Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Évolusi saka parasit mikroba melu counteraction antarane seleksi alam, kang nimbulaké parasit kanggo nambah, lan genetis drift, kang nimbulaké parasit ilang gen lan nglumpukake mutasi deleterious.Ing kene, kanggo mangerteni carane counteraction iki dumadi ing skala makromolekul tunggal, kita njlèntrèhaké struktur cryo-EM saka ribosom Encephalitozoon cuniculi, organisme eukariotik kanthi salah siji saka génom paling cilik ing alam.Pengurangan ekstrim rRNA ing ribosom E. cuniculi diiringi owah-owahan struktural unprecedented, kayata évolusi saka linkers rRNA nyawiji sadurunge dingerteni lan rRNA tanpa bulges.Kajaba iku, ribosom E. cuniculi bisa slamet saka mundhut pecahan rRNA lan protein kanthi ngembangake kemampuan kanggo nggunakake molekul cilik minangka mimic struktural pecahan rRNA lan protein sing rusak.Sakabèhé, kita nuduhake manawa struktur molekul sing wis suwe dianggep suda, degenerasi, lan kena mutasi sing ngrusak duwe sawetara mekanisme kompensasi sing tetep aktif sanajan kontraksi molekuler sing ekstrem.
Amarga umume klompok parasit mikroba duwe alat molekul sing unik kanggo ngeksploitasi host, kita asring kudu ngembangake terapi sing beda kanggo macem-macem klompok parasit1,2.Nanging, bukti anyar nyatake yen sawetara aspek evolusi parasit konvergen lan umume bisa diprediksi, nuduhake basis potensial kanggo intervensi terapeutik sing luas ing parasit mikroba3,4,5,6,7,8,9.
Karya sadurunge wis nemtokake tren evolusi umum ing parasit mikroba sing diarani pengurangan genom utawa pembusukan genom10,11,12,13.Panaliten saiki nuduhake yen mikroorganisme nyerahake gaya urip bebas lan dadi parasit intraselular (utawa endosymbionts), genome ngalami metamorfosis alon nanging apik tenan sajrone jutaan taun9,11.Ing proses sing dikenal minangka pembusukan genom, parasit mikroba nglumpukake mutasi sing ngrusak sing ngowahi akeh gen sing sadurunge penting dadi pseudogenes, sing ndadékaké mundhut gen bertahap lan ambruk mutasi14,15.Ambruk iki bisa ngrusak nganti 95% gen ing organisme intrasel sing paling tuwa dibandhingake karo spesies sing urip bebas sing raket.Mangkono, évolusi parasit intraselular minangka perang tarik antarane rong pasukan sing nentang: seleksi alam Darwin, ndadékaké paningkatan parasit, lan ambruk génom, mbuwang parasit menyang lalen.Kepiye parasit bisa metu saka perang tarik-menarik iki lan nahan aktivitas struktur molekule isih durung jelas.
Sanajan mekanisme pembusukan genom ora dimangerteni kanthi lengkap, kedadeyan kasebut utamane amarga owah-owahan genetik sing asring.Amarga parasit manggon ing populasi cilik, asèksual, lan winates sacara genetis, ora bisa ngilangi mutasi sing ngrusak sing kadhangkala dumadi nalika réplikasi DNA.Iki nyebabake akumulasi mutasi sing mbebayani lan nyuda genom parasit sing ora bisa dibatalake.Akibaté, parasit ora mung ilang gen sing ora perlu kanggo urip ing lingkungan intraselular.Iku ora bisa populasi parasit kanggo èfèktif ngilangi mutasi ngrusak sporadis sing njalari mutasi iki kanggo nglumpukake saindhenging génom, kalebu gen sing paling penting.
Kathah pangertosan kita babagan pengurangan genom mung adhedhasar perbandingan urutan genom, kanthi kurang perhatian marang owah-owahan molekul nyata sing nindakake fungsi housekeeping lan dadi target obat potensial.Pasinaon komparatif nuduhake yen beban mutasi mikroba intraselular sing mbebayani katon predisposisi protein lan asam nukleat dadi salah lan agregat, dadi luwih gumantung lan hipersensitif marang panas19,20,21,22,23.Kajaba iku, macem-macem parasit - évolusi independen kadhangkala dipisahake nganti 2,5 milyar taun - ngalami mundhut pusat kontrol kualitas sing padha ing sintesis protein5,6 lan mekanisme ndandani DNA24.Nanging, ora pati ngerti babagan pengaruh gaya urip intraseluler ing kabeh sifat makromolekul seluler liyane, kalebu adaptasi molekul kanggo nambah beban mutasi sing ngrusak.
Ing karya iki, supaya luwih ngerti evolusi protein lan asam nukleat mikroorganisme intraselular, kita nemtokake struktur ribosom saka parasit intraselular Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi minangka organisme kaya jamur sing kagolong ing klompok microsporidia parasit sing nduweni genom eukariotik sing luar biasa cilik lan mulane digunakake minangka organisme model kanggo nyinaoni pembusukan genom25,26,27,28,29,30.Bubar, struktur ribosom cryo-EM ditemtokake kanggo genom Microsporidia, Paranosema locustae, lan Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom) sing rada suda.Struktur kasebut nuduhake yen sawetara mundhut amplifikasi rRNA dikompensasi dening pangembangan kontak anyar antarane protein ribosom tetanggan utawa akuisisi protein msL131,32 ribosom anyar.Spesies Encephalitozoon (genom ~ 2,5 yuta bp), bebarengan karo Ordospora sing paling cedhak, nuduhake tingkat paling dhuwur saka reduksi genom ing eukariota - duwe kurang saka 2000 gen pengkode protein, lan samesthine yen ribosom kasebut ora mung tanpa fragmen ekspansi rRNA (fragmen rRNA sing mbedakake ribosom amarga ribosom bakteri uga duwe ribosom ribosom). homolog ing genom E. cuniculi26,27,28.Mulane, kita nyimpulake yen ribosom E. cuniculi bisa mbukak strategi sing durung dingerteni sadurunge kanggo adaptasi molekuler kanggo pembusukan genom.
