Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan winates kanggo CSS.Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer).Sauntara kuwi, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Morfogenesis usus manungsa netepake fitur crypt-villus saka microarchitecture epitelial 3D lan organisasi spasial. Struktur unik iki dibutuhake kanggo njaga homeostasis usus kanthi nglindhungi ceruk sel stem ing crypt basal saka antigen mikroba eksogen lan metabolite. permukaan mukosa.Mulane, nggawe maneh struktur epitelium 3D penting banget kanggo pambangunan model usus in vitro. Utamane, usus-on-a-chip mimetik organik bisa nyebabake morfogenesis 3D spontan saka epitelium usus kanthi fungsi fisiologis lan biomekanik sing ditingkatake. usus ing chip mikrofluida uga ing chip hibrida Transwell sing ditempelake. Kita njlèntrèhaké cara rinci kanggo fabrikasi piranti, kultur Caco-2 utawa sel epiteli organoid usus ing setelan konvensional uga ing platform mikrofluida, induksi morfogenesis 3D, lan karakterisasi epitel 3D sing diadegaké kanthi nggunakake protokol pencitraan multifungsi. ngontrol aliran cairan basolateral kanggo 5 d.Metode morfogenesis in vitro kita nggunakake stres geser lan gerakan mekanik sing relevan sacara fisiologis lan ora mbutuhake rekayasa sel utawa manipulasi sing kompleks, sing bisa ngalahake teknik liyane sing ana. aplikasi.
Eksperimen nduduhake manawa sel Caco-2 epitel usus sing dibudidaya ing usus-on-a-chip1,2,3,4,5 utawa piranti mikrofluida bilayer6,7 bisa ngalami morfogenesis 3D spontan ing vitro tanpa pangerten sing jelas babagan mekanisme sing ndasari. morfogenesis epitel in vitro, sing wis dituduhake dening Caco-2 lan organoid usus sing asale saka pasien. Sel epitel divalidasi. Ing panliten iki, kita khusus fokus ing produksi sel lan distribusi konsentrasi saka antagonis Wnt kuat, Dickkopf-1 (DKK-1), ing usus-on-a-chip lan piranti microfluidic sing diowahi sing ngemot sisipan Transwell, diarani "Chip Hibrida". protein sing gegandhengan karo frizzled 1, utawa Soggy-1) menyang usus on-chip nyegah morfogenesis utawa ngganggu lapisan epitel 3D sing wis direncanakake, sing nuduhake yen stres antagonis sajrone kultur tanggung jawab kanggo morfogenesis usus in vitro. Mulane, pendekatan praktis kanggo entuk morfogenesis sing kuat ing tingkat epitelial antarmuka antagonist yaiku kanggo mbusak antarmuka komponèn basogon kanthi minimal. kanthi aktif flushing (contone, ing usus-on-a-chip utawa hibrida-on-a-chip platform) utawa difusi .Media Basolateral (contone, saka sisipan Transwell menyang reservoir basolateral gedhe ing sumur).
Ing protokol iki, kita menehi cara rinci kanggo nggawe microdevices usus-on-a-chip lan Kripik hibrida Transwell-insertable (langkah 1-5) kanggo kultur sel epiteli usus ing membran keropos basis polydimethylsiloxane (PDMS) (langkah 6A, 7A, 8, 9) utawa polyester Bs, 8, 9) utawa polyester ing membran Transwell, 8, 9. 9) lan morfogenesis 3D in vitro (langkah 10). Kita uga ngenali fitur seluler lan molekul sing nuduhake histogenesis spesifik jaringan lan diferensiasi selular sing gumantung saka garis keturunan kanthi nggunakake macem-macem modalitas pencitraan (langkah 11-24). modifikasi membran keropos, nggawe monolayers 2D, lan biokimia usus lan Reproduksi lingkungan mikro biomekanik.in vitro.Kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D saka monolayers epitelium 2D, kita mbusak antagonis morphogen ing loro formulir kultur kanthi mili medium menyang kompartemen basolateral saka kultur sing bisa diwakili. lapisan epitelium sing bisa digunakake kanggo model wutah epiteli gumantung morphogen, longitudinal host-microbiome co-kultur, infèksi pathogen, tatu inflamasi, disfungsi alangi epitelial, lan terapi adhedhasar probiotik Conto.pengaruh.
Protokol kita bisa migunani kanggo macem-macem ilmuwan ing dhasar (contone, biologi mukosa usus, biologi sel induk, lan biologi perkembangan) lan riset terapan (umpamane, tes obat praklinis, model penyakit, teknik jaringan, lan gastroenterologi) dampak sing amba. bisa disebarake menyang pamirsa sing nyinaoni dinamika sinyal sel sajrone perkembangan usus, regenerasi utawa homeostasis .Kajaba iku, protokol kita migunani kanggo interogasi infeksi ing macem-macem agen infèksi kayata Norovirus 8, Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhilae utawa Salmonella Typhimu. Pemirsa patologi lan patogenesis penyakit uga migunani.Panggunaan sistem mikrofisiologi usus on-chip bisa ngidini co-kultur longitudinal 10 lan penilaian sabanjure pertahanan inang, respon imun lan ndandani cedera sing ana gandhengane karo patogen ing saluran gastrointestinal (GI) 11 .Gangguan GI liyane sing ana gandhengane karo sindrom usus bocor, penyakit celiac, sindrom kolitis, kolitis, ulcerative, Crohn's disease. Lapisan epitel usus 3D disiapake nggunakake lapisan epitel usus 3D pasien, penyakit kasebut kalebu atrofi villous, shortening crypt, karusakan mukosa, utawa alangan epitel cacat. Biopsi utawa organoids usus sing asale saka sel stem12,13. sel mononuklear getih periferal pasien (PBMCs), kanggo model sing ngemot microarchitectures villus-crypt usus 3D. sel imun spesifik jaringan, 5.
