Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com. Sampeyan nggunakake versi browser kanthi dhukungan CSS winates. Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.
Nampilake carousel telung slide bebarengan. Gunakake tombol Sadurungé lan Sabanjure kanggo pindhah liwat telung minger bebarengan, utawa nggunakake tombol panggeser ing mburi kanggo pindhah liwat telung minger bebarengan.
Organel neural mandhiri minangka platform in vitro sing janjeni kanggo model pangembangan lan penyakit manungsa. Nanging, organoid ora nduweni konektivitas sing ana ing vivo, sing mbatesi mateng lan nyegah integrasi karo sirkuit liyane sing ngontrol prilaku. Ing kene kita nuduhake manawa organoid kortikal sing asale saka sel stem manungsa sing ditransplantasikan menyang korteks somatosensori tikus mudo neonatal ngembangake jinis sel diwasa sing nggabungake menyang sirkuit sensori lan motivasi. MRI ngungkapake pertumbuhan organoid pasca-transplantasi ing sawetara garis sel induk lan kewan, nalika analisis siji-inti ngungkapake kemajuan kortiogenesis lan munculé program transkripsi sing gumantung saka aktivitas. Pancen, neuron kortikal sing ditransplantasi nuduhake sifat morfologis, sinaptik, lan membran internal sing luwih kompleks tinimbang mitra in vitro, ngidini deteksi cacat neuron ing pasien karo sindrom Timothy. Pelacakan anatomi lan fungsional nuduhake manawa organel sing ditransplantasi nampa input thalamocortical lan corticocortical, lan rekaman vivo aktivitas saraf nuduhake yen input kasebut bisa ngasilake respon sensori ing sel manungsa. Pungkasan, organoid kortikal ngluwihi akson ing saindhenging otak tikus, lan aktivasi optogenetik nyebabake prilaku golek ganjaran. Mangkono, neuron korteks manungsa sing ditransplantasi dadi diwasa lan melu ing sirkuit host sing ngontrol prilaku. Kita ngarepake pendekatan iki kanggo nggampangake deteksi fenotipe tingkat untaian ing sel sing diturunake pasien sing ora bisa dideteksi kanthi cara liya.
Otak manungsa sing berkembang minangka proses ngatur diri sing luar biasa ing ngendi sel berkembang, mbedakake, migrasi, lan nyambung kanggo mbentuk sirkuit neuron fungsional sing luwih disempurnakake liwat pengalaman sensori. Masalah utama kanggo mangerteni perkembangan otak manungsa, utamane ing konteks penyakit, yaiku kekurangan akses menyang jaringan otak. Organel sing ngatur dhewe, kalebu organoid korteks manungsa (hCO; uga dikenal minangka bola korteks manungsa), bisa ngasilake 2,3,4,5,6. Nanging, sawetara watesan mbatesi aplikasi sing luwih akeh kanggo mangerteni pangembangan lan fungsi sirkuit saraf. Utamane, ora jelas manawa mateng hCO diwatesi amarga ora ana input mikroenvironmental lan sensori tartamtu sing ana ing vivo. Kajaba iku, amarga hCO ora digabungake menyang sirkuit sing bisa ngasilake asil prilaku, utilitas kanggo model kelainan neuropsikiatri genetis lan prilaku sing kompleks saiki diwatesi.
Transplantasi hCO menyang otak sing isih urip bisa ngatasi watesan kasebut. Panaliten sadurunge nuduhake yen neuron manungsa sing ditransplantasikan menyang korteks tikus bisa urip, proyek, lan komunikasi karo sel tikus7,8,9,10,11,12. Nanging, eksperimen iki biasane ditindakake ing kewan diwasa, sing bisa mbatesi integrasi sinaptik lan akson. Ing kene, kita njlèntrèhaké paradigma transplantasi ing ngendi kita transplantasi 3D hCO sing asalé saka sel hiPS menyang korteks somatosensori primer (S1) tikus immunodeficient ing tahap awal pangembangan plastik. Neuron hCO (t-hCO) sing ditransplantasi ngalami pematangan sing akeh, nampa input thalamocortical lan cortical-cortical sing ngasilake respon sensori, lan ngluwihi proyeksi axonal menyang otak tikus kanggo ngarahake prilaku nggoleki ganjaran. Maturasi lengkap t-hCO wis ngungkapake cacat neuronal ing pasien karo sindrom Timothy (TS), kelainan genetik sing abot sing disebabake dening mutasi ing saluran kalsium CaV1.2 sing sensitif voltase (dienkode dening CACNA1C).
Kanggo sinau neuron korteks manungsa ing sirkuit ing vivo, kita stereotactically transplanted utuh 3D hCO menyang S1 saka awal postnatal tikus athymic (dina 3-7 postnatally) (Fig. 1a lan data ditambahi Fig. 1a-c). Ing titik iki, proyeksi axonal thalamocortical lan corticocortical durung rampung innervation S1 (ref. 13). Mangkono, pendekatan iki dirancang kanggo nggedhekake t-hCO integrasi nalika minimalake impact ing sirkuit endogen. Kanggo nggambarake lokasi t-hCO ing kewan urip, kita nindakake rekonstruksi otak MRI T2-bobot saka tikus 2-3 sasi sawise transplantasi (Gambar 1b lan data lengkap, Gambar 1d). t-hCO gampang diamati lan pangukuran volume t-hCO padha karo sing diitung saka irisan tetep (Data Extended Fig. 1d, e; P> 0.05). t-hCO gampang diamati lan pangukuran volume t-hCO padha karo sing diitung saka irisan tetep (Data Extended Fig. 1d, e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (раснид срезов) 1d, e; P> 0,05). t-hCO gampang diamati, lan pangukuran t-hCO volumetrik padha karo sing diitung kanggo bagean tetep (data sing ditambahi, Fig. 1d, e; P> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d,e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (раснид срезов) 1d, e; P> 0,05). t-hCO gampang diamati, lan pangukuran t-hCO volumetrik padha karo sing diitung kanggo bagean tetep (data sing ditambahi, Fig. 1d, e; P> 0.05).Kita nemtokake t-hCO ing 81% kewan sing ditransplantasi kira-kira 2 wulan sawise transplantasi (n = 72 kewan; hCO saka 10 garis sel hiPS; garis sel hiPS ing Tabel Tambahan 1). Saka jumlah kasebut, 87% ana ing korteks serebral (Gambar 1c). Kanthi nindakake pemindaian MRI serial ing pirang-pirang titik wektu ing tikus sing padha ditransplantasikan, kita nemokake paningkatan volume t-hCO 9 kaping sajrone 3 sasi (Fig. 1d lan data sing ditambahi, Fig. 1f). Kéwan sing ditransplantasi nduweni tingkat kaslametan sing dhuwur (74%) ing 12 sasi sawise transplantasi (data sing ditambahi, Gambar 1g lan Tabel Tambahan 2), lan ora ana gangguan motor utawa memori sing jelas, gliosis, utawa electroencephalogram (EEG) sing ditemokake. Data Gambar 1g lan tabel tambahan 2). 1h–m lan 3e).
a, Skema rancangan eksperimental. hCO sing asalé saka sel hiPS ditransplantasikan menyang S1 tikus mudo bayi ing dina 30-60 diferensiasi. b, T2-bobot gambar koronal lan horisontal MRI nuduhake t-hCO ing S1 2 sasi sawise transplantasi. Skala bar, 2 mm. c, Kuantifikasi tingkat sukses engraftment ditampilake kanggo saben baris sel hiPS (n = 108, nomer ing bar nuduhake jumlah t-hCO saben baris sel hIPS) lan lokasi kortikal utawa subkortikal (n = 88). d, Gambar MRI saka arteri koroner (kiwa; bar skala, 3 mm) lan rekonstruksi volumetrik 3D sing cocog (bar skala, 3 mm) nuduhake peningkatan t-hCO liwat 3 sasi. e, Tinjauan pola t-hCO ing korteks serebral tikus. Skala bar, 1 mm. f, Gambar immunocytochemical wakil saka t-hCO ditampilake saka ndhuwur kiwa menyang tengen (sajrone diferensiasi): PPP1R17 (4 sasi), NeuN (8 sasi), SOX9 lan GFAP (8 sasi), PDGFRα; (8 sasi), MAP2 (8 sasi) lan IBA1 (8 sasi). Skala bar, 20 µm. Co-ekspresi HNA nuduhake sel asal manungsa. g, snRNA-seq: Unified manifold and projection (UMAP) dimensionality imaging reduction of all high quality t-hCO nuclei after Seurat integration (n=3 t-hCO samples, n=2 hiPS cell lines). Astrosit, sel saka garis astrocyte; cycl prog, progenitor sirkulasi; GluN DL, neuron glutamatergik jero; GluN DL/SP, neuron glutamatergik jero lan sublamellar; GluN UL, neuron glutamatergik lapisan ndhuwur; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, sel progenitor oligodendrocyte; RELN, reelin neuron. h, Gene Ontology (GO) analisis pengayaan istilah gen sacara signifikan upregulated (diatur P <0.05, owah-owahan lipatan> 2, ditulis ing paling 10% saka inti) ing t-hCO neuron glutamatergic dibandhingake karo hCO neuron glutamatergic. h, Gene Ontology (GO) analisis pengayaan istilah gen sacara signifikan upregulated (diatur P <0.05, owah-owahan lipatan> 2, ditulis ing paling 10% saka inti) ing t-hCO neuron glutamatergic dibandhingake karo hCO neuron glutamatergic. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратмоснеть ия экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическиром . h, Analisis pengayaan istilah Gene Ontology (GO) kanggo gen kanthi aktivasi sing signifikan (dilarasake P <0.05, owah-owahan lipatan> 2, ekspresi paling sethithik 10% inti) ing neuron glutamatergic t-hCO dibandhingake karo neuron glutamatergic hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P ， 嘾整后 P < 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 后 后变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 (GO)术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне в 1% глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ тебяониа h, gen padha upregulated Ngartekno (disetel P <0.05, owah-owahan lipat> 2, ditulis ing paling 10% saka inti) ing t-hCO neuron glutamatergic dibandhingake hCO neuron glutamatergic analisis Ontologis (GO) saka istilah pengayaan.Garis burik nuduhake nilai aq 0,05. i, UMAP imaging saka jinis sel GluN ing t-hCO nggunakake transfer label saka referensi 22 snRNA-seq dataset motor korteks diwasa. CT - sel kortikotalamus, ET - sel ekstraserebral, IT - sel telencephalic internal, NP - cedhak proyeksi.