Struktur cryo-EM kita nggambarake ribosom sitoplasma eukariotik sing paling cilik sing bakal diciriake lan menehi wawasan babagan carane tingkat pangurangan genom pungkasan mengaruhi struktur, perakitan, lan evolusi mesin molekuler sing integral karo sel.Kita nemokake yen ribosom E. cuniculi nglanggar prinsip-prinsip lempitan RNA lan perakitan ribosom sing akeh, lan nemokake protein ribosom sing durung dingerteni sadurunge.Ora dikarepke, kita nuduhake yen ribosom microsporidia wis ngalami évolusi kemampuan kanggo ngiket molekul cilik, lan hipotesis manawa pemotongan ing rRNA lan protein bisa nyebabake inovasi evolusi sing pungkasane bisa menehi kualitas migunani ing ribosom.
Kanggo nambah pemahaman kita babagan evolusi protein lan asam nukleat ing organisme intraselular, kita mutusake kanggo ngisolasi spora E. cuniculi saka kultur sel mamalia sing kena infeksi supaya bisa ngresiki ribosom lan nemtokake struktur ribosom kasebut.Iku angel kanggo entuk jumlah gedhe saka microsporidia parasit amarga microsporidia ora bisa dibudidaya ing medium nutrisi.Nanging, padha tuwuh lan ngasilake mung ing njero sel inang.Mulane, kanggo njupuk biomas E. cuniculi kanggo dimurnèkaké ribosom, kita infèksi garis sel ginjel mamalia RK13 karo spora E. cuniculi lan kultur sel infèksi iki kanggo sawetara minggu kanggo ngidini E. cuniculi kanggo tuwuh lan Multiply.Nggunakake monolayer sel sing kena infeksi kira-kira setengah meter persegi, kita bisa ngresiki udakara 300 mg spora Microsporidia lan digunakake kanggo ngisolasi ribosom.Kita banjur ngganggu spora diresiki karo manik-manik kaca lan ngisolasi ribosom mentah nggunakake fraksinasi polietilen glikol stepwise saka lysates.Iki ngidini kita entuk kira-kira 300 µg ribosom E. cuniculi mentah kanggo analisis struktural.
Kita banjur nglumpukake gambar cryo-EM nggunakake conto ribosom sing diasilake lan ngolah gambar kasebut nggunakake topeng sing cocog karo subunit ribosom gedhe, kepala subunit cilik, lan subunit cilik.Sajrone proses iki, kita nglumpukake gambar babagan 108,000 partikel ribosom lan ngetung gambar cryo-EM kanthi resolusi 2.7 Å (Gambar Tambahan 1-3).Kita banjur nggunakake gambar cryoEM kanggo model rRNA, protein ribosom, lan faktor hibernasi Mdf1 digandhengake karo E. cuniculi ribosom (Fig. 1a, b).
a Struktur ribosom E. cuniculi ing kompleks kanthi faktor hibernasi Mdf1 (pdb id 7QEP).b Peta faktor hibernasi Mdf1 digandhengake karo ribosom E. cuniculi.c Peta struktur sekunder mbandhingake rRNA sing ditemokake ing spesies Microsporidian karo struktur ribosom sing dikenal.Panel kasebut nuduhake lokasi fragmen rRNA (ES) lan situs aktif ribosom, kalebu situs dekoding (DC), loop sarcinicin (SRL), lan pusat transferase peptidyl (PTC).d Kapadhetan elektron sing cocog karo pusat transferase peptidil saka ribosom E. cuniculi nuduhake yen situs katalitik iki nduweni struktur sing padha ing parasit E. cuniculi lan hoste, kalebu H. sapiens.e, f Kapadhetan elektron sing cocog saka pusat dekoding (e) lan struktur skematik pusat dekoding (f) nuduhake yen E. cuniculi nduweni residu U1491 tinimbang A1491 (nomer E. coli) ing akeh eukariota liyane.Owah-owahan iki nuduhake yen E. cuniculi bisa uga sensitif marang antibiotik sing ngarahake situs aktif iki.
Beda karo struktur ribosom V. necatrix lan P. locustae sing wis diadegake (loro struktur kasebut minangka famili Nosematidae microsporidia sing padha lan meh padha karo siji liyane), 31,32 E. cuniculi ribosomes ngalami akeh proses rRNA lan fragmentasi protein.Denaturasi luwih lanjut (Gambar Tambahan 4-6).Ing rRNA, owah-owahan sing paling nyenengake kalebu mundhut lengkap fragmen 25S rRNA sing digedhekake ES12L lan degenerasi parsial h39, h41, lan H18 heliks (Gambar 1c, Gambar Tambahan 4).Antarane protein ribosom, owah-owahan sing paling nggumunake kalebu mundhut lengkap protein eS30 lan nyepetake protein eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, lan eS7 (Gambar Tambahan 4, 5).
Mangkono, pangurangan ekstrem saka génom spesies Encephalotozoon / Ordospora dibayangke ing struktur ribosom: E. ribosom cuniculi ngalami mundhut isi protein sing paling dramatis ing ribosom sitoplasma eukariotik sing tundhuk karo karakterisasi struktural, lan padha ora duwe rRNA lan fragmen protein sing akeh dikonservasi ing telung domain, nanging ora mung ing eukariota urip.Struktur ribosom E. cuniculi nyedhiyakake model molekuler pisanan kanggo owah-owahan kasebut lan ngungkapake acara evolusi sing wis diabaikan dening genomik komparatif lan studi struktur biomolekul intraselular (Tambahan Gambar 7).Ing ngisor iki, kita njlèntrèhaké saben acara kasebut bebarengan karo asal-usul evolusioner sing kemungkinan lan pengaruh potensial ing fungsi ribosom.
