Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Sampeyan nggunakake versi browser kanthi dhukungan CSS winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.
Nampilake carousel telung slide bebarengan.Gunakake tombol Sadurungé lan Sabanjure kanggo pindhah liwat telung minger bebarengan, utawa nggunakake tombol panggeser ing mburi kanggo pindhah liwat telung minger bebarengan.
Barrier getih-otak lan alangi getih-otak nyegah agen bioterapeutik tekan target ing sistem saraf pusat, saéngga ngalangi perawatan penyakit neurologis sing efektif.Kanggo nemokake transporter otak novel ing vivo, kita ngenalake perpustakaan peptida phage T7 lan ngumpulake getih lan cairan serebrospinal (CSF) kanthi serial nggunakake model blumbang gedhe sing disadari saka tikus.Klon phage spesifik diperkaya ing CSF sawise patang putaran pilihan.Pengujian peptida calon individu nuduhake pengayaan luwih saka 1000 kali ing CSF.Bioaktivitas pangiriman peptida-mediated menyang otak dikonfirmasi kanthi nyuda 40% tingkat amyloid-β ing cairan serebrospinal nggunakake inhibitor peptida BACE1 sing disambung karo peptida transit novel sing diidentifikasi.Asil kasebut nuduhake manawa peptida sing diidentifikasi kanthi metode pemilihan in vivo phage bisa dadi kendaraan sing migunani kanggo pangiriman makromolekul sistemik menyang otak kanthi efek terapeutik.
Riset terapi sing ditargetake sistem saraf pusat (CNS) umume fokus kanggo ngenali obat-obatan lan agen sing dioptimalake sing nuduhake sifat penargetan CNS, kanthi kurang upaya kanggo nemokake mekanisme sing nyebabake pangiriman obat aktif menyang otak.Iki wiwit owah saiki amarga pangiriman obat, utamane molekul gedhe, minangka bagean integral saka pangembangan obat neurosains modern.Lingkungan sistem saraf pusat dilindhungi kanthi apik dening sistem penghalang serebrovaskular, sing dumadi saka alangi getih-otak (BBB) ​​​​lan alangi getih-otak (BCBB)1, dadi tantangan kanggo ngirim obat menyang otak1,2.Dikira-kira meh kabeh obat molekul gedhe lan luwih saka 98% obat molekul cilik diilangi saka otak3.Mulane penting banget kanggo ngenali sistem transportasi otak anyar sing nyedhiyakake pangiriman obat terapeutik sing efisien lan spesifik menyang CNS 4,5.Nanging, BBB lan BCSFB uga menehi kesempatan sing apik kanggo pangiriman obat amarga nembus lan mlebu kabeh struktur otak liwat pembuluh darah sing akeh.Mangkono, upaya saiki kanggo nggunakake cara non-invasif pangiriman menyang otak umume adhedhasar mekanisme transportasi mediasi reseptor (PMT) nggunakake reseptor BBB6 endogen.Senadyan kemajuan kunci anyar nggunakake jalur reseptor transferin7,8, pangembangan sistem pangiriman anyar kanthi sifat sing luwih apik dibutuhake.Kanggo tujuan iki, tujuan kita yaiku kanggo ngenali peptida sing bisa mediasi transportasi CSF, amarga bisa digunakake kanggo ngirim makromolekul menyang CNS utawa mbukak jalur reseptor anyar.Utamane, reseptor lan transporter spesifik saka sistem serebrovaskular (BBB lan BSCFB) bisa dadi target potensial kanggo pangiriman obat bioterapi sing aktif lan spesifik.Cairan serebrospinal (CSF) minangka produk sekresi saka pleksus koroid (CS) lan kontak langsung karo cairan interstitial otak liwat ruang subarachnoid lan ruang ventrikel4.Bubar wis ditampilake yen cairan cerebrospinal subarachnoid nyebar banget menyang interstitium otak9.Muga-muga bisa ngakses ruang parenkim nggunakake saluran inflow subarachnoid iki utawa langsung liwat BBB.Kanggo nggayuh iki, kita ngetrapake strategi pilihan vivo phage sing kuat sing ngenali peptida sing diangkut dening salah siji saka rong jalur sing béda iki.
Saiki kita njlèntrèhaké cara screening tampilan vivo phage kanthi sampling CSF ditambah karo urutan throughput dhuwur (HTS) kanggo ngawasi babak pilihan awal kanthi keragaman perpustakaan sing paling dhuwur.Screening ditindakake ing tikus sing sadar kanthi kanula cisterna gedhe (CM) sing ditanem kanthi permanen kanggo nyegah kontaminasi getih.Sing penting, pendekatan iki milih target otak lan peptida kanthi aktivitas transportasi ngliwati alangan serebrovaskular.Kita nggunakake fag T7 amarga ukurane cilik (~ 60 nm) 10 lan disaranake yen cocok kanggo transportasi vesikel sing ngidini nyebrang transselular saka penghalang endothelial lan / utawa epithelial-medulla.Sawise patang babak panning, populasi phage diisolasi nuduhake pengayaan CSF ing vivo lan asosiasi microvessel serebral.Sing penting, kita bisa ngonfirmasi temuan kasebut kanthi nuduhake manawa peptida calon paling apik sing disenengi lan disintesis sacara kimia bisa ngeterake kargo protein menyang cairan cerebrospinal.Kaping pisanan, efek farmakodinamik saka CNS ditetepake kanthi nggabungake peptida transit sing unggul karo inhibitor peptida BACE1.Saliyane nuduhake yen strategi screening fungsional ing vivo bisa ngenali peptida transportasi otak novel minangka operator kargo protein sing efektif, kita ngarepake pendekatan pilihan fungsional sing padha uga dadi penting kanggo ngenali jalur transportasi otak novel.
Adhedhasar unit pembentuk plak (PFU), sawise langkah kemasan phage, perpustakaan peptida phage T7 linear 12-mer kanthi macem-macem kira-kira 109 dirancang lan digawe (pirsani Bahan lan Metode).Wigati dicathet yen kita nganalisa perpustakaan iki kanthi ati-ati sadurunge panning vivo.amplifikasi PCR saka sampel perpustakaan phage nggunakake primer dipunéwahi kui amplicons sing langsung ditrapake kanggo HTS (Tambahan Fig. 1a).Amarga a) kesalahan urutan HTS11, b) impact ing kualitas primer (NNK) 1-12, lan c) anané wild-jinis (wt) phage (sisipan balung) ing perpustakaan siyaga, prosedur nyaring urutan dipun ginakaken kanggo extract mung informasi urutan diverifikasi (Tambahan Fig. 1b).Langkah-langkah panyaring iki ditrapake kanggo kabeh perpustakaan urutan HTS.Kanggo perpustakaan standar, total 233,868 diwaca, sing 39% ngliwati kriteria panyaring lan digunakake kanggo analisis perpustakaan lan pilihan kanggo babak sabanjure (Tambahan Gambar 1c-e).Wacan kasebut umume kelipatan saka 3 pasangan basa kanthi puncak ing 36 nukleotida (Tambahan Gambar 1c), ngonfirmasi desain perpustakaan (NNK) 1-12.Notabene, kira-kira 11% saka anggota perpustakaan ngemot 12-dimensi wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL sisipan, lan meh setengah saka urutan (49%) ngemot sisipan utawa pambusakan.HTS perpustakaan perpustakaan ngonfirmasi keragaman peptida sing dhuwur ing perpustakaan: luwih saka 81% saka urutan peptida ditemokake mung sapisan lan mung 1,5% ing ≥4 salinan (Tambahan Gambar 2a).Frekuensi asam amino (aa) ing kabeh posisi 12 ing repertoar hubungane apik karo frekuensi sing dikarepake kanggo jumlah kodon sing diasilake dening repertoar NKK sing degenerasi (Tambahan Gambar 2b).Frekuensi sing diamati saka residu aa sing dienkode dening sisipan kasebut ana hubungane karo frekuensi sing diwilang (r = 0,893) (Tambahan Gambar 2c).Persiapan perpustakaan phage kanggo injeksi kalebu langkah-langkah amplifikasi lan mbusak endotoksin.Iki sadurunge wis dituduhake bisa nyuda keragaman perpustakaan phage12,13.Mulane, kita ngurutake perpustakaan phage plate-amplified sing wis ngalami penghapusan endotoksin lan dibandhingake karo perpustakaan asli kanggo ngira frekuensi AA.Korelasi sing kuat (r = 0.995) diamati ing antarane blumbang asli lan kolam sing dikuatake lan diresiki (Tambahan Gambar 2d), nuduhake yen kompetisi antarane klon sing digedhekake ing piring nggunakake T7 phage ora nyebabake bias utama.Perbandhingan iki adhedhasar frekuensi motif tripeptida ing saben perpustakaan, amarga keragaman perpustakaan (~109) ora bisa dijupuk kanthi lengkap sanajan nganggo HTS.Analisis frekuensi aa ing saben posisi nuduhake bias gumantung posisi cilik ing telung posisi pungkasan saka repertoar sing mlebu (Tambahan Gambar 2e).Ing kesimpulan, kita nyimpulake yen kualitas lan keragaman perpustakaan bisa ditampa lan mung owah-owahan cilik ing keragaman sing diamati amarga amplifikasi lan nyiapake perpustakaan phage antarane sawetara babak pilihan.