Wiwit mikrostruktur epitel 3D bisa didandani lan digambarake tanpa proses bagean, pamirsa sing nggarap transkriptomi spasial lan pencitraan resolusi dhuwur utawa super-resolusi bisa uga kasengsem ing pemetaan dinamika spasiotemporal gen lan protein ing relung epitel. Kasengsem ing teknologi.Tanggepan kanggo rangsangan mikroba utawa imun.Salajengipun, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 sing koordinasi homeostasis usus bisa ditetepake ing lapisan mukosa usus 3D kanthi co-kultur macem-macem spesies mikroba, komunitas mikroba utawa mikrobiota fecal, utamane ing usus. ing platform.Pendekatan iki utamané atraktif kanggo pamirsa sinau imunologi mucosal, gastroenterology, microbiome manungsa, culturomics lan mikrobiologi klinis seeking kanggo cultivate microbiota usus sadurunge uncultured ing laboratorium. protokol uga bisa disebarake kanggo sing ngembangaken pharmaceutical, biomedical Utawa dhuwur-throughput screening utawa platform validasi kanggo industri pangan. Minangka bukti-of-prinsip, kita bubar nduduhake kelayakan sistem morfogenesis high-throughput multiplex sing bisa diukur menyang format piring 24-sumur. cara morfogenesis in vitro kita bisa dicepetake lan duweni potensi diadopsi dening akeh laboratorium riset, industri utawa pemerintah lan lembaga regulasi kanggo mangerteni pemrograman ulang seluler saka morfogenesis usus in vitro ing tingkat transkriptomi kanggo nguji obat-obatan utawa biotherapeutics. proses morfogenesis.
Sawetara model eksperimen sing relevan karo manungsa wis digunakake kanggo nyinaoni morfogenesis epitel usus, utamane amarga ora ana protokol sing bisa diimplementasikake kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D ing vitro. Nyatane, akeh pengetahuan saiki babagan morfogenesis usus adhedhasar studi kewan (contone, iwak zebra20, tikus21 utawa pitik, lan bisa uga biaya, nanging bisa ditindakake kanthi biaya). dipertanyakan, lan sing paling Jahwéh, ora sabenere nemtokake pangolahan pembangunan manungsa.Model iki uga winates banget ing kemampuan kanggo dites ing multi-cara scalable manner.Mulane, protokol kita kanggo regenerasi struktur jaringan 3D in vitro outperforms in vivo model kewan uga statis tradisional model kultur sel 2D liyane.Kaya struktur exam3D sing wis diterangake sadurunge, epatial diijini, epatial diterangake, epatial 3D. lokalisasi sel sing dibedakake ing sumbu crypt-villus kanggo nanggepi macem-macem rangsangan mukosa utawa imun. Lapisan epitel 3D bisa nyedhiyakake papan kanggo nyinaoni carane sel mikroba saingan kanggo mbentuk ceruk spasial lan evolusi ekologis kanggo nanggepi faktor inang (contone, lapisan lendir njero versus njaba, sekresi IgA lan kantung epitelial antimikrobial ngidini kantung epitelial antimikrobial, kita). carane mikrobiota usus mbentuk komunitas lan sinergis ngasilake metabolit mikroba (contone, asam lemak rantai cendhak) sing mbentuk organisasi seluler lan relung sel stem ing crypts basal.
Saliyane metode kita nggawe struktur epitel usus 3D, ana sawetara metode in vitro.Budaya organoid usus minangka teknik rekayasa jaringan paling canggih adhedhasar budidaya sel induk usus ing kahanan morfogen tartamtu23,24,25. lumen usus terlampir ing organoid lan mulane, introduksi komponen luminal kayata sel mikroba utawa antigen eksogen diwatesi. Akses menyang lumen organoid bisa ditingkatake kanthi nggunakake microinjector,26,27 nanging metode iki invasif lan intensif tenaga kerja lan mbutuhake kawruh khusus kanggo nindakake.