Kita banjur nemokake manawa, saliyane trunkasi rRNA gedhe, ribosom E. cuniculi duwe variasi rRNA ing salah sawijining situs sing aktif.Sanajan pusat transferase peptidil saka ribosom E. cuniculi nduweni struktur sing padha karo ribosom eukariotik liyane (Gambar 1d), pusat dekoding beda amarga variasi urutan ing nukleotida 1491 (panomeran E. coli, Fig. 1e, f).Pengamatan iki penting amarga situs dekoding ribosom eukariotik biasane ngemot residu G1408 lan A1491 dibandhingake karo residu tipe bakteri A1408 lan G1491.Variasi iki ndasari sensitivitas sing beda saka ribosom bakteri lan eukariotik menyang kulawarga aminoglikosida antibiotik ribosom lan molekul cilik liyane sing ngarahake situs dekoding.Ing situs dekoding saka ribosom E. cuniculi, residu A1491 diganti karo U1491, duweni potensi nggawe antarmuka naleni unik kanggo molekul cilik sing ngarahake situs aktif iki.Varian A14901 sing padha uga ana ing microsporidia liyane kayata P. locustae lan V. necatrix, sing nuduhake manawa nyebar ing antarane spesies microsporidia (Gambar 1f).
Amarga sampel ribosom E. cuniculi kita diisolasi saka spora metabolik sing ora aktif, kita nguji peta cryo-EM saka E. cuniculi kanggo ikatan ribosom sing diterangake sadurunge ing kahanan stres utawa kelaparan.Faktor hibernasi 31,32,36,37, 38. Kita cocog karo struktur ribosom hibernasi sadurunge karo peta cryo-EM saka ribosom E. cuniculi.Kanggo docking, ribosom S. cerevisiae digunakake ing kompleks kanthi faktor hibernasi Stm138, ribosom belalang ing kompleks kanthi faktor Lso232, lan ribosom V. necatrix ing kompleks kanthi faktor Mdf1 lan Mdf231.Ing wektu sing padha, kita nemokake kapadhetan cryo-EM sing cocog karo faktor liyane Mdf1.Padha karo Mdf1 naleni karo ribosom V. necatrix, Mdf1 uga ngiket karo ribosom E. cuniculi, ing ngendi iku ngalangi situs E ribosom, bisa bantuan kanggo nggawe ribosom kasedhiya nalika spora parasit dadi metabolically ora aktif nalika awak ora aktif (Gambar 2).).
Mdf1 ngalangi situs E ribosom, sing katon mbantu mateni ribosom nalika spora parasit dadi ora aktif sacara metabolik.Ing struktur ribosom E. cuniculi, kita nemokake manawa Mdf1 mbentuk kontak sing sadurunge ora dingerteni karo batang ribosom L1, bagean ribosom sing nggampangake ngeculake tRNA deacylated saka ribosom sajrone sintesis protein.Kontak kasebut nuduhake yen Mdf1 dissociate saka ribosom nggunakake mekanisme sing padha karo tRNA deasetilasi, nyedhiyakake panjelasan babagan carane ribosom mbusak Mdf1 kanggo ngaktifake maneh sintesis protein.
Nanging, struktur kita nuduhake kontak sing ora dingerteni ing antarane Mdf1 lan sikil ribosom L1 (bagean ribosom sing mbantu ngeculake tRNA deasil saka ribosom sajrone sintesis protein).Utamane, Mdf1 nggunakake kontak sing padha karo bagean siku saka molekul tRNA deacylated (Gambar 2).Pemodelan molekuler sing durung dingerteni sadurunge iki nuduhake yen Mdf1 dissociate saka ribosom nggunakake mekanisme sing padha karo tRNA deacetylated, sing nerangake carane ribosom mbusak faktor hibernasi iki kanggo ngaktifake sintesis protein.
Nalika mbangun model rRNA, kita ketemu sing E. cuniculi ribosom wis abnormally lempitan rRNA pecahan, kang kita disebut rRNA nggabungke (Fig. 3).Ing ribosom sing nyakup telung domain urip, rRNA melu ing struktur sing paling rRNA basis pasangan basa lan melu siji liyane utawa interaksi karo protein ribosom38,39,40.Nanging, ing ribosom E. cuniculi, rRNA katon nglanggar prinsip lempitan iki kanthi ngowahi sawetara heliks dadi wilayah rRNA sing ora dilipat.
Struktur helix H18 25S rRNA ing S. cerevisiae, V. necatrix, lan E. cuniculi.Biasane, ing ribosom sing ngliwati telung domain urip, penghubung iki dadi heliks RNA sing ngemot 24 nganti 34 residu.Ing Microsporidia, ing kontras, linker rRNA iki mboko sithik suda kanggo loro linker sugih uridine siji-stranded mung ngemot 12 residu.Akèh-akèhé ampas iki kapapar pelarut.Tokoh kasebut nuduhake yen microsporidia parasit katon nglanggar prinsip umum lempitan rRNA, ing ngendi basa rRNA biasane digandhengake karo basa liyane utawa melu interaksi rRNA-protein.Ing microsporidia, sawetara fragmen rRNA njupuk lipatan sing ora apik, ing endi heliks rRNA sing lawas dadi fragmen untai tunggal sing meh padha karo garis lurus.Anane wilayah sing ora biasa iki ngidini microsporidia rRNA bisa ngiket fragmen rRNA sing adoh kanthi nggunakake jumlah basa RNA minimal.
