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AFEXで前処理したトウモロコシ茎葉中の難分解性オリゴ糖の複合分析のための新しい免疫学的および質量分析法。リグノセルロース系バイオマスは化石燃料の持続可能な代替物であり、食品、飼料、燃料、化学品などの製品生産のためのバイオテクノロジーの開発に広く使用されています。これらの技術の鍵となるのは、植物細胞壁に存在する複雑な炭水化物をグルコース、キシロース、アラビノースなどの単糖に変換するためのコスト競争力のあるプロセスの開発です。リグノセルロース系バイオマスは非常に扱いにくいため、目的の製品を得るには、熱化学的処理（例：アンモニア繊維剥離（AFEX）、希酸（DA）、イオン液体（IL））と生物学的処理（例：酵素加水分解および微生物発酵）を組み合わせて行う必要があります。しかし、市販の真菌酵素を加水分解プロセスに用いると、生成される可溶性糖のうち単糖類はわずか75～85%に過ぎず、残りの15～25%は可溶性で扱いにくいオリゴ糖であり、微生物が必ずしも利用できるとは限りません。我々はこれまでに、炭素分離と珪藻土分離、そしてサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせることで、難分解性の可溶性オリゴ糖を単離・精製することに成功し、その酵素阻害特性も調べてきました。その結果、高重合度（DP）のメチル化ウロン酸置換を含むオリゴ糖は、低重合度および中性オリゴ糖よりも市販の酵素ブレンドで処理することが困難であることがわかりました。本研究では、植物バイオマスグリカンに特異的なモノクローナル抗体（mAb）を用いたグリカンプロファイリング、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、飛行時間型質量分析法など、いくつかの追加手法を用いて植物細胞壁および酵素加水分解物中のグリカン結合を解析した結果を報告する。 MALDI-TOF-MS法は、負イオンの二次崩壊後の分光法、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析（GC-MS）によって得られた構造情報の診断ピークを使用して、誘導体化の有無にかかわらずオリゴ糖結合を特性評価します。オリゴ糖はDPが4～20と小さいため、これらの分子をmAbに結合させて特性評価することは困難です。この問題を解決するために、我々はビオチン結合に基づく新しいオリゴ糖固定化法を適用し、マイクロプレート表面の低DP可溶性オリゴ糖の大部分を標識することに成功しました。その後、これをハイスループットmAbシステムで使用して、特異的ライゲーション分析を行いました。この新しい方法は、将来、診断目的のバイオマーカーに存在するオリゴ糖を単離して特性評価するために使用できる、より高度なハイスループットグライコームアッセイの開発を促進するでしょう。
リグノセルロース系バイオマスは、農業、林業、草本、木質材料から構成され、食品、飼料、燃料、化学前駆体などのバイオベース製品の製造に使用できる潜在的な原料であり、より価値の高い製品を生産します1。植物細胞壁に含まれる炭水化物（セルロースやヘミセルロースなど）は、化学処理や生体内変換（酵素加水分解や微生物発酵など）によって単糖に脱重合されます。一般的な前処理には、アンモニア繊維膨張（AFEX）、希酸（DA）、イオン液体（IL）、蒸気爆発（SE）などがあり、化学物質と熱を組み合わせて植物細胞壁を開き、リグノセルロースの生成を抑えます3,4。物質の頑固さ、5。酵素加水分解は、市販の活性炭水化物含有酵素（CAZymes）を使用して高固形分負荷で実行され、バイオベースの燃料や化学物質が生成されます6。
市販酵素に含まれるCAZymeは、複雑な酵素混合物から構成されており、これらの酵素が相乗的に複雑な炭水化物-糖結合を切断して単糖を形成します2,7。以前報告したように、リグニンと炭水化物の芳香族ポリマーの複雑なネットワークは、酵素処理を非常に困難にしています。そのため、糖の変換が不完全となり、前処理されたバイオマスの酵素加水分解中に生成されない性オリゴ糖が15～25%蓄積されます。これは、様々なバイオマス前処理方法に共通する問題です。このボトルネックの原因としては、加水分解中の酵素阻害、または植物バイオマス中の糖結合を切断するために必要な必須酵素の欠乏または低レベルなどが挙げられます。オリゴ糖中の糖結合など、糖の組成と構造特性を理解することは、加水分解中の糖変換率を向上させるのに役立ち、バイオテクノロジープロセスを石油由来製品とコスト競争力のあるものにします。
