Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan winates kanggo CSS.Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer).Sauntara kuwi, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.
Morfogenesis usus manungsa netepake fitur crypt-villus saka mikroarsitektur epitel 3D lan organisasi spasial. Struktur unik iki dibutuhake kanggo njaga homeostasis usus kanthi nglindhungi ceruk sel induk ing crypt basal saka antigen mikroba eksogen lan metabolite. bijih, nggawe maneh struktur epitel 3D penting banget kanggo pambangunan model usus in vitro. Utamane, usus mimetik organik ing chip bisa nyebabake morfogenesis 3D spontan saka epitelium usus kanthi fungsi fisiologis lan biomekanik sing ditingkatake. chip hibrida sing ditempelake Transwell. Kita njlèntrèhaké cara rinci kanggo fabrikasi piranti, kultur Caco-2 utawa sel epiteli organoid usus ing setelan konvensional uga ing platform mikrofluida, induksi morfogenesis 3D, lan karakterisasi epitel 3D sing diadegaké kanthi nggunakake macem-macem modalitas pencitraan .Protokol iki entuk regenerasi aliran cairan mikromorfik d. metode ogenesis nggunakake stres geser lan gerakan mekanik sing relevan sacara fisiologis lan ora mbutuhake rekayasa utawa manipulasi sel sing rumit, sing bisa ngluwihi teknik liyane sing wis ana. Kita mbayangake manawa protokol sing diusulake bisa duwe implikasi sing amba kanggo komunitas riset biomedis, nyedhiyakake cara kanggo regenerasi lapisan epitel usus 3D kanthi in vitro kanggo aplikasi biomedis, klinis, lan farmasi.
Eksperimen nuduhake yen sel Caco-2 epitel usus sing dikultur ing usus-on-a-chip1,2,3,4,5 utawa piranti mikrofluida bilayer6,7 bisa ngalami morfogenesis 3D spontan ing vitro tanpa pangerten sing jelas babagan mekanisme sing ndasari. in vitro, sing wis dituduhake dening Caco-2 lan organoid usus sing asale saka pasien.Sel epitel divalidasi. Ing panliten iki, kita khusus fokus ing produksi sel lan distribusi konsentrasi saka antagonis Wnt kuat, Dickkopf-1 (DKK-1), ing usus-on-a-chip lan piranti microfluidic sing diowahi sing ngemot sisipan Transwell, diarani "Chip Hibrid". 1, utawa Soggy-1) menyang usus on-chip nyegah morfogenesis utawa ngganggu lapisan epitel 3D sing wis direncanakake, sing nuduhake stres antagonis sajrone kultur tanggung jawab kanggo morfogenesis usus in vitro. -on-a-chip utawa hybrid-on-a-chip platform) utawa difusi .Media Basolateral (contone, saka sisipan Transwell menyang reservoir basolateral gedhe ing sumur).
Ing protokol iki, kita menehi cara rinci kanggo nggawe microdevices usus-on-a-chip lan Kripik hibrida Transwell-insertable (langkah 1-5) kanggo kultur sel epitel usus ing membran porous basis polydimethylsiloxane (PDMS) (langkah 6A, 7A, 8, 9) utawa polyester ing membran 6A, 7A, 8, 9) utawa polyester ing membran 6, 7, 9, 9 utawa polyester ing Transwell Bs, 7 ced 3D morphogenesis in vitro (langkah 10). Kita uga ngenali fitur seluler lan molekul sing nuduhake histogenesis spesifik jaringan lan diferensiasi selular sing gumantung saka garis keturunan kanthi nggunakake macem-macem modalitas pencitraan (langkah 11-24). Monolayers 2D, lan biokimia usus lan Reproduksi lingkungan mikro biomekanik.in vitro.Kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D saka monolayers epitelium 2D, kita mbusak antagonis morphogen ing loro formulir kultur kanthi nglebokake medium menyang kompartemen basolateral saka kultur. wutah epitelial, longitudinal host-microbiome co-kultur, infèksi patogen, tatu inflamasi, disfungsi alangi epitelial, lan terapi adhedhasar probiotik Conto.pengaruh.
Protokol kita bisa migunani kanggo macem-macem ilmuwan ing dhasar (contone, biologi mukosa usus, biologi sel induk, lan biologi perkembangan) lan riset terapan (contone, tes obat praklinis, model penyakit, teknik jaringan, lan gastroenterologi) dampak sing amba. Kanggo pamirsa sing nyinaoni dinamika sinyal sel sajrone perkembangan usus, regenerasi utawa homeostasis. Kajaba iku, protokol kita migunani kanggo interogasi infeksi ing macem-macem agen infèksi kayata Norovirus 8, Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmochonella Typhimurium utawa Salmonella Typhimuorium.Pemirsa patologi penyakit lan patogenesis uga migunani.Panggunaan sistem mikrofisiologi usus on-chip bisa ngidini co-kultur longitudinal 10 lan penilaian sabanjure pertahanan inang, respon imun lan perbaikan cedera sing gegandhengan karo patogen ing saluran gastrointestinal (GI) 11 . Kelainan GI liyane sing gegandhèngan karo sindrom usus bocor, penyakit celiac, sindrom Crohn's, kolitis ulseratif, utawa boroktest bisa dadi penyakit Crohn's, influenza, borok, borok ulser, lapisan epitel inal disiapake nggunakake lapisan epitel usus 3D pasien, penyakit kasebut kalebu atrofi villous, shortening crypt, karusakan mukosa, utawa alangan epitel cacat. PBMCs), kanggo model sing ngemot microarchitectures villus-crypt usus 3D.sel imun spesifik jaringan, 5.