Sampling cairan cerebrospinal serial bisa ditindakake kanthi nglebokake kanula menyang CM tikus sadar kanggo nggampangake identifikasi T7 phage sing disuntikake intravena (iv) liwat BBB lan / utawa BCSFB (Fig. 1a-b).Kita nggunakake rong lengen pilihan independen (lengen A lan B) ing telung babak pisanan pilihan in vivo (Fig. 1c).Kita mboko sithik nambah stringency saka pilihan dening mudun jumlah total phage ngenalaken ing telung babak pisanan pilihan.Kanggo panning babak kaping papat, kita gabungke conto saka cabang A lan B lan nindakake telung pilihan independen tambahan.Kanggo nyinaoni sifat in vivo saka partikel phage T7 ing model iki, phage jinis liar (PAGISRELVDKL master insert) disuntikake menyang tikus liwat vena buntut.Pemulihan fag saka cairan cerebrospinal lan getih ing titik wektu sing beda-beda nuduhake yen fag icosahedral T7 sing relatif cilik nduweni fase reresik awal sing cepet saka kompartemen getih (Tambahan Gambar 3).Adhedhasar titer sing diwenehake lan volume getih tikus, kita ngitung mung kira-kira 1% wt.phage saka dosis sing diwenehake dideteksi ing getih 10 menit sawise injeksi intravena.Sawise penurunan cepet awal iki, reresik primer sing luwih alon diukur kanthi umur setengah 27,7 menit.Sing penting, mung sawetara phage sing dijupuk saka kompartemen CSF, nuduhake latar mburi sing kurang kanggo migrasi phage jinis liar menyang kompartemen CSF (Tambahan Gambar 3).Rata-rata, mung kira-kira 1 x 10-3% titer saka T7 phage ing getih lan 4 x 10-8% saka fag wiwitan sing dideteksi ing cairan cerebrospinal sajrone kabeh periode sampling (0-250 menit).Utamane, setengah umur (25.7 min) fag jinis liar ing cairan cerebrospinal padha karo sing diamati ing getih.Data kasebut nduduhake manawa penghalang sing misahake kompartemen CSF saka getih utuh ing tikus sing dilebokake CM, ngidini pilihan perpustakaan phage in vivo kanggo ngenali klon sing siap diangkut saka getih menyang kompartemen CSF.
(a) Nyetel cara kanggo re-sampling cairan cerebrospinal (CSF) saka blumbang gedhe.(b) Diagram sing nuduhake lokasi selular penghalang sistem saraf pusat (CNS) lan strategi pilihan sing digunakake kanggo ngenali peptida sing ngliwati alangan getih-otak (BBB) ​​lan alangan getih-otak.(c) In vivo phage tampilan flowchart screening.Ing saben babak pilihan, phages (pengenal kewan ing jero panah) disuntikake intravena.Loro cabang alternatif independen (A, B) disimpen kanthi kapisah nganti babak 4 pemilihan.Kanggo babak pilihan 3 lan 4, saben klon phage sing diekstrak saka CSF diurutake kanthi manual.(d) Kinetika phage sing diisolasi saka getih (bunderan abang) lan cairan cerebrospinal (segitiga ijo) sajrone pemilihan babak pisanan ing rong tikus cannulated sawise injeksi intravena saka perpustakaan peptida T7 (2 x 1012 phages / kewan).Kothak biru nuduhake konsentrasi awal rata-rata phage ing getih, diitung saka jumlah phage sing disuntikake, kanthi ngitung volume getih total.Kothak ireng nuduhake titik persimpangan garis y sing diekstrapolasi saka konsentrasi fag getih.(e, f) Nyedhiyakake frekuensi relatif lan distribusi kabeh motif tripeptida tumpang tindih sing bisa ditemokake ing peptida.Jumlah motif sing ditemokake ing 1000 wacan ditampilake.Tegese (p < 0,001) motif sing disuguhake diwenehi tandha titik abang.(e) Korelasi scatterplot mbandhingake frekuensi relatif saka motif tripeptida perpustakaan nyuntikaken karo phage getih-asalé saka kéwan # 1.1 lan # 1.2.(f) Korelasi scatterplot mbandhingake frekuensi relatif saka motif tripeptida fag kewan #1.1 lan #1.2 sing diisolasi ing getih lan cairan cerebrospinal.(g, h) Perwakilan ID urutan phage sing diperkaya ing getih (g) versus perpustakaan sing disuntikake lan phage sing diperkaya ing CSF (h) versus getih sawise babak pilihan in vivo ing loro kewan.Ukuran kode siji huruf nuduhake sepira kerepe asam amino kasebut dumadi ing posisi kasebut.Ijo = polar, ungu = netral, biru = basa, abang = asam lan ireng = asam amino hidrofobik.Gambar 1a, b dirancang lan diprodhuksi dening Eduard Urich.