炭水化物の構造決定は困難であり、液体クロマトグラフィー（LC）11,12、核磁気共鳴分光法（NMR）13、キャピラリー電気泳動（CE）14,15,16、質量分析法（MS）17,18などの手法を組み合わせる必要があります。MALDI-TOF-MS（レーザー脱離イオン化マトリックスを用いた飛行時間型質量分析）などのMS法は、炭水化物の構造を同定するための汎用性の高い手法です。最近では、ナトリウムイオン付加物の衝突誘起解離（CID）タンデムMSが、オリゴ糖の結合位置、アノマー配置、配列、分岐位置に対応するフィンガープリントの同定に最も広く利用されています20,21。
グリカン分析は、炭水化物結合を詳細に同定するための優れたツールです22。この方法では、植物細胞壁グリカンに対するモノクローナル抗体 (mAbs) をプローブとして使用し、複雑な炭水化物結合を解明します。世界中で 250 種類以上の mAbs が利用可能で、さまざまな糖類を使用してさまざまな直鎖状および分岐鎖オリゴ糖に対して設計されています24。植物細胞壁の構造、組成、および修飾は、植物細胞の種類、器官、年齢、発育段階、および生育環境によって大きく異なるため、いくつかの mAbs が広く使用されています25,26。最近では、この方法は、植物および動物システムの小胞集団と、細胞内マーカー、発育段階、または環境刺激によって決定されるグリカン輸送におけるそれぞれの役割を理解するために、また酵素活性を決定するために使用されています。特定されているグリカンとキシランのさまざまな構造には、ペクチン (P)、キシラン (X)、マンナン (M)、キシログルカン (XylG)、混合結合グルカン (MLG)、アラビノキシラン (ArbX)、ガラクトマンナン (GalG)、グルクロン酸アラビノキシラン (GArbX)、アラビノガラクタン (ArbG)29 などがあります。
しかし、こうした研究努力にもかかわらず、高固形分負荷（HSL）加水分解中のオリゴ糖蓄積の性質、すなわちオリゴ糖の遊離、加水分解中のオリゴマー鎖長の変化、様々な低DPポリマー、およびそれらの曲線分布に焦点を当てた研究はごくわずかです。30,31,32。一方、グリカン分析はグリカン構造の包括的な分析に有用なツールであることが証明されているものの、抗体法を用いて水溶性の低DPオリゴ糖を評価することは困難です。分子量が5～10 kDa未満の小さなDPオリゴ糖はELISAプレートに結合せず33, 34、抗体添加前に洗い流されてしまいます。
本研究では、可溶性難治性オリゴ糖に対するワンステップビオチン化法とグライコーム分析を組み合わせた、モノクローナル抗体を用いたアビジンコーティングプレート上でのELISAアッセイを初めて実証する。本アプローチは、加水分解糖組成物のトリメチルシリル（TMS）誘導体化を用いたMALDI-TOF-MSおよびGC-MSによる相補的オリゴ糖結合の分析によって検証された。この革新的なアプローチは、将来的にハイスループット法として開発され、生物医学研究においてより広範な応用が期待される35。
酵素や抗体の翻訳後修飾、例えばグリコシル化36 は、それらの生物学的活性に影響を与えます。例えば、血清タンパク質のグリコシル化の変化は炎症性関節炎において重要な役割を果たしており、グリコシル化の変化は診断マーカーとして用いられています37。文献では、消化管や肝臓の慢性炎症性疾患、ウイルス感染症、卵巣がん、乳がん、前立腺がんなど、様々な疾患において様々なグリカンが容易に出現することが報告されています38,39,40。抗体ベースのグリカンELISA法を用いてグリカンの構造を理解することで、複雑な質量分析法を用いることなく、疾患診断の信頼性を高めることができます。