Pendekatan liyane sing digunakake dening sawetara kelompok riset nggunakake scaffolds hidrogel 3D sing wis direncanakake kanggo niru struktur epitel usus kanthi kultur sel usus manungsa sing terisolasi ing permukaan gel. gradien morphogen, nggawe struktur epitel rasio aspek dhuwur lan crosstalk stroma-epiteli kanthi nyakup sel stroma ing scaffold.Nanging, sifat scaffolds prestructured bisa nyegah tampilan saka proses morphogenetic spontan dhewe.Model iki uga ora nyedhiyani luminal utawa interstitial aliran fluida shelogenesis sing dinamis lan lacking ing sèl-sèl-sèl-sèl morfologis sing butuh aliran stres interstitial. lan entuk fungsi fisiologis.Panaliten anyar liyane nggunakake scaffolds hidrogel ing platform microfluidic lan struktur epiteli usus pola nggunakake teknik laser-etching. gerakan mekanobiologis. Teknik printing 3D saka klompok sing padha bisa nggawe tabung usus miniatur kanthi proses morfogenetik spontan. Senadyan fabrikasi kompleks segmen usus sing beda ing tabung, model iki uga ora duwe aliran cairan luminal lan deformasi mekanik. morfogenesis usus, stres geser sing cocog sacara fisiologis, biomekanik sing niru motilitas usus, aksesibilitas kompartemen apikal lan basolateral independen, lan nggawe maneh lingkungan mikro biologis kompleks modularitas.Mulane, protokol morfogenesis 3D in vitro kita bisa nyedhiyakake pendekatan pelengkap kanggo ngatasi tantangan metode sing ana.
Protokol kita kabeh fokus ing morfogenesis epitel 3D, kanthi mung sel epitel ing kultur lan ora ana jinis sel liyane ing saubengé kayata sel mesenchymal, sel endothelial, lan sel imun. Kaya sing wis diterangake sadurunge, inti saka protokol kita yaiku induksi morfogenesis epitel kanthi ngilangi inhibitor morfogen sing disekresi ing sisih basolateral modulus medium. gut-on-a-chip lan hybrid-on-a-chip ngidini kita nggawé ulang lapisan epitel 3D undulating, kerumitan biologis tambahan kayata interaksi epiteli-mesenchymal33,34, deposisi Matriks ekstraseluler (ECM) 35 lan, ing model kita, fitur crypt-villus sing ngirim ceruk sel stem tetep ing sel basal blasts. mesenkim nduweni peran kunci ing produksi protein ECM lan regulasi morfogenesis usus ing vivo35,37,38. Penambahan sel mesenkim ing model kita ningkatake proses morfogenetik lan efisiensi lampiran sel. Lapisan endothelial (yaiku, kapiler utawa limfatik) nduweni peran penting kanggo ngatur rekrutmen sel 39 lan rekrutmen sel imun. microenvironment.Salajengipun, komponen vaskular sing bisa disambungake antarane model jaringan minangka prasyarat nalika model jaringan dirancang kanggo nduduhake interaksi multi-organ.Mulane, sel endothelial bisa uga kudu dilebokake kanggo model fitur fisiologis sing luwih akurat kanthi resolusi tingkat organ.Sel kekebalan sing asale saka pasien uga penting kanggo nampilake respon imun bawaan, presentasi imun, lan antigen adaptif. kekebalan ing konteks niru penyakit usus.
Panggunaan kripik hibrida luwih gampang tinimbang gut-on-a-chip amarga persiyapan piranti luwih prasaja lan panggunaan sisipan Transwell ngidini kultur epitelium usus sing bisa diukur. ing sisih apikal.Cetha, sifat statis ing kompartemen apikal arang mbisakake co-kultur bakteri jangka panjang ing kripik hibrida.Nalika kita bisa kanthi kuat ngindhuksi morfogenesis 3D ing sisipan Transwell nalika nggunakake chip hibrida, kekurangan biomekanik sing relevan sacara fisiologis lan aliran cairan apikal bisa mbatesi kelayakan platform chip hibrida.
Rekonstruksi skala penuh saka sumbu crypt-villus manungsa ing kultur usus-on-a-chip lan hibrida-on-a-chip durung rampung. Epitelium 3D, wilayah crypt lan villous ora diwatesi kanthi jelas. Sanajan saluran ndhuwur sing luwih dhuwur ing chip mimpin kanggo nambah dhuwur saka epitelium microengineered, dhuwur maksimum isih diwatesi kanggo ~300-400 μm. Ambane nyata saka usus manungsa crypts ing usus cilik lan gedhe ~ 0µm3, lan ~5µµm3, lan gedhe ~ 1m3 lan gedhe. dhuwur saka villi usus cilik ~ 600 µm41.
Saka sudut pandang pencitraan, pencitraan in situ super-resolusi microarchitectures 3D bisa diwatesi ing usus ing chip, amarga jarak kerja sing dibutuhake saka lensa obyektif menyang lapisan epitelium ana ing urutan sawetara milimeter. Kanggo ngatasi masalah iki, obyek sing adoh bisa uga dibutuhake. PDMS.Salajengipun, wiwit lapisan-by-lapisan microfabrication isine weteng ing chip melu adhesion permanen antarane saben lapisan, iku arang banget tantangan kanggo mbukak utawa mbusak lapisan ndhuwur kanggo nliti struktur lumahing lapisan epitelium.Contone, nggunakake mikroskop elektron scanning (SEM).