Kita banjur ngevaluasi cytoarchitecture lan komposisi seluler sakabèhé t-hCO. Pewarnaan antibodi sel endothelial tikus nuduhake vaskularisasi karo t-hCO, nalika pewarnaan IBA1 nuduhake anané mikroglia tikus ing saindhenging graft (Gambar 1f lan data sing ditambahi, Gambar 3c, d). Immunostaining ngungkapake sel positif antigen nuklir manungsa (HNA) sing nuduhake PPP1R17 (progenitor kortikal), NeuN (neuron), SOX9 lan GFAP (sel turunan glial) utawa PDGFRα (progenitor oligodendrocyte) (Gambar 1f). Kanggo nyinaoni komposisi seluler t-hCO ing resolusi sel tunggal, kita nindakake urutan RNA inti tunggal (snRNA-seq) sawise kira-kira 8 sasi diferensiasi. Penyaringan massal lan mbusak inti tikus ngasilake 21.500 peta mononuklear manungsa sing berkualitas tinggi (Gambar 1g lan data sing ditambahi, Gambar 4a, b). Pola ekspresi penanda tipe sel khas ngidhentifikasi kluster kelas sel kortikal utama, kalebu neuron glutamatergik jero lan dangkal, progenitor sirkulasi, oligodendrocytes, lan garis keturunan astrocyte (Gambar 1g, data sing ditambahi, Gambar 4c, lan Tabel Tambahan 3). Immunostaining kanggo SATB2 lan CTIP2 nuduhake yen sanajan ana subtipe kortikal, t-hCO ora nuduhake stratifikasi anatomi sing jelas (data sing ditambahi, Gambar 3a). snRNA-seq hCO sing cocog karo tahapan ngasilake kelas sel sing padha, kanthi sawetara pangecualian, kalebu ora ana oligodendrocytes lan anané neuron GABAergic, sing bisa nggambarake kahanan in vitro sing dilapurake sadurunge kanggo sel progenitor lateral15 (data sing ditambahi, Fig. 4f - i lan Tabel Tambahan 4). Analisis ekspresi gen diferensial ngandhakake bedane signifikan ing neuron glutamatergic antarane t-hCO lan hCO (Tabel Tambahan 5), kalebu aktivasi set gen sing ana gandhengane karo pematangan neuron kayata sinyal sinaptik, lokalisasi dendritik, lan aktivitas saluran voltase-gated (Gambar 1h lan Tabel Tambahan 5). tabel 6). Dadi, neuron t-hCO glutamatergik kortikal nampilake pematangan transkripsi sing cepet.
Kanggo njlentrehake manawa owah-owahan transkripsi ing t-hCO ana hubungane karo beda morfologis antarane hCO in vitro lan t-hCO ing vivo, kita mbangun maneh hCO lan hCO sing diisi biocytin sing cocog karo tahapan ing bagean akut sawise diferensiasi 7-8 sasi. neuron hCO (Gambar 2a). neuron t-hCO padha Ngartekno luwih gedhe, wis 1,5 kaping diameteripun soma, kaping pindho minangka akeh dendrites, lan sakabèhé nambah enem-fold saka total dawa dendritik dibandhingake in vitro hCO (Fig. 2b). Kajaba iku, kita mirsani kapadhetan spines dendritik sing luwih dhuwur ing neuron t-hCO tinimbang ing neuron hCO (Gambar 2c). Iki nuduhake yen neuron t-hCO ngalami elongasi lan percabangan dendritik sing ekstensif, sing, kanthi kombinasi proliferasi sel sing terus-terusan, bisa nyumbang kanggo pertumbuhan intensif t-hCO sawise transplantasi (Gambar 1d lan Data Lengkap Gambar 1f). Iki nyebabake kita nyelidiki sifat elektrofisiologis. Kapasitansi membran wolung kali luwih dhuwur (data sing ditambahi, Gambar 8d), potensial membran negara istirahat luwih hiperpolarisasi (kira-kira 20 mV), lan injeksi saiki nyebabake tingkat eksitasi maksimum sing luwih dhuwur ing neuron t-hCO tinimbang ing neuron hCO. in vitro (Fig. 2d), e), sing konsisten karo fitur morfologi t-hCO sing luwih gedhe lan luwih kompleks. Kajaba iku, frekuensi acara saiki postsynaptic excitatory spontan (EPSC) sacara signifikan luwih dhuwur ing neuron t-hCO (Gambar 2f), nuduhake yen tambah kepadatan spines dendritik sing diamati ing neuron t-hCO digandhengake karo excitability fungsional. sinaps seksual. Kita ngonfirmasi karakter neuron hCO sing durung diwasa ing vitro kanthi ngrekam neuron glutamatergic label (data sing ditambahi, Fig. 6a-c).
a, rekonstruksi 3D neuron hCO lan t-hCO sing diisi biocytin sawise diferensiasi 8 wulan. b, Kuantifikasi fitur morfologis (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 lan *** P <0.0001). b, Kuantifikasi fitur morfologis (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 lan *** P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01 P = 0,01). b, kuantifikasi fitur morfologis (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, lan *** P <0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和 。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和 。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01 P = 0,01). b, kuantifikasi fitur morfologis (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, lan *** P <0.0001).c, rekonstruksi 3D saka cabang dendritik hCO lan t-hCO sawise diferensiasi 8 sasi. Asterisk abang nuduhake spines dendritik putative. Kuantifikasi kepadatan tulang belakang dendritik (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; ** P = 0.0092). d, Kuantifikasi potensial membran istirahat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). d, Kuantifikasi potensial membran istirahat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kuantifikasi potensial membran istirahat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kuantifikasi potensial membran istirahat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). e, Penembakan potensial aksi berulang ing hCO lan t-hCO sing diakibatake kanthi nambah injeksi saiki, lan kuantifikasi tingkat tembak maksimal (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e, Penembakan potensial aksi berulang ing hCO lan t-hCO sing diakibatake kanthi nambah injeksi saiki, lan kuantifikasi tingkat tembak maksimal (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия ing ​​hCO lan t-hCO, вызванное увеличением тока, lan количественная оценка мальсими возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, potensial aksi re-firing ing hCO lan t-hCO sing disebabake dening kenaikan saiki lan kuantifikasi tingkat tembak maksimum (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量匍率的量化神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （n （2（n ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественнамламол скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, tembak bola-bali saka hCO lan t-hCO potensial aksi sing disebabake dening tambah pasokan saiki lan kuantifikasi tingkat tembak maksimum (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). f, EPSCs spontan (sEPSCs) ing neuron hCO lan t-hCO ing 8 sasi diferensiasi, lan kuantifikasi frekuensi acara sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 t-hCO neuron; *** P <0.0001). f, EPSCs spontan (sEPSCs) ing neuron hCO lan t-hCO ing 8 sasi diferensiasi, lan kuantifikasi frekuensi acara sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 neuron t-hCO; *** P <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) ing нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синтич = 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSCs spontan (sEPSCs) ing neuron hCO lan t-hCO ing 8 sasi diferensiasi lan kuantifikasi tingkat acara sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 neuron t-hCO; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n CO2（n 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼5（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) ing нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синтич = 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCs spontan (sEPSCs) ing neuron hCO lan t-hCO ing 8 sasi diferensiasi lan kuantifikasi tingkat acara sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 t-hCO neuron; *** P <0.0001).Kanggo bf, hCO lan t-hCO ing baris 1208-2 dijupuk saka kumpulan diferensiasi padha maintained ing podo karo. g, Analisis pengayaan set gen (tes pas Fisher siji-sisi) saka gen sing diatur kanthi signifikan (dilarasake P <0.05, owah-owahan lipatan> 2, sing ditulis ing paling ora 10% inti) ing neuron glutamatergik t-hCO dibandhingake karo hCO glutamatergik karo set gen saka neuron-respon aktif awal (ERG) sing diidentifikasi saka neuron respon awal (ERG) sing diidentifikasi kanthi respon awal (ERG). tikus sinau16 lan LRG khusus manungsa saka neuron in vitro17. g, Analisis pengayaan set gen (tes pas Fisher siji-sisi) saka gen sing diatur kanthi signifikan (dilarasake P <0.05, owah-owahan lipatan> 2, sing ditulis ing paling ora 10% inti) ing neuron glutamatergik t-hCO dibandhingake karo hCO glutamatergik karo set gen saka neuron-respon aktif awal (ERG) sing diidentifikasi saka neuron respon awal (ERG) sing diidentifikasi kanthi respon awal (ERG). tikus sinau16 lan LRG khusus manungsa saka neuron in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скор0рыть, ректироть) изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению стергимита стермич hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в иванных в имисла и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, analisis pengayaan set gen (tes pas Fisher siji-buntut) saka gen kanthi aktivasi sing signifikan (disetel P <0.05, owah-owahan lipatan> 2, ekspresi paling ora 10% inti) ing neuron glutamatergic t-hCO dibandhingake karo neuron glutamatergic hCO set saka aktivitas awal (ERG) lan pungkasan (LRG) sing diidentifikasi ing aktivitas manungsa (LRG) lan pungkasan (LRG). LRG saka neuron in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 元 上调 0. ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 的 基因 璌 16神经元 17 中 中 17 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишетра) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и in vivo16 и нейиефсч для человека. g, neuron glutamatergik t-hCO diunggahake sacara signifikan dibandhingake karo neuron glutamatergic hCO (dilarasake P<0.05, owah-owahan lipatan> 2, paling ora 10% Tanggapan awal (ERG) lan analisis pengayaan gen respon pungkasan (tes pas Fisher siji-buntut) gen gumantung aktivitas respon (LRGs) sing diidentifikasi ing neuron spesifik LRG in vivo16 manungsa.Garis burik nuduhake nilai P sing dikoreksi Bonferroni 0,05. h, ekspresi gen GluN (paket pseudo lan skala saben gen) diregulasi sacara signifikan ing replika snRNA-seq gen LRG ing neuron glutamatergic t-hCO. i, immunostaining nuduhake ekspresi SCG2 ing t-hCO (ndhuwur) lan hCO (ngisor) neuron. Panah putih tumuju menyang sel SCG2+. Skala bar, 25 µm. Data dipunandharaken kanthi rata-rata ± standar deviasi.