Conto paling striking saka transisi évolusi iki bisa diamati ing H18 25S rRNA helix (Fig. 3).Ing spesies saka E. coli nganti manungsa, dhasar heliks rRNA iki ngandhut 24-32 nukleotida, mbentuk heliks sing rada ora teratur.Ing struktur ribosom sing wis diidentifikasi sadurunge saka V. necatrix lan P. locustae, 31,32 dhasar saka heliks H18 sebagian uncoiled, nanging pasangan basa nukleotida dilestarekake.Nanging, ing E. cuniculi pecahan rRNA iki dadi linkers paling cendhak 228UUUGU232 lan 301UUUUUUUUU307.Ora kaya fragmen rRNA sing khas, linker sing sugih uridine iki ora nggulung utawa nggawe kontak ekstensif karo protein ribosom.Nanging, dheweke nggunakake struktur sing mbukak pelarut lan mbukak kanthi lengkap ing ngendi untaian rRNA dilanjutake meh lurus.Konformasi dowo iki nerangake carane E. cuniculi mung nggunakake 12 basa RNA kanggo ngisi longkangan 33 Å antarane H16 lan H18 rRNA helices, nalika spesies liyane mbutuhake paling kaping pindho basa rRNA kanggo ngisi longkangan.
Mangkono, kita bisa nduduhake manawa, liwat lempitan sing ora nyenengake kanthi energik, mikrosporidia parasit wis ngembangake strategi kanggo ngontrak malah segmen rRNA sing tetep dilestarikake ing antarane spesies ing telung domain urip.Ketoke, kanthi nglumpukake mutasi sing ngowahi heliks rRNA dadi penghubung poli-U sing cendhak, E. cuniculi bisa mbentuk pecahan rRNA sing ora biasa sing ngemot sawetara nukleotida sabisa kanggo ligasi fragmen rRNA distal.Iki mbantu nerangake carane microsporidia entuk pangurangan dramatis ing struktur molekul dhasar tanpa kelangan integritas struktural lan fungsional.
Liyane fitur mboten umum saka E. cuniculi rRNA katon rRNA tanpa thickenings (Fig. 4).Tonjolan iku nukleotida tanpa pasangan basa sing metu saka heliks RNA tinimbang ndhelik ing njero.Umume protrusions rRNA tumindak minangka adhesives molekuler, mbantu kanggo ikatan protèin ribosom jejer utawa pecahan rRNA liyane.Sawetara bulge tumindak minangka engsel, saéngga rRNA helix bisa lentur lan melu kanthi optimal kanggo sintesis protein sing produktif 41 .
a Tonjolan rRNA (S. cerevisiae numbering) ora ana ing struktur ribosom E. cuniculi, nanging ana ing sebagian besar eukariota b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, lan E. cuniculi ribosom internal.parasit lack akeh kuna, Highly konservasi rRNA bulges.Iki thickenings stabil struktur ribosom;mulane, anané ing microsporidia nuduhake stabilitas suda rRNA lempitan ing parasit microsporidia.Comparison karo P stems (L7 / L12 stems ing bakteri) nuduhake yen mundhut rRNA bumps kadhangkala pas karo munculé bumps anyar jejere bumps ilang.Helix H42 ing rRNA 23S/28S nduweni tonjolan kuna (U1206 ing Saccharomyces cerevisiae) kira-kira umure paling sethithik 3,5 milyar taun amarga proteksi ing telung domain urip.Ing microsporidia, bulge iki diilangi.Nanging, katon bulge anyar ing jejere bulge sing ilang (A1306 ing E. cuniculi).
Sing nggumunake, kita nemokake yen ribosom E. cuniculi ora duwe sebagian besar bulge rRNA sing ditemokake ing spesies liyane, kalebu luwih saka 30 bulge sing disimpen ing eukariota liyane (Fig. 4a).Mundhut iki ngilangi akeh kontak antarane subunit ribosom lan heliks rRNA jejer, kadhangkala nggawe void kothong gedhe ing ribosom, nggawe ribosom E. cuniculi luwih keropos dibandhingake ribosom liyane tradisional (Fig. 4b).Notabene, kita ketemu sing paling bulges iki uga ilang ing struktur ribosom V. necatrix lan P. locustae sing wis diidentifikasi sadurunge, sing ora digatekake dening analisis struktural sadurunge31,32.
Kadhangkala mundhut rRNA bulges diiringi pangembangan bulges anyar jejere bulge ilang.Contone, ribosom P-batang ngandhut U1208 bulge (ing Saccharomyces cerevisiae) sing slamet saka E. coli kanggo manungsa lan mulane kira-kira 3,5 milyar taun.Sajrone sintesis protein, bulge iki mbantu batang P pindhah antarane konformasi mbukak lan ditutup supaya ribosom bisa njupuk faktor terjemahan lan ngirim menyang situs aktif.Ing ribosom E. cuniculi, penebalan iki ora ana;Nanging, thickening anyar (G883) dumunung mung ing telung pasangan basa bisa kontribusi kanggo mulihake keluwesan optimal saka gagang P (Fig. 4c).
Data kita babagan rRNA tanpa bulges nuduhake manawa minimalake rRNA ora mung ilang unsur rRNA ing permukaan ribosom, nanging bisa uga nglibatake inti ribosom, nggawe cacat molekular spesifik parasit sing durung diterangake ing sel sing urip bebas.spesies urip diamati.