Hidrofobik PDMS wis dadi faktor watesan ing studi basis mikrofluida sing gegayutan karo molekul cilik hidrofobik, amarga PDMS bisa nyerap molekul hidrofobik kasebut sacara nonspesifik. Alternatif kanggo PDMS bisa uga dianggep karo bahan polimer liyane. minimalake adsorpsi molekul hidrofobik.
Pungkasan, metode kita durung ditondoi kanthi apik babagan nyedhiyakake screening throughput dhuwur utawa platform eksperimen sing ramah pangguna "siji-ukuran-cocok-kabeh". Protokol saiki mbutuhake pompa syringe saben microdevice, sing njupuk ruang ing inkubator CO2 lan nyegah eksperimen skala gedhe. Sisipan keropos 384-sumur sing ngidini replenishment terus-terusan lan mbusak media basolateral).
Kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D saka epitelium usus manungsa ing vitro, kita nggunakake piranti usus chip microfluidic sing ngemot rong saluran mikro paralel lan membran keropos elastis ing antarane kanggo nggawe antarmuka lumen-kapiler. platform, morfogenesis saka macem-macem sel epiteli usus manungsa bisa dituduhake kanthi nggunakake manipulasi arah aliran kanggo mbusak antagonis morphogen saka kompartemen basolateral.Prosedur eksperimen kabeh (Gambar 1) kasusun saka limang bagean: (i) microfabrication saka chip usus utawa Transwell insertable chip hibrida (langkah 1-5); (sel Caco-2) utawa organoid usus manungsa; kothak 2-5), (iii) kultur sel epitel usus ing kripik usus utawa kripik hibrida (langkah 6-9), (iv) induksi morfogenesis 3D in vitro (langkah 10) lan (v) ) kanggo menehi ciri struktur mikro epitelium 3D (langkah 11-24) . morfogenesis vitro kanthi mbandhingake morfogenesis epitel karo kontrol spasial, temporal, kondisional, utawa prosedural.
Kita nggunakake rong platform budaya sing beda: usus-on-a-chip kanthi saluran lurus utawa saluran convoluted nonlinear, utawa chip hibrida sing ngemot sisipan Transwell (TW) ing piranti mikrofluida, digawe kaya sing diterangake ing Kotak 1, lan langkah 1 -5. organoid usus manungsa) lan prosedur kultur sing digunakake ing protokol iki. "In vitro morphogenesis" nuduhake langkah-langkah sakabèhé ing ngendi Caco-2 utawa sel epitelium sing asalé saka organoid dibudidaya ing chip usus utawa ing sisipan Transwell saka chip hibrida, diikuti dening induksi morfogenesis 3D lan pambentukan struktur epitelium sing khas. lapisan epitel usus bisa digunakake, contone, ing karakterisasi diferensiasi sel, studi fisiologi usus, panyiapan ekosistem host-microbiome, lan modeling penyakit.Gambar imunofluoresensi ing "Diferensiasi Sel" sing nuduhake inti, F-aktin lan MUC2 sing ditulis ing sinyal 3D Caco-2 sing diasilake ing sinyal 3D Caco-2 epithel usus. sel goblet lan mucus sing disekresi saka lumahing mukosa. Gambar fluoresensi ing Fisiologi Gut nuduhake lendir diprodhuksi dening pewarnaan kanggo asam sialic lan residu N-asetilglukosamin nggunakake fluoresensi gandum germ agglutinin. Gambar loro sing tumpang tindih ing "Host-Microbe Co-Cultures" nuduhake wakil host-mikrobiome panel co-culture ing co-culture saka chip. coli ngandhakake protein fluoresensi ijo (GFP) kanthi sel epitel 3D Caco-2 sing direkayasa mikro. Panel tengen nuduhake lokalisasi GFP E. coli dikultur bebarengan karo sel epitel 3D Caco-2, diikuti pewarnaan immunofluoresensi kanthi F-aktin (abang) lan nukleus (biru). kanthi antigen bakteri (contone, lipopolysaccharide, LPS) lan sel imun (contone, PBMC; ijo).Sel Caco-2 dibudidayakake kanggo nggawe lapisan epitel 3D. Bar skala, 50 µm.Gambar ing baris ngisor: "Diferensiasi sel" diadaptasi kanthi ijin saka referensi.2. Oxford University Press; Diprodhuksi kanthi ijin saka Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" diadaptasi kanthi ijin saka ref.3. NAS; "Pemodelan Penyakit" dicocogake kanthi ijin saka referensi.5. NAS.