Adhedhasar aktivitas tambah t-hCO sing diamati ing irisan ex vivo, snRNA-seq ngandhakake upregulasi transkrip gen sing gumantung karo aktivitas ing t-hCO dibandhingake karo hCO in vitro. Neuron t-hCO glutamatergic nyatakake tingkat gen sing luwih dhuwur sing ngatur aktivitas respon pungkasan (Fig. 2g, h), sing ditemokake ing studi sadurunge ing mouse lan neuron manungsa16,17. Contone, BDNF18, SCG2, lan OSTN, gen sing ngatur aktivitas spesifik primata, nuduhake ekspresi tambah ing neuron t-hCO dibandhingake karo neuron hCO (Gambar 2g-i). Mangkono, neuron t-hCO nuduhake karakteristik mateng sing luwih apik dibandhingake karo neuron hCO kanthi analisis transkripsi, morfologis, lan fungsional.
Kanggo luwih ngevaluasi asosiasi mateng t-hCO karo perkembangan otak manungsa, kita nindakake perbandingan transkriptomik saka jinis sel kortikal janin lan diwasa19,20 lan adult21,22 uga data ekstensif babagan ekspresi gen kortikal23 sajrone pangembangan (data sing ditambahi, Fig. 5). ). kanthi karya sadurunge 24, status maturasi transkriptom hCO lan t-hCO global ing 7-8 sasi diferensiasi sacara wiyar konsisten karo wektu pangembangan vivo lan paling padha karo urip janin pungkasan (Data Extended Fig. 5a). Utamane, kita mirsani kadewasan transkriptom sing tambah ing t-hCO dibandhingake karo hCO sing cocog karo umur, uga aktivasi transkriptom sing ana gandhengane karo sinaptogenesis, astroogenesis, lan myelination (data sing ditambahi, Gambar 5b-d). Ing tingkat seluler, kita nemokake bukti subtipe korteks sing luwih tipis ing t-hCO, kanthi klompok neuron glutamatergik tumpang tindih karo subtipe neuron L2 / 3, L5, lan L6 diwasa (Gambar 1i). Ing kontras, tumpang tindih kluster antarane neuron t-hCO glutamatergic lan neuron kortikal janin luwih winates ing tengah meteng (data sing ditambahi, Gambar 5e-j). Kanggo nemtokake manawa neuron t-hCO fungsine padha karo neuron neocortical postnatal manungsa, kita nindakake rekaman elektrofisiologis lan rekonstruksi anatomi neuron piramida L2 / 3 manungsa ing bagean sing cetha saka korteks postnatal manungsa (data sing ditambahi, Fig. 7a). Sifat elektrofisiologis saka neuron piramida L2 / 3 padha karo neuron piramida t-hCO (data sing ditambahi, Gambar 7e). Secara morfologis, neuron L2 / 3 saka sampel manungsa postnatal luwih mirip karo t-hCO tinimbang hCO, sanajan sel L2 / 3 luwih dawa, ngemot luwih akeh cabang sakabèhé, lan nduweni kepadatan tulang belakang sing luwih dhuwur (Gambar 3g lan data sing ditambahi, Gambar 7b-). G).
a, transplantasi hCO sing diprodhuksi dening kontrol lan garis sel TS hiPS menyang tikus neonatal. b, rekonstruksi 3D neuron t-hCO sing diisi biocytin sawise diferensiasi 8 wulan. c, kuantifikasi dawa dendritik rata-rata (n = 19 neuron kontrol, n = 21 TS neuron; ** P = 0.0041). d, cabang dendritik sing direkonstruksi 3D saka kontrol lan TS t-hCO ing 8 sasi diferensiasi, lan kuantifikasi kepadatan tulang belakang dendritik (n = 16 neuron kontrol, n = 21 TS neuron, *** P <0.0001). d, cabang dendritik sing direkonstruksi 3D saka kontrol lan TS t-hCO ing 8 sasi diferensiasi, lan kuantifikasi kepadatan tulang belakang dendritik (n = 16 neuron kontrol, n = 21 TS neuron, *** P <0.0001). d, 3D-rekonservasi дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественнка столоння дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0.0001). d, Rekonstruksi 3D cabang dendritik saka kontrol lan t-hCO TS ing 8 sasi diferensiasi lan kuantifikasi kepadatan tulang belakang dendritik (n = 16 neuron kontrol, n = 21 TS neuron, *** P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个女21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 ／化 6元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-sistem kontrol 3D ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная отнхисти шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, rekonstruksi 3D cabang dendritik kontrol lan TS t-hCO ing 8 sasi diferensiasi lan kuantifikasi kepadatan tulang belakang dendritik (n = 16 neuron kontrol, n = 21 TS neuron, *** P <0.0001).Asterisk abang nuduhake spines dendritik putative. e, EPSCs spontan ing kontrol lan TS t-hCO neuron sawise 8 sasi diferensiasi. f, plot frekuensi kumulatif lan kuantifikasi frekuensi lan amplitudo acara sinaptik (n = 32 neuron kontrol, n = 26 TS neuron; ** P = 0.0076 lan P = 0.8102). g, Analisis Scholl TS lan neuron kontrol ing hCO lan t-hCO. Garis putus-putus nuduhake neuron piramida postnatal L2 / 3 manungsa kanggo mbandhingake (n = 24 ngontrol neuron t-hCO, n = 21 TS t-hCO neuron, n = 8 ngontrol neuron hCO, lan n = 7 TS hCO neuron). Data dipunandharaken kanthi rata-rata ± standar deviasi
Kemampuan t-hCO kanggo niru fitur morfologis lan fungsional neuron korteks manungsa ing tingkat dhuwur nyebabake kita njelajah apa t-hCO bisa digunakake kanggo ndeteksi fenotipe penyakit. Kita fokus ing TS, kelainan neurodevelopmental abot sing disebabake mutasi gain-of-function ing gen enkoding CaV1.2, sing miwiti transkripsi gen sing gumantung karo aktivitas ing neuron. Kita entuk hCO saka telung pasien TS sing nggawa substitusi sing paling umum (p.G406R) lan telung kontrol (Gambar 3a). Sawise transplantasi, kita nemokake yen morfologi dendritik diowahi ing neuron TS dibandhingake karo kontrol (Fig. 3b lan data sing ditambahi, Fig. 8a, b), kanthi nambah kaping pindho ing jumlah dendrit primer lan paningkatan sakabèhé ing rata-rata lan nyuda sakabèhé ing dawa dendritik (Fig. 3c lan data lengkap, Fig. 8c). Iki digandhengake karo tambah kepadatan spines lan frekuensi tambah saka EPSCs spontan ing TS dibandhingake neuron kontrol (Fig. 3d-f lan data ditambahi, Fig. 8g). Analisis luwih lanjut nuduhake pola cabang dendritik sing ora normal ing t-hCO TS dibandhingake kontrol, nanging ora ing in vitro TS hCO ing tahap diferensiasi sing padha (Fig. 3g). Iki konsisten karo laporan sadurunge babagan penyusutan dendritik sing gumantung saka kegiatan ing TS lan nyorot kemampuan platform transplantasi iki kanggo ndeteksi fenotipe penyakit ing vivo.