Kita nyuntikake perpustakaan peptida phage menyang rong tikus instrumen CM (clades A lan B) lan phage terisolasi saka cairan cerebrospinal lan getih (Gambar 1d).Reresik cepet awal perpustakaan iki kurang pocapan dibandhingake phage alam bébas.Rata-rata setengah umur perpustakaan sing disuntik ing kewan kasebut yaiku 24,8 menit ing getih, padha karo phage jinis liar, lan 38,5 menit ing CSF.Sampel phage getih lan cairan cerebrospinal saka saben kewan kena HTS lan kabeh peptida sing diidentifikasi dianalisis kanggo anané motif tripeptida sing cendhak.Motif tripeptida dipilih amarga menehi basis minimal kanggo pembentukan struktur lan interaksi peptida-protein14,15.Kita nemokake korélasi sing apik ing distribusi motif antarane perpustakaan phage sing disuntikake lan klon sing diekstrak saka getih kewan loro kasebut (Gambar 1e).Data kasebut nuduhake yen komposisi perpustakaan mung sithik banget ing kompartemen getih.Frekuensi asam amino lan urutan konsensus luwih dianalisis ing saben posisi nggunakake adaptasi saka piranti lunak Weblogo16.Apike, kita nemokake pengayaan sing kuat ing residu glisin getih (Gambar 1g).Nalika getih dibandhingake karo klon sing dipilih saka CSF, pilihan sing kuwat lan sawetara motif ora dipilih (Fig. 1f), lan asam amino tartamtu luwih disenengi ing posisi sing wis ditemtokake ing anggota 12 (Fig. 1h).Utamane, kewan individu beda-beda sacara signifikan ing cairan cerebrospinal, dene pengayaan glisin getih diamati ing kewan kasebut (Tambahan Gambar 4a-j).Sawise nyaring data urutan sing ketat ing cairan cerebrospinal kewan # 1.1 lan # 1.2, total 964 lan 420 peptida 12-mer unik dipikolehi (Tambahan Gambar 1d-e).Klon phage sing terisolasi digedhekake lan ditindakake ing babak kapindho pilihan in vivo.Phage sing diekstrak saka babak kapindho pilihan dikenai HTS ing saben kewan lan kabeh peptida sing diidentifikasi digunakake minangka input kanggo program pangenalan motif kanggo nganalisa kedadeyan motif tripeptida (Fig. 2a, b, ef).Dibandhingake karo siklus pisanan saka phage mbalekake saka CSF, kita diamati pilihan luwih lan deselection saka akeh motif ing CSF ing cabang A lan B (Fig. 2).Algoritma identifikasi jaringan ditrapake kanggo nemtokake manawa padha nuduhake pola urutan sing konsisten.Persamaan sing jelas diamati antarane urutan 12 dimensi sing ditemokake dening CSF ing clade alternatif A (Fig. 2c, d) lan clade B (Fig. 2g, h).Analisis sing dikumpulake ing saben cabang nuduhake profil pilihan sing beda kanggo peptida 12-mer (Tambahan Fig. 5c, d) lan paningkatan rasio CSF ​​/ titer getih sajrone wektu kanggo klon sing dikumpulake sawise pilihan babak kapindho dibandhingake karo pilihan babak pisanan (Tambahan Gambar 5e).).
Pengayaan motif lan peptida ing cairan cerebrospinal kanthi rong babak berturut-turut pilihan tampilan phage fungsional in vivo.
Kabeh phages adi cerebrospinal mbalekake saka babak pisanan saben kewan (kewan # 1.1 lan # 1.2) padha pooled, amplified, HT-sequenced lan reinjected bebarengan (2 x 1010 phages / kewan) 2 SM cannulated clurut (# 1.1 → #).2.1 lan 2.2, 1.2 → 2.3 lan 2.4).(a, b, e, f) Korelasi scatterplots mbandhingake frekuensi relatif saka motif tripeptida kabeh phages asalé CSF ing babak pilihan pisanan lan kaloro.Frekuensi relatif lan distribusi motif sing makili kabeh tripeptida tumpang tindih sing bisa ditemokake ing peptida ing loro orientasi kasebut.Jumlah motif sing ditemokake ing 1000 wacan ditampilake.Motif sing dipilih kanthi signifikan (p <0,001) utawa ora kalebu ing salah sawijining perpustakaan sing dibandhingake disorot nganggo titik abang.(c, d, g, h) Representasi logo urutan saka kabeh CSF-sugih 12 asam amino urutan dawa adhedhasar babak 2 lan 1 saka pilihan ing vivo.Ukuran kode siji huruf nuduhake sepira kerepe asam amino kasebut dumadi ing posisi kasebut.Kanggo makili logo, frekuensi saka urutan CSF dijupuk saka kéwan individu antarane rong babak pilihan dibandhingake lan urutan enriched ing babak kapindho ditampilake: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 lan (h) #1.2–#2.4.Asam amino sing paling sugih ing posisi tartamtu ing (c, d) kéwan no.2.1 lan no.2.2 utawa (g, h) ing kéwan no.2.3 lan no.2.4 ditampilake ing werna.Ijo = polar, ungu = netral, biru = basa, abang = asam lan ireng = asam amino hidrofobik.
Sawise pilihan kaping telu, kita nemtokake urutan peptida unik 124 (# 3.1 lan # 3.2) saka 332 klon phage reconstituted CSF sing diisolasi saka rong kewan (Tambahan Gambar 6a).Urutan LGSVS (18,7%) nduweni proporsi relatif paling dhuwur, ngiring dening sisipan jinis liar PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), lan SARGSWREIVSLS (2,2%).Ing babak kaping papat pungkasan, kita nglumpukake rong cabang sing dipilih kanthi mandiri saka telung kewan sing kapisah (Fig. 1c).Saka 925 klon phage sing diurutake saka CSF, ing babak kaping papat, kita nemokake 64 urutan peptida unik (Tambahan Gambar 6b), ing antarane proporsi relatif saka phage jinis liar mudhun dadi 0,8%.Klone CSF sing paling umum ing babak kaping papat yaiku LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) lan RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Jangkoan dawa peptida sing dipilih amarga sisipan / penghapusan nukleotida utawa kodon mandheg prematur ing primer perpustakaan nalika nggunakake kodon degenerasi kanggo desain perpustakaan NNK.Kodon mandheg prematur ngasilake peptida sing luwih cendhek lan dipilih amarga ngemot motif aa sing apik.Peptida sing luwih dawa bisa nyebabake sisipan/pambusakan ing primer perpustakaan sintetik.Iki posisi kodon mandeg sing dirancang ing njaba pigura lan diwaca nganti kodon mandeg anyar katon ing hilir.Umumé, kita ngitung faktor pengayaan kanggo kabeh papat babak pilihan kanthi mbandhingake data input karo data output sampel.Kanggo screening babak pisanan, kita nggunakake titer phage jinis liar minangka referensi latar mburi sing ora spesifik.Apike, pilihan phage negatif kuwat banget ing siklus CSF pisanan, nanging ora ana ing getih (Gambar 3a), sing bisa uga amarga kemungkinan difusi pasif sing sithik saka sebagian besar anggota perpustakaan peptida menyang kompartemen CSF utawa phages relatif cenderung luwih efisien ditahan utawa dibusak saka aliran getih tinimbang bakteriofag.Nanging, ing babak kapindho panning, pilihan kuwat saka phages ing CSF diamati ing loro clades, suggest sing babak sadurungé iki enriched ing phages nampilake peptida sing ningkataké uptake CSF (Fig. 3a).Maneh, tanpa pengayaan getih sing signifikan.Uga ing babak katelu lan kaping papat, klon phage sacara signifikan diperkaya ing CSF.Mbandingaken frekuensi relatif saben urutan peptida unik antarane rong babak pungkasan saka pilihan, kita ketemu sing urutan padha malah luwih enriched ing babak pilihan papat (Fig. 3b).Gunggunge 931 motif tripeptida diekstrak saka kabeh 64 urutan peptida unik kanthi nggunakake orientasi peptida.Motif sing paling sugih ing babak kaping papat ditliti kanthi teliti kanggo profil pengayaan ing kabeh babak dibandhingake karo perpustakaan sing disuntikake (cut-off: 10% pengayaan) (Tambahan Gambar 6c).Pola seleksi umum nuduhake yen akeh motif sing ditliti wis diperkaya ing kabeh babak sadurunge loro cabang pilihan.Nanging, sawetara motif (umpamane SGL, VSG, LGS GSV) umume saka klade alternatif A, dene liyane (umpamane FGW, RTN, WGF, NTR) ditambahake ing klade alternatif B.
Validasi transportasi CSF saka peptida sing ditampilake phage sing diperkaya CSF lan peptida pimpinan biotinilasi sing dikonjugasi menyang muatan streptavidin.