Kripik usus-on-chip lan hibrida digawe nggunakake replika PDMS sing dibongkar saka cetakan silikon kanthi litografi alus1,44 lan dipola nganggo SU-8. Desain saluran mikro ing saben chip ditemtokake kanthi nimbang hidrodinamika kayata tegangan geser lan tekanan hidrodinamik1,4,12. Desain usus-on-a-chip asli saka Fig. microchannels lurus paralel juxtaposed, wis berkembang dadi usus-on-a-chip Komplek (Data Extended Fig. 1b) sing kalebu sepasang microchannels sudhut mlengkung kanggo ngindhuksi Tambah wektu panggonan fluida, pola aliran nonlinear, lan deformasi multiaxial sel kultur (Gbr. 2a-fhen) 12. biomekanika luwih kompleks. gut-on-a-chips bisa dipilih. Kita wis nuduhake manawa Gut-Chip sing rumit uga nyebabake morfogenesis 3D ing pigura wektu sing padha karo tingkat pertumbuhan epitelium sing padha dibandhingake karo Gut-Chip asli, preduli saka jinis sel sing dibudidaya. Mulane, kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D, linear lan komplèks on-chip moplicons interchangeable on-chip. Pola SU-8 nyedhiyakake fitur negatif sawise demolding (Fig. 2a). Kanggo nggawe usus ing chip, lapisan PDMS ndhuwur sing disiapake diikat kanthi urutan menyang film PDMS keropos lan banjur didadekake siji karo lapisan PDMS ngisor kanthi ikatan sing ora bisa dibatalake kanthi nggunakake corona treater (Gbr. 2b-f) . sing bisa nampung sisipan Transwell (Fig. 2h lan Extended Data Fig. 2). Proses ikatan ditindakake kanthi ngobati permukaan replika PDMS lan kaca kanthi plasma oksigen utawa perawatan korona. Sawise sterilisasi piranti mikrofabrikasi sing dipasang ing tabung silikon, persiyapan piranti siap kanggo nindakake 3D morfogenesis epithelium2figlogenesis saka intestinag.
a, Ilustrasi skematis persiapan bagian PDMS saka cetakan silikon berpola SU-8. Solusi PDMS sing ora diresiki diwutahake menyang cetakan silikon (kiwa), diobati ing 60 °C (tengah) lan dibongkar (tengen). nggawe membran keropos PDMS.d, Serangkaian foto komponen PDMS ndhuwur lan ngisor lan piranti usus on-chip sing dirakit.e, Skema keselarasan komponen PDMS ndhuwur, membran, lan ngisor. Saben lapisan diikat kanthi plasma utawa perawatan korona.f, Skema saka fabrikasi gut-on-a-channel sing digawe kanthi piranti microcuum-on-a-channel sing digawe. chambers.g, Setup saka isine weteng-on-a-chip kanggo budaya sel microfluidic. Isine weteng fabricated ing chip nglumpuk karo tabung silikon lan syringe iki diselehake ing coverslip a. Piranti chip diselehake ing tutup saka 150 mm Petri sajian kanggo Processing. Binder digunakake kanggo nutup tabung silikon.h, Gambar jepretan saka 3D Sato chip morphogenesis disiapake saka kain Sato chipswell. kanggo budaya monolayers 2D saka sel epitel usus padha dilebokake menyang chip Sato kanggo ngindhuksi morphogenesis 3D usus.Medium wis perfused liwat microchannels ngisor lapisan sel ditetepake ing Transwell insert.Scale bar, 1 cm.h Reprinted karo ijin saka reference.4. Liyane.
Ing protokol iki, garis sel Caco-2 lan organoid usus digunakake minangka sumber epitel (Gambar 3a).Kalorone jinis sel kasebut dibudidaya kanthi mandiri (Kotak 2 lan Kotak 5) lan digunakake kanggo nyebarake saluran mikro sing dilapisi ECM saka usus on-chip utawa sisipan Transwell. Nalika sel konfluen (> 95% kultur sel sing dilebokake sacara rutin (> 95% nutupi kultur flaks) 10 lan 50) ing T-flasks dipanen kanggo nyiapake suspensi sel disosiasi kanthi cairan trypsinization (kotak 2). Organoid usus manungsa saka biopsi usus utawa reseksi bedah dibudidayakan ing kubah scaffold Matrigel ing piring 24 sumur kanggo ndhukung struktur mikroorganisme penting, minangka mikroenvirogen struktural. R-spondin, lan Noggin) lan faktor wutah sing disiapake kaya sing diterangake ing Kotak 3 ditambah saben dina liyane nganti organoid tuwuh nganti diametere ~500 µm. Organoid sing wis diwasa kanthi lengkap dipanen lan dipisahake dadi sel tunggal kanggo diselehake ing usus utawa sisipan Transwell ing chip (Kotak 5). kolitis, penyakit Crohn, kanker kolorektal, utawa donor normal), situs lesi (contone, lesi versus area non-lesi) lan lokasi gastrointestinal ing saluran (contone, duodenum, jejunum, ileum, sekum, usus besar, utawa rektum). organoid.