Wiwit mikrostruktur epitel 3D bisa didandani lan digambarake tanpa proses bagean, pamirsa sing nggarap transkriptomi spasial lan pencitraan resolusi dhuwur utawa super-resolusi bisa uga kasengsem ing pemetaan dinamika spasiotemporal gen lan protein ing relung epitel.Kasengsem ing teknologi.Tanggepan kanggo rangsangan mikroba utawa imun.Salajengipun, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 sing koordinasi homeostasis usus bisa ditetepake ing lapisan mukosa usus 3D kanthi co-kultur macem-macem spesies mikroba, komunitas mikroba utawa mikrobiota fecal, utamane ing usus.ing platform.Pendekatan iki utamané atraktif kanggo pamirsa sinau imunologi mukosa, gastroenterology, microbiome manungsa, culturomics lan mikrobiologi klinis seeking kanggo cultivate microbiota usus sadurunge uncultured ing laboratorium. disebarake kanggo sing ngembangake platform screening utawa validasi pharmaceutical, biomedis Utawa dhuwur-throughput kanggo industri panganan. Minangka prinsip bukti, kita bubar nuduhake kemungkinan sistem morfogenesis multi-throughput sing bisa diukur menyang format piring 24 sumur. diakselerasi lan duweni potensi diadopsi dening akeh laboratorium riset, industri utawa pemerintah lan lembaga regulasi kanggo mangerteni pemrograman ulang selular saka morfogenesis usus in vitro ing tingkat transkriptomi kanggo nguji obat utawa bioterapeutik Penyerapan lan transportasi calon obat ditaksir nggunakake pengganti usus 3D utawa nggunakake model reproduksibilitas organ-on-a-chip khusus utawa komersial kanggo netepake reproduksibilitas gutogenesis.
Sawetara model eksperimen sing relevan karo manungsa wis digunakake kanggo nyinaoni morfogenesis epitel usus, utamane amarga ora ana protokol sing bisa ditindakake kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D ing vitro. Nyatane, akeh kawruh saiki babagan morfogenesis usus adhedhasar studi kewan (contone, iwak zebra20, tikus21 utawa pitik sing paling penting, lan bisa ditindakake kanthi cara sing paling penting). ly, ora sabenere nemtokake proses pembangunan manungsa.Model iki uga winates banget ing kemampuan kanggo dites ing multi-way scalable manner.Mulane, protokol kita kanggo regenerasi struktur jaringan 3D in vitro outperforms in vivo model kewan uga model kultur sel 2D statis tradisional liyane. Kaya sing wis diterangake sadurunge, nggunakake struktur epitelial 3D sing diijini kanggo sel kriptopatial sing beda-beda. -sumbu villus kanggo nanggepi macem-macem rangsangan mukosa utawa imun. Lapisan epitelium 3D bisa nyedhiyakake ruang kanggo nyinaoni cara sel mikroba saingan kanggo mbentuk ceruk spasial lan evolusi ekologis kanggo nanggepi faktor inang (contone, lapisan lendir njero versus njaba, sekresi IgA lan peptida antimikroba). ngasilake metabolit mikroba (contone, asam lemak rantai cendhak) sing mbentuk organisasi seluler lan relung sel induk ing crypts basal. Fitur iki mung bisa dituduhake nalika lapisan epitel 3D diadegake ing vitro.
Saliyane cara nggawe struktur epitel usus 3D, ana sawetara metode in vitro. Kultur organoid usus minangka teknik rekayasa jaringan paling canggih adhedhasar budidaya sel induk usus ing kahanan morfogen tartamtu23,24,25. terlampir ing organoid lan, mulane, introduksi komponen luminal kayata sel mikroba utawa antigen eksogen diwatesi.Akses menyang lumen organoid bisa ditingkatake kanthi nggunakake microinjector,26,27 nanging metode iki invasif lan intensif tenaga kerja lan mbutuhake kawruh khusus kanggo nindakake.