(a) rasio pengayaan diwilang ing kabeh papat babak (R1-R4) adhedhasar nyuntikaken (input = I) phage (PFU) titer lan ditemtokake CSF titer phage (output = O).Faktor pengayaan kanggo telung babak pungkasan (R2-R4) diwilang dening comparison karo babak sadurungé lan babak pisanan (R1) karo data bobot.Bar sing mbukak yaiku cairan cerebrospinal, bar sing teduh yaiku plasma.(***p<0,001, adhedhasar uji t Siswa).(b) Dhaptar peptida phage sing paling akeh, miturut proporsi relatif kanggo kabeh fag sing diklumpukake ing CSF sawise babak 4 pilihan.Enem klon phage sing paling umum disorot kanthi warna, nomer lan faktor pengayaan antarane babak 3 lan 4 pilihan (inset).(c, d) Enem klon phage sing paling akeh diperkaya, perpustakaan phage kosong lan peptida phage parental saka babak 4 dianalisis kanthi individu ing model sampling CSF.CSF lan sampel getih diklumpukake ing titik wektu sing dituduhake.(c) Jumlah sing padha karo 6 klon fag calon (2 x 1010 fag/kewan), fag kosong (#1779) (2 x 1010 fag/kewan) lan perpustakaan peptida phage saham (2 x 1012 fag/kewan) Nyuntikake paling sethithik 3 CM liwat kewan sing kapisah.Farmakokinetik CSF saben klon phage sing disuntikake lan perpustakaan peptida phage sajrone wektu ditampilake.(d) nuduhake rasio CSF ​​/ getih rata-rata kanggo kabeh fag / mL sing pulih sajrone wektu sampling.(e) Papat peptida pamimpin sintetik lan siji kontrol scrambled disambungake karo biotin menyang streptavidin liwat N-terminus (tampilan tetramer) banjur disuntik (vena buntut iv, 10 mg streptavidin / kg).Paling ora telung tikus intubasi (N = 3).).Sampel CSF diklumpukake ing titik wektu sing dituduhake lan konsentrasi streptavidin diukur kanthi CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ora dideteksi).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, adhedhasar tes ANOVA).(f) Perbandingan urutan asam amino klon peptida phage sing paling diperkaya #2002 (ungu) karo klon peptida phage liyane sing dipilih saka pilihan babak kaping 4.Pecahan asam amino sing padha lan padha ana kode warna.
Kabeh phages enriched ing babak kaping papat (Fig. 3b), enem calon klon dipilih kanggo analisis individu luwih ing model sampling CSF.Jumlah sing padha karo enem calon phage, phage kosong (ora ana sisipan) lan perpustakaan peptida prophage disuntikake menyang telung kewan CM cannulated, lan farmakokinetik ditemtokake ing CSF (Fig. 3c) lan getih (Tambahan Fig. 7) assays.Kabeh klon phage sing diuji ngarahake kompartemen CSF ing tingkat 10-1000 kaping luwih dhuwur tinimbang phage kontrol kosong (#1779).Contone, klon #2020 lan #2077 duwe titer CSF 1000 kaping luwih dhuwur tinimbang kontrol phage.Profil farmakokinetik saben peptida sing dipilih beda-beda, nanging kabeh duwe kemampuan omah CSF sing dhuwur.We diamati nyuda pancet liwat wektu kanggo turunan # 1903 lan # 2011, nalika kanggo turunan # 2077, # 2002 lan # 2009 Tambah sak pisanan 10 menit bisa nunjukaké transportasi aktif nanging kudu diverifikasi.Klon #2020, #2002, lan #2077 stabil ing tingkat sing dhuwur, dene konsentrasi CSF klon #2009 alon-alon mudhun sawise kenaikan awal.Kita banjur mbandhingake frekuensi relatif saben calon CSF kanthi konsentrasi getih (Gambar 3d).Korélasi titer rata-rata saben kandidat CSF karo titer getih ing kabeh wektu sampling nuduhake yen telu saka enem calon kasebut sacara signifikan diperkaya ing CSF getih.Sing nggumunake, klon #2077 nuduhake stabilitas getih sing luwih dhuwur (Tambahan Gambar 7).Kanggo mesthekake yen peptida dhewe bisa aktif ngangkut kargo liyane saka partikel phage menyang kompartemen CSF, kita sintesis papat peptida pimpinan derivatized karo biotin ing N-terminus ngendi peptida nempel ing partikel phage.Peptida biotinilasi (nos. 2002, 2009, 2020 lan 2077) dikonjugasi karo streptavidin (SA) kanggo entuk bentuk multimerik sing rada niru geometri phage.Format iki uga ngidini kita ngukur eksposur SA ing getih lan cairan serebrospinal minangka peptida protein transportasi kargo.Jahwéh, data phage asring bisa maleh nalika peptida sintetik diterbitake ing format SA-conjugated iki (Fig. 3e).Peptida scrambled kurang cahya awal lan reresik CSF luwih cepet kanthi tingkat sing ora bisa dideteksi sajrone 48 jam.Kanggo entuk wawasan babagan jalur pangiriman klon phage peptida kasebut menyang ruang CSF, kita nganalisa lokalisasi peptida phage individu kanthi nggunakake immunohistochemistry (IHC) kanggo langsung ndeteksi partikel phage 1 jam sawise injeksi intravena ing vivo.Utamane, klon #2002, #2077, lan #2009 bisa dideteksi kanthi pewarnaan sing kuat ing kapiler otak, nalika kontrol phage (#1779) lan klon #2020 ora dideteksi (Tambahan Gambar 8).Iki nuduhake manawa peptida kasebut nyumbangake efek ing otak kanthi nyebrang BBB.Analisis sing luwih rinci dibutuhake kanggo nguji hipotesis iki, amarga rute BSCFB uga bisa ditindakake.Nalika mbandhingake urutan asam amino saka klon sing paling sugih (# 2002) karo peptida liyane sing dipilih, dicathet yen sawetara ana sing duwe ekstensi asam amino sing padha, sing bisa uga nuduhake mekanisme transportasi sing padha (Gambar 3f).
Amarga profil plasma sing unik lan paningkatan CSF sing signifikan sajrone wektu, klon tampilan phage #2077 luwih ditliti sajrone wektu 48 jam sing luwih dawa lan bisa ngasilake paningkatan cepet ing CSF sing diamati ing hubungane karo tingkat SA sing tetep (Fig. 4a).Babagan klon phage liyane sing diidentifikasi, #2077 diwarnai banget kanggo kapiler otak lan nuduhake kolokalisasi sing signifikan karo lektin penanda kapiler nalika dideleng kanthi resolusi sing luwih dhuwur lan bisa uga ana pewarnaan ing ruang parenchymal (Gambar 4b).Kanggo neliti manawa efek farmakologis sing dimediasi peptida bisa diduweni ing CNS, kita nindakake eksperimen ing ngendi versi biotinilasi i) peptida transit #2077 lan ii) peptida inhibitor BACE1 dicampur karo SA ing rong rasio sing beda.Kanggo siji kombinasi, kita mung nggunakake inhibitor peptida BACE1 lan liyane nggunakake rasio 1: 3 saka inhibitor peptida BACE1 kanggo peptida #2077.Loro-lorone conto kasebut diwenehake sacara intravena lan tingkat cairan serebrospinal beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) diukur liwat wektu.Abeta40 diukur ing CSF amarga nuduhake inhibisi BACE1 ing parenchyma otak.Kaya sing dikarepake, loro kompleks kasebut nyuda tingkat Abeta40 ing getih (Gambar 4c, d).Nanging, mung conto sing ngemot campuran peptida no.2077 lan inhibitor peptida BACE1 sing dikonjugasi menyang SA nyebabake penurunan Abeta40 sing signifikan ing cairan cerebrospinal (Gambar 4c).Data nuduhake yen peptida no.2077 bisa ngeterake protein 60 kDa SA menyang CNS lan uga nyebabake efek farmakologis karo inhibitor SA-conjugated saka peptida BACE1.