a, Alur kerja kanggo induksi morfogenesis usus ing chip usus. Epitelium usus manungsa Caco-2 lan organoid usus digunakake ing protokol iki kanggo nduduhake morfogenesis 3D. Sel epitel sing terisolasi ditanem ing piranti gut-on-a-chip sing disiapake (persiapan chip). (D0), aliran apikal (AP) diwiwiti lan dipertahanake sajrone 2 dina pisanan (aliran, AP, D0-D2). Aliran Basolateral (BL) uga diwiwiti bebarengan karo gerakan peregangan siklik (regangan, aliran, AP lan BL) nalika monolayer 2D lengkap dibentuk. Gambar 3D morfogenesis usus morfogenesis dumadi sacara spontan sawise 5 dina kultur D5 kontraidik. morfologi perwakilan sel Caco-2 ing saben langkah eksperimen utawa titik wektu (grafik bar, 100 µm). Papat diagram skematis sing nggambarake kaskade morfogenesis usus sing cocog (tengen ndhuwur). (kotak putih putus-putus) nuduhake microvilli regenerasi ing lapisan 3D Caco-2 (tengen).c, Horizontal tampilan frontal saka diadegaké Caco-2 3D, claudin (ZO-1, abang) lan membran wewatesan rerumput terus labeled F-actin (ijo) lan inti (biru) Immunofluorescence confocal sel visualisasi ing epithelial titik tengah visualisasi ing epithelial titik tengah ing epithelial sclerosis. Ndhuwur lokasi bidang fokus kanggo saben tampilan confocal.d, Wektu owah-owahan morfologi ing organoid sing dibudidayakake ing chip sing dipikolehi dening mikroskop kontras fase ing dina 3, 7, 9, 11, lan 13. Inset (tengen ndhuwur) nuduhake perbesaran dhuwur saka gambar sing kasedhiya.e, DIC photomicrograph organoid ing irisan 3D ing epithelium sing diadegake ing gut7 dina. gambar immunofluorescence nuduhake panandha kanggo sel induk (LGR5; magenta), sel goblet (MUC2; ijo), F-aktin (abu-abu) lan nukleus (cyan) thukul ing kripik usus suwene 3 dina, masing-masing (Kiri) lan 13 dina (tengah) organoid ing lapisan epitel. Deleng uga Sorotan Data LG3R5 sing ditambahi. signaling.Gambar fluoresensi nuduhake microstructure epitelial (tengen) saka epitelium organoid 3D ditetepake ing usus ing chip dening staining membran plasma karo CellMask dye (tengen) ing dina 13 budaya. Skala bar 50 μm kajaba nyatakake.b Dicetak ulang karo ijin saka referensi.2. Oxford University Press; c Dicocogake kanthi idin saka Referensi.2. Oxford University Press; e lan f diadaptasi kanthi ijin kanthi referensi.12 Ing Lisensi Creative Commons CC BY 4.0.
Ing usus ing chip, perlu kanggo ngowahi permukaan hidrofobik membran keropos PDMS kanggo lapisan ECM sing sukses. Ing protokol iki, kita nggunakake rong cara kanggo ngowahi hidrofobik membran PDMS. membran.Nanging, kultur mikrofluida saka epitelium organoid mbutuhake fungsionalisasi permukaan adhedhasar kimia kanggo entuk deposisi protein ECM sing efisien kanthi ngetrapake polietilenaimin (PEI) lan glutaraldehida ing saluran mikro PDMS. ditempelake, budaya sel microfluidic diwiwiti kanthi perfusi mung medium menyang microchannel ndhuwur nganti sel mbentuk monolayer lengkap, nalika microchannel ngisor njogo kahanan statis.Cara iki optimized kanggo aktifitas lumahing lan lapisan ECM mbisakake lampiran epitelium organoid kanggo ngindhuksi morphogenesis 3D ing lumahing PDMS.
Kultur Transwell uga mbutuhake lapisan ECM sadurunge seeding sel; Nanging, kultur Transwell ora mbutuhake langkah-langkah pretreatment sing rumit kanggo ngaktifake permukaan sisipan keropos. Kanggo ngembangake sel Caco-2 ing sisipan Transwell, lapisan ECM ing sisipan keropos nyepetake lampiran sel Caco-2 sing dipisahake (<1 jam) lan pembentukan penghalang persimpangan sing ketat (<1-2 dina). Sisipan sing dilapisi ECM, ditempelake ing permukaan membran (<3 h) lan dijaga nganti organoid mbentuk monolayer lengkap kanthi integritas penghalang .Budaya Transwell ditindakake ing piring 24 sumur tanpa nggunakake chip hibrida.
Morfogenesis 3D in vitro bisa diwiwiti kanthi ngetrapake aliran cairan menyang aspek basolateral saka lapisan epitelium sing diadegake.Ing usus ing chip, morfogenesis epitel diwiwiti nalika medium kasebut perfusi menyang saluran mikro ndhuwur lan ngisor (Gambar 3a). Kaya sing wis diterangake sadurunge, penting kanggo ngenalake aliran cairan ing arah kompartemen inferior (basolateral) sing terus-terusan. Inhibitor.Kanggo nyedhiyakake nutrisi lan serum sing cukup kanggo sel sing kaiket ing membran keropos lan ngasilake stres geser luminal, kita biasane ngetrapake aliran ganda ing usus ing chip. Ing chip hibrida, sisipan Transwell sing ngemot monolayers epitel dilebokake ing chip hibrida. aliran basolateral ing loro platform kultur.
