюден та; *p < 0,05)。 c トロポニン-TおよびNFATC4免疫標識と、異なるブタのCM核におけるNFATC4転座の定量化のための、0日目および6日目のMTOS心臓スライスの代表的な画像（n = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ、両側t基準スチューデント; * p < 0.05）。エラーバーは平均±標準偏差を表します。
トランスレーショナル心臓血管研究には、心臓環境を正確に再現する細胞モデルが必要です。この研究では、心臓の極薄部分を刺激できる CTCM デバイスが開発され、その特徴が明らかにされました。CTCM システムには、生理学的に同期された電気機械刺激と、T3 および Dex 流体の濃縮が含まれています。ブタの心臓切片をこれらの因子に曝露すると、その生存率、構造的完全性、代謝活性、および転写発現は、12 日間培養した後の新鮮な心臓組織と同じままでした。さらに、心臓組織の過度の伸張は、過伸展による心臓肥大を引き起こす可能性があります。全体として、これらの結果は、正常な心臓表現型の維持における生理学的培養条件の重要な役割を裏付け、薬物スクリーニングのプラットフォームを提供する。
心筋細胞の機能と生存に最適な環境の構築には、多くの要因が寄与しています。これらの因子のうち最も明白なものは、(1) 細胞間相互作用、(2) 電気機械的刺激、(3) 体液性因子、および (4) 代謝基質に関連しています。生理学的細胞間相互作用には、細胞外マトリックスによってサポートされる複数の細胞タイプの複雑な三次元ネットワークが必要です。このような複雑な細胞相互作用は、個々の細胞型を共培養して in vitro で再構築することは困難ですが、心臓切片の器官型の性質を利用して容易に実現できます。
心筋細胞の機械的ストレッチと電気刺激は、心臓の表現型を維持するために重要です 33、34、35。機械的刺激は、hi​​PSC-CM のコンディショニングと成熟に広く使用されていますが、最近、いくつかのエレガントな研究で、一軸負荷を使用した培養心臓スライスの機械的刺激が試みられています。これらの研究は、2D 一軸機械的負荷が培養中の心臓の表現型にプラスの影響を与えることを示しています。これらの研究では、心臓の各部分に等尺性の引張力 17 、線形の要求張力 18 が負荷されるか、力変換器のフィードバックと張力駆動を使用して心周期が再現されます。しかし、これらの方法は環境の最適化を行わずに一軸性の組織伸長を使用するため、多くの心臓遺伝子の抑制や、異常な伸長反応に関連する遺伝子の過剰発現が生じます。ここで説明する CTCM は、サイクル タイムと生理学的ストレッチ (ストレッチ 25%、収縮期 40%、拡張期 60%、および毎分 72 拍) の点で自然な心周期を模倣する 3D 電気機械刺激を提供します。この 3 次元の機械的刺激だけでは組織の完全性を維持するには十分ではありませんが、組織の生存率、機能、完全性を適切に維持するには、T3/Dex を使用した体液性刺激と機械的刺激の組み合わせが必要です。
体液性因子は、成人の心臓の表現型を調節する上で重要な役割を果たします。このことは、細胞成熟を促進するために T3 と Dex を培地に添加した HiPS-CM 研究で強調されました。T3 は、細胞膜を通過するアミノ酸、糖、カルシウムの輸送に影響を与える可能性があります 36。さらに、T3 は MHC-α の発現と MHC-β の下方制御を促進し、胎児 CM の遅筋原線維と比較して、成熟心筋細胞の速筋原線維の形成を促進します。甲状腺機能低下患者における T3 欠乏は、筋原線維帯の喪失と緊張発達速度の低下をもたらします 37。Dex は糖質コルチコイド受容体に作用し、灌流された摘出心臓の心筋収縮性を高めることが示されています。38 この改善は、カルシウム沈着による侵入（SOCE）への影響に関連していると考えられています 39,40。さらに、Dex はその受容体に結合し、免疫機能と炎症を抑制する広範な細胞内反応を引き起こします 30。
我々の結果は、物理的機械的刺激（MS）はCtrlと比較して全体的な培養パフォーマンスを向上させましたが、培養中の12日間にわたる生存率、構造的完全性、および心臓発現を維持できなかったことを示しています。Ctrl と比較して、CTCM (MT) 培養物に T3 および Dex を添加すると生存率が向上し、新鮮な心臓組織と同様の転写プロファイル、構造的完全性、代謝活性が 12 日間維持されました。さらに、組織の伸張の程度を制御することにより、STCM を使用して過伸展誘発性心肥大モデルが作成され、STCM システムの多用途性が示されました。心臓リモデリングと線維化には通常、循環細胞が適切なサイトカインや食作用、その他のリモデリング因子を提供できる無傷の臓器が関与しますが、心臓の一部はストレスや外傷に応答して線維化プロセスを模倣する可能性があることに注意する必要があります。筋線維芽細胞に。これは、この心臓スライス モデルで以前に評価されています。CTCM パラメータは、圧力/電気振幅および周波数を変更することによって調整して、頻脈、徐脈、機械的循環サポート (機械的負荷のない心臓) などの多くの状態をシミュレートできることに注意してください。これにより、システムは薬物検査の中程度のスループットになります。過運動誘発性心肥大をモデル化する CTCM の機能により、個別化された治療のためにこのシステムをテストする道が開かれます。結論として、本研究は、機械的ストレッチと体液性刺激が心臓組織切片の培養を維持するために重要であることを実証しています。