(a) Injeksi klonal (2 × 10 phages / kewan) saka T7 phage sing nuduhake profil farmakokinetik jangka panjang saka peptida CSF #2077 (RLSSVDSSDLSGC) lan fage kontrol sing ora disuntikake (#1779) ing paling ora telung tikus sing diintubasi CM.(b) Gambar mikroskopik confocal saka microvessels kortikal perwakilan ing tikus sing disuntikake phage (2 × 10 10 phages / kewan) nuduhake counterstaining peptida #2077 lan pembuluh (lektin).Klon phage iki diwènèhaké marang 3 tikus lan diijini kanggo sirkulasi 1 jam sadurunge perfusi.Otak dipérang lan diwarnai karo antibodi berlabel FITC poliklonal marang kapsid phage T7.Sepuluh menit sadurunge perfusi lan fiksasi sabanjure, lektin kanthi label DyLight594 diwenehake kanthi intravena.Gambar neon nuduhake pewarnaan lektin (abang) saka sisih luminal microvessels lan fag (ijo) ing lumen kapiler lan jaringan otak perivaskular.Bar skala cocog karo 10 µm.(c, d) Peptida inhibisi BACE1 biotinilasi piyambak utawa ing kombinasi karo peptida transit biotinilasi #2077 digandhengake karo streptavidin diiringi injeksi intravena paling ora telung tikus CM cannulated (10 mg streptavidin / kg).Pengurangan BACE1 peptida-mediated ing Aβ40 diukur dening Aβ1-40 ELISA ing getih (abang) lan cairan cerebrospinal (oranye) ing titik wektu sing dituduhake.Kanggo kajelasan sing luwih apik, garis burik digambar ing grafik kanthi skala 100%.(c) Pengurangan persentase ing Aβ40 ing getih (segitiga abang) lan cairan cerebrospinal (segitiga oranye) ing tikus sing diobati karo streptavidin sing dikonjugasi dadi peptida transit #2077 lan peptida penghambat BACE1 kanthi rasio 3: 1.(d) Pengurangan persentase ing getih Aβ40 (bunderan abang) lan cairan serebrospinal (bunderan oranye) tikus sing diobati karo streptavidin ditambah karo peptida penghambat BACE1 mung.Konsentrasi Aβ ing kontrol yaiku 420 pg / ml (standar deviasi = 101 pg / ml).
Tampilan Phage wis kasil diterapake ing sawetara bidang riset biomedis17.Cara iki wis digunakake kanggo studi keragaman vaskular in vivo18,19 uga studi sing nargetake pembuluh serebral20,21,22,23,24,25,26.Ing panliten iki, kita ngluwihi aplikasi metode pilihan iki ora mung kanggo identifikasi langsung peptida sing nargetake pembuluh serebral, nanging uga kanggo nemokake calon sing nduweni sifat transportasi aktif kanggo nyabrang penghalang getih-otak.Saiki kita njlèntrèhaké pangembangan prosedur pilihan in vivo ing tikus intubasi CM lan nduduhake potensial kanggo ngenali peptida kanthi sifat homing CSF.Nggunakake phage T7 nampilake perpustakaan peptida acak 12-mer, kita bisa nduduhake yen phage T7 cukup cilik (diameteripun kira-kira 60 nm) 10 kanggo diadaptasi menyang alangi getih-otak, saéngga langsung nyabrang alangan getih-otak utawa plexus choroid.Kita mirsani manawa panen CSF saka tikus CM cannulated minangka metode screening fungsional in vivo sing dikontrol kanthi apik, lan fage sing diekstrak ora mung terikat karo pembuluh darah nanging uga berfungsi minangka transporter ngliwati penghalang getih-otak.Salajengipun, kanthi ngumpulake getih kanthi bebarengan lan ngetrapake HTS menyang CSF lan phages sing asale saka getih, kita ngonfirmasi manawa pilihan CSF kita ora kena pengaruh pengayaan getih utawa kabugaran kanggo ekspansi antarane babak pilihan.Nanging, kompartemen getih minangka bagéan saka prosedur seleksi, amarga phages sing bisa tekan kompartemen CSF kudu urip lan sirkulasi ing aliran getih cukup suwe kanggo nambahi awak ing otak.Kanggo ngekstrak informasi urutan sing dipercaya saka data HTS mentah, kita ngetrapake saringan sing diadaptasi kanggo kesalahan urutan khusus platform ing alur kerja analisis.Kanthi nggabungake paramèter kinetik menyang metode screening, kita ngonfirmasi farmakokinetik cepet saka fag T7 jinis liar (t½ ~ 28 min) ing getih24, 27, 28 lan uga nemtokake setengah umur ing cairan cerebrospinal (t½ ~ 26 min) saben menit).Senadyan profil farmakokinetik sing padha ing getih lan CSF, mung 0,001% saka konsentrasi phage ing getih sing bisa dideteksi ing CSF, sing nuduhake mobilitas latar mburi T7 phage liar sing kurang ing sawayah otak getih.Karya iki nyoroti pentinge pilihan babak pisanan nalika nggunakake strategi panning in vivo, utamane kanggo sistem phage sing cepet dibusak saka sirkulasi, amarga sawetara klon bisa tekan kompartemen CNS.Mangkono, ing babak pisanan, pangurangan ing bhinéka perpustakaan gedhe banget, amarga mung jumlah winates saka turunan pungkasanipun diklumpukake ing model CSF ketat banget iki.Strategi panning in vivo iki kalebu sawetara langkah pilihan kayata akumulasi aktif ing kompartemen CSF, slamet klon ing kompartemen getih, lan mbusak klon phage T7 kanthi cepet saka getih sajrone 10 menit pisanan (Gambar 1d lan Gambar Tambahan 4M).).Mangkono, sawise babak pisanan, klon phage beda diidentifikasi ing CSF, sanajan blumbang awal sing padha digunakake kanggo kewan individu.Iki nuduhake manawa pirang-pirang langkah pilihan sing ketat kanggo perpustakaan sumber kanthi jumlah anggota perpustakaan sing akeh nyebabake nyuda macem-macem.Mulane, acara acak bakal dadi bagéan integral saka proses pilihan awal, banget mengaruhi asil.Kemungkinan akeh klon ing perpustakaan asli duwe kecenderungan pengayaan CSF sing padha.Nanging, sanajan ing kahanan eksperimen sing padha, asil pilihan bisa beda-beda amarga jumlah cilik saka saben klon tartamtu ing blumbang wiwitan.
Motif sing diperkaya ing CSF beda karo sing ana ing getih.Sing nggumunake, kita nyathet owah-owahan pisanan menyang peptida sing sugih glisin ing getih kewan individu.(Gambar 1g, Gambar Tambahan 4e, 4f).Phage sing ngandhut peptida glisin bisa uga luwih stabil lan kurang kamungkinan bakal metu saka sirkulasi.Nanging, peptida kaya glisin iki ora dideteksi ing conto cairan cerebrospinal, sing nuduhake yen perpustakaan sing dikurasi ngliwati rong langkah pilihan sing beda: siji ing getih lan liyane diijini nglumpukake ing cairan serebrospinal.Klon sing diperkaya CSF asil saka pilihan babak kaping papat wis diuji sacara ekstensif.Saklawasé kabeh klon sing diuji kanthi individu dikonfirmasi bakal diperkaya ing CSF dibandhingake karo phage kontrol kosong.Siji hit peptida (#2077) diteliti kanthi luwih rinci.Iki nuduhake setengah umur plasma sing luwih dawa dibandhingake karo hit liyane (Gambar 3d lan Gambar Tambahan 7), lan sing menarik, peptida iki ngemot residu sistein ing terminal C.Saiki wis ditampilake manawa tambahan sistein menyang peptida bisa nambah sifat farmakokinetik kanthi ngiket albumin 29.Iki saiki ora dingerteni kanggo peptida #2077 lan mbutuhake sinau luwih lanjut.Sawetara peptida nuduhake ketergantungan valensi ing pengayaan CSF (data ora ditampilake), sing bisa uga ana hubungane karo geometri permukaan sing ditampilake saka kapsid T7.Sistem T7 sing digunakake nuduhake 5-15 salinan saben peptida saben partikel fag.IHC ditindakake ing klon phage timbal calon sing disuntikake intravena menyang korteks serebral tikus (Tambahan Gambar 8).Data kasebut nuduhake paling ora ana telung klon (No. 2002, No. 2009 lan No. 2077) sing interaksi karo BBB.Sampeyan isih kudu ditemtokake manawa interaksi BBB iki nyebabake akumulasi CSF utawa gerakan klon kasebut langsung menyang BCSFB.Sing penting, kita nuduhake yen peptida sing dipilih nahan kapasitas transportasi CSF nalika disintesis lan diikat menyang kargo protein.Ikatan peptida biotinilasi N-terminal menyang SA ateges mbaleni asil sing dipikolehi karo klon phage masing-masing ing getih lan cairan cerebrospinal (Gambar 3e).Pungkasan, kita nuduhake yen peptida timbal #2077 bisa ningkatake aksi otak saka inhibitor peptida biotinilasi BACE1 sing dikonjugasi menyang SA, nyebabake efek farmakodinamik sing diucapake ing CNS kanthi nyuda tingkat Abeta40 ing CSF (Gambar 4).Kita ora bisa ngenali homolog ing basis data kanthi nindakake telusuran homologi urutan peptida kabeh hits.Wigati dicathet menawa ukuran perpustakaan T7 kira-kira 109, nalika ukuran perpustakaan teoritis kanggo 12-mers 4 x 1015. Mulane, kita mung milih bagian sekedhik saka spasi bhinéka saka perpustakaan peptida 12-mer, kang bisa uga ateges sing peptida luwih optimized bisa dikenali dening ngevaluasi spasi urutan dikenali iki.Secara hipotetis, salah sawijining sebab kenapa kita ora nemokake homolog alami saka peptida kasebut bisa uga ora dipilih sajrone evolusi kanggo nyegah entri motif peptida tartamtu menyang otak sing ora bisa dikendhaleni.