Sawise model protein ribosom kanonik lan rRNA, kita nemokake manawa komponen ribosom konvensional ora bisa nerangake telung bagean saka gambar cryo-EM.Loro fragmen kasebut minangka ukuran molekul cilik (Gambar 5, Gambar Tambahan 8).Segmen pisanan diapit ing antarane protein ribosom uL15 lan eL18 ing posisi sing biasane dikuwasani dening terminal C eL18, sing disingkat ing E. cuniculi.Senajan kita ora bisa nemtokake identitas molekul iki, ukuran lan wangun saka pulo Kapadhetan iki uga diterangake dening ngarsane molekul spermidine.Ikatan karo ribosom distabilake kanthi mutasi khusus microsporidia ing protein uL15 (Asp51 lan Arg56), sing katon nambah afinitas ribosom kanggo molekul cilik iki, amarga ngidini uL15 mbungkus molekul cilik dadi struktur ribosom.Gambar Tambahan 2).8, data tambahan 1, 2).
Cryo-EM imaging nuduhake anané nukleotida njaba ribosa bound kanggo E. cuniculi ribosome.Ing ribosom E. cuniculi, nukleotida iki manggoni panggonan sing padha karo nukleotida 25S rRNA A3186 (panomeran Saccharomyces cerevisiae) ing sebagian besar ribosom eukariotik liyane.b Ing struktur ribosom E. cuniculi, nukleotida iki dumunung ing antarane protèin ribosom uL9 lan eL20, saéngga nyetabilake kontak antara loro protèin kasebut.analisis konservasi urutan cd eL20 antarane spesies microsporidia.Wit filogenetik spesies Microsporidia (c) lan alignment pirang-pirang urutan saka protein eL20 (d) nuduhake yen residu nukleotida-binding F170 lan K172 disimpen ing Microsporidia sing paling khas, kajaba S. lophii, kajaba Microsporidia cabang awal, sing nahan ekstensi rRNA ES39L.e Angka iki nuduhake yen residu pengikat nukleotida F170 lan K172 mung ana ing eL20 saka genom microsporidia sing suda banget, nanging ora ana ing eukariota liyane.Sakabèhé, data kasebut nuduhaké yèn ribosom Microsporidian wis ngembangake situs pengikatan nukleotida sing katon kanggo ngiket molekul AMP lan digunakake kanggo nyetabilake interaksi protein-protein ing struktur ribosom.Konservasi dhuwur saka situs ikatan iki ing Microsporidia lan ora ana ing eukariota liyane nuduhake yen situs iki bisa menehi kauntungan kaslametan sing selektif kanggo Microsporidia.Mangkono, kanthong nukleotida-naleni ing ribosom microsporidia ora katon minangka fitur degenerasi utawa wangun pungkasan saka degradasi rRNA kaya sing wis diterangake sadurunge, nanging minangka inovasi evolusi migunani sing ngidini ribosom microsporidia bisa langsung ngiket molekul cilik, digunakake minangka blok bangunan molekul.pamblokiran kanggo ribosom.Panemuan iki ndadekake ribosom microsporidia minangka siji-sijine ribosom sing dikenal nggunakake nukleotida tunggal minangka blok bangunan struktural.f Jalur evolusi hipotetis sing asale saka ikatan nukleotida.
Kapadhetan bobot molekul rendah kapindho dumunung ing antarmuka antarane protein ribosom uL9 lan eL30 (Gambar 5a).Antarmuka iki sadurunge diterangake ing struktur ribosom Saccharomyces cerevisiae minangka situs pengikat kanggo nukleotida 25S saka rRNA A3186 (bagean saka ekstensi rRNA ES39L)38.Dituduhake yen ing ribosom P. locustae ES39L sing degenerasi, antarmuka iki ngiket nukleotida tunggal sing ora dingerteni 31, lan dianggep yen nukleotida iki minangka wangun rRNA sing dikurangi, sing dawa rRNA yaiku ~ 130-230 basa.ES39L dikurangi dadi siji nukleotida 32.43.Gambar cryo-EM kita ndhukung ide manawa kapadhetan bisa diterangake dening nukleotida.Nanging, resolusi sing luwih dhuwur saka struktur kita nuduhake yen nukleotida iki minangka molekul ekstraribosomal, bisa uga AMP (Gambar 5a, b).
Kita banjur takon apa situs naleni nukleotida katon ing ribosom E. cuniculi utawa apa wis ana sadurunge.Wiwit ikatan nukleotida utamane dimediasi dening residu Phe170 lan Lys172 ing protein ribosom eL30, kita ngevaluasi konservasi residu kasebut ing 4396 eukariota perwakilan.Kaya ing kasus uL15 ing ndhuwur, kita nemokake yen residu Phe170 lan Lys172 dikonservasi mung ing Microsporidia khas, nanging ora ana ing eukariota liyane, kalebu Microsporidia Mitosporidium lan Amphiamblys atipikal, sing fragmen ES39L rRNA ora dikurangi 44, 45, 45.-e).
Digabungake, data kasebut ndhukung gagasan yen E. cuniculi lan bisa uga microsporidia kanonik liyane wis ngalami évolusi kemampuan kanggo nyekel metabolit cilik ing struktur ribosom kanthi efisien kanggo ngimbangi penurunan tingkat rRNA lan protein.Kanthi mengkono, dheweke wis ngembangake kemampuan unik kanggo ngiket nukleotida ing njaba ribosom, nuduhake yen struktur molekul parasit menehi kompensasi kanthi njupuk metabolit cilik sing akeh banget lan digunakake minangka niru struktur RNA lan pecahan protein sing rusak..