以前の研究では、頑固なオリゴ糖は前処理と酵素加水分解後に加水分解されないままであることを示しました（図1）。以前に発表した研究では、AFEX前処理されたトウモロコシ茎葉加水分解物（ACSH）8からオリゴ糖を単離するための活性炭固相抽出法を開発しました。最初の抽出と分離の後、オリゴ糖はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によってさらに分画され、分子量の順に集められました。さまざまな前処理から放出された糖モノマーとオリゴマーは、糖組成分析によって分析されました。さまざまな前処理方法で得られた糖オリゴマーの含有量を比較すると、頑固なオリゴ糖の存在は、バイオマスから単糖への変換における一般的な問題であり、少なくとも10〜15％、最大18％の糖収量の減少につながる可能性があります。この方法は、オリゴ糖画分のさらなる大規模生産に使用されます。得られた ACH とその後の分子量の異なる画分は、本研究におけるオリゴ糖の特性評価のための実験材料として使用されました。
前処理と酵素加水分解後も、分解されなかったオリゴ糖は残存していた。(A)は、AFEX前処理したトウモロコシ茎葉加水分解物（ACSH）から活性炭と珪藻土の充填層を用いてオリゴ糖を単離するオリゴ糖分離法である。(B)はオリゴ糖の分離法である。オリゴ糖はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によってさらに分離される。(C)は、様々な前処理（希釈酸：DA、イオン液体：IL、AFEX）から遊離した糖モノマーとオリゴマーである。酵素加水分解条件: 25% (w/w) の高固形分負荷 (グルカン負荷約 8%)、96 時間加水分解、20 mg/g 市販酵素負荷 (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 比率)、および (D) AFEX で前処理したトウモロコシ茎葉 (ACS) から放出されたグルコース、キシロース、アラビノースの糖モノマーとオリゴマー。
グリカン分析は、固形バイオマス残渣から単離された抽出物中のグリカンの包括的な構造解析に有用なツールであることが証明されています。しかし、この従来の方法では、低分子量オリゴ糖はELISAプレートへの固定化が難しく、抗体添加前に洗浄されてしまうため、水溶性糖が十分に解析されていません41。そこで、抗体結合と特性評価のために、可溶性の非適合性オリゴ糖をアビジンコーティングしたELISAプレートにコーティングするワンステップビオチン化法が用いられました。この方法は、以前に作製したACSHと、その分子量（または重合度、DP）に基づく分画を用いて試験されました。ワンステップビオチン化は、ビオチン-LC-ヒドラジドを炭水化物の還元末端に添加することで、オリゴ糖の結合親和性を高めるために用いられました（図2）。溶液中では、還元末端のヘミアセタール基がビオチン-LC-ヒドラジドのヒドラジド基と反応し、ヒドラゾン結合を形成します。還元剤NaCNBH3の存在下では、ヒドラゾン結合は還元され、安定なビオチン化された最終生成物となる。糖還元末端の修飾により、低分子量オリゴ糖をELISAプレートに結合させることが可能となり、本研究では、アビジンコーティングプレート上で糖鎖標的mAbを用いてこれを実施した。
ELISAに基づくビオチン化オリゴ糖に対するモノクローナル抗体のスクリーニング。（A）は、オリゴ糖のビオチン化と、ニュートラアビジンでコーティングしたプレート上でのグリカン標的mAbを用いたELISAスクリーニングを組み合わせたもので、（B）は反応生成物のビオチン化のためのワンステップ手順を示しています。
オリゴ糖標識抗体をアビジンでコーティングしたプレートを一次抗体および二次抗体に加え、光感受性および時間感受性の培地で洗浄した。抗体の結合が完了したら、TMB基質を添加してプレートをインキュベートした。最後に硫酸で反応を停止させた。インキュベートしたプレートをELISAリーダーで分析し、各抗体の結合強度を測定することで、抗体特異的なクロスリンクを検出した。実験の詳細およびパラメータについては、「材料および方法」の該当セクションを参照のこと。
我々は、ACSHに含まれる可溶性オリゴ糖、ならびにリグノセルロース加水分解物から単離された粗オリゴ糖および精製オリゴ糖分画に含まれる可溶性オリゴ糖を特性評価することにより、この新開発法の特定用途への有用性を実証した。図3に示すように、バイオアシル化グライコームアッセイ法を用いてACSHで同定された最も一般的なエピトープ置換キシランは、通常、ウロン酸（U）またはメチルウロン酸（MeU）およびペクチンアラビノガラクタンである。これらのほとんどは、我々の以前の非加水分解固形物（UHS）のグリカン分析研究でも発見されている43。