ここで提示されたデータは、CTCM が無傷の心筋をモデル化するための非常に有望なプラットフォームであることを示唆していますが、この培養方法にはいくつかの制限があります。CTCM 培養の主な制限は、スライスに継続的な動的機械的ストレスを課すため、各サイクル中の心臓スライスの収縮を積極的に監視することができないことです。さらに、心臓切片のサイズが小さい (7 mm) ため、従来の力センサーを使用して培養システムの外で収縮機能を評価する能力は限られています。現在の原稿では、収縮機能の指標として光電圧を評価することにより、この制限を部分的に克服します。ただし、この制限にはさらなる研究が必要であり、将来的には、カルシウムや電位感受性色素を使用した光学マッピングなど、培養中の心臓切片の機能を光学的にモニタリングする方法を導入することで対処できる可能性があります。CTCM のもう 1 つの制限は、作業モデルが生理学的ストレス (前負荷と後負荷) を操作しないことです。CTCM では、非常に大きな組織の拡張期 (完全な伸長) と収縮期 (電気刺激中の収縮の長さ) の 25% の生理的伸張を再現するために、反対方向に圧力が誘導されました。この制限は、将来の CTCM 設計では、両側から心臓組織に適切な圧力を加え、心臓の室内で発生する正確な圧力と体積の関係を適用することによって取り除く必要があります。
この原稿で報告されている過伸長誘発リモデリングは、肥大性過伸長シグナルの模倣に限定されています。したがって、このモデルは、体液性因子や神経因子（このシステムには存在しない）を必要とせずに、伸張誘発性の肥大シグナル伝達の研究に役立ちます。CTCMの多様性を高めるにはさらなる研究が必要であり、例えば、免疫細胞との共培養、循環血漿液性因子、神経細胞との共培養時の神経支配などにより、CTCMによる疾患モデル化の可能性が向上する。
この研究では 13 頭のブタが使用されました。すべての動物手順は施設のガイドラインに従って実行され、ルイビル大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。大動脈弓をクランプし、心臓を 1 L の滅菌心停止剤 (110 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、16 mM KCl、16 mM MgCl2、10 mM NaHCO3、5 U/mL ヘパリン、pH 7.4 まで) で灌流しました。 心臓は、氷上の研究室に輸送されるまで（通常は10分未満）、氷冷した心停止溶液中で保存した。 心臓は、氷上の研究室に輸送されるまで（通常は10分未満）、氷冷した心停止溶液中で保存した。 Лердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <1 0分 心臓は、氷上の研究室に輸送されるまで、氷冷した心停止溶液中で保管された。通常、氷上の実験室には10分未満かかる。心臓は、実験室に送られるまで、通常１０分未満の間、冷たい心臓滞留液中に保存される。心臓は、実験室に送られるまで、通常１０分未満の間、冷たい心臓滞留液中に保存される。 所要時間は 10 分以内です。 心臓を氷上で研究室に輸送するまで、通常は10分未満の心停止状態に保ちます。
CTCM デバイスは、SolidWorks コンピュータ支援設計 (CAD) ソフトウェアで開発されました。培養チャンバー、ディバイダー、エアチャンバーは CNC 透明アクリルプラスチックで作られています。直径 7 mm のバックアップ リングは中央が高密度ポリエチレン (HDPE) でできており、その下のメディアをシールするために使用されるシリコン O リングを収容するための O リング溝があります。薄いシリカ膜が培養チャンバーを分離プレートから分離します。シリコーン膜は厚さ 0.02 インチのシリコーンシートからレーザーカットされ、硬度は 35A です。底部と上部のシリコンガスケットは厚さ1/16インチのシリコンシートからレーザーカットされており、硬度は50Aです。ブロックの固定と気密シールの作成には、316L ステンレス鋼のネジと蝶ナットが使用されます。