Pendekatan liyane sing digunakake dening sawetara kelompok riset nggunakake scaffolds hidrogel 3D sing wis direncanakake kanggo niru struktur epitel usus kanthi kultur sel usus manungsa sing terisolasi ing permukaan gel. gradien, nggawe struktur epitel rasio aspek dhuwur lan crosstalk stroma-epiteli kanthi nyakup sel stroma ing scaffold.Nanging, sifat scaffolds sing wis direncanakake bisa nyegah tampilan proses morphogenetic spontan dhewe.Model iki uga ora nyedhiyakake luminal dinamis utawa interstitial shelogenesis, sing kurang kanggo fungsi fluida morfologis sing anyar, sing ora ana ing ngisor iki. sinau nggunakake scaffolds hidrogel ing platform microfluidic lan struktur epitel usus pola nggunakake teknik laser-etching. Organoid usus tikus tindakake pola etched kanggo mbentuk struktur tubular usus, lan aliran cairan intraluminal bisa recapitulated nggunakake modul microfluidics.Nanging, model iki uga ora ngetokne obahe cetak mechanogenes spontan3. klompok sing padha bisa nggawe tabung usus miniatur kanthi proses morfogenetik spontan. Senadyan fabrikasi kompleks saka segmen usus sing beda-beda ing tabung, model iki uga ora duwe aliran cairan luminal lan deformasi mekanik. Kajaba iku, operabilitas model bisa diwatesi, utamane sawise proses bioprinting rampung, ngganggu kahanan eksperimen utawa interaksi sel-ke-sel. mimic motilitas usus, aksesibilitas kompartemen apikal lan basolateral independen, lan nggawe maneh lingkungan mikro biologi kompleks modularitas.Mulane, protokol morfogenesis 3D in vitro kita bisa nyedhiyakake pendekatan pelengkap kanggo ngatasi tantangan metode sing ana.
Protokol kita kabeh fokus ing morfogenesis epitel 3D, kanthi mung sel epitel ing kultur lan ora ana jinis sel liyane ing saubengé kayata sel mesenchymal, sel endothelial, lan sel imun. Kaya sing wis diterangake sadurunge, inti saka protokol kita yaiku induksi morfogenesis epitel kanthi ngilangi inhibitor morfogen sing disekresi ing sisih basolateral-modulhibrida saka rongga-modul hibrida. -on-a-chip ngidini kita nggawe maneh lapisan epitel 3D sing undulating, kerumitan biologis tambahan kayata interaksi epiteli-mesenchymal33,34, deposisi Matriks ekstraselular (ECM) 35 lan, ing model kita, fitur crypt-villus sing ngirim relung sel stem ing kriptografi basal tetep dianggep luwih lanjut. s lan regulasi morfogenesis usus ing vivo35,37,38. Penambahan sel mesenkimal ing model kita ningkatake proses morfogenetik lan efisiensi lampiran sel. Lapisan endothelial (yaiku kapiler utawa limfatik) nduweni peran penting kanggo ngatur transportasi molekul39 lan rekrutmen sel imun40 ing model liyane sing ana hubungane karo mikroorganisme. quisite nalika model jaringan dirancang kanggo nduduhake interaksi multi-organ.Mulane, sel endothelial bisa uga kudu dilebokake kanggo model fitur fisiologis sing luwih akurat kanthi resolusi tingkat organ.Sel imun sing asale saka pasien uga penting kanggo nampilake respon imun bawaan, presentasi antigen, crosstalk imun adaptif bawaan, lan penyakit kekebalan spesifik jaringan ing konteks mimilmi.
Panggunaan chip hibrida luwih gampang tinimbang gut-on-a-chip amarga persiyapan piranti luwih prasaja lan panggunaan sisipan Transwell ngidini kultur epitelium usus sing bisa skalabel. .Cetha, sifat statis ing kompartemen apikal arang ngaktifake co-kultur bakteri jangka panjang ing kripik hibrida. Nalika kita bisa kanthi kuat ngindhuksi morfogenesis 3D ing sisipan Transwell nalika nggunakake chip hibrida, kekurangan biomekanik sing relevan sacara fisiologis lan aliran cairan apikal bisa mbatesi kemungkinan platform chip hibrida kanggo aplikasi potensial.
Rekonstruksi skala penuh sumbu crypt-villus manungsa ing kultur usus-on-a-chip lan hibrida-on-a-chip durung rampung. Wiwit morfogenesis diwiwiti saka monolayer epitelial, mikroarsitektur 3D ora mesthi nyedhiyakake persamaan morfologis karo kriptografi ing vivo. Sanajan morfogenesis diwiwiti saka monolayer epitel, mikroarsitektur 3D ora mesthi nyedhiyakake persamaan morfologis karo kriptografi ing vivo. Thelium, crypt lan wilayah villous ora demarkasi kanthi jelas. Sanajan saluran ndhuwur sing luwih dhuwur ing chip nyebabake tambah dhuwur saka epitelium microengineered, dhuwur maksimum isih diwatesi nganti ~ 300-400 μm. Ambane nyata saka crypts usus manungsa ing usus cilik lan gedhe yaiku ~ 135 µm µl ing usus cilik, lan ~ 135 µl ing jero tes cilik. punika ~600 µm41.
Saka sudut pandang pencitraan, pencitraan in situ super-resolusi mikroarsitektur 3D bisa diwatesi ing usus ing chip, amarga jarak kerja sing dibutuhake saka lensa obyektif menyang lapisan epitelium ana ing urutan sawetara milimeter. Kanggo ngatasi masalah iki, obyek sing adoh bisa uga dibutuhake. lapisan-by-lapisan microfabrication isine weteng ing chip melu adhesion permanen antarane saben lapisan, iku arang banget tantangan kanggo mbukak utawa mbusak lapisan ndhuwur kanggo nliti struktur lumahing lapisan epitelium.Contone, kanthi nggunakake mikroskop elektron scanning (SEM).