Kita banjur takon apa ombone sel t-hCO digabungake kanthi fungsional menyang tikus S1. S1 ing rodents nampa input sinaptik sing kuat saka inti basal ventral lan posterior thalamic ipsilateral, uga motor ipsilateral lan korteks somatosensori sekunder, lan kontralateral S1 (Gambar 4a). Kanggo mulihake pola innervation, kita nginfeksi hCO karo virus rabies-dG-GFP/AAV-G lan transplantasi hCO menyang tikus S1 3 dina sabanjure. Kita diamati ekspresi GFP padhet ing neuron saka S1 ipsilateral lan ganglia basal ventral 7-14 dina sawise transplantasi (Gambar 4b, c). Kajaba iku, pewarnaan antibodi saka thalamic marker netrin G1 nuduhake anané thalamic endings ing t-hCO (Gambar 4d, e). Kanggo ngevaluasi manawa proyeksi aferen iki bisa ngasilake respon sinaptik ing sel t-hCO, kita nindakake rekaman sel kabeh saka sel manungsa ing bagean sing cetha saka lapisan thalamocortical. Stimulasi listrik tikus S1, kapsul internal, materi putih, serat cedhak t-hCO utawa aktivasi optogenetik saka opsin-expressing thalamic endings ing t-hCO induced short-latency EPSCs ing neuron t-hCO sing kapapar antagonis reseptor AMPA NBQX. (Fig. 4f, g lan data lengkap, Fig. 9a-g). Data kasebut nuduhake manawa t-hCO digabungake kanthi anatomi menyang otak tikus lan bisa diaktifake dening jaringan host tikus.
a, Diagram skematis saka eksperimen nelusuri rabies. b, GFP lan ekspresi STEM121 khusus manungsa antarane t-hCO lan korteks serebral tikus (panel ndhuwur). Uga ditampilake ekspresi GFP ing inti basal ventral ipsilateral tikus (VB) (kiwa ngisor) lan ipsilateral S1 (tengen ngisor). Skala bar, 50 µm. Kothak abang nggambarake area otak ing ngendi gambar dijupuk. c, kuantifikasi sel sing nyatakake GFP (n = 4 tikus). d, e - Netrin G1 + terminal thalamic ing t-hCO. d nuduhake bagean koronal ngemot inti t-hCO lan VB. Skala bar, 2 mm. e nuduhake ekspresi Netrin G1 lan STEM121 ing neuron t-hCO (kiwa) lan VB (tengen). Skala bar, 50 µm. Garis burik oranye nuduhake wates t-hCO. f, g, Tilak saiki neuron t-hCO sawise stimulasi listrik ing tikus S1 (f) utawa kapsul internal (g), kanthi (ungu) utawa tanpa (ireng) NBQX (kiwa). Amplitudo EPSC kanthi lan tanpa NBQX (n = 6 neuron S1, * P = 0.0119; lan n = 6 neuron kapsul internal, ** P = 0.0022) (tengah). Persentase neuron t-hCO sing nuduhake EPSC kanggo nanggepi stimulasi listrik tikus S1 (f) utawa kapsul internal (g) (tengen). aCSF, cairan serebrospinal buatan. h, diagram skematik eksperimen pencitraan 2P (kiwa). Ekspresi GCaMP6s ing t-hCO (tengah). Skala bar, 100 µm. Selang wektu fluoresensi saka GCaMP6s (tengen). i, Z-skor saka fluoresensi aktivitas spontan. j, ilustrasi skematis stimulasi kumis. k, lintasan fluoresensi 2P skor z ing siji nyoba, didadekake siji karo simpangan whisker ing wektu nul (garis putus-putus) ing sel conto. l, respon z-skor populasi rata-rata kabeh sel sing didadekake siji karo panyimpangan whisker ing wektu nul (garis putus-putus) (abang) utawa cap wektu kanthi acak (abu-abu). m. Diagram skematis eksperimen babagan tandha optik. n, kurva voltase Raw saka conto sel t-hCO sak stimulasi laser biru utawa deflection whisker. Panah abang nuduhake spike pisanan sing disebabake cahya (ndhuwur) utawa disebabake defleksi kumis (ngisor). Shading abu-abu nuduhake periode defleksi kumis. o, Bentuk gelombang cahya puncak lan respon defleksi kumis. p, spikes saka nyoba siji, didadekake siji karo penyimpangan saka whiskers ing sel conto. 0 nuduhake penyimpangan kumis (garis putus-putus). q, rata-rata populasi z-skor tingkat diperlokaké kanggo kabeh sel fotosensitif, didadekake siji karo panyimpangan whisker ing wektu nul (garis putus-putus) (abang) utawa wektu kanthi acak (abu-abu). r, Proporsi unit photosensitive Ngartekno modulated dening penyimpangan whisker (n = 3 clurut) (kiwa). Puncak latensi z-skor (n = 3 tikus; n = 5 (ijo peteng), n = 4 (ijo peteng), lan n = 4 (cyan) unit modulasi defleksi kumis saben tikus) (tengen). Data dipunandharaken kanthi rata-rata ± standar deviasi
Kita banjur takon apa t-hCO bisa diaktifake kanthi rangsangan sensori ing vivo. Kita transplantasi hCO sing nuduhake indikator kalsium sing dikode sacara genetis GCaMP6 menyang tikus S1. Sawise 150 dina, kita nindakake fotometri serat utawa pencitraan kalsium rong foton (Gambar 4h lan data sing ditambahi, Gambar 10a). Kita nemokake yen sel t-hCO nuduhake aktivitas irama sing disinkronake (Gambar 4i, Data sing Ditambahake, Gambar 10b lan Video Tambahan 1). Kanggo ciri aktivitas t-hCO puncak, kita nindakake rekaman elektrofisiologi ekstraselular ing tikus transplantasi anestesi (data sing ditambahi, Fig. 10c-f). Kita wis ngasilake koordinat stereotaxic saka gambar MRI; mangkono, Unit direkam iki makili neuron manungsa putative, sanajan electrophysiology piyambak ora ngidini spesies asal kanggo ditemtokake. Kita mirsani bledosan sing disinkronake (data sing ditambahi, Fig. 10d). Semburan kasebut kira-kira 460 ms lan dipisahake kanthi wektu bisu kira-kira 2 s (data sing ditambahi, Fig. 10d, e). Unit individu murub rata-rata udakara telung puteran saben bledosan, yaiku kira-kira 73% saka unit kadhaptar saben bledosan. Aktivitas unit individu padha banget hubungane, lan korélasi kasebut luwih dhuwur tinimbang unit sing diidentifikasi ing kéwan sing ora divaksinasi sing dicathet ing kondisi sing padha (data sing ditambahi, Fig. 10f). Kanggo luwih menehi ciri respon spike saka neuron sing ditemokake manungsa, kita nindakake eksperimen tagging cahya ing tikus anestesi sing ditransplantasikan karo hCO sing nyatakake saluran kation sensitif cahya rhodopsin 2 (hChR2), liwat t-hCO neuron short-latency pangenalan (kurang saka 10 ms) kanggo nanggepi rangsangan cahya biru (Fig.4m-Fig). Neuron t-hCO nuduhake semburan aktivitas spontan ing frekuensi sing padha karo sing diamati ing pencitraan kalsium, uga rekaman elektrofisiologis sing ditindakake ing t-hCO tanpa tandha cahya (data sing ditambahi, Gambar 10c-g). Ora ana kegiatan spontan sing diamati ing tahap hCO sing cocog sing direkam ing vitro. Kanggo netepake apa t-hCO bisa diaktifake dening rangsangan sensori, kita sedhela deflected kumis tikus adoh saka t-hCO (Fig. 4j, m lan data lengkap, Fig. 10h, k). Miturut studi sadurunge 8,10, subset saka sel t-hCO nuduhake aktivitas tambah kanggo nanggepi defleksi whisker, sing ora diamati nalika data dibandhingake karo prangko wektu acak (Fig. 4k-q lan data ditambahi, Fig. 10h-q). Pancen, udakara 54% saka unit tunggal sing dilabeli opto nuduhake tingkat gairah sing saya tambah akeh sawise stimulasi kumis, puncake kira-kira 650 ms (Fig. 4r). Digabungake, data kasebut nuduhake manawa t-hCO nampa input fungsional sing cocog lan bisa diaktifake kanthi rangsangan lingkungan.