細胞壁グリカンを標的としたモノクローナル抗体を用いた、難治性オリゴ糖エピトープの検出。「中性」画分はACN画分、「酸性」画分はFA画分です。ヒートマップ上の明るい赤色はエピトープ含有量が高いことを示し、明るい青色は背景が空白であることを示します。スケール上の色値は、製剤N=2の生のOD値に基づいています。抗体が認識する主要なエピトープは右側に示されています。
これらの非セルロース構造は、試験した市販酵素混合物（最も一般的に使用されている市販酵素を含む）中の最も一般的なセルラーゼおよびヘミセルラーゼでは分解できませんでした。したがって、これらの加水分解には新たな補助酵素が必要です。必要な非セルロース補助酵素がなければ、これらの非セルロース結合は、たとえ市販酵素混合物を用いて親糖ポリマーを徹底的に加水分解して短い断片にし、溶解したとしても、単糖への完全な変換を妨げます。
シグナル分布とその結合強度をさらに研究した結果、二量体では、結合エピトープは低DP画分（D、E、F、DP）よりも高DP糖画分（A、B、C、DP 20+まで）の方が少ないことが示されました（図1）。酸性フラグメントは、中性フラグメントよりも非セルロースエピトープでより一般的です。これらの現象は、高DPおよび酸性部分が酵素加水分解に対してより抵抗性であった、以前の研究で観察されたパターンと一致しています。したがって、非セルロースグリカンエピトープとUおよびMeU置換の存在は、オリゴ糖の安定性に大きく貢献する可能性があります。低DPオリゴ糖、特にエピトープが二量体または三量体オリゴ糖である場合、結合および検出効率に問題が生じる可能性があることに注意する必要があります。これは、特定のmAbに結合するエピトープを1つだけ含む、さまざまな長さの市販のオリゴ糖を使用してテストできます。
このように、構造特異的抗体を用いることで、ある種の難分解性結合が明らかになりました。使用する抗体の種類、適切なライゲーションパターン、そしてそれが生成するシグナルの強度（最も多く、最も少なく）に応じて、新たな酵素を同定し、酵素混合物に半定量的に添加することで、より完全なグリココンバージョンを実現できます。ACSHオリゴ糖の分析を例にとると、各バイオマス材料についてグリカン結合のデータベースを作成できます。ここで注意すべき点は、抗体の親和性の違いを考慮する必要があるということです。親和性が不明な場合、異なる抗体のシグナルを比較する際に、特定の困難が生じる可能性があります。さらに、同じ抗体を用いたサンプル間でのグリカン結合の比較が最も効果的である場合もあります。これらの難分解性結合はCAZymeデータベースにリンクすることができ、そこから酵素を同定し、候補酵素を選択して結合切断酵素を試験したり、バイオリファイナリーで使用するためにこれらの酵素を発現する微生物系を開発したりすることができます44。
リグノセルロース加水分解物中に存在する低分子量オリゴ糖を特徴付ける代替方法を免疫学的方法がどのように補完するかを評価するために、同じパネル（図5）のオリゴ糖部分に対してMALDI（図4、S1-S8）とGC-MSに基づくTMS由来糖の分析を行った。 MALDIは、オリゴ糖分子の質量分布が意図した構造と一致するかどうかを比較するために使用される。 図4に、中性成分ACN-AとACN-BのMSを示す。 ACN-A分析では、DP 4～8（図4）からDP 22（図S1）までのペントース糖の範囲が確認され、その重量はMeU-キシランオリゴ糖に対応する。 ACN-B分析では、DP 8～15のペントースおよびグルコキシランシリーズが確認された。図S3などの補足資料では、FA-C酸性部分の質量分布マップは、重合度8～15の(Me)U置換ペントース糖の範囲を示しており、これはELISAベースのmAbスクリーニングで検出された置換キシランと一致しています。エピトープは一致しています。
ACS中に存在する可溶性ノンコンプライアントオリゴ糖のMALDI-MSスペクトル。(A) ACN-Aの低分子量範囲画分にはメチル化ウロン酸（DP 4-8）置換グルクロキシランオリゴ糖が含まれており、(B) ACN-Bのキシランおよびメチル化ウロン酸オリゴ糖はグルクロキシラン（DP 8-15）で置換されている。