Bagean katelu sing ora disimulasi saka peta cryo-EM kita, ditemokake ing subunit ribosom gedhe.Resolusi sing relatif dhuwur (2.6 Å) saka peta kita nuduhake yen kapadhetan iki kalebu protein kanthi kombinasi unik saka residu rantai sisih gedhe, sing ngidini kita ngenali kapadhetan iki minangka protein ribosom sing durung dingerteni sadurunge diidentifikasi minangka msL2 (Microsporidia- protein spesifik L2) (metode, tokoh 6).Panelusuran homologi kita nuduhake yen msL2 disimpen ing clade Microsporidia saka genus Encephaliter lan Orosporidium, nanging ora ana ing spesies liyane, kalebu Microsporidia liyane.Ing struktur ribosom, msL2 ngenggoni celah sing dibentuk kanthi mundhut rRNA ES31L sing diperluas.Ing kekosongan iki, msL2 mbantu nyetabilake rRNA lempitan lan bisa ngimbangi mundhut ES31L (Gambar 6).
Kapadhetan elektron lan model protein ribosom khusus Microsporidia msL2 sing ditemokake ing ribosom E. cuniculi.b Umume ribosom eukariotik, kalebu ribosom 80S saka Saccharomyces cerevisiae, duwe amplifikasi ES19L rRNA sing ilang ing sebagian besar spesies Microsporidian.Struktur ribosom microsporidia V. necatrix sing wis ditemtokake sadurunge nuduhake yen mundhut ES19L ing parasit kasebut dikompensasi dening evolusi protein ribosom msL1 anyar.Ing panliten iki, kita nemokake yen ribosom E. cuniculi uga ngembangake protein mimik RNA ribosom tambahan minangka kompensasi sing katon kanggo mundhut ES19L.Nanging, msL2 (saiki dianotasi minangka protein ECU06_1135 hipotetis) lan msL1 nduweni asal-usul struktural lan evolusi sing beda.c Panemuan generasi protèin ribosom msL1 lan msL2 sing ora ana hubungané évolusi iki nuduhaké yèn ribosom nglumpukake mutasi sing ngrugekake ing rRNA, bisa nggayuh tingkat keragaman komposisi sing durung tau ana ing sapérangan subset spesies sing raket banget.Panemuan iki bisa mbantu njlentrehake asal-usul lan evolusi ribosom mitokondria, sing dikenal amarga rRNA sing sithik banget lan variasi sing ora normal ing komposisi protein ing antarane spesies.
Kita banjur mbandhingake protein msL2 karo protein msL1 sing wis diterangake sadurunge, mung protein ribosom khusus microsporidia sing ditemokake ing ribosom V. necatrix.Kita pengin nyoba apa msL1 lan msL2 ana hubungane evolusi.Analisis kita nuduhake yen msL1 lan msL2 manggoni rongga sing padha ing struktur ribosom, nanging nduweni struktur primer lan tersier sing beda, sing nuduhake asal-usul evolusi sing mandiri (Gambar 6).Mangkono, panemuan msL2 menehi bukti yen klompok spesies eukariotik kompak bisa kanthi mandiri ngembangake protein ribosom kanthi struktur sing beda kanggo ngimbangi kelangan fragmen rRNA.Temuan iki kacathet amarga umume ribosom eukariotik sitoplasma ngemot protein invarian, kalebu kulawarga sing padha karo 81 protein ribosom.Munculé msL1 lan msL2 ing macem-macem clades microsporidia kanggo nanggepi mundhut saka segmen rRNA lengkap nuduhake yen degradasi arsitektur molekul parasit nyebabake parasit kanggo nggoleki mutasi ganti rugi, kang pungkasanipun bisa mimpin kanggo akuisisi ing populasi parasit beda.struktur.
Pungkasan, nalika model kita rampung, kita mbandhingake komposisi ribosom E. cuniculi karo sing diprediksi saka urutan genom.Sawetara protein ribosom, kalebu eL14, eL38, eL41, lan eS30, sadurunge dianggep ilang saka génom E. cuniculi amarga ora ana homolog saka génom E. cuniculi.Mundhut akeh protèin ribosom uga diprediksi ing akèh parasit intraselular lan endosimbion liyané sing suda banget.Contone, sanajan umume bakteri sing urip bebas ngemot kulawarga sing padha karo 54 protein ribosom, mung 11 saka kulawarga protein kasebut duwe homolog sing bisa dideteksi ing saben genom bakteri sing diwatesi host sing dianalisis.Kanggo ndhukung gagasan iki, mundhut protein ribosom wis diamati kanthi eksperimen ing V. necatrix lan P. locustae microsporidia, sing ora duwe protein eL38 lan eL4131,32.
Nanging, struktur kita nuduhake yen mung eL38, eL41, lan eS30 sing bener-bener ilang ing ribosom E. cuniculi.Protein eL14 disimpen lan struktur kita nuduhake kenapa protein iki ora bisa ditemokake ing panelusuran homologi (Gambar 7).Ing ribosom E. cuniculi, sebagian besar situs pengikatan eL14 ilang amarga degradasi ES39L sing diamplifikasi rRNA.Tanpa anané ES39L, eL14 ilang sebagian besar struktur sekunder, lan mung 18% saka urutan eL14 sing padha ing E. cuniculi lan S. cerevisiae.Pengawetan urutan sing ora apik iki luar biasa amarga sanajan Saccharomyces cerevisiae lan Homo sapiens—organisme sing beda-beda 1,5 milyar taun-andum luwih saka 51% saka residu sing padha ing eL14.Kerugian konservasi anomali iki nerangake kenapa E. cuniculi eL14 saiki dianotasi minangka protein M970_061160 putative lan dudu protein ribosom eL1427.