Hidrofobik PDMS wis dadi faktor watesan ing studi basis mikrofluida sing gegayutan karo molekul cilik hidrofobik, amarga PDMS bisa nyedhot molekul hidrofobik kasebut kanthi nonspesifik. Alternatif kanggo PDMS bisa uga dianggep karo bahan polimer liyane. molekul hidrofobik.
Pungkasan, metode kita durung ditondoi kanthi apik babagan nyediakake screening throughput dhuwur utawa platform eksperimen sing ramah pangguna "siji-ukuran-cocok-kabeh". sisipan sing ngidini replenishment terus-terusan lan mbusak media basolateral).
Kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D saka epitelium usus manungsa ing vitro, kita nggunakake piranti usus chip microfluidic sing ngemot rong saluran mikro paralel lan membran keropos elastis ing antarane kanggo nggawe antarmuka lumen-kapiler. Kita uga nduduhake panggunaan piranti mikrofluida saluran siji (chip hibrida) sing nyedhiyakake aliran epithelial sing terus-terusan ing platform epithelial sing terus-terusan ing lapisan epithelial ing platform transogenesis sing terus-terusan. saka macem-macem sel epitel usus manungsa bisa dituduhake kanthi nggunakake manipulasi arah aliran kanggo mbusak antagonis morphogen saka kompartemen basolateral.Prosedur eksperimen kabeh (Gambar 1) kasusun saka limang bagean: (i) microfabrication saka chip usus utawa Transwell insertable chip (langkah 1-5; Box 1 saka sel-sel hibrida utawa sel-sel hibrida intestinal) (Kotak 1), (i) oids;kothak 2-5), (iii) kultur sel epitel usus ing kripik usus utawa kripik hibrida (langkah 6-9), (iv) induksi morfogenesis 3D in vitro (langkah 10) lan (v) ) kanggo menehi ciri struktur mikro epitel 3D (langkah 11-24) . kanthi mbandhingake morfogenesis epitel karo kontrol spasial, temporal, kondisional, utawa prosedural.
Kita nggunakake rong platform budaya sing beda: gut-on-a-chip kanthi saluran lurus utawa saluran convoluted nonlinear, utawa chip hibrida sing ngemot sisipan Transwell (TW) ing piranti mikrofluida, digawe kaya sing diterangake ing Kotak 1, lan langkah 1 -5. organoid) lan prosedur kultur sing digunakake ing protokol iki. "In vitro morphogenesis" nuduhake langkah-langkah sakabèhé ing ngendi Caco-2 utawa sel epitelium sing asalé saka organoid dibudidaya ing chip usus utawa ing sisipan Transwell saka chip hibrida, diikuti dening induksi morfogenesis 3D lan pambentukan struktur epitelium sing khas. digunakake, contone, ing karakterisasi diferensiasi sel, studi fisiologi usus, panyiapan ekosistem host-microbiome, lan modeling penyakit.Gambar imunofluoresensi ing "Diferensiasi Sel" nuduhake inti, F-aktin lan MUC2 ditulis ing 3D Caco-2 lapisan epitelial muco-2 sing diasilake ing lapisan mucosal permukaan sing diasilake ing sel mukosa permukaan mucoF. gambar orescent ing Fisiologi Gut nuduhake lendir sing diprodhuksi dening pewarnaan kanggo asam sialic lan residu N-acetylglucosamine nggunakake agglutinin kuman gandum fluoresensi. Gambar loro sing tumpang tindih ing "Host-Microbe Co-Cultures" nuduhake kultur inang-mikrobiome perwakilan ing usus ing chip. -2 sel epitel. Panel tengen nuduhake lokalisasi GFP E. coli co-cultured karo 3D Caco-2 sel epitel, ngiring dening immunofluorescence pewarnaan karo F-actin (abang) lan nukleus (biru).Pemodelan penyakit nggambaraké sehat versus usus bocor ing usus inflamasi chips ing physiologicals tantangan sel (PS) lan bakteri L. PBMC;ijo).Sel Caco-2 dibudidayakake kanggo nggawe lapisan epitel 3D. Bar skala, 50 µm. Gambar ing baris ngisor: "Diferensiasi sel" diadaptasi kanthi ijin saka referensi.2.Oxford University Press;Diprodhuksi kanthi ijin saka Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" diadaptasi kanthi ijin saka ref.3.NAS;"Pemodelan Penyakit" dicocogake kanthi ijin saka referensi.5.NAS.