Fitur morfologi lapisan epitel 3D microengineered bisa dianalisis kanthi nggunakake macem-macem modalitas pencitraan, kalebu mikroskop kontras fase, mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC), SEM, utawa mikroskop confocal immunofluoresensi (Gambar 3 lan 4). lapisan.Amarga transparansi optik saka PDMS lan film poliester, loro-lorone ing usus-on-a-chip lan platform chip hibrida bisa nyedhiyani nyata-wektu ing situ imaging tanpa perlu kanggo sectioning utawa disassembly saka piranti. Nalika nindakake immunofluorescence imaging (Tokoh 1, 3c, f lan 4b, c) sel sing paratypically tetep. (PFA), diikuti dening Triton X-100 lan 2% (wt / vol) ) albumin serum sapi (BSA), kanthi urutan. Gumantung ing jinis sel, fiksatif, permeabiliser, lan agen pamblokiran sing beda bisa digunakake. (contone, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) utawa F-actin (contone, phalloidin kanthi label fluoresensi). co-culture"), rekrutmen sel imun (Fig. 1, 'Pemodelan Penyakit') utawa kontur morfologi epitel 3D (Fig. 3c, f lan 4b, c). Nalika ngowahi usus ing chip kanggo misahake lapisan ndhuwur saka lapisan microchannel ngisor, kaya sing diterangake ing ref. Minangka ditampilake ing morfologi 3D evilli. tapel wates sikat apikal bisa digambarake dening SEM (Gambar 3b). Ekspresi marker diferensiasi bisa ditaksir kanthi nindakake PCR5 kuantitatif utawa urutan RNA sel tunggal. Ing kasus iki, lapisan 3D saka sel epitel sing ditanam ing kripik usus utawa chip hibrida dipanen dening trypsinization lan banjur digunakake kanggo analisis molekuler utawa genetik.
a, Alur kerja kanggo induksi morfogenesis usus ing chip hibrida. Caco-2 lan organoid usus digunakake ing protokol iki kanggo nduduhake morfogenesis 3D ing platform chip hibrida.Sel epitelium sing dipisahake ditanem ing sisipan Transwell sing disiapake (TW prep; ndeleng gambar ing ngisor iki) . kondisi (kultur TW).Sawise 7 dina, insert Transwell siji sing ngemot monolayer 2D saka sel epitel digabungake menyang chip hibrida kanggo ngenalake aliran basolateral (Flow, BL), sing pungkasane mimpin kanggo generasi lapisan epitel 3D (morfogenesis). langkah eksperimen utawa titik wektu.Skema ing lapisan ndhuwur nggambarake konfigurasi eksperimen kanggo saben langkah.b, Kripik hibrida (skema kiwa) bisa nyebabake morfogenesis 3D sel epitel organoid kanthi tampilan mikroskop confocal ndhuwur-mudhun sing dijupuk ing posisi Z sing beda-beda (ndhuwur, tengah, lan ngisor; ndeleng garis skematik tengen lan garis dotted sing cocog). nuduhake karakteristik morfologis sing jelas.F-aktin (cyan), nukleus (abu-abu).c, Mikrograf confocal fluoresensi (tampilan sudut 3D) saka sel epitelium sing asale saka organoid sing dikultur ing Transwell statis (TW; inset ing kothak putih putus-putus) versus chip hibrida (gambar lengkap paling gedhe) mbandhingake 2D versus morfologi 3D ing pasangan vertikal-potongan, masing-masing. pojok tengen; "XZ") uga nuduhake fitur 2D lan 3D. Bar skala, 100 µm.c Dicetak ulang kanthi ijin saka referensi.4. Liyane.
Kontrol bisa disiapake kanthi kultur sel sing padha (Caco-2 utawa sel epitel organoid usus) dadi monolayer rong dimensi ing kahanan kultur statis konvensional. Utamane, kekurangan nutrisi bisa nyebabake kapasitas saluran mikro sing winates (yaiku ~ 4 µL ing saluran ndhuwur ing aplikasi gut-chip asli, desain epithelial uga saka saluran cerna, epithelial sadurunge). ditandhingake.
Proses litografi alus kudu ditindakake ing kamar sing resik. Kanggo saben lapisan ing chip (lapisan ndhuwur lan ngisor lan membran) lan chip hibrida, photomasks beda digunakake lan digawe ing wafer silikon sing kapisah amarga dhuwure saluran mikro beda. 200 µm.
Selehake wafer silikon 3-inch ing sajian karo aseton.Alon-alon swirl piring kanggo 30 detik, banjur online garing wafer.Transfer wafer kanggo piring karo IPA, banjur muter piring kanggo 30 s kanggo ngresiki.
Solusi piranha (campuran hidrogen peroksida lan asam sulfat pekat, 1:3 (vol/vol)) bisa opsional digunakake kanggo ngoptimalake mbusak residu organik saka permukaan wafer silikon.
Solusi Piranha arang banget korosif lan ngasilake panas.Pancegahan safety tambahan dibutuhake.Kanggo pembuangan sampah, ngidini solusi kasebut adhem lan ditransfer menyang wadhah sampah sing resik lan garing.Gunakake wadhah sekunder lan label wadhah sampah kanthi bener.Mangga tindakake pedoman safety fasilitas kanggo prosedur sing luwih rinci.
Dehidrasi wafer kanthi nyelehake ing piring panas 200 ° C suwene 10 menit. Sawise dehidrasi, wafer digoyangake kaping lima ing udhara kanggo adhem.