Kita banjur nyelidiki apa t-hCO bisa ngaktifake sirkuit ing tikus kanggo ngontrol prilaku. Kita pisanan nyelidiki apa akson neuron t-hCO proyek menyang jaringan sekitar tikus. Kita nginfeksi hCO kanthi enkoding lentivirus hChR2 sing digabung karo EYFP (hChR2-EYFP). Sawise 110 dina, kita mirsani ekspresi EYFP ing wilayah kortikal ipsilateral, kalebu korteks pendengaran, motorik, lan somatosensori, uga ing wilayah subkortikal, kalebu striatum, hippocampus, lan thalamus (Gambar 5a). Kanggo netepake manawa proyeksi eferen kasebut bisa ngasilake respon sinaptik ing sel tikus, kita kanthi optik ngaktifake sel t-hCO sing nyatakake hChR2-EYFP kanthi ngrekam sel korteks serebral tikus ing bagean otak sing cetha. Pengaktifan akson t-hCO kanthi cahya biru nyebabake EPSCs short-latency ing neuron korteks piramida tikus, sing diblokir dening NBQX (Fig. 5b-g). Kajaba iku, respon kasebut bisa diblokir dening tetrodotoxin (TTX) lan dibalekake dening 4-aminopyridine (4-AP), sing nuduhake yen padha disebabake sambungan monosynaptic (Gambar 5e).
a, Diagram skematis pelacakan akson (kiwa). ekspresi t-hCO EYFP (kanan). Skala bar, 100 µm. A1, korteks pendengaran, ACC, korteks cingulate anterior, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diafragma, septum lateral, mPFC, korteks prefrontal medial, piri, korteks piriform, v. striatum, striatum ventral, VPM, inti ventropostomedial thalamus, VTA, wilayah tegmental ventral. Kothak abang nggambarake area otak ing ngendi gambar dijupuk. b, Diagram skematik eksperimen stimulasi. c, d, Conto respon photocurrent cahya biru (ndhuwur) lan voltase (ngisor) ing manungsa (c) EYFP + t-hCO utawa rat (d) EYFP-sel. e, f, Tilak saiki neuron tikus sawise stimulasi cahya biru saka akson t-hCO kanthi TTX lan 4-AR (ijo), TTX (abu-abu) utawa aCSF (ireng) (e), kanthi (violet) utawa tanpa (ireng) ) ) NBQX (e). g, latensi respon sing disebabake dening cahya biru ing sel tikus (n = 16 sel); bar horisontal nuduhake latensi rata-rata (7,13 ms) (kiwa). Amplitudo EPSCs cahya sing direkam nganggo utawa tanpa NBQX (n = 7 sel; *** P <0.0001) (tengah). Amplitudo EPSCs cahya sing direkam nganggo utawa tanpa NBQX (n = 7 sel; *** P <0.0001) (tengah). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ing центре). Amplitudo EPSC sing diakibatake cahya sing direkam nganggo utawa tanpa NBQX (n = 7 sel; *** P <0.0001) (tengah).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ing центре). Amplitudo EPSC sing diakibatake cahya sing direkam nganggo utawa tanpa NBQX (n = 7 sel; *** P <0.0001) (tengah).Persentase sel tikus sing nuduhake EPSC sing nanggapi cahya biru (tengen). h, Diagram skematis saka tugas prilaku. d0, dina 0. i. Kinerja kewan teladan ing dina 1 (kiwa) utawa dina 15 (tengen) latihan. Jumlah rata-rata licks sing ditindakake ing dina 1 (kiwa) utawa dina 15 (tengah tengen) (n = 150 uji coba cahya biru, n = 150 uji coba lampu abang; *** P <0.0001). Jumlah rata-rata licks sing ditindakake ing dina 1 (kiwa) utawa dina 15 (tengah tengen) (n = 150 uji coba cahya biru, n = 150 uji coba lampu abang; *** P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) utawa день 15 (ing центре справа) (n = 150 испытаний с = сито5ми с = сито5мо испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Rata-rata jumlah licks sing ditindakake ing dina 1 (kiwa) utawa dina 15 (tengen tengah) (n = 150 uji coba cahya biru, n = 150 uji coba lampu abang; *** P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) utawa день 15 (ing центре справа) (n = 150 испытаний с = сито5ми с = сито5мо испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Rata-rata jumlah licks sing ditindakake ing dina 1 (kiwa) utawa dina 15 (tengen tengah) (n = 150 uji coba cahya biru, n = 150 uji coba lampu abang; *** P <0.0001).Dilat kumulatif kanggo uji coba cahya abang lan biru ing dina 1 (kiwa tengah) utawa dina 15 (tengen). NS, ora penting. j, k, Karakteristik prilaku kabeh kewan sing ditransplantasikan kanthi t-hCO sing nyatakake hChR2-EYFP (j) utawa kontrol fluorophore (k) ing dina 1 utawa 15 (hChR2-EYFP: n = 9 tikus, ** P = 0.0049; kontrol: n = 9, P = 0.1497). l, Evolusi skor preferensi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; ** P <0,001, *** P <0,0001). l, Evolusi skor preferensi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; ** P <0,001, *** P <0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolusi skor preferensi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; ** P <0.001, *** P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolusi skor preferensi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; ** P <0.001, *** P <0.0001).m, ekspresi FOS kanggo nanggepi aktivasi optogenetik t-hCO ing S1. Gambar ekspresi FOS (kiwa), lan kuantifikasi (n = 3 saben klompok; *P <0.05, **P <0.01 lan ***P <0.001) (tengen) ditampilake. Gambar ekspresi FOS (kiwa), lan kuantifikasi (n = 3 saben klompok; *P <0.05, **P <0.01 lan ***P <0.001) (tengen) ditampilake. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) lan количественного определения (n = 3 группу; * P <0,05, ** P <0,01, и *** P <0,01,001) (0,01,00) Gambar ekspresi FOS (kiwa) lan kuantifikasi (n = 3 saben klompok; * P <0.05, ** P <0.01, lan *** P <0.001) ditampilake (tengen).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）））的叾）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）））的叾） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) lan количественного определения (n = 3 группу; * P <0,05, ** P <0,01, и *** P <0,01,001) (0,01,00) Gambar ekspresi FOS (kiwa) lan kuantifikasi (n = 3 saben klompok; * P <0.05, ** P <0.01, lan *** P <0.001) ditampilake (tengen).Skala bar, 100 µm. Data kasebut minangka rata-rata ± kesalahan standar BLA, tonsil basolateral, MDT, inti thalamic dorsomedial, PAG, abu-abu periaqueductal.
Pungkasan, kita takon yen t-hCO bisa ngowahi prilaku tikus. Kanggo nguji iki, kita transplantasi hChR2-EYFP-expressing hCO menyang S1, lan 90 dina sabanjure, kita implan serat optik menyang t-hCO kanggo pangiriman cahya. Kita banjur nglatih tikus kanthi paradigma kahanan operan sing diowahi (Gambar 5h). Kita sijine kewan ing kamar test prilaku lan kanthi acak 5 detik biru (473 nm) lan abang (635 nm) rangsangan laser. Kewan nampa ganjaran banyu yen dilat nalika stimulasi cahya biru nanging ora dilat nalika stimulasi cahya abang. Ing dina pisanan latihan, kewan-kewan kasebut ora ana bedane nalika dilat nalika dirangsang nganggo lampu biru utawa abang. Nanging, ing dina 15, kewan sing ditransplantasikan karo hCO sing nyebutake hChR2-EYFP nuduhake dilat sing luwih aktif nalika dirangsang karo cahya biru dibandhingake karo stimulasi cahya abang. Owah-owahan ing prilaku dilat iki ora diamati ing kewan kontrol sing ditransplantasikan karo hCO sing nyatakake fluorophore kontrol (tingkat sukses sinau: hChR2 89%, EYFP 0%, Gambar 5i-1 lan Video Tambahan 2). Data kasebut nuduhake manawa sel t-hCO bisa ngaktifake neuron tikus kanggo ngrangsang prilaku golek ganjaran. Kanggo ngerteni sirkuit saraf t-hCO tikus sing bisa uga ana ing owah-owahan prilaku kasebut, kita ngaktifake t-hCO kanthi optogenetik ing kewan sing dilatih lan jaringan sing dipanen 90 menit mengko. Imunohistokimia ngungkapake ekspresi protein FOS sing gumantung ing aktivitas ing sawetara wilayah otak sing melu prilaku motivasi, kalebu korteks prefrontal medial, thalamus medial, lan materi abu-abu periaqueductal, sing dituduhake ing kewan kontrol sing ora distimulasi utawa ing kewan. beras. 5m). Digabungake, data kasebut nuduhake manawa t-hCO bisa ngowahi aktivitas neuron tikus kanggo ngarahake prilaku.
Organoid syaraf minangka sistem sing apik kanggo nyinaoni perkembangan manungsa lan penyakit in vitro, nanging diwatesi amarga ora ana sambungan antarane sirkuit sing ana ing vivo. Kita wis ngembangake platform anyar ing ngendi kita transplantasi hCO menyang S1 saka tikus postnatal awal immunocompromised kanggo nyinaoni pangembangan lan fungsi sel manungsa ing vivo. Kita wis nuduhake manawa t-hCO ngembangake jinis sel diwasa sing ora diamati ing vitro28 lan t-hCO digabungake sacara anatomis lan fungsional menyang otak tikus. Integrasi t-hCO menyang sirkuit saraf rodent ngidini kita nggawe hubungan antarane aktivitas seluler manungsa lan sinau prilaku kewan, nuduhake yen neuron t-hCO bisa modulate aktivitas neuronal tikus kanggo ndorong respon prilaku.