Kripik usus-on-chip lan hibrida digawe nggunakake replika PDMS sing dibongkar saka cetakan silikon kanthi litografi alus1,44 lan dipola SU-8. Desain saluran mikro ing saben chip ditemtokake kanthi nimbang hidrodinamika kayata tegangan geser lan tekanan hidrodinamik1,4,12.Data gut-on-atend-chip asli (Extended parax) Fig. microchannels, wis ngrembaka dadi usus-on-a-chip Komplek (Data Extended Fig. 1b) sing kalebu sepasang microchannels mlengkung kanggo ngindhuksi Tambah wektu panggonan adi, pola aliran nonlinear, lan deformasi multiaxial saka sel kultur (Gbr. 2a-f) 12. Nalika kita luwih kompleks bisa milih biomechanics dadi biomechanics usus-usus. nuduhake manawa Gut-Chip sing bengkok uga bisa nyebabake morfogenesis 3D ing pigura wektu sing padha kanthi tingkat pertumbuhan epitel sing padha dibandhingake karo Gut-Chip asli, preduli saka jinis sel kultur. Mulane, kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D, desain usus on-chip linier lan kompleks bisa diganti.2a) .Kanggo nggawe usus ing chip, lapisan PDMS ndhuwur sing disiapake disambungake kanthi urutan menyang film PDMS keropos lan banjur didadekake siji karo lapisan PDMS ngisor kanthi ikatan sing ora bisa dibatalake kanthi nggunakake corona treater (Fig. 2b-f). lan Data Extended Fig. 2) .Proses ikatan ditindakake kanthi nambani permukaan replika PDMS lan kaca kanthi plasma oksigen utawa perawatan korona. Sawise sterilisasi piranti mikrofabrikasi sing dipasang ing tabung silikon, persiyapan piranti siap kanggo nindakake morfogenesis 3D saka epitelium usus (Gambar 2g).
a, Ilustrasi skematis persiapan bagian PDMS saka cetakan silikon berpola SU-8. Solusi PDMS sing ora diresiki diwutahake ing cetakan silikon (kiwa), diobati ing 60 °C (tengah) lan dibongkar (tengen). membran keropos.d, Serangkaian foto komponen PDMS ndhuwur lan ngisor lan piranti usus on-chip sing dirakit.e, Skema keselarasan komponen PDMS ndhuwur, membran, lan ngisor. Saben lapisan ora bisa dibatalake kanthi perawatan plasma utawa korona.f, Skema saka piranti usus-on-a-chip sing digawe lan piranti convolug. -a-chip kanggo kultur sel microfluidic.Usus sing digawe ing chip sing dipasang karo tabung silikon lan jarum suntik diselehake ing tutup tutup. Piranti chip diselehake ing tutup piring Petri 150 mm kanggo diproses. Binder digunakake kanggo nutup tabung silikon.h, Gambar visual saka fabrikasi chip hibrida lan morfogenesis 3D ing sel kultur hibrida2D disiapake kanthi mandiri ing chips kultur2D Translay sing disiapake kanthi monopithelial. dilebokake ing chip hibrida kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D usus. Medium kasebut diselehake liwat saluran mikro ing ngisor lapisan sel sing ditetepake ing sisipan Transwell. Bar skala, 1 cm.h Dicetak ulang kanthi ijin saka referensi.4.Liyane.
Ing protokol iki, garis sel Caco-2 lan organoid usus digunakake minangka sumber epitel (Gambar 3a).Loro jinis sel kasebut dibudidaya kanthi mandiri (Kotak 2 lan Kotak 5) lan digunakake kanggo nyebarake saluran mikro sing dilapisi ECM saka usus on-chip utawa sisipan Transwell. Nalika sel konfluen (> 95% kultur sel cabe2, nutupi kultur kanthi rutin (>95%) 50) ing T-flasks dipanen kanggo nyiapake suspensi sel disosiasi kanthi cairan trypsinization (kotak 2). Organoid usus manungsa saka biopsi usus utawa reseksi bedah dibudidayakan ing kubah scaffold Matrigel ing piring 24 sumur kanggo ndhukung lingkungan mikro struktural, sing ngandhut mikroenvironment, lan Nospongin. lan faktor wutah sing disiapake kaya sing diterangake ing Kotak 3 ditambah saben dina nganti organoid tuwuh nganti diametere ~500 µm. Organoid sing wis diwasa kanthi lengkap dipanen lan dipisahake dadi sel tunggal kanggo diselehake ing usus utawa sisipan Transwell ing chip (Kotak 5). Kaya sing wis dilaporake sadurunge, bisa dibedakake miturut penyakit ulser, 13, croectal 13, ulser warna, utawa kanker normal. donor), situs lesi (contone, lesi versus area non-lesi) lan lokasi gastrointestinal ing saluran (contone, duodenum, jejunum, ileum, sekum, usus besar, utawa rektum).Kita nyedhiyakake protokol sing dioptimalake ing Kotak 5 kanggo kultur organoid kolon (koloid) sing biasane mbutuhake konsentrasi morfogen sing luwih dhuwur tinimbang organoid cilik.