Tuang ~10 g photoresist SU-8 2100 menyang tengah wafer silikon sing wis di resiki.Gunakake tweezers kanggo nyebar photoresist kanthi merata ing wafer.Kadhangkala nyelehake wafer ing piring panas 65 ° C kanggo nggawe photoresist kurang lengket lan luwih gampang nyebar.Aja nyelehake wafer langsung ing piring panas.
SU-8 disebarake kanthi rata ing wafer kanthi nutupi spin. Program rotasi mlebu SU-8 suwene 5-10 detik kanggo nyebar ing 500 rpm kanthi akselerasi 100 rpm/s. Setel spin utama kanggo pola ketebalan 200 µm kanthi ketebalan 1.500 µm 50, utawa 500 rpm. Dhuwur µm kanggo lapisan ndhuwur usus ing chip; deleng "Langkah kritis" ing ngisor iki) disetel kanthi akselerasi 300 rpm/s 30 detik ing 1.200 rpm.
Kacepetan spin utama bisa diatur miturut ketebalan target pola SU-8 ing wafer silikon.
Kanggo nggawe pola SU-8 kanthi dhuwur 500 µm kanggo lapisan ndhuwur usus ing chip, lapisan puteran lan langkah panggang sing alus saka Kotak iki (langkah 7 lan 8) diulang kanthi urutan (pirsani langkah 9) kanggo ngasilake rong lapisan 250 µm Lapisan SU-8 sing kandel, sing bisa dilapisi lan disambungake ing kothak cahya UV 10 µm iki. dhuwur.
Panggang alus wafer sing dilapisi SU-8 kanthi nyelehake wafer ing piring panas kanthi suhu 65 °C suwene 5 menit, banjur ganti setelan dadi 95 °C lan inkubasi nganti 40 menit tambahan.
Kanggo entuk dhuwur 500 μm pola SU-8 ing saluran mikro ndhuwur, baleni langkah 7 lan 8 kanggo ngasilake rong lapisan SU-8 250 μm.
Nggunakake UV Mask Aligner, tindakake tes lampu miturut instruksi pabrikan kanggo ngetung wektu cahya wafer.(wektu pajanan, ms) = (dosis pajanan, mJ/cm2)/(daya lampu, mW/cm2).
Sawise nemtokake wektu cahya, pasang fotomask ing wadhah topeng aligner topeng UV lan pasang fotomask ing wafer sing dilapisi SU-8.
Selehake lumahing fotomask sing dicithak langsung ing sisih dilapisi SU-8 wafer silikon kanggo nyilikake dispersi UV.
Mbukak wafer lan photomask sing dilapisi SU-8 kanthi vertikal nganti 260 mJ/cm2 sinar UV kanggo wektu cahya sing wis ditemtokake (ndeleng langkah 10 saka kothak iki).
Sawise cahya UV, wafer silikon sing dilapisi SU-8 dipanggang ing suhu 65 ° C sajrone 5 menit lan 95 ° C sajrone 15 menit ing saben piring panas kanggo nggawe pola kanthi dhuwur 200 μm. Ngluwihi wektu pasca panggang ing 95 ° C nganti 30 menit kanggo nggawe pola kanthi dhuwur 500 µm.
Pangembang diwutahake menyang sajian kaca, lan wafer panggang diselehake ing sajian.Volume pangembang SU-8 bisa beda-beda gumantung saka ukuran piring kaca. Priksa manawa sampeyan nggunakake pangembang SU-8 sing cukup kanggo mbusak SU-8 sing ora katon. Contone, nalika nggunakake piring kaca diameter 150 mm kanthi kapasitas 1 L, gunakake ~300 mL saka pangembang puteran 5 menit.
Cuci cetakan sing dikembangake kanthi ~ 10 mL pangembang seger banjur IPA kanthi nyemprotake solusi nggunakake pipette.
Selehake wafer ing resik plasma lan mbukak ing plasma oksigen (gas atmosfer, tekanan target 1 × 10−5 Torr, daya 125 W) kanggo 1,5 menit.
Selehake wafer ing desikator vakum kanthi kaca geser ing jero.Wafer lan geser bisa diselehake bebarengan.Yen desikator vakum dipérang dadi pirang-pirang lapisan kanthi piring, lebokake slide ing kamar ngisor lan wafer ing kamar ndhuwur. Nyelehake 100 μL trikloro(1H, 1H, 2H, 2H, geser solusi kaca ing aplikasi asil-fluoro). vakum kanggo silanisasi.
Copot sel Caco-2 beku ing adus banyu 37 ° C, banjur transfer sel sing dicairake menyang labu T75 sing ngemot 15 mL medium Caco-2 sing wis dipanasake sadurunge 37 ° C.
Kanggo ngliwati sel Caco-2 kanthi ~90% konfluensi, pisanan medium Caco-2 anget, PBS, lan 0,25% trypsin/1 mM EDTA ing adus banyu 37°C.
Aspirate medium kanthi aspirasi vakum. Cuci sel kaping pindho nganggo 5 mL PBS anget kanthi mbaleni aspirasi vakum lan nambah PBS seger.