難溶性オリゴ糖のグリカン残基組成分析。(A) GC-MS分析により得られた様々なオリゴ糖分画のTMS糖組成。(B) オリゴ糖中に存在する様々なTMS由来糖の構造。ACNは中性オリゴ糖を含むアセトニトリル分画、FAは酸性オリゴ糖を含むフェルラ酸分画。
図S9に示すように、オリゴ糖画分のLC-MS分析からもう一つの興味深い結論が導き出されました（分析方法は電子補足資料をご覧ください）。ACN-B画分のライゲーション中に、ヘキソースおよび-OAc基の断片が繰り返し観察されました。この知見は、グライコームおよびMALDI-TOF分析で観察された断片化を裏付けるだけでなく、前処理済みのリグノセルロース系バイオマスに含まれる潜在的な炭水化物誘導体に関する新たな情報も提供します。
TMSグリカン誘導体化法を用いて、オリゴ糖分画のグリカン組成分析も行いました。GC-MSを用いて、オリゴ糖分画中の神経糖（非誘導体糖）と酸性糖（GluAおよびGalA）の組成を決定しました（図5）。グルクロン酸は酸性成分CおよびDに、ガラクツロン酸は酸性成分AおよびBに存在し、いずれも酸性糖の高重合度成分です。これらの結果は、ELISAおよびMALDIデータを確認するだけでなく、オリゴ糖蓄積に関するこれまでの研究とも一致しています。したがって、オリゴ糖のビオチン化とそれに続くELISAスクリーニングを用いた最新の免疫学的手法は、様々な生物学的サンプル中の可溶性難溶性オリゴ糖を検出するのに十分であると考えています。
ELISAベースのmAbスクリーニング法はいくつかの異なる方法によって検証されているため、この新しい定量法の可能性をさらに探求したいと考えました。2種類の市販オリゴ糖、キシロヘキササッカリドオリゴ糖（XHE）と23-α-L-アラビノフラノシル-キシロトリオース（A2XX）を購入し、細胞壁グリカンを標的とする新しいmAbアプローチを使用してテストしました。図6は、ビオチン化結合シグナルとオリゴ糖濃度の対数との間の直線相関を示しており、ラングミュア吸着モデルの可能性を示唆しています。mAbのうち、CCRC-M137、CCRC-M138、CCRC-M147、CCRC-M148、CCRC-M151はXHEと相関し、CCRC-M108、CCRC-M109、LM11は1 nmから100 nmの範囲でA2XXと相関しました。実験中は抗体の入手が限られていたため、各オリゴ糖濃度における実験は限定的でした。ここで注目すべきは、一部の抗体は同じオリゴ糖を基質として用いても、非常に異なる反応を示すことです。これはおそらく、抗体がわずかに異なるエピトープに結合し、結合親和性が大きく異なるためと考えられます。この新しいmAbアプローチを実際のサンプルに適用した場合、正確なエピトープ同定のメカニズムとその意義は、はるかに複雑になるでしょう。
市販のオリゴ糖2種類を用いて、様々な糖鎖標的mAbの検出範囲を決定した。オリゴ糖濃度の対数に対する直線相関は、(A) XHEとmAb、(B) A2XXとmAbのラングミュア吸着パターンを示している。対応するエピトープは、本アッセイで基質として使用した市販オリゴ糖の構造を示している。
グリカン標的モノクローナル抗体（グリココミクス分析またはELISAベースのmAbスクリーニング）の使用は、植物バイオマスを構成する主要な細胞壁グリカンのほとんどを詳細に特性評価するための強力なツールです。しかし、従来のグリカン分析では、ほとんどのオリゴ糖がELISAプレート上に効率的に固定化されないため、より大きな細胞壁グリカンしか特性評価できません。本研究では、AFEX前処理したトウモロコシ茎葉を高固形分濃度で酵素加水分解しました。糖分析を用いて、加水分解物中の難分解性細胞壁炭水化物の組成を決定しました。しかし、加水分解物中のより小さなオリゴ糖のmAb分析は過小評価されており、オリゴ糖をELISAプレート上に効果的に固定化するには、追加のツールが必要です。
本研究では、オリゴ糖のビオチン化とNeutrAvidin™コーティングプレートを用いたELISAスクリーニングを組み合わせた、mAbスクリーニングのための新規かつ効率的なオリゴ糖固定化法を報告する。固定化されたビオチン化オリゴ糖は抗体に対して十分な親和性を示し、難検出性のオリゴ糖を迅速かつ効率的に検出することが可能となった。質量分析法に基づくこれらの難検出性オリゴ糖の組成分析により、この新しい免疫スクリーニング手法の有効性が裏付けられた。したがって、これらの研究は、オリゴ糖のビオチン化とグリカン標的モノクローナル抗体を用いたELISAスクリーニングの組み合わせが、オリゴ糖中の架橋検出に利用可能であり、オリゴ糖の構造を解析する他の生化学研究にも広く応用できることを示している。