専用のプリント基板 (PCB) は、C-PACE-EM システムと統合されるように設計されています。PCB 上のスイス マシン コネクタ ソケットは、銀メッキ銅線と電極にねじ込まれた青銅の 0 ～ 60 ネジによってグラファイト電極に接続されています。プリント基板は 3D プリンターのカバー内に配置されます。
CTCM デバイスは、心周期と同様の制御された循環圧を生成するプログラム可能な空気圧アクチュエータ (PPD) によって制御されます。空気室内の圧力が上昇すると、柔軟なシリコン膜が上方に膨張し、媒体が組織部位の下に押し込まれます。組織の領域はこの液体の排出によって引き伸ばされ、拡張期中の心臓の生理学的拡張を模倣します。弛緩のピーク時に、グラファイト電極を通じて電気刺激が加えられ、これにより空気室内の圧力が低下し、組織切片の収縮が引き起こされました。パイプ内には、空気システム内の圧力を検出する圧力センサーを備えた止血弁があります。圧力センサーによって感知された圧力は、ラップトップに接続されたデータコレクターに適用されます。これにより、ガス室内の圧力を継続的に監視できます。最大チャンバー圧力 (標準 80 mmHg、140 mmHg OS) に達すると、データ収集デバイスは C-PACE-EM システムに信号を送信し、4 V に設定された 2 ミリ秒の二相電圧信号を生成するように命令されました。
心臓切片を取得し、６つのウェルにおける培養条件を以下のように行った：採取した心臓を移送容器から冷（４℃）心停止装置を含むトレイに移す。左心室を滅菌ブレードで摘出し、1～2 cm 3 の小片に切断しました。これらの組織ブロックを組織接着剤で組織支持体に取り付け、タイロード液を含む振動ミクロトーム組織槽に置き、連続的に酸素供給（3 g/L 2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）、140 mM NaCl（8.18 g））、6 mM KCl（0.447 g）、10 mM D-グルコース（1.86 g）、10 mM HEPES（2. 38 g)、1 mM MgCl2 (1 ml 1 M 溶液)、1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M 溶液)、最大 1 L ddH2O)。振動ミクロトームは、周波数 80 Hz、水平振動振幅 2 mm、前進速度 0.03 mm/s で厚さ 300 μm のスライスを切断するように設定されました。溶液を冷たく保つために組織浴を氷で囲み、温度を４℃に維持した。1 枚の培養プレートに十分な切片が得られるまで、組織切片をミクロトーム槽から、氷上の連続酸素化タイロード溶液を含むインキュベーション槽に移します。トランスウェル培養では、組織切片を滅菌した幅 6 mm のポリウレタン支持体に取り付け、6 ml の最適化培地 (199 培地、1x ITS サプリメント、10% FBS、5 ng/ml VEGF、10 ng/ml FGF-アルカリおよび 2X 抗生物質-抗真菌剤) に配置しました。電気刺激 (10 V、周波数 1.2 Hz) を C-Pace を通じて組織切片に加えました。TD 条件の場合、培地交換ごとに新鮮な T3 と Dex を 100 nM と 1 μM で添加しました。培地は、1 日 3 回交換する前に酸素で飽和させます。組織切片は、37°C​​、5% CO2 のインキュベーター内で培養されました。
CTCM 培養の場合、組織切片を、改変タイロード液を含むペトリ皿内のカスタムメイド 3D プリンターに配置しました。このデバイスは、心臓のスライスのサイズをサポート リングの面積の 25% 増加させるように設計されています。これは、タイロード液から培地に移した後および拡張期に心臓の切片が伸ばさないようにするために行われます。ヒストアクリル接着剤を使用して、厚さ 300 μm の切片を直径 7 mm のサポート リングに固定しました。組織切片をサポートリングに取り付けた後、余分な組織切片を切り取り、1 つのデバイスに十分な切片が準備されるまで、取り付けられた組織切片を氷上のタイロード溶液のバス (4°C) に戻します。すべてのデバイスの合計処理時間は 2 時間を超えてはなりません。6 つの組織切片をサポート リングに取り付けた後、CTCM デバイスを組み立てました。CTCM 培養チャンバーには、21 ml の酸素添加済み培地があらかじめ充填されています。組織切片を培養チャンバーに移し、ピペットで気泡を慎重に取り除きます。次に、組織切片を穴に導き、所定の位置にゆっくりと押し込みます。最後に、電極キャップをデバイスに置き、デバイスをインキュベーターに移します。次に、CTCM をエア チューブと C-PACE-EM システムに接続します。空気圧アクチュエータが開き、エアバルブが CTCM を開きます。C-PACE-EM システムは、2 ミリ秒の二相ペーシング中に 1.2 Hz で 4 V を供給するように構成されました。電極上にグラファイトが蓄積するのを避けるために、培地を１日２回交換し、電極を１日１回交換した。必要に応じて、組織切片を培養ウェルから取り出して、組織切片の下に落ちた可能性のある気泡を追い出します。MT 処理条件では、100 nM T3 および 1 μM Dex で培地を交換するたびに、T3/Dex を新たに添加しました。CTCM デバイスは、37°C​​、5% CO2 のインキュベーター内で培養されました。