Platform sing kita jelasake duwe sawetara kaluwihan tinimbang riset sadurunge babagan transplantasi sel manungsa menyang otak tikus. Kaping pisanan, kita transplantasi hCO menyang korteks ngembangake tikus postnatal awal, sing bisa nggampangake integrasi anatomi lan fungsional. Kapindho, pemantauan t-hCO MRI ngidini kita nyinaoni posisi korupsi lan wutah ing kéwan urip, saéngga kita bisa nganakake studi multi-kewan jangka panjang lan netepake linuwih sawetara garis sel hiPS. Pungkasan, kita transplantasi organoid sing utuh, tinimbang suspensi sel tunggal sing terisolasi, sing kurang ngrusak sel manungsa lan bisa ningkatake integrasi lan generasi neuron korteks manungsa ing otak tikus.
Kita ngakoni manawa sanajan ana kemajuan ing platform iki, kendala temporal, spasial, lan spesies silang nyegah pambentukan sirkuit saraf manungsa kanthi kesetiaan sing dhuwur, sanajan sawise transplantasi ing tahap awal pembangunan. Contone, ora jelas manawa aktivitas spontan sing diamati ing t-hCO nuduhake fenotipe perkembangan sing padha karo aktivitas ritmik sing diamati sajrone perkembangan korteks, utawa apa amarga ora ana jinis sel suppressive sing ana ing t-hCO. Kajaba iku, ora jelas manawa ora ana laminasi ing t-hCO mengaruhi konektivitas rantai30. Pakaryan ing mangsa ngarep bakal fokus ing nggabungake jinis sel liyane kayata microglia manungsa, sel endothelial manungsa, lan proporsi sing beda-beda saka interneuron GABAergic kaya sing dituduhake nggunakake perakitan 6 in vitro, uga mangerteni carane integrasi lan pangolahan saraf bisa kedadeyan ing t-hCO sing diowahi. tingkat transkripsi, sinaptik lan prilaku ing sel sing dipikolehi saka pasien.
Sakabèhé, platform in vivo iki minangka sumber daya sing kuat sing bisa nglengkapi pangembangan otak manungsa lan riset penyakit in vitro. Kita ngarepake yen platform iki bakal ngidini kita nemokake fenotipe tingkat untaian novel ing sel sing asale saka pasien lan nyoba strategi terapi anyar.
Kita ngasilake hCO2.5 saka sel HiPS kaya sing diterangake sadurunge. Kanggo miwiti produksi hCO saka sel hiPS sing dikultur ing lapisan feeder, koloni sel hiPS sing utuh dibuang saka piring kultur nggunakake dispase (0.35 mg / mL) lan ditransfer menyang kultur plastik lampiran ultra-rendah sing ngemot piring karo medium kultur sel hiPS. (Corning) ditambah karo loro inhibitor SMAD dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) lan SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) lan ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Sajrone 5 dina pisanan, medium sel hiPS diganti saben dina lan dorsomorphine lan SB-431542 ditambahake. Ing dina kaping enem ing penundaan, spheroid saraf ditransfer menyang medium saraf sing ngemot neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penisilin lan streptomycin (1: 100, Life Technologies) lan ditambah karo faktor pertumbuhan e (100 ml; Sistem R & D) lan faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1; Sistem R & D) nganti dina 24. Saka dina 25 nganti dina 42, medium kasebut ditambah karo faktor neurotropik sing asale saka otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) lan neurotropin 3 (NT3; 20 ng ml) medium liyane. Ing dina kaping enem ing penundaan, spheroid saraf ditransfer menyang medium saraf sing ngemot neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penisilin lan streptomycin (1: 100, Life Technologies) lan ditambah karo faktor pertumbuhan e (100 ml; Sistem R & D) lan faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1; Sistem R & D) nganti dina 24. Saka dina 25 nganti dina 42, medium kasebut ditambah karo faktor neurotropik sing asale saka otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) lan neurotropin 3 (NT3; 20 ng ml) medium liyane.Ing dina kaping enem ing penundaan, spheroid saraf ditransfer menyang medium saraf sing ngemot Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penisilin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) lan дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) lan фактором роста фиб;2м (0 fнг; 2мброб) Sistem R&D) nganti 24-го дня. lan streptomycin (1:100, Life Technologies) lan ditambah karo faktor pertumbuhan epidermis (EGF; 20 ng / ml; Sistem R&D) lan faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng / ml; Sistem R&D) nganti dina 24.Saka dina 25 nganti 42, faktor neurotropik sing asale saka otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) lan neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ditambahake ing medium, ngganti medium saben dina liyane.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素0，1:10 Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF ngR&D；；20 Sistem）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 的索2 b补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （1（素 （1）素 （1（素 （1）素生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；笛紬夳 。 Ing 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добизав7 А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальакото (GF2; нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Ing dina 6, suspensi neurosfer diuripake menyang suplemen sing ngemot neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), streptomycin sing dinetralake penisilin (1: 100, Life Technologies) ditambah karo faktor pertumbuhan epidermal & 12; faktor wutah fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Sistem R&D) nganti 24-го дня. Sistem R&D) nganti dina 24.Saka dina 25 nganti 42, faktor neurotropik sing asale saka otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) lan faktor neurotropik 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ditambahake ing medium kultur saben dina liyane. Sedheng ngganti sapisan.Wiwit dina 43, hCO dijaga ing medium neurobasal-A sing ora ditambah (NM; 1088022, Thermo Fisher) kanthi owah-owahan medium saben 4-6 dina. Kanggo entuk hCO saka sel hiPS sing dibudidaya ing kahanan sing ora ana feeder, sel hiPS diinkubasi karo Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ing 37 ° C suwene 7 menit, dipisahake dadi sel tunggal, lan dilapisi ing piring AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) kanthi kapadhetan sel tunggal 3 × 106 ing medium tambahan ROCK. Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Sawise 24 jam, media ing sumur kasebut dipipet munggah mudhun menyang media sing ngemot media Essential 6 (A1516401, Life Technologies) ditambah karo dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) lan SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Saka dina 2 nganti 6, medium Essential 6 diganti saben dina karo dorsomorphine lan tambahan SB-431542. Saka dina kaping enem, suspensi neurosphere ditransfer menyang medium neurobasal lan dikelola kaya sing kasebut ing ndhuwur.
Kabeh prosedur kewan ditindakake miturut pedoman perawatan kewan sing disetujoni dening Komite Administratif Perawatan Kewan Laboratorium Universitas Stanford (APLAC). Tikus euthymic RNU (rnu/+) meteng dituku (Charles River Laboratories) utawa dipanggoni. Kéwan disimpen ing siklus cahya-peteng 12 jam kanthi ad libitum pangan lan banyu. Anak tikus bogel (FOXN1–/–) umur telung nganti pitung dina diidentifikasi kanthi tuwuh kumis sing durung diwasa sadurunge dibuang. Anak kirik (lanang lan wadon) dibius nganggo isoflurane 2-3% lan dilebokake ing pigura stereotaxic. Trepanasi tengkorak kanthi diameter kira-kira 2-3 mm ing ndhuwur S1 ditindakake nalika njaga integritas dura mater. Banjur gunakake jarum 30-G (kira-kira 0,3 mm) ing njaba kraniotomi kanggo nusuk dura. Banjur aplikasi HCO menyang parafilm lancip 3 × 3 cm lan mbusak keluwihan medium. Nggunakake jarum suntik Hamilton sing dipasang ing jarum 23 G, 45 °, alon-alon tarik hCO menyang ujung jarum sing paling adoh. Banjur pasang syringe ing pompa syringe sing disambungake menyang piranti stereotaxic. Banjur nyelehake pucuk jarum ing bolongan tusukan 0,3 mm sing sadurunge digawe ing dura (z = 0 mm) lan sempit jarum suntik 1-2 mm (z = kira-kira -1,5 mm) nganti jarum ana ing antarane dura mater A. segel sing kandhel dibentuk. Banjur munggahake jarum suntik menyang tengah permukaan korteks ing z = -0,5 mm lan nyuntikake hCO kanthi kecepatan 1-2 µl saben menit. Sawise rampung injeksi hCO, jarum ditarik kanthi kecepatan 0.2-0.5 mm saben menit, kulit dijahit, lan kirik kasebut langsung diselehake ing pad pemanas sing anget nganti pulih lengkap. Sawetara kewan ditransplantasikan kanthi bilateral.