このビオチンベースのグリカンプロファイリング法は、植物バイオマス中の可溶性オリゴ糖の難分解性糖結合を解析できる初めての報告です。バイオ燃料生産において、バイオマスの一部がなぜそれほど分解しにくいのかを理解する上で役立ちます。この方法は、グライコーム分析法における重要なギャップを埋め、植物オリゴ糖以外のより幅広い基質への適用範囲を拡大します。将来的には、ロボット技術を用いてビオチン化を行い、今回開発した手法をELISAを用いたサンプルのハイスループット分析に活用することも考えられます。
パイオニア33A14ハイブリッド種子から栽培されたトウモロコシの茎（CS）は、2010年にコロラド州レイのクレイマー農場で収穫されました。土地所有者の許可があれば、このバイオマスは研究に使用することができます。 サンプルは、ジップロック袋に入れて室温で乾燥（水分 6% 未満）して保管されました。 サンプルは、ジップロック袋に入れて室温で乾燥（水分 6% 未満）して保管されました。 Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. サンプルはジッパー付きの袋に入れて室温で湿度 6% 未満の乾燥した状態で保管されました。サンプルは、周囲温度で乾燥して＜６％の水分が密封袋内に存在した。サンプルを室温で乾燥 < 6% 6%未満です。 サンプルはジッパー付きの袋に入れて、湿度 6% 未満の室温で保管されます。本研究は地方および国のガイドラインに準拠し、NRELプロトコルを用いて組成分析を実施しました。その結果、グルカン31.4%、キシラン18.7%、アラビナン3.3%、ガラクタン1.2%、アセチル2.2%、リグニン14.3%、タンパク質1.7%、灰分13.4%が含まれていることが判明しました。
Cellic® CTec2（タンパク質138 mg/ml、ロット番号VCNI 0001）は、Novozymes社（ノースカロライナ州フランクリントン、米国）のセルラーゼ、β-グルコシダーゼ、およびCellic® HTec2（タンパク質157 mg/ml、ロット番号VHN00001）の複合混合物です。ペクチン分解酵素の複合混合物であるMultifect Pectinase®（タンパク質72 mg/ml）は、DuPont Industrial Biosciences社（カリフォルニア州パロアルト、米国）から提供されました。酵素タンパク質濃度は、ケルダール法窒素分析（AOAC法 2001.11、Dairy One Cooperative Inc.、ニューヨーク州イサカ、米国）を用いてタンパク質含量を推定し（非タンパク質性窒素の寄与を差し引いて）、測定しました。珪藻土545はEMD Millipore社（マサチューセッツ州ビレリカ）から購入しました。活性炭 (DARCO、100 メッシュ顆粒)、アビセル (PH-101)、ブナキシラン、およびその他のすべての化学物質は、Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス) から購入しました。
AFEX前処理は、GLBRC（ミシガン州立大学バイオマス変換研究所、米国ミシガン州ランシング）で実施しました。前処理は140℃で15分間実施しました。ステンレス製ベンチトップバッチリアクター（Parr Instruments Company）に無水アンモニアとバイオマスを1:1の比率で60%（w/w）負荷し、滞留時間は46時間でした。処理には30分かかりました。リアクターを140℃に加熱するとアンモニアが急速に放出され、バイオマスはすぐに室温に戻りました。AFEX前処理済みのトウモロコシ茎葉（ACS）の組成は、未処理のトウモロコシ茎葉（UT-CS）と類似していました。