a, Alur kerja kanggo induksi morfogenesis usus ing chip usus. Caco-2 epitelium usus manungsa lan organoid usus digunakake ing protokol iki kanggo nduduhake morfogenesis 3D. Sel epitelium sing terisolasi ditanem ing piranti gut-on-a-chip sing disiapake (persiapan chip). aliran kal (AP) diwiwiti lan dikelola sajrone 2 dina pisanan (aliran, AP, D0-D2). Aliran Basolateral (BL) uga diwiwiti bebarengan karo gerakan peregangan siklik (stretch, flow, AP lan BL) nalika monolayer 2D lengkap dibentuk. ing saben langkah eksperimen utawa titik wektu (grafik bar, 100 µm). Papat diagram skematis sing nggambarake kaskade morfogenesis usus sing cocog (tengen ndhuwur). Panah putus-putus ing skema kasebut nuduhake arah aliran fluida.b, gambar SEM nuduhake topologi permukaan 3D Caco-2 epitelium sing diadegake (kiwa ing sisih kiwa kothak maggene). lapisan 3D Caco-2 (tengen) .c, Horisontal tampilan ngarep saka diadegaké Caco-2 3D, claudin (ZO-1, abang) lan terus rerumput wewatesan membran labeled F-aktin (ijo) lan inti (biru) Immunofluorescence confocal visualisasi saka sel epitelium ing Kripik usus. owah-owahan morfologis ing organoid sing dikultur ing chip sing dipikolehi dening mikroskop kontras fase ing dina 3, 7, 9, 11, lan 13. Inset (tengen ndhuwur) nuduhake perbesaran dhuwur saka gambar sing kasedhiya.e, DIC photomicrograph saka epitelium 3D organoid sing ditetepake ing usus ing irisan sing dijupuk ing dina 7.f, Overlaid sel immunofluorescence;magenta), sel goblet (MUC2; ijo), F-aktin (abu-abu) lan nukleus (cyan) thukul ing kripik usus suwene 3 dina, masing-masing (Kiri) lan 13 dina (tengah) organoid ing lapisan epitel. Deleng uga Data sing Diperpanjang Gambar 3, sing nyorot sinyal LGR5 tanpa sinyal epithelial struktural LGR5. epitelium organoid ditetepake ing usus ing chip kanthi pewarnaan membran plasma kanthi pewarna CellMask (tengen) ing dina 13 kultur. Bar skala 50 μm kajaba nyatakake.b Dicetak ulang kanthi ijin saka referensi.2.Oxford University Press;c Dicocogake kanthi idin saka Referensi.2.Oxford University Press;e lan f diadaptasi kanthi ijin kanthi referensi.12 Ing Lisensi Creative Commons CC BY 4.0.
Ing usus ing chip, perlu kanggo ngowahi permukaan hidrofobik saka membran keropos PDMS kanggo lapisan ECM sing sukses. Ing protokol iki, kita nggunakake rong cara kanggo ngowahi hidrofobik membran PDMS. kultur idic saka epitelium organoid mbutuhake functionalization lumahing adhedhasar kimia kanggo entuk deposisi efisien saka protèin ECM dening sequentially nglamar polyethyleneimine (PEI) lan glutaraldehyde kanggo PDMS microchannels.Sawise modifikasi permukaan, protein ECM disimpen kanggo nutupi lumahing PDMS functionalized lan banjur ngenalaken menyang sel kultur sel sing diisolasi dening microfluid.A. perfusing mung medium menyang microchannel ndhuwur nganti sel mbentuk monolayer lengkap, nalika microchannel ngisor njogo kahanan statis.Cara iki optimized kanggo aktifitas lumahing lan lapisan ECM mbisakake lampiran epitelium organoid kanggo ngindhuksi morphogenesis 3D ing lumahing PDMS.
Kultur Transwell uga mbutuhake lapisan ECM sadurunge seeding sel;Nanging, kultur Transwell ora mbutuhake langkah-langkah pretreatment sing rumit kanggo ngaktifake permukaan sisipan keropos. Kanggo ngembangake sel Caco-2 ing sisipan Transwell, lapisan ECM ing sisipan keropos nyepetake lampiran sel Caco-2 sing dipisahake (<1 jam) lan pembentukan penghalang persimpangan sing ketat (<1-2 dina). ditempelake ing lumahing membran (<3 h) lan maintained nganti organoids mbentuk monolayer lengkap karo integritas alangi .Budaya Transwell dileksanakake ing piring 24-sumur tanpa nggunakake Kripik hibrida.
Morfogenesis 3D in vitro bisa diwiwiti kanthi ngetrapake aliran cairan menyang aspek basolateral saka lapisan epitelium sing diadegake.Ing usus ing chip, morfogenesis epitel diwiwiti nalika medium kasebut perfusi menyang saluran mikro ndhuwur lan ngisor (Fig. 3a). Kaya sing wis diterangake sadurunge, penting kanggo ngenalake aliran cairan ing kompartemen kompartemen. nutrisi lan serum menyang sel sing kaiket ing membran keropos lan ngasilake stres geser luminal, kita biasane ngetrapake aliran ganda ing usus ing chip. Ing chip hibrida, sisipan Transwell sing ngemot monolayers epitelium dilebokake ing chip hibrida.