心臓スライスの引き伸ばされた軌跡を取得するために、特別なカメラ システムが開発されました。SLR カメラ (Canon Rebel T7i、Canon、東京、日本) を Navitar Zoom 7000 18-108mm マクロ レンズ (Navitar、カリフォルニア州サンフランシスコ) とともに使用しました。可視化は、培地を新しい培地に交換した後、室温で行った。カメラは 51° の角度で配置され、ビデオは 30 フレーム/秒で記録されます。まず、オープンソース ソフトウェア (MUSCLEMOTION43) を Image-J とともに使用して、心臓スライスの動きを定量化しました。このマスクは、ノイズを避けるために拍動する心臓スライスの対象領域を定義するために、MATLAB (MathWorks、米国マサチューセッツ州ナティック) を使用して作成されました。手動でセグメント化されたマスクは、フレーム シーケンス内のすべての画像に適用され、MUSCLEMOTION プラグインに渡されます。Muscle Motion は、各フレームのピクセルの平均強度を使用して、参照フレームに対する動きを定量化します。データは記録され、フィルタリングされ、サイクル時間を定量化し、心周期中の組織の伸びを評価するために使用されました。記録されたビデオは、一次ゼロ位相デジタル フィルターを使用して後処理されました。組織の伸び (ピークツーピーク) を定量化するために、ピークツーピーク分析を実行して、記録された信号の山と谷を区別しました。さらに、6 次多項式を使用してトレンド除去が実行され、信号のドリフトが排除されます。プログラム コードは、全体的な組織運動、サイクル タイム、弛緩時間、および収縮時間を決定するために MATLAB で開発されました (補足プログラム コード 44)。
ひずみ解析では、機械的ストレッチ評価用に作成されたのと同じビデオを使用して、まず MUSCLEMOTION ソフトウェアに従って動作のピーク (動作の最高 (上部) 点と最低 (下部) 点) を表す 2 つの画像をトレースしました。次に、組織領域をセグメント化し、セグメント化された組織にシェーディングアルゴリズムの形式を適用しました（補足図2a）。次に、セグメント化された組織を 10 のサブサーフェスに分割し、次の式を使用して各表面の応力を計算しました: ひずみ = (Sup-Sdown)/Sdown、ここで、Sup と Sdown は、それぞれ生地の上部と下部の影からの形状の距離です (補足図 2b)。
心臓切片を 4% パラホルムアルデヒドで 48 時間固定しました。固定組織を 10% および 20% スクロース中で 1 時間脱水し、次に 30% スクロース中で一晩脱水しました。次に、切片を最適切断温度コンパウンド (OCT コンパウンド) に埋め込み、イソペンタン/ドライアイス浴で徐々に凍結させました。分離するまで、OCT 包埋ブロックを -80 °C で保管します。スライドは、厚さ 8 μm の切片として準備されました。
心臓切片から OCT を除去するには、加熱ブロック上のスライドを 95 °C で 5 分間加熱します。各スライドに 1 ml の PBS を加え、室温で 30 分間インキュベートし、その後、PBS 中の 0.1% Triton-X を室温で 15 分間設定して切片に浸透させます。非特異的抗体がサンプルに結合するのを防ぐために、1 ml の 3% BSA 溶液をスライドに加え、室温で 1 時間インキュベートします。次いでBSAを除去し、スライドをPBSで洗浄した。各サンプルに鉛筆で印を付けます。一次抗体 (1% BSA で 1:200 希釈) (コネキシン 43 (アブカム; #AB11370)、NFATC4 (アブカム; #AB99431)、およびトロポニン T (Thermo Scientific; #MA5-12960) を 90 分かけて添加し、次にマウス Alexa Fluor 488 (The rmo Scientific; #A16079)、ウサギ Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) に対してさらに 90 分間 PBS で 3 回洗浄 ターゲットの染色をバックグラウンドから区別するために、対照として二次抗体のみを使用 最後に、DAPI 核染色を追加し、スライドを vectashield (Vector Laboratories) に置き、マニキュアで密封しました。-x 倍率) および 40x 倍率のキーエンス顕微鏡化。
ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのＷＧＡ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；＃Ｗ３２４６４）をＷＧＡ染色に使用し、固定切片に室温で３０分間適用した。次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し、スーダンブラックを各スライドに添加し、３０分間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し、ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ包埋媒体を添加した。スライドは、Keyence 顕微鏡で 40 倍の倍率で視覚化されました。
ＯＣＴは、上記のようにサンプルから除去された。OCT を取り外した後、スライドをブアン液に一晩浸します。次いで、スライドを蒸留水で１時間リンスし、その後、Ｂｉｂｒｉｃｈアロエ酸フクシン溶液中に１０分間入れた。次いで、スライドを蒸留水で洗浄し、５％リンモリブデン／５％リンタングステン酸の溶液中に１０分間置いた。洗い流さずに、スライドを直接アニリンブルー溶液に移し、15 分間放置します。次いで、スライドを蒸留水で洗浄し、１％酢酸溶液中に２分間入れた。スライドを２００Ｎエタノール中で乾燥させ、キシレンに移した。染色されたスライドは、10 倍の対物レンズを備えた Keyence 顕微鏡を使用して視覚化されました。線維症領域の割合は、Keyence Analyzer ソフトウェアを使用して定量化されました。
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA)、カタログ番号 V13154、メーカーのプロトコールに一部変更を加えたものに準拠。特に、MTT 分析中に均一な組織サイズを確保するために、直径 6 mm の外科用パンチが使用されました。メーカーのプロトコールに従って、MTT基質を含む12ウェルプレートのウェルに組織を個別に播種した。切片を３７℃で３時間インキュベートすると、生体組織はＭＴＴ基質を代謝して紫色のホルマザン化合物を形成する。MTT 溶液を 1 ml DMSO に置き換え、37 °C で 15 分間インキュベートして、心臓切片から紫色のホルマザンを抽出します。サンプルを96ウェル透明底プレート内のDMSOで1:10に希釈し、Cytationプレートリーダー(BioTek)を使用して紫色の強度を570nmで測定した。測定値は、心臓の各スライスの重量に対して正規化されました。
前述のように、グルコース利用アッセイのために、心臓スライス培地を、1μCi/ml [5-3H]-グルコースを含む培地（Moravek Biochemicals、Brea、CA、USA）と交換した。4 時間のインキュベーション後、100 μl の 0.2 N HCl を含む開いた微量遠心管に 100 μl の培地を加えます。次いで、この管を、５００μｌのｄＨ ２ Ｏを含むシンチレーション管に置き、３７℃で７２時間かけて［３Ｈ］ ２ Ｏを蒸発させた。次に、微量遠心管をシンチレーション チューブから取り外し、10 ml のシンチレーション液を加えます。シンチレーションカウントは、Tri-Carb 2900TR 液体シンチレーションアナライザー (Packard Bioscience Company、メリデン、コネチカット州、米国) を使用して実行されました。次いで、[5-3H]-グルコース比活性、不完全な平衡およびバックグラウンド、未標識グルコースに対する[5-3H]-の希釈、およびシンチレーションカウンター効率を考慮して、グルコース利用を計算した。データは心臓の切片の質量に対して正規化されています。
Trizol中で組織を均質化した後、Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874を製造業者のプロトコールに従って使用して、心臓切片からRNAを単離した。RNAsec ライブラリーの調製、配列決定、およびデータ分析は次のように実行されました。