高固形分ACSH 25% (w/w)（デキストラン含有量約8%）を、オリゴ糖の大規模生産のための出発原料として調製した。ACSの酵素加水分解は、市販の酵素混合物（Cellic® Ctec2（10 mgタンパク質/gグルカン、前処理済みバイオマス）、Htec2（Novozymes、ノースカロライナ州フランクリントン）、5 mgタンパク質/gグルカン、およびMultifect Pectinase（Genencor Inc、米国）を含む）を用いて実施した。）、5 mgタンパク質/gデキストラン。酵素加水分解は、5リットル容量のバイオリアクター（作業容量3リットル、pH 4.8、50℃、250 rpm）で実施した。 96時間加水分解した後、加水分解物を6000 rpmで30分間、続いて14000 rpmで30分間遠心分離し、未加水分解固形物を除去しました。その後、加水分解物を0.22 mmのフィルタービーカーで滅菌濾過しました。濾過後の加水分解物は滅菌ボトルに入れて4℃で保存し、その後、炭素上で分画しました。
NREL実験室分析手順に従った抽出物ベースのバイオマスサンプルの組成分析：組成分析用サンプルの準備（NREL / TP-510-42620）およびバイオマス中の構造炭水化物とリグニンの決定（NREL / TP-510 – 42618）47。
オートクレーブを用いた酸加水分解法を用いて、2 mLスケールで加水分解液中のオリゴ糖分析を実施した。10 mLスクリューキャップ付き培養管に加水分解液サンプルを72%硫酸69.7 µLと混合し、ベンチトップで121 °Cで1時間インキュベートした後、氷上で冷却し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）用バイアルにろ過した。オリゴ糖濃度は、酸加水分解サンプル中の総糖濃度から非加水分解サンプル中の単糖濃度を差し引くことで測定した。
酸加水分解バイオマス中のグルコース、キシロース、およびアラビノース濃度は、オートサンプラー、カラムヒーター、アイソクラティックポンプ、屈折率検出器を備えた島津製作所製HPLCシステムを用いて、Bio-Rad Aminex HPX-87Hカラムで分析した。カラムは50℃に保たれ、5 mM H2SO4水溶液（0.6 ml/分）で溶出させた。
加水分解液の上澄み液を希釈し、モノマーおよびオリゴ糖含有量を分析した。酵素加水分解後に得られたモノマー糖は、Bio-Rad（カリフォルニア州ヘラクレス）製Aminex HPX-87Pカラムおよびアッシュガードカラムを備えたHPLCで分析した。カラム温度は80℃に維持し、移動相には水を用い、流速は0.6 ml/分とした。オリゴ糖は、文献41、48、49に記載の方法に従い、希酸中121℃で加水分解することにより測定した。
糖分析は、これまでに記載された手順27, 43, 50, 51 に従って、生の、AFEX で前処理した、およびすべての非加水分解バイオマス残渣 (連続細胞壁抽出物の作製およびその mAb スクリーニングを含む) に対して実施しました。グライコーム分析では、植物細胞壁物質のアルコール不溶性残渣がバイオマス残渣から調製され、以前に記載されたとおり52,53 、シュウ酸アンモニウム (50 mM)、炭酸ナトリウム (50 mM および 0.5% w/v)、CON. (1 M および 4 M、両方とも 1% w/v 水素化ホウ素ナトリウムを含む)、酸性亜塩素酸塩などの徐々に刺激の強い試薬で連続抽出されます。次に抽出物は、細胞壁グリカンに対する mAb50 の複雑なパネルに対して ELISA にかけられ、mAb 結合反応はヒートマップとして示されました。植物細胞壁グリカンを標的とする mAbs は、研究室のストック (CCRC、JIM、MAC シリーズ) から購入しました。
オリゴ糖のワンステップビオチン化。ビオチン-LC-ヒドラジドによる炭水化物の結合は、以下の手順で行った。ビオチン-LC-ヒドラジド（4.6 mg/12 μmol）をジメチルスルホキシド（DMSO、70 μl）に激しく撹拌しながら溶解し、65℃で1分間加熱した。氷酢酸（30 μl）を加え、混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウム（6.4 mg/100 μmol）に注ぎ、65℃で約1分間加熱して完全に溶解させた。次に、反応混合物5～8 μlを乾燥オリゴ糖（1～100 nmol）に加え、還元末端に対して10倍以上のモル過剰の標識を得た。反応は65℃で2時間行い、その後、サンプルを直ちに精製した。還元なしの標識実験ではシアノ水素化ホウ素ナトリウムは使用されず、サンプルは 65 ° C で 2.5 時間反応しました。