Kabeh prosedur kewan ditindakake miturut pedoman perawatan kewan sing disetujoni APLAC Universitas Stanford. Tikus (luwih saka 60 dina sawise transplantasi) diinduksi kanthi anestesi isoflurane 5% lan dibius nganggo isoflurane 1-3% sajrone pencitraan. Kanggo visualisasi, 7 Tesla aktif shielded horisontal borehole scanner Bruker (Bruker Corp.) karo International Electric Company (IECO) gradient drive, shielded gradient insert karo diameteripun internal 120 mm (600 mT / m, 1000 T / m / s) digunakake nggunakake AVANCE. III, wolung saluran multi-coil RF lan multi-inti Kapabilitas, lan gawan Paravision 6.0.1 platform. Rekaman dileksanakake nggunakake coil RF volumetrik decoupled aktif karo diameteripun internal 86 mm lan papat saluran cryo-cooled RF coil kanggo nampa mung. Axial 2D Turbo-RARE (wektu pengulangan = 2500 ms, wektu gema = 33 ms, rata-rata 2) kanthi 16 tangkapan irisan, ketebalan irisan 0,6-0,8 mm, ngemot sampel 256 × 256. Sinyal kasebut ditampa kanthi nggunakake kumparan RF volumetrik transceiver kuadrat kanthi diameter internal 2 cm (Rapid MR International, LLC). Pungkasan, gunakake fungsi perkiraan permukaan Imaris (BitPlane) sing dibangun kanggo rendering 3D lan analisis volume. Transplantasi sing sukses ditetepake minangka salah sawijining area sinyal MRI bobot T2 sing terus-terusan dibentuk ing hemisfer sing ditransplantasikan. Penolakan graft ditetepake minangka korupsi sing ora ngasilake area sinyal MRI bobot T2 sing terus-terusan ing hemisfer sing ditransplantasikan. Subkortikal t-hCO ora kalebu saka analisis sakteruse.
Kanggo nyatakake GCaMP6s kanthi stabil ing hCO kanggo pencitraan kalsium rong foton, sel hiPS kena infeksi pLV [Exp] -EF1a :: GcaMP6s-WPRE-Puro diikuti karo pilihan antibiotik. Sedhela, sel dipisahake karo EDTA lan digantung ing 1 ml medium Essential 8 kanthi kapadhetan kira-kira 300.000 sel ing ngarsane polybrene (5 μg / ml) lan 15 μl virus. Sel kasebut banjur diinkubasi ing suspensi suwene 60 menit lan dibiji kanthi kapadhetan 50.000 sel saben sumur. Sawise confluence, sel diobati karo 5-10 μg ml-1 puromycin kanggo 5-10 dina utawa nganti koloni stabil katon. Infeksi hCO akut ditindakake kaya sing diterangake sadurunge 5 kanthi sawetara modifikasi. Sedhela, transfer dina 30-45 hCO menyang 1,5 ml tabung microcentrifuge Eppendorf sing ngemot 100 µl medium saraf. Banjur kira-kira 90 µl medium dicopot, 3-6 µl lentivirus titer dhuwur (saka 0,5 x 108 nganti 1,2 x 109) ditambahake menyang tabung, lan hCO ditransfer menyang inkubator suwene 30 menit. Banjur tambahake 90-100 µl medium kanggo saben tabung lan bali tabung menyang inkubator sewengi. Dina sabanjure, transfer hCO menyang medium saraf seger ing piring lampiran sing kurang. Sawise 7 dina, hCO ditransfer menyang piring ngisor kaca 24 sumur kanggo visualisasi lan evaluasi kualitas infeksi. pLV [Exp] -SYN1 :: EYFP-WPRE lan pLV [Exp] -SYN1 :: hChR2-EYFP-WPRE digawe dening VectorBuilder. Lentivirus digunakake ing akeh eksperimen amarga digabungake menyang genom inang, ngidini ekspresi gen reporter ing garis sel sing kena infeksi. Kanggo tindak lanjut rabies, dina 30-45 hCO kena infeksi rabies-ΔG-eGFP lan AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), dikumbah kanthi sak tenane sajrone 3 dina, lan ditransplantasikan menyang tikus ing S1 lan dipelihara ing 7-14 dina.
Kanggo immunocytochemistry, kewan dibius lan transcardially perfused karo PBS ngiring dening 4% paraformaldehyde (PFA ing PBS; Electron Microscopy Sciences). Otak didandani ing 4% PFA kanggo 2 jam utawa sewengi ing 4 ° C, cryopreserved ing 30% sukrosa ing PBS kanggo 48-72 jam, lan ditempelake ing 1: 1, 30% sukrosa: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek) lan koronal aicaostat (digawe ing bagean coronal 30s). Kanggo imunohistokimia saka bagean sing kandel, kewan diwutahake karo PBS, lan otak dibedah lan dipotong koronal ing 300-400 µm nggunakake vibratome (Leica) lan bagean kasebut tetep nganggo 4% PFA sajrone 30 menit. Banjur cryosections utawa bagean kandel dicuci nganggo PBS, diblokir sajrone 1 jam ing suhu kamar (10% normal kuldi serum (NDS) lan 0,3% Triton X-100 diencerke ing PBS) lan diblokir karo solusi pamblokiran ing 4 ° C. - Cryosections inkubasi diinkubasi sewengi lan bagean sing kandel diinkubasi sajrone 5 dina. Antibodi utama sing digunakake yaiku: anti-NeuN (tikus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (terwelu, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (1,1Tex, Gene) anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (terwelu, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, HPA0, Atlasbo1, 1:2008; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (terwelu, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (wedhus, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1A: 100, 6, Sistem Netrin G1A: 100, 6 anti-STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (terwelu, 1:400; ABN904, Millipore) lan anti-IBA1 (wedhus, 6: ab5). Antibodi utama sing digunakake yaiku: anti-NeuN (tikus, 1: 500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (tikus, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (terwelu, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti -GFP: 1, Tex, Genex 09 anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (terwelu, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, HPA0, Atlasbo1, 1:2008; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kelinci , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (wedhus, 1:500; AF3075, R&D Sistem), Netrin AF: 10, R&D, Sistem Netrin G1a: 100, R&D anti-STEM121 (mouse , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) lan anti-IBA1 :107; a107; a107; Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные; 5, 304, 6; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, нтиклик), 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas1, Круз) ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a, нетрин G1a (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коз10), 1: AF10; анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040, 1:4040; Miliore; (koza, 1:100; ab5076, abkam). Antibodi utama sing digunakake yaiku: anti-NeuN (tikus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (terwelu, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP1009; anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (terwelu, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, 1:2478; HPA, Atlas178; HPA, 2478; HPA, 2470; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (kelinci, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (wedhus, 1:500; AF3075, R&D Sistem), netrin G1AF: 100; 106; Sistem R&D STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) lan anti-IBA1 (wedhus, 1:50).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Sistem），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GFP（1:1,000；GTX13970，GeneTex），HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN 7 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，ab9774，ab9774， 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，Sistem R&D），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，Sistem R&D1:Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (terwelu, 1:400; ABN904, Millipore) lan anti-IBA1 (wedhus, 1:100; ab5076, abcam).Antibodi utama sing digunakake yaiku: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (pitik, 1: 1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mouse, 1: 200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1: 500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (terwelu, 1: 200R, 1:200, 1:200) (terwelu, 1:200; HPA047819, antibodi Atlas), anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (terwelu), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (1:40, Tasikmalaya) анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) lan анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (wedhus, 1:500; AF3075, Sistem R&D), Netrin G1a (wedhus, 1:100; AF1166, Sistem R&D), anti-STEM121 (mouse, 1:200; Takara Bio, 500; Y4040, anti- ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore), lan anti-IBA1 (wedhus, 1:100; ab5076, abkam).Bagean banjur dikumbah nganggo PBS lan diinkubasi karo antibodi sekunder sajrone 1 jam ing suhu kamar (bagian beku) utawa sewengi ing 4 ° C (bagian kandel). Alexa Fluor antibodi sekunder (Life Technologies) diencerke 1:1000 ing solusi pamblokiran digunakake. Sawise ngumbah nganggo PBS, inti kasebut digambarake nganggo Hoechst 33258 (Life Technologies). Pungkasan, slide kasebut diselehake ing mikroskop kanthi tutup tutup (Fisher Scientific) nggunakake Aquamount (Polysciences) lan dianalisis ing mikroskop neon Keyence (BZ-X analyzer) utawa mikroskop confocal Leica TCS SP8 (Las-X) ing gambar kasebut. Gambar kasebut diproses nggunakake program ImageJ (Fiji). Kanggo ngitung proporsi neuron manungsa ing t-hCO lan korteks tikus, gambar persegi panjang 387.5 μm dijupuk ing tengah t-hCO, ing utawa cedhak pinggir korteks tikus. Margin graft ditemtokake kanthi netepake owah-owahan ing transparansi jaringan, inti HNA +, lan / utawa anané autofluoresensi jaringan. Ing saben gambar, jumlah total sel NeuN+ lan HNA+ dibagi karo jumlah total sel NeuN+ ing wilayah sing padha. Kanggo mesthekake yen mung sel karo inti ing bidang gambar diitung, mung sel sing uga Hoechst + kalebu ing pitungan. Loro gambar sing dipisahake paling sethithik 1 mm dirata-rata kanggo nyuda kesalahan statistik.