lan ribosom Microsporidia ilang ekstensi rRNA ES39L, sing sebagian ngilangi situs ikatan protein ribosom eL14.Tanpa anané ES39L, protein microspore eL14 ngalami mundhut saka struktur sekunder, kang mantan rRNA-binding α-helix degenerates menyang daur ulang dawa minimal.b Multiple sequence alignment nuduhake yen protein eL14 banget dikonservasi ing spesies eukariotik (57% identitas urutan antarane ragi lan homolog manungsa), nanging kurang dikonservasi lan divergen ing microsporidia (sing ora luwih saka 24% residu sing padha karo homolog eL14).saka S. cerevisiae utawa H. sapiens).Konservasi urutan sing ora apik lan variabilitas struktur sekunder iki nerangake kenapa homolog eL14 ora tau ditemokake ing E. cuniculi lan kenapa protein iki dianggep ilang ing E. cuniculi.Ing kontras, E. cuniculi eL14 sadurunge dianotasi minangka protein M970_061160 putative.Observasi iki nyatake yen keragaman genom microsporidia saiki dianggep luwih dhuwur: sawetara gen sing saiki dianggep ilang ing microsporidia nyatane diawetake, sanajan ing wangun sing beda banget;Nanging, ana sing dianggep ngode gen microsporidia kanggo protein spesifik cacing (contone, protein hipotetis M970_061160) bener-bener menehi kode kanggo protein sing maneka warna sing ditemokake ing eukariota liyane.
Panemuan iki nuduhake yen denaturasi rRNA bisa nyebabake mundhut konservasi urutan sing dramatis ing protèin ribosom sing cedhak, saéngga protèin kasebut ora bisa dideteksi kanggo telusuran homologi.Mangkono, kita bisa ngira-ngira tingkat nyata degradasi molekuler ing organisme genom cilik, amarga sawetara protèin sing dianggep ilang bener-bener tetep, sanajan ing wangun sing wis diowahi.
Kepiye parasit bisa nahan fungsi mesin molekuler ing kahanan pengurangan genom sing ekstrem?Panliten kita njawab pitakonan iki kanthi njlèntrèhaké struktur molekul komplèks (ribosom) E. cuniculi, sawijining organisme kanthi salah siji genom eukariotik paling cilik.
Wis dikenal meh rong puluh taun yen molekul protein lan RNA ing parasit mikroba asring beda karo molekul homolog ing spesies sing urip bebas amarga ora duwe pusat kontrol kualitas, dikurangi dadi 50% ukurane ing mikroba sing urip bebas, lsp.akeh mutasi debilitating sing ngrusak lempitan lan fungsi.Contone, ing ribosom saka organisme genom cilik, kalebu akeh parasit intraselular lan endosymbionts, samesthine kanggo lack sawetara protèin ribosom lan nganti sapratelo saka nukleotida rRNA dibandhingake spesies free-urip 27, 29, 30, 49. Nanging, cara molekul iki fungsi ing parasit tetep umumé misteri genomics liwat.
Panliten kita nuduhake yen struktur makromolekul bisa mbukak akeh aspek evolusi sing angel diekstrak saka studi genom komparatif tradisional parasit intraselular lan organisme sing diwatesi host liyane (Tambahan Gambar 7).Contone, conto protein eL14 nuduhake yen kita bisa ngira-ngira tingkat nyata degradasi aparat molekul ing spesies parasit.Parasit encephalitic saiki dipercaya duwe atusan gen spesifik microsporidia.Nanging, asil kita nuduhake yen sawetara gen sing katon spesifik iki sejatine mung varian gen sing beda banget sing umum ing eukariota liyane.Kajaba iku, conto protein msL2 nuduhake kepiye kita ora nggatekake protein ribosom anyar lan ngremehake isi mesin molekuler parasit.Conto molekul cilik nuduhake carane kita bisa nglirwakake inovasi paling akale ing struktur molekul parasit sing bisa menehi aktivitas biologi anyar.
Yen dijupuk bebarengan, asil iki nambah pemahaman kita babagan beda antarane struktur molekul organisme sing diwatesi inang lan pasangane ing organisme urip bebas.Kita nuduhake yen mesin molekuler, sing wis suwe dikira bakal suda, degenerasi, lan ngalami mutasi sing ngrusak macem-macem, tinimbang duwe sekumpulan fitur struktural sing ora biasa sing ora digatekake kanthi sistematis.
Ing sisih liya, fragmen rRNA non-bulky lan fragmen gabungan sing ditemokake ing ribosom E. cuniculi nuduhake yen pengurangan genom bisa ngganti malah bagean mesin molekuler dhasar sing disimpen ing telung domain urip - sawise meh 3,5 milyar taun.evolusi independen spesies.
Fragmen rRNA bulge-free lan nggabung ing E. cuniculi ribosomes utamané kapentingan ing cahya saka pasinaon sadurungé molekul RNA ing bakteri endosymbiotic.Contone, ing aphid endosymbiont Buchnera aphidicola, rRNA lan tRNA molekul wis ditampilake duwe struktur sensitif-temperatur amarga bias komposisi A + T lan proporsi dhuwur saka pasangan basa non-kanonik20,50.Owah-owahan ing RNA iki, uga owah-owahan ing molekul protein, saiki dianggep tanggung jawab kanggo overdependence endosymbionts ing partners lan ora bisa endosymbionts kanggo nransfer panas 21, 23.Senadyan microsporidia rRNA parasit nduweni owah-owahan struktural sing béda, sifat owah-owahan kasebut nuduhaké yèn stabilitas termal sing suda lan katergantungan sing luwih dhuwur marang protèin chaperone bisa dadi fitur umum molekul RNA ing organisme kanthi génom sing suda.