ビオチン化オリゴ糖サンプルのELISAコーティングおよび洗浄。アビジンコーティングプレートの各ウェルに、ビオチン化サンプル25μl（各濃縮サンプル100μlを5mlの0.1Mトリス緩衝液（TBS）で希釈）を添加した。コントロールウェルには、0.1M TBSで10μg/mlの濃度に調整したビオチン50μlをコーティングした。ブランク測定用のコーティングには脱イオン水を使用した。錠剤は暗所で室温で2時間インキュベートした。Grenier flat 3Aのプログラム番号11を使用して、0.1M TBSで0.1%スキムミルクを溶解した溶液でプレートを3回洗浄した。
一次抗体の添加と洗浄。各ウェルに一次抗体40µLを添加し、マイクロプレートを暗所で室温で1時間インキュベートする。その後、0.1%ミルクを含む0.1M TBS溶液で、Grenier Flat 3Aの洗浄プログラム#11を用いて3回洗浄した。
二次抗体を添加し、洗浄する。マウス／ラット二次抗体（0.1%ミルクを含む0.1 M TBSで1:5000に希釈）50 µlを各ウェルに加える。マイクロプレートを暗所で室温で1時間インキュベートする。その後、Grenier Flat 5Aプレート洗浄プログラム#12を用いて、0.1%ミルクを含む0.1 M TBSでマイクロプレートを5回洗浄する。
基質の添加。3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン（TMB）50µlをベース基質（脱イオン水15mlに緩衝液2滴、TMB3滴、過酸化水素2滴を加える）に加えます。TMB基質を調製し、使用前にボルテックスで撹拌します。マイクロプレートを室温で30分間インキュベートします。暗所で行います。
手順を完了し、錠剤の読み取りを行います。各ウェルに1N硫酸50µlを加え、ELISAリーダーを用いて450～655 nmの吸光度を記録します。
脱イオン水で以下の分析対象物質の1 mg/ml溶液を調製する：アラビノース、ラムノース、フコース、キシロース、ガラクツロン酸（GalA）、グルクロン酸（GlcA）、マンノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、N-アセチルマンノサミン（manNAc）、N-アセチルグルコサミン（glcNAc）、N-アセチルガラクトサミン（galNAc）、イノシトール（内部標準）。表1に示す1 mg/mL糖溶液を加えて2種類の標準溶液を調製した。サンプルは凍結し、-80℃で水分が完全に除去されるまで（通常約12～18時間）凍結乾燥する。
分析天秤のスクリューキャップ付き試験管に100～500µgのサンプルを加えます。添加量を記録します。サンプルは特定の濃度の溶媒に溶解し、液体として試験管に加えるのが最適です。各サンプル試験管には、1mg/mlイノシトール20µlを内部標準として用います。サンプルに加える内部標準の量は、標準試験管に加える内部標準の量と必ず同じにしてください。
スクリューキャップ付きバイアルに無水メタノール8mlを加え、次に3Nメタノール性塩酸溶液4mlを加え、キャップをして振盪する。この工程では水は使用しない。
オリゴ糖サンプルと標準TMSチューブに1M HClメタノール溶液500µlを加える。サンプルはサーマルブロック内で80℃で一晩（168時間）インキュベートする。メタノリシス生成物は、乾燥マニホールドを用いて室温で乾燥させる。メタノール200µlを加え、再度乾燥させる。このプロセスを2回繰り返す。サンプルにメタノール200µl、ピリジン100µl、無水酢酸100µlを加え、よく混合する。サンプルを室温で30分間インキュベートし、乾燥させる。メタノール200µlを加え、再度乾燥させる。
200µlのTri-Silを加え、キャップをしたチューブを80℃で20分間加熱し、その後室温まで冷却します。乾燥マニホールドを用いてサンプルをさらに乾燥させ、約50µlの容量にします。サンプルを完全に乾燥させないように注意してください。
ヘキサン2mlを加え、ボルテックスでよく混合する。直径5-8mmのパスツールピペットの先端にグラスウールを差し込み、先端をグラスウールで満たす。サンプルは3000gで2分間遠心分離し、不溶性残留物を沈殿させる。サンプルを乾燥させて100～150µlとする。約1µlをGC-MSに注入し、初期温度80℃、初期時間2.0分とした（表2）。