Fitur morfologi lapisan epitel 3D microengineered bisa dianalisis kanthi nggunakake macem-macem modalitas pencitraan, kalebu mikroskop kontras fase, mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC), SEM, utawa mikroskop confocal immunofluorescence (Gambar 3 lan 4). kanggo transparansi optik film PDMS lan poliester, loro-lorone ing usus-on-a-chip lan platform chip hibrida bisa nyedhiyakake pencitraan in situ wektu-nyata tanpa perlu bagean utawa disassembly piranti. Nalika nindakake pencitraan immunofluoresensi (Gambar 1, 3c, f lan 4b, c), sel-sel (biasane didandani kanthi PF / 4b, c), sel (biasane didandani kanthi PF / hydl) 0 lan 2% (wt / vol) ) albumin serum sapi (BSA), kanthi urutan. Gumantung ing jinis sel, fiksatif, permeabiliser, lan agen pamblokiran sing beda bisa digunakake. Antibodi primer sing nargetake penanda sel utawa wilayah sing gumantung saka garis keturunan digunakake kanggo nyorot sel sing ora bisa dimobilisasi ing situ ing chip, disusul antibodi sekunder bebarengan karo target counterstain-2,-diamilen'2,-diamilen' ) indole, DAPI) utawa F-actin (contone, phalloidin kanthi label fluoresensi).1, "Diferensiasi sel" lan "Fisiologi usus"), kolonisasi acak sel mikroba (Gbr. 1, "Ko-kultur host-mikroba"), rekrutmen sel imun (Fig. 1, 'Pemodelan Penyakit') utawa kontur morfologi epitel 3D (Gambar 3c, f lan morfologi morfologi sing kapisah saka lapisan ndhuwur mikrob, c,f). lapisan nnel, kaya sing diterangake ing ref. Minangka ditampilake ing Fig. 2, morfologi epitel 3D uga microvilli ing tapel wates sikat apikal bisa digambarake dening SEM (Fig. 3b). Ekspresi marker diferensiasi bisa ditaksir kanthi nindakake PCR5 kuantitatif utawa urutan RNA sel tunggal. banjur digunakake kanggo analisis molekuler utawa genetik.
a, Alur kerja kanggo induksi morfogenesis usus ing chip hibrida. Caco-2 lan organoid usus digunakake ing protokol iki kanggo nduduhake morfogenesis 3D ing platform chip hibrida.Sel epitelium sing dipisahake ditanem ing sisipan Transwell sing disiapake (TW prep; ndeleng gambar ing ngisor iki) . Sawise 7 dina, siji sisipan Transwell sing ngemot monolayer 2D saka sel epitel digabungake menyang chip hibrida kanggo ngenalake aliran basolateral (Flow, BL), sing pungkasane nyebabake generasi lapisan epitel 3D (morfogenesis).Mikrograf kontras fase sing nuduhake fitur morfologi sel epitel organ manungsa sing asale saka titik koordinat titik normal C103. s ing lapisan ndhuwur nggambarake konfigurasi eksperimen kanggo saben step.b, Kripik Sato (skema kiwa) bisa mimpin kanggo morfogenesis 3D saka sel epiteli organoid karo tampilan mikroskop confocal ndhuwur-mudhun dijupuk ing posisi Z beda (ndhuwur, tengah, lan ngisor;ndeleng skema tengen lan garis burik sing cocog).nuduhake karakteristik morfologis sing jelas.F-aktin (cyan), nukleus (abu-abu).c, Mikrograf confocal Fluoresensi (tampilan sudut 3D) saka sel epitel asale saka organoid sing dikultur ing Transwell statis (TW; inset ing kothak putih pucet) versus chip hibrida (shot lengkap paling gedhe) mbandhingake 2D versus morfologi 3D ing sisih tengen ndhuwur; Z") uga nuduhake fitur 2D lan 3D. Bar skala, 100 µm.c Dicetak ulang kanthi ijin saka referensi.4.Liyane.
Kontrol bisa disiapake kanthi kultur sel sing padha (Caco-2 utawa sel epitelium organoid usus) dadi monolayer rong dimensi ing kahanan kultur statis konvensional. Utamane, kekurangan nutrisi bisa nyebabake kapasitas volume saluran mikro sing winates (yaiku ~ 4 µL ing saluran ndhuwur ing aplikasi gut-chip asli, uga desain epithelial gut-chip sadurunge.
Proses litografi alus kudu ditindakake ing kamar sing resik. Kanggo saben lapisan ing chip (lapisan ndhuwur lan ngisor lan membran) lan chip hibrida, photomasks beda digunakake lan digawe ing wafer silikon sing kapisah amarga dhuwure saluran mikro beda. µm.
Selehake wafer silikon 3-inch ing sajian karo aseton.Alon-alon swirl piring kanggo 30 detik, banjur online garing wafer.Transfer wafer kanggo piring karo IPA, banjur muter piring kanggo 30 s kanggo ngresiki.
Solusi piranha (campuran hidrogen peroksida lan asam sulfat pekat, 1:3 (vol/vol)) bisa opsional digunakake kanggo ngoptimalake mbusak residu organik saka permukaan wafer silikon.
Solusi Piranha arang banget korosif lan ngasilake panas.Kanggo pembuangan sampah, ngidini solusi kasebut adhem lan ditransfer menyang wadhah sampah sing resik lan garing.Gunakake wadhah sekunder lan label wadhah sampah kanthi bener. Mangga tindakake pedoman safety fasilitas kanggo prosedur sing luwih rinci.