Seminggu sadurunge koleksi sampel, nyelehake kewan transplantasi hCO (kira-kira 8 sasi diferensiasi) ing kamar sing peteng kanthi kumis sing dipotong kanggo nyuda stimulasi sensori. Isolasi inti ditindakake kaya sing diterangake sadurunge, kanthi sawetara modifikasi. Sedhela, t-hCO lan hCO dirusak nggunakake lisis sel deterjen-mekanik lan gilingan jaringan kaca 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich / KIMBLE). Nukleus mentah banjur disaring nganggo saringan 40 µm lan disentrifugasi ing 320 g suwene 10 menit ing suhu 4 °C sadurunge nindakake gradien kapadhetan sukrosa. Sawise langkah sentrifugasi (320 g kanggo 20 menit ing 4 ° C), conto kasebut digantung maneh ing 0,04% BSA / PBS kanthi tambahan 0,2 unit inhibitor µl-1 RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) lan liwat filter aliran 40 µm. Inti dissociated banjur resuspended ing PBS ngemot 0.02% BSA lan dimuat menyang Chromium Single Cell 3' chip (kira-kira Recovery saka 8.000 sel saben jalur). Pustaka snRNA-seq disiapake karo Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Pustaka snRNA-seq disiapake karo Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Sel Tunggal 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Pustaka snRNA-seq disiapake nggunakake Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Sel Tunggal 3′ GEM, Pustaka & Kit Manik Gel v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Sel Tunggal 3′ GEM, Pustaka & Kit Manik Gel v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Sel Tunggal 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Pustaka snRNA-seq disiapake nggunakake Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Pustaka saka macem-macem conto dikumpulake lan diurutake dening Admera Health ing NovaSeq S4 (Illumina).
Tingkat ekspresi gen kanggo saben barcode nuklir putative diukur nggunakake paket piranti lunak analisis 10x Genomics CellRanger (versi 6.1.2). Khususe, wacan kasebut cocog karo kombinasi genom referensi manungsa (GRCh38, Ensemble, versi 98) lan tikus (Rnor_6.0, Ensemble, versi 100) sing digawe nganggo perintah mkref lan nggunakake count karo printah –include-introns=TRUE kanggo kuantitatif kalebu maca sing dipetakan menyang wilayah intron. Kanggo conto t-hCO, inti manungsa diidentifikasi adhedhasar syarat konservatif sing paling ora 95% kabeh maca sing dipetakan cocog karo genom manungsa. Kabeh analisis sakteruse padha dileksanakake ing output Uploaded barcode saring saka CellRanger nggunakake paket R (versi 4.1.2) Seurat (versi 4.1.1)32.
Kanggo mesthekake yen mung inti kualitas dhuwur sing kalebu ing analisis sakteruse, proses nyaring iteratif ditindakake kanggo saben sampel. Kaping pisanan, inti kualitas rendah kanthi kurang saka 1000 gen unik sing ditemokake lan luwih saka 20% saka total mitokondria diidentifikasi lan dibusak. Salajengipun, matriks nomer gen mentah dinormalisasi kanthi regresi binomial negatif regulasi kanthi nggunakake fungsi sctransform(vst.flavor=”v2″), sing uga ngidhentifikasi 3000 gen paling variabel nggunakake parameter standar. Pengurangan dimensi ditindakake ing gen variabel ndhuwur nggunakake Analisis Komponen Utama (PCA) kanthi parameter standar sing dipilih nggunakake set data 330. inspeksi situs dhengkul lan digunakake kanggo kabeh sampel lan analisis ensemble kita banjur nindakake sawetara babak saka clustering iteratif (resolusi = 1) kanggo nggolongake gen adhedhasar count gen abnormally kurang (median ngisor persentil 10th), count gen mitokondria abnormally dhuwur (median ndhuwur persentil 95th) kanggo ngenali lan mbusak sel sing diidentifikasi saka kembar kualitas dhuwur 3 utawa paket (tegese skor DoubletFinder ing ndhuwur persentil 95. sampel t-hCO (n = 3) lan sampel hCO (n = 3) digabungake kanthi kapisah nggunakake fungsi IntegrateData kanthi paramèter ing ndhuwur.
Sawise ngilangi kernel kualitas rendah, dataset terintegrasi diklompokaké (resolusi = 0,5) lan ditempelake kanggo tujuan visualisasi UMAP34. Gen panandha kanggo saben kluster ditemtokake nggunakake fungsi FindMarkers kanthi paramèter standar sing diitung saka data ekspresi gen sing dinormalisasi. Kita ngenali lan nggolongake kelas sel utama kanthi nggabungake dataset referensi kortikal janin lan diwasa kanthi ekspresi gen marker 19,20,21,35 lan anotasi. Utamane, prekursor sirkulasi diidentifikasi kanthi ekspresi MKI67 lan TOP2A. Kluster progenitor ditemtokake kanthi ora ana transkrip mitosis, tumpang tindih dhuwur karo kluster progenitor glial multipotent sing diterangake ing korteks janin metaphase pungkasan, lan ekspresi EGFR lan OLIG1. Kita nggunakake istilah astrocyte kanggo nyakup sawetara negara diferensiasi astrosit, saka glia radial pungkasan nganti mateng astrosit. Kluster astrocyte nyatakake tingkat dhuwur saka SLC1A3 lan AQP4 lan wis ditampilake peta karo subtipe glia radial janin lan / utawa astrosit diwasa. OPCs nyatakake PDGFRA lan SOX10 nalika oligodendrocytes nyatakake marker myelination (MOG lan MYRF). Neuron glutamatergic diidentifikasi kanthi anané transkrip neuron (SYT1 lan SNAP25), ora ana tandha GABAergic (GAD2), lan ekspresi NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, utawa SATB2. Neuron GluN dipérang dadi subclass ndhuwur (ekspresi SAB2 lan mundhut BCL11B) lan jero (ekspresi BCL11B). Neuron subplate (SP) Putative nyatakake marker SP18 sing dikenal kayata ST18 lan SORCS1 saliyane marker GluN jero. Sel kaya plexus choroid diidentifikasi kanthi ekspresi TTR, lan sel kaya meningeal nyatakake gen sing gegandhengan karo fibroblast lan dipetakan sel pial / vaskular saka set data referensi.
Analisis diferensial ekspresi gen antarane subkelas t-hCO lan hCO ditindakake kanthi nggunakake metode pseudo-batch sing mentas dikembangake ing conto sing diimplementasikake nggunakake paket Libra R (versi 1.0.0). Secara khusus, tes kemungkinan log edgeR (versi 3.36.0, paket R) ditindakake kanggo klompok kanthi nyimpulake jumlah gen ing sel kanggo kelas sel tartamtu kanggo saben replikasi sampel. Kanggo visualisasi heatmap, nilai normalisasi saben yuta (CPM) diitung nggunakake fungsi edgeR (cpm()) lan skala (kanggo entuk rata-rata = 0, standar deviasi = 1). Analisis pengayaan Gene Ontology (GO) saka gen t-hCO GluN sing diregulasi sacara signifikan (Benjamini-Hochberg mbenerake nilai P kurang saka 0,05 sing ditulis ing paling ora 10% sel t-hCO GluN lan paningkatan lipatan ing owah-owahan paling sethithik 2 kali). dileksanakake nggunakake ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Kita nggunakake aplikasi ToppFun kanthi paramèter gawan lan nglaporake nilai-P sing dikoreksi Benjamini-Hochberg sing diwilang saka tes hipergeometrik beranotasi GO.
Kanggo cocog kluster snRNA-seq kita karo klompok sel anotasi saka studi referensi RNA-seq sel tunggal utami utawa snRNA-seq19,20,21,22 diwasa, kita nggunakake pendekatan integrasi dataset sing dipasangake. Kita nggunakake alur kerja normalisasi SCTransform (v2) ing Seurat kanggo nggabungake lan mbandhingake tumpang tindih kluster antarane dataset (nggunakake paramèter sing padha ing ndhuwur). Dataset individu diganti kanthi acak nganti 500 sel utawa inti saben kluster asli kanggo efisiensi komputasi. Nggunakake pendekatan sing padha kaya sing diterangake sadurunge, tumpang tindih kluster ditetepake minangka proporsi sel utawa inti ing saben kluster sing digabung karo label kluster referensi. Kanggo luwih nggolongake GluN, kita nggunakake alur kerja TransferData Seurat kanggo data subset GluN kanggo nemtokake label dataset referensi menyang sel GluN kita.
Kanggo netepake status mateng saka transkriptom global saka conto t-hCO lan hCO, kita mbandhingake conto pseudo-bulk kita karo BrainSpan / psychENCODE23, sing kalebu urutan RNA gedhe sing kalebu pangembangan otak manungsa. Kita nindakake PCA ing matriks ekspresi gen pola-normalisasi gabungan saka conto kortikal 10 minggu sawise konsepsi lan mengko, ing gen 5567 (bebarengan karo data kita) sing sadurunge diidentifikasi minangka aktif ing conto kortikal BrainSpan (ditetepake luwih saka 50% ing varians perkembangan sing diterangake miturut umur nggunakake model kubik)38. Kajaba iku, kita ngasilake gen sing