Digabungake, asil kita nyedhiyakake dhasar kanggo kerja ing mangsa ngarep kanggo ngenali lan menehi ciri sistem transportasi penghalang serebrovaskular ing vivo kanthi luwih rinci.Persiyapan dhasar saka metode iki adhedhasar strategi pilihan fungsional sing ora mung ngenali klon kanthi sifat ikatan pembuluh darah serebral, nanging uga kalebu langkah kritis sing klon sukses duwe aktivitas intrinsik kanggo nyabrang alangan biologis ing vivo menyang kompartemen CNS.yaiku kanggo njlentrehake mekanisme transportasi peptida kasebut lan preferensi kanggo ngiket menyang microvasculature khusus ing wilayah otak.Iki bisa nyebabake panemuan jalur anyar kanggo transportasi BBB lan reseptor.Kita ngarepake manawa peptida sing diidentifikasi bisa langsung ikatan karo reseptor serebrovaskular utawa ligan sirkulasi sing diangkut liwat BBB utawa BCSFB.Vektor peptida kanthi aktivitas transportasi CSF sing ditemokake ing karya iki bakal diselidiki luwih lanjut.Saiki kita nyelidiki spesifik otak saka peptida kasebut amarga kemampuane nyabrang BBB lan / utawa BCSFB.Peptida anyar iki bakal dadi alat sing migunani banget kanggo panemuan potensial reseptor utawa jalur anyar lan kanggo pangembangan platform anyar sing efisien banget kanggo pangiriman makromolekul, kayata biologi, menyang otak.
Cannulate cisterna gedhe (CM) nggunakake modifikasi saka cara diterangake sadurunge.Tikus Wistar sing dibius (200-350 g) dipasang ing piranti stereotaxic lan sayatan median digawe ing kulit sirah sing dicukur lan disiapake kanthi aseptik kanggo mbukak tengkorak.Pengeboran rong bolongan ing area sash ndhuwur lan kencengake sekrup mbenakake ing bolongan kasebut.Bolongan tambahan dilatih ing crest occipital lateral kanggo panuntun stereotactic cannula stainless steel menyang CM.Pasang semen dental ing sekitar kanula lan aman nganggo sekrup.Sawise photo-curing lan hardening semen, tatu kulit ditutup kanthi jahitan supramid 4/0.Panggonan cannula sing tepat dikonfirmasi kanthi bocor spontan cairan serebrospinal (CSF).Copot tikus saka aparat stereotaxic, tampa perawatan pasca operasi lan manajemen nyeri sing cocog, lan ngidini bisa pulih paling ora seminggu nganti tandha getih katon ing cairan serebrospinal.Tikus Wistar (Crl:WI/Han) dipikolehi saka Kali Charles (Prancis).Kabeh tikus disimpen ing kahanan tartamtu sing bebas patogen.Kabeh eksperimen kewan disetujoni dening Kantor Veteriner Kutha Basel, Swiss, lan ditindakake miturut Lisensi Kewan No. 2474 (Assessment of Active Brain Transport by Measuring Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Alon-alon supaya tikus sadar karo kanula CM ing tangan.Copot Datura saka kanula lan kumpulake 10 µl cairan serebrospinal sing mili spontan.Wiwit patensi kanula pungkasane dikompromi, mung conto cairan serebrospinal sing cetha tanpa bukti kontaminasi getih utawa owah-owahan warna sing kalebu ing panliten iki.Secara paralel, kira-kira 10-20 μl getih dijupuk saka sayatan cilik ing pucuk buntut menyang tabung kanthi heparin (Sigma-Aldrich).CSF lan getih diklumpukake ing macem-macem titik wektu sawise injeksi intravena T7 phage.Kira-kira 5-10 μl cairan dibuwang sadurunge saben sampel CSF diklumpukake, sing cocog karo volume mati kateter.
Pustaka digawe nggunakake vektor T7Select 10-3b kaya sing diterangake ing manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Sedhela, sisipan DNA 12-mer acak disintesis ing format ing ngisor iki:
Kodon NNK digunakake kanggo nyegah kodon dobel stop lan overexpression asam amino ing sisipan.N minangka rasio equimolar sing dicampur kanthi manual saben nukleotida, lan K minangka rasio equimolar sing dicampur kanthi manual saka nukleotida adenine lan sitosin.Wilayah terdampar tunggal diowahi dadi DNA untai ganda kanthi inkubasi luwih lanjut karo dNTP (Novagen) lan enzim Klenow (New England Biolabs) ing buffer Klenow (New England Biolabs) suwene 3 jam ing 37 ° C.Sawise reaksi kasebut, DNA untai ganda ditemokake kanthi presipitasi EtOH.DNA sing diasilake dicerna nganggo enzim pembatasan EcoRI lan HindIII (loro saka Roche).Sisipan sing dibelah lan diresiki (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) banjur diikat ing pigura dadi vektor T7 sing wis dibelah sawise asam amino 348 saka gen kapsid 10B.Reaksi ligasi diinkubasi ing 16 ° C kanggo 18 jam sadurunge kemasan in vitro.Kemasan phage in vitro ditindakake miturut pandhuan sing diwenehake karo kit kloning T7Select 10-3b (Novagen) lan solusi kemasan digedhekake sapisan kanggo lisis nggunakake Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lysates padha centrifuged, titrated lan beku ing -80 ° C. minangka solusi Simpenan gliserol.
Amplifikasi PCR langsung saka wilayah variabel fag sing digedhekake ing duduh kaldu utawa piring nggunakake primer fusi 454 / Roche-amplicon proprietary.Primer fusi maju ngemot urutan sing diapit wilayah variabel (NNK) 12 (khusus cithakan), GS FLX Titanium Adapter A, lan urutan kunci perpustakaan papat basis (TCAG) (Tambahan Gambar 1a):
Primer fusi terbalik uga ngandhut biotin sing ditempelake kanggo nangkep manik-manik lan GS FLX Titanium Adapter B sing dibutuhake kanggo amplifikasi klonal sajrone emulsi PCR:
Amplicons banjur kena 454/Roche pyrosequencing miturut protokol 454 GS-FLX Titanium.Kanggo urutan Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA phage T7 diamplifikasi dening PCR lan diurutake kanthi pasangan primer ing ngisor iki:
Sisipan saka plakat individu kena amplifikasi PCR nggunakake Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (miturut pandhuan pabrikan).Nindakake wiwitan panas (10 menit ing 95 °C) lan 35 siklus boost (50 s ing 95 °C, 1 menit ing 50 °C, lan 1 menit ing 72 °C).