サンプルあたり 1 μg の RNA を、RNA ライブラリーの調製のための出発物質として使用しました。メーカーの推奨に従って、NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB、USA) を使用してシーケンシング ライブラリを生成し、各サンプルの属性配列にインデックス コードを追加しました。簡単に説明すると、ポリ T オリゴヌクレオチドを付着させた磁気ビーズを使用して、mRNA を全 RNA から精製しました。断片化は、NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 中で高温で二価カチオンを使用して実行されます。第１鎖ｃＤＮＡは、ランダムヘキサマープライマーおよびＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ－）を使用して合成した。次に、DNA ポリメラーゼ I と RNase H を使用して、2 番目の cDNA 鎖が合成されます。残りのオーバーハングは、エキソヌクレアーゼ/ポリメラーゼ活性によって平滑末端に変換されます。DNA断片の3'末端をアデニル化した後、ヘアピンループ構造を持つNEBNextアダプターを付加し、ハイブリダイゼーションの準備をします。好ましい長さ 150 ～ 200 bp の cDNA フラグメントの選択用。ライブラリー断片は、AMPure XP システム (Beckman Coulter、Beverly、USA) を使用して精製しました。次に、サイズ選択された cDNA をアダプターにライゲーションした 3 μl USER Enzyme (NEB、USA) を 37℃ で 15 分間使用し、その後 PCR 前に 95℃ で 5 分間使用しました。次に、Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ、ユニバーサル PCR プライマー、およびインデックス (X) プライマーを使用して PCR を実行しました。最後に、PCR 産物を精製し (AMPure XP システム)、ライブラリの品質を Agilent Bioanalyzer 2100 システムで評価しました。次に、Novaseq シーケンサーを使用して cDNA ライブラリーの配列を決定しました。Illumina からの RAW 画像ファイルは、CASAVA Base Calling を使用して RAW 読み取りに変換されました。生データは、読み取りシーケンスと対応する塩基品質を含む FASTQ(fq) 形式のファイルに保存されます。HISAT2 を選択して、フィルター処理されたシーケンシングリードを Sscrofa11.1 参照ゲノムと照合します。一般に、HISAT2 は、40 億塩基を超えるゲノムを含むあらゆるサイズのゲノムをサポートしており、ほとんどのパラメーターにはデフォルト値が設定されています。RNA Seq データからのスプライシングリードは、現在利用可能な最速のシステムである HISAT2 を使用して、他の方法と同等以上の精度で効率的にアラインメントできます。
転写物の豊富さは、遺伝子発現のレベルを直接反映します。遺伝子発現レベルは、ゲノムまたはエクソンに関連する転写産物の量 (配列決定数) によって評価されます。リード数は、遺伝子発現レベル、遺伝子長、およびシーケンスの深さに比例します。FPKM (百万塩基対ごとに配列決定された転写産物の千塩基対あたりの断片) を計算し、DESeq2 パッケージを使用して差次的発現の P 値を決定しました。次に、組み込みの R 関数「p.adjust」に基づく Benjamini-Hochberg 法 9 を使用して、各 P 値の誤発見率 (FDR) を計算しました。
心臓切片から単離したRNAを、Thermo社のSuperScript IV Vilo Master mix（Thermo、カタログ番号11756050）を使用して200ng/μlの濃度でcDNAに変換した。定量的 RT-PCR は、Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 ウェル透明反応プレート (Thermo、カタログ番号 4483319) および microamp 光学接着剤 (Thermo、カタログ番号 4311971) を使用して実行されました。反応混合物は、ウェルあたり 5 μl の Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo、カタログ番号 4444557)、0.5 μl の Taqman プライマー、および 3.5 μl の H2O を混合したもので構成されています。標準的な qPCR サイクルを実行し、Applied Biosystems Quantstudio 5 リアルタイム PCR 装置 (384 ウェル モジュール; 製品番号 A28135) を使用して CT 値を測定しました。Taqman プライマーは Thermo から購入しました (GAPDH (Ss03375629_u1)、PARP12 (Ss06908795_m1)、PKDCC (Ss06903874_m1)、CYGB (Ss06900188_m1)、RGL1 (Ss06868890_m1)、ACTN1 (Ss01009508_) mH)、GATA4 (Ss03383805_u1)、GJA1 (Ss03374839_u1)、COL1A2 (Ss03375009_u1)、COL3A1 (Ss04323794_m1)、ACTA2 (Ss04245588_m1) すべてのサンプルの CT 値はハウスキーピング遺伝子に対して正規化されましたGAPDH。