Ing sisih liya, struktur kita nuduhake yen microsporidia parasit wis ngalami évolusi kemampuan unik kanggo nolak rRNA lan pecahan protein sing dikonservasi sacara wiyar, ngembangake kemampuan kanggo nggunakake metabolit cilik sing akeh banget lan kasedhiya minangka niru struktur rRNA lan pecahan protein sing rusak.Degradasi struktur molekul..Panemu iki didhukung dening kasunyatan manawa molekul cilik sing ngimbangi mundhut pecahan protein ing rRNA lan ribosom E. cuniculi ikatan karo residu khusus microsporidia ing protein uL15 lan eL30.Iki nuduhake yen ikatan molekul cilik menyang ribosom bisa uga minangka produk pilihan positif, ing ngendi mutasi spesifik Microsporidia ing protein ribosom wis dipilih amarga kemampuane nambah afinitas ribosom kanggo molekul cilik, sing bisa nyebabake organisme ribosom sing luwih efisien.Panemuan kasebut nuduhake inovasi cerdas ing struktur molekul parasit mikroba lan menehi pemahaman sing luwih apik babagan carane struktur molekul parasit njaga fungsi kasebut sanajan ana evolusi reduktif.
Saiki, identifikasi molekul cilik iki tetep ora jelas.Ora jelas kenapa katon molekul cilik kasebut ing struktur ribosom beda antarane spesies microsporidia.Utamane, ora jelas kenapa ikatan nukleotida diamati ing ribosom E. cuniculi lan P. locustae, lan ora ana ing ribosom V. necatrix, sanajan ana residu F170 ing protein eL20 lan K172 saka V. necatrix.Pambusakan iki bisa disebabake residu 43 uL6 (dumunung ing jejere kantong pengikat nukleotida), yaiku tirosin ing V. necatrix lan dudu treonine ing E. cuniculi lan P. locustae.Rantai sisih aromatik Tyr43 sing gedhe banget bisa ngganggu ikatan nukleotida amarga tumpang tindih sterik.Utawa, pambusakan nukleotida sing katon bisa uga amarga resolusi pencitraan cryo-EM sing kurang, sing ngalangi pemodelan fragmen ribosom V. necatrix.
Ing sisih liya, pakaryan kita nuduhake manawa proses pembusukan genom bisa uga dadi kekuwatan inventif.Utamane, struktur ribosom E. cuniculi nyatake yen ilang rRNA lan pecahan protein ing ribosom microsporidia nggawe tekanan evolusi sing ningkatake owah-owahan struktur ribosom.Varian iki dumadi adoh saka situs aktif ribosom lan katon kanggo mbantu njaga (utawa mulihake) rakitan ribosom optimal sing bakal kaganggu dening rRNA suda.Iki nuduhake manawa inovasi utama saka ribosom microsporidia katon wis berkembang dadi kabutuhan kanggo nyegat drift gen.
Mbok menawa iki paling apik digambarake kanthi ikatan nukleotida, sing durung tau diamati ing organisme liya nganti saiki.Kasunyatan manawa residu pengikat nukleotida ana ing mikrosporidia sing khas, nanging ora ana ing eukariota liyane, nuduhake yen situs sing ngiket nukleotida ora mung tinggalan sing nunggu ilang, utawa situs pungkasan kanggo rRNA dibalèkaké dadi wangun nukleotida individu.Nanging, situs iki katon kaya fitur migunani sing bisa berkembang liwat sawetara babak pilihan positif.Situs pengikatan nukleotida bisa dadi produk sampingan saka seleksi alam: yen ES39L rusak, microsporidia kepeksa njaluk ganti rugi kanggo mulihake biogenesis ribosom sing optimal tanpa ana ES39L.Amarga nukleotida iki bisa niru kontak molekul nukleotida A3186 ing ES39L, molekul nukleotida dadi blok bangunan ribosom, sing ikatan kasebut luwih apik kanthi mutasi urutan eL30.
Babagan evolusi molekuler parasit intraselular, panliten kita nuduhake yen pasukan seleksi alam Darwin lan drift genetis saka pembusukan genom ora beroperasi kanthi paralel, nanging osilasi.Kaping pisanan, drift genetik ngilangi fitur-fitur penting biomolekul, nggawe kompensasi dibutuhake banget.Mung nalika parasit nyukupi kabutuhan iki liwat seleksi alam Darwinian, makromolekul bakal duwe kesempatan kanggo ngembangake sipat sing paling nyengsemake lan inovatif.Sing penting, evolusi situs pengikatan nukleotida ing ribosom E. cuniculi nuduhake manawa pola evolusi molekuler sing ilang-kanggo-kauntungan iki ora mung amortize mutasi sing ngrusak, nanging kadhangkala menehi fungsi anyar ing makromolekul parasit.
Ide iki jumbuh karo teori kesetimbangan obah Sewell Wright, sing nyatakake yen sistem seleksi alam sing ketat mbatesi kemampuan organisme kanggo berinovasi51,52,53.Nanging, yen drift genetis ngganggu seleksi alam, drift iki bisa ngasilake owah-owahan sing ora adaptif (utawa malah ngrugekake) nanging nyebabake owah-owahan luwih lanjut sing nyedhiyakake kabugaran sing luwih dhuwur utawa aktivitas biologis anyar.Kerangka kerja kita ndhukung ide iki kanthi nggambarake manawa mutasi jinis sing padha sing nyuda lipatan lan fungsi biomolekul katon minangka pemicu utama kanggo perbaikan kasebut.Selaras karo model evolusi win-win, panliten kita nuduhake yen pembusukan genom, sing sacara tradisional dianggep minangka proses degeneratif, uga minangka pembalap utama inovasi, kadhangkala lan bisa uga asring ngidini makromolekul entuk aktivitas parasit anyar.bisa digunakake.