Dehidrasi wafer kanthi nyelehake ing piring panas 200 ° C suwene 10 menit. Sawise dehidrasi, wafer digoyang kaping lima ing udhara kanggo adhem.
Tuang ~10 g photoresist SU-8 2100 menyang tengah wafer silikon sing wis di resiki.Gunakake pinset kanggo nyebarake photoresist kanthi merata ing wafer.Kadhangkala nyelehake wafer ing piring panas 65 ° C kanggo nggawe photoresist kurang lengket lan luwih gampang nyebar.Aja nyelehake wafer langsung ing piring panas.
SU-8 disebarake kanthi merata ing wafer kanthi lapisan spin. lapisan ndhuwur usus ing chip; deleng "Langkah kritis" ing ngisor iki) disetel ing akselerasi 300 rpm / s 30 detik ing 1.200 rpm.
Kacepetan spin utama bisa diatur miturut ketebalan target pola SU-8 ing wafer silikon.
Kanggo nggawe pola SU-8 kanthi dhuwur 500 µm kanggo lapisan ndhuwur usus ing chip, lapisan puteran lan langkah panggang sing alus saka Kotak iki (langkah 7 lan 8) diulang kanthi urutan (pirsani langkah 9) kanggo ngasilake rong lapisan 250 µm Lapisan SU-8 sing kandel, sing bisa dilapisi lan disambungake ing kothak cahya 10µm kanthi dhuwur 12 µm.
Panggang alus wafer sing dilapisi SU-8 kanthi nyelehake wafer ing piring panas kanthi suhu 65 °C suwene 5 menit, banjur ganti setelan dadi 95 °C lan inkubasi nganti 40 menit tambahan.
Kanggo entuk dhuwur 500 μm pola SU-8 ing saluran mikro ndhuwur, baleni langkah 7 lan 8 kanggo ngasilake rong lapisan SU-8 250 μm.
Nggunakake UV Mask Aligner, tindakake tes lampu miturut instruksi pabrik kanggo ngetung wektu cahya wafer.(wektu pajanan, ms) = (dosis pajanan, mJ/cm2)/(daya lampu, mW/cm2).
Sawise nemtokake wektu cahya, pasang fotomask ing wadhah topeng aligner topeng UV lan pasang fotomask ing wafer sing dilapisi SU-8.
Selehake lumahing fotomask sing dicithak langsung ing sisih dilapisi SU-8 wafer silikon kanggo nyilikake dispersi UV.
Mbukak wafer lan photomask sing dilapisi SU-8 kanthi vertikal nganti 260 mJ/cm2 sinar UV kanggo wektu cahya sing wis ditemtokake (ndeleng langkah 10 saka kothak iki).
Sawise cahya UV, wafer silikon sing dilapisi SU-8 dipanggang ing suhu 65 ° C kanggo 5 menit lan 95 ° C kanggo 15 menit ing saben piring panas kanggo nggawe pola kanthi dhuwur 200 μm. Ngluwihi wektu pasca panggang ing 95 ° C nganti 30 menit kanggo nggawe pola kanthi dhuwur 500 µm.
Pangembang diwutahake menyang sajian kaca, lan wafer panggang diselehake ing sajian.Volume pangembang SU-8 bisa beda-beda gumantung saka ukuran piring kaca. Priksa manawa nggunakake pangembang SU-8 sing cukup kanggo mbusak SU-8 sing ora katon. Contone, nalika nggunakake piring kaca diameter 150 mm kanthi kapasitas 1 L, gunakake ~300 mL pangembang puteran 5 menit.
Cuci cetakan sing dikembangake kanthi ~ 10 mL pangembang seger banjur IPA kanthi nyemprotake solusi nggunakake pipette.
Selehake wafer ing resik plasma lan mbukak ing plasma oksigen (gas atmosfer, tekanan target 1 × 10−5 Torr, daya 125 W) kanggo 1,5 menit.
Selehake wafer ing desikator vakum karo kaca geser nang.Wafers lan minger bisa diselehake sisih dening sisih.Yen desikator vakum dipérang dadi sawetara lapisan dening piring, lebokake minger ing kamar ngisor lan wafer ing kamar ndhuwur.Drop 100 μL saka trichloro(1H, 1H, 2H, geseran solusi kaca kanggo aplikasi asil-flunoro, 1H, 1H, 2H) isasi.
Copot sel Caco-2 beku ing adus banyu 37 ° C, banjur transfer sel sing dicairake menyang labu T75 sing ngemot 15 mL medium Caco-2 sing wis dipanasake sadurunge 37 ° C.
Kanggo ngliwati sel Caco-2 kanthi ~90% konfluensi, pisanan medium Caco-2 anget, PBS, lan 0,25% trypsin/1 mM EDTA ing adus banyu 37°C.
Aspirate medium kanthi aspirasi vakum. Cuci sel kaping pindho nganggo 5 mL PBS anget kanthi mbaleni aspirasi vakum lan nambah PBS seger.