NT-ProBNP の培地放出は、メーカーのプロトコールに従って NT-ProBNP キット (ブタ) (カタログ番号 MBS2086979、MyBioSource) を使用して評価しました。簡単に言うと、250 μl の各サンプルと標準を各ウェルに 2 回ずつ加えました。サンプルを添加した直後に、50 μl のアッセイ試薬 A を各ウェルに添加します。プレートを静かに振って、シーラントで密封します。次いで、錠剤を37℃で1時間インキュベートした。次に、溶液を吸引し、ウェルを 350 μl の 1X 洗浄溶液で 4 回洗浄し、毎回洗浄溶液を 1 ～ 2 分間インキュベートします。次に、ウェルあたり 100 µl のアッセイ試薬 B を加え、プレート シーラントでシールします。錠剤を穏やかに振盪し、37℃で30分間インキュベートした。溶液を吸引し、1X 洗浄液 350 μl でウェルを 5 回洗浄します。90 μl の基質溶液を各ウェルに加え、プレートを密閉します。プレートを 37°C で 10 ～ 20 分間インキュベートします。50 μl の停止液を各ウェルに加えます。450 nmに設定したCytation (BioTek) プレートリーダーを使用して、プレートを直ちに測定した。
検出力分析を実行して、パラメータの 10% の絶対変化を 5% のタイプ I エラー率で検出するために >80% の検出力を提供するグループ サイズを選択しました。 検出力分析を実行して、パラメータの 10% の絶対変化を 5% のタイプ I エラー率で検出するために >80% の検出力を提供するグループ サイズを選択しました。 Анализ мощности был выполнен для выбора размеров группп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютн ого изменения параметра с 5% частотой овибок типа I. 検出力分析を実行して、5% のタイプ I エラー率で 10% の絶対パラメータ変化を検出するために >80% の検出力を提供するグループ サイズを選択しました。性能分析を行って、測定パラメータ中の１０％の変化および５％のＩ型試薬率で８０％を超える電力を提供するものを選択した。性能分析を行って、測定パラメータ中の１０％の変化および５％のＩ型試薬率で８０％を超える電力を提供するものを選択した。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсол ютного изменения параметров и 5% частоты олибок типа I. 検出力分析を実行して、10% の絶対パラメーター変化と 5% のタイプ I エラー率を検出するために >80% の検出力を提供するグループ サイズを選択しました。組織切片は実験前にランダムに選択されました。すべての分析は条件ブラインドで行われ、サンプルはすべてのデータが分析された後にのみデコードされました。GraphPad Prism ソフトウェア (カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、すべての統計分析を実行しました。 すべての統計について、p 値は値 <0.05 で有意であるとみなされます。 すべての統計について、p 値は値 <0.05 で有意であるとみなされます。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. すべての統計について、p 値は値 <0.05 で有意であるとみなされます。すべての記録データについて、p 値は値 < 0.05 であると見なされます。すべての記録データについて、p 値は値 < 0.05 であると見なされます。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. すべての統計について、p 値は値 <0.05 で有意であるとみなされます。両側スチューデント t 検定は、2 つの比較のみを使用してデータに対して実行されました。一元配置または二元配置 ANOVA を使用して、複数のグループ間の有意性を決定しました。事後テストを実行する場合、複数の比較を考慮して Tukey の補正が適用されました。RNAsec データには、「方法」セクションで説明されているように、FDR と p.adjust を計算する際に特別な統計的考慮事項があります。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの要約を参照してください。