Phage saka perpustakaan, phage liar, phage sing diluwari saka CSF lan getih, utawa klon individu digedhekake ing Escherichia coli BL5615 ing kaldu TB (Sigma Aldrich) utawa ing piring 500 cm2 (Thermo Scientific) sajrone 4 jam ing 37 ° C.Phage diekstrak saka piring kanthi mbilas piring nganggo buffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) utawa kanthi ngumpulake plak kanthi tip pipet steril.Phage diisolasi saka supernatan kultur utawa buffer ekstraksi karo siji babak saka polietilen glikol (PEG 8000) udan (Promega) lan resuspended ing Tris-EDTA buffer.
Fag sing digedhekake ditindakake 2-3 puteran penghapusan endotoksin nggunakake manik penghapus endotoksin (Miltenyi Biotec) sadurunge injeksi intravena (IV) (500 μl / kewan).Ing babak pisanan, 2 × 1012 phages dikenalaké;ing kaloro, 2 × 1010 phages;ing babak pilihan katelu lan papat, 2 × 109 phages saben kewan.Konten phage ing CSF lan conto getih sing diklumpukake ing titik wektu sing dituduhake ditemtokake kanthi ngitung plak miturut pandhuan pabrikan (manual sistem T7Select).Seleksi phage ditindakake kanthi injeksi intravena perpustakaan sing diresiki menyang vena buntut utawa kanthi injeksi maneh phage sing diekstrak saka CSF saka babak pilihan sadurunge, lan panen sabanjure ditindakake ing 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, lan 240 min sampel getih.Gunggunge papat babak panning in vivo ditindakake ing ngendi rong cabang sing dipilih disimpen lan dianalisis kanthi kapisah sajrone telung babak pemilihan pisanan.Kabeh sisipan phage sing diekstrak saka CSF saka rong babak seleksi pisanan kena 454/Roche pyrosequencing, dene kabeh klon sing diekstrak saka CSF saka rong babak pilihan pungkasan diurutake kanthi manual.Kabeh fag getih saka seleksi babak pisanan uga kena 454/Roche pyrosequencing.Kanggo injeksi klon fag, fag sing dipilih digedhekake ing E. coli (BL5615) ing piring 500 cm2 ing 37 ° C suwene 4 jam.Klon sing dipilih lan diurutake kanthi manual disebarake ing medium TB.Sawise ekstraksi phage, pemurnian lan penghapusan endotoksin (kaya sing kasebut ing ndhuwur), 2 × 1010 fag / kewan ing 300 μl disuntikake intravena menyang siji urat buntut.
Preprocessing lan nyaring kualitatif saka data urutan.Data mentah 454 / Roche diowahi saka format peta stream standar binar (sff) menyang format sing bisa diwaca manungsa Pearson (fasta) nggunakake piranti lunak vendor.Pangolahan luwih lanjut saka urutan nukleotida ditindakake kanthi nggunakake program lan skrip C proprietary (paket piranti lunak sing durung dirilis) kaya sing diterangake ing ngisor iki.Analisis data utami kalebu prosedur nyaring multi-tahap sing ketat.Kanggo nyaring diwaca sing ora ngemot urutan DNA insert 12mer bener, diwaca sequentially didadekake siji kanggo miwiti label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), label mandeg (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) lan insert latar mburi (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) nggunakake Needleman-Wunsch global test.alignment ngidini nganti 2 inconsistencies saben alignment31.Mulane, maca tanpa wiwitan lan mungkasi tags lan maca ngemot sisipan latar mburi, IE, alignments sing ngluwihi nomer diijini mismatches, dibusak saka perpustakaan.Kanggo maca sing isih ana, urutan DNA N-mer sing wiwit saka tandha wiwitan lan pungkasan sadurunge tandha mandeg dibusak saka urutan maca asli lan diproses luwih lanjut (sabanjuré diarani "sisipake").Sawise terjemahan saka sisipan, bagean sawise kodon mandeg pisanan ing 5′ mburi primer dibusak saka sisipan.Kajaba iku, nukleotida sing ndadékaké kodon sing ora lengkap ing pungkasan 3′ primer uga dibusak.Kanggo ngilangi sisipan sing mung ngemot urutan latar mburi, sisipan sing diterjemahake diwiwiti kanthi pola asam amino "PAG" uga dibusak.Peptida kanthi dawa pasca-translasi kurang saka 3 asam amino dibusak saka perpustakaan.Pungkasan, mbusak redundansi ing blumbang insert lan nemtokake frekuensi saben insert unik.Asil analisis iki kalebu dhaptar urutan nukleotida (sisipan) lan frekuensi (maca) (Gambar Tambahan 1c lan 2).
Klompok N-mer DNA sisipan dening podo urutan: Kanggo ngilangke 454 / kesalahan urutan tartamtu Roche (kayata masalah karo ekstensi homopolymer urutan) lan mbusak redundansi kurang penting, sadurunge disaring N-mer DNA sisipan urutan (sisipan) diurutake dening podho.sisipan (nganti 2 basis sing ora cocog diijini) nggunakake algoritma iteratif sing ditetepake kaya ing ngisor iki: sisipan diurutake dhisik miturut frekuensi (paling dhuwur nganti paling murah), lan yen padha, miturut urutan sekunder kanthi dawa (paling dawa nganti paling cendhak) ).Mangkono, sisipan sing paling kerep lan paling dawa nemtokake "klompok" pisanan.Frekuensi klompok disetel menyang frekuensi tombol.Banjur, saben sisipan sing isih ana ing dhaptar sing diurutake dicoba ditambahake menyang grup kanthi alignment Needleman-Wunsch.Yen jumlah sing ora cocog, sisipan, utawa pambusakan ing alignment ora ngluwihi batesan 2, sisipan ditambahake menyang grup kasebut, lan frekuensi grup sakabèhé ditambah sepira kerepe sisipan ditambahake.Sisipan sing ditambahake menyang grup ditandhani minangka digunakake lan ora kalebu ing proses luwih lanjut.Yen urutan sisipan ora bisa ditambahake menyang grup sing wis ana, urutan sisipan digunakake kanggo nggawe grup anyar kanthi frekuensi sisipan sing cocog lan ditandhani minangka digunakake.Pengulangan rampung nalika saben urutan sisipan wis digunakake kanggo mbentuk grup anyar utawa bisa dilebokake ing grup sing wis ana.Sawise kabeh, sisipan sing dikelompokake sing kasusun saka nukleotida pungkasane diterjemahake menyang urutan peptida (perpustakaan peptida).Asil analisis iki minangka set sisipan lan frekuensi sing cocog sing nggawe jumlah maca sing berturut-turut (Tambahan Gambar 2).
Generasi Motif: Adhedhasar dhaptar peptida unik, perpustakaan digawe ngemot kabeh kemungkinan pola asam amino (aa) kaya ing ngisor iki.Saben pola dawa 3 sing bisa diekstrak saka peptida lan pola kuwalik ditambahake bebarengan karo perpustakaan motif umum sing ngemot kabeh pola (tripeptida).Pustaka kanthi motif sing bola-bali banget diurutake lan redundansi dibusak.Banjur, kanggo saben tripeptida ing perpustakaan motif, kita mriksa ngarsane ing perpustakaan nggunakake alat komputasi.Ing kasus iki, frekuensi peptida sing ngemot tripeptida motif sing ditemokake ditambahake lan ditugasake ing motif ing perpustakaan motif ("jumlah motif").Asil saka generasi motif yaiku susunan rong dimensi sing ngemot kabeh kedadeyan tripeptida (motif) lan nilai masing-masing, yaiku jumlah urutan maca sing ngasilake motif sing cocog nalika wacan kasebut disaring, dikelompokake, lan diterjemahake.Metrik kaya sing diterangake kanthi rinci ing ndhuwur.
Normalisasi jumlah motif lan scatterplots sing cocog: Jumlah motif kanggo saben sampel dinormalisasi nggunakake
ing ngendi ni minangka jumlah wacan sing ngemot topik i.Mangkono, vi nggantosi frekuensi persentasi saka maca (utawa peptida) ngemot motif i ing sampel.Nilai-P kanggo jumlah motif sing ora dinormalisasi diwilang nggunakake tes pas Fisher.Babagan correlograms saka jumlah motif, korélasi Spearman diwilang nggunakake nomer normalisasi motif karo R.
Kanggo nggambarake isi asam amino ing saben posisi ing perpustakaan peptida, logogram web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) digawe.Kaping pisanan, isi asam amino ing saben posisi peptida 12-mer disimpen ing matriks 20 × 12.Banjur, set 1000 peptida ngemot isi asam amino relatif padha ing saben posisi kui ing format fasta-urutan lan kasedhiya minangka input kanggo web-logo 3, kang ngasilake grafis saka isi asam amino relatif ing saben posisi.kanggo perpustakaan peptida diwenehi.Kanggo nggambarake dataset multidimensi, peta panas digawe nggunakake alat sing dikembangake sacara internal ing R (biosHeatmap, paket R sing durung dirilis).Dendrogram sing ditampilake ing peta panas diitung nggunakake metode clustering hirarkis Ward kanthi metrik jarak Euclidean.Kanggo analisis statistik data skor motif, nilai P kanggo skor unnormalized diwilang nggunakake uji pas Fisher.Nilai-P kanggo dataset liyane diwilang ing R nggunakake tes t Student utawa ANOVA.
Klon phage lan fag sing dipilih tanpa sisipan disuntikake intravena liwat vena buntut (2 × 1010 phages / kewan ing 300 μl PBS).Sepuluh menit sadurunge perfusi lan fiksasi sabanjure, kewan sing padha disuntikake sacara intravena kanthi 100 μl lektin label DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 menit sawise injeksi phage, tikus dibuwang liwat jantung kanthi 50 ml PBS diikuti 50 ml 4% PFA / PBS.Sampel otak ditambahake sewengi ing 4% PFA / PBS lan direndhem ing 30% sukrosa sewengi ing 4 ° C.Sampel flash beku ing campuran OCT.Analisis imunohistokimia saka sampel beku ditindakake ing suhu kamar ing cryosections 30 µm sing diblokir karo 1% BSA lan diinkubasi karo antibodi berlabel FITC poliklonal marang T7 phage (Novus NB 600-376A) ing 4 °C.Inkubasi sewengi.Pungkasan, bagean kasebut dikumbah kaping 3 nganggo PBS lan diteliti nganggo mikroskop laser confocal (Leica TCS SP5).
Kabeh peptida kanthi kemurnian minimal 98% disintesis dening GenScript USA, biotinilasi lan lyophilized.Biotin kaiket liwat spacer triple glycine tambahan ing N-terminus.Priksa kabeh peptida nggunakake spektrometri massa.
Streptavidin (Sigma S0677) dicampur karo keluwihan equimolar 5 kali lipat saka peptida biotinilasi, peptida penghambat BACE1 sing dibiotinilasi, utawa kombinasi (rasio 3: 1) saka peptida penghambat BACE1 sing dibiotinilasi lan peptida penghambat BACE1 ing 5-10% DMSO / diinkubasi ing PBSO.1 jam ing suhu kamar sadurunge injeksi.Peptida konjugasi Streptavidin disuntikake sacara intravena kanthi dosis 10 mg / kg menyang salah sawijining urat buntut tikus kanthi rongga serebral.
Konsentrasi kompleks streptavidin-peptida ditaksir dening ELISA.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) dilapisi sewengi ing 4 ° C kanthi antibodi anti-streptavidin tikus 1,5 μg / ml (Thermo, MA1-20011).Sawise pamblokiran (pemblokiran buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) ing suhu kamar kanggo 2 jam, wisuh piring karo 0,05% Tween-20 / PBS (wash buffer) kanggo 3 Detik, CSF lan plasma buffer00 sing beda-beda ditambahake kanggo 3 Detik, CSF lan plasma buffering sampel. CSF 1:115).Piring kasebut banjur diinkubasi sewengi ing 4 ° C kanthi antibodi deteksi (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Sawise telung langkah ngumbah, streptavidin dideteksi kanthi inkubasi ing larutan substrat TMB (Roche) nganti 20 menit.Sawise mungkasi pangembangan warna kanthi 1M H2SO4, ukur absorbansi ing 450 nm.
Fungsi kompleks inhibitor streptavidin-peptide-BACE1 ditaksir dening Aβ(1-40) ELISA miturut protokol pabrikan (Wako, 294-64701).Sedhela, conto CSF ​​diencerake ing pengencer standar (1:23) lan diinkubasi sewengi ing suhu 4 ° C ing piring sumur 96 sing dilapisi antibodi penangkap BNT77.Sawise limang langkah ngumbah, antibodi BA27 sing dikonjugasi HRP ditambahake lan diinkubasi sajrone 2 jam ing suhu 4 ° C, diterusake kanthi limang langkah ngumbah.Aβ(1-40) dideteksi kanthi inkubasi ing larutan TMB suwene 30 menit ing suhu kamar.Sawise pangembangan werna wis mandheg karo solusi stop, ngukur absorbansi ing 450 nm.Sampel plasma ngalami ekstraksi fase padat sadurunge Aβ(1-40) ELISA.Plasma ditambahake menyang 0,2% DEA (Sigma) ing piring 96 sumur lan diinkubasi ing suhu kamar suwene 30 menit.Sawise ngumbah piring SPE kanthi berturut-turut (Oasis, 186000679) nganggo banyu lan metanol 100%, conto plasma ditambahake ing piring SPE lan kabeh cairan dibuwang.Sampel dikumbah (pisanan nganggo 5% metanol banjur 30% metanol) lan diencerake nganggo 2% NH4OH/90% metanol.Sawise pangatusan eluate ing 55 ° C kanggo 99 menit ing arus N2 konstan, sampel dikurangi ing diluent standar lan Aβ (1-40) diukur kaya sing kasebut ing ndhuwur.
Piye carane ngutip artikel iki: Urich, E. et al.Pangiriman kargo menyang otak nggunakake peptida transit sing diidentifikasi ing vivo.ngelmu.5, 14104;doi: 10.1038 / srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB lan Moos T. Pangiriman obatan macromolecular menyang otak nggunakake therapy diangkah.Jurnal Neurokimia 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., lan Martinez-Martinez, P. Pangiriman obat peptida lan protein ngliwati alangi getih-otak.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Barrier getih-otak: bottleneck ing pangembangan obat otak.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602 / neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, lan Byrd, A. Prospek kanggo pangiriman obat sing luwih apik lan nargetake menyang otak liwat jalur choroid plexus-CSF.Riset Farmasi 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasi biofarmasi karo jaran Trojan molekuler kanggo pangiriman otak.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021 / bc800148t (2008).
Pardridge, transportasi peptida sing dimediasi reseptor WM ngliwati alangan getih-otak.Endokr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Nambah penetrasi otak lan khasiat antibodi terapeutik nggunakake antar-jemput molekul monovalen.Neuron 81, 49-60, 10.1016 / j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transportasi reseptor transferin (TfR) nemtokake serapan otak saka varian afinitas antibodi TfR.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084 / jem.20131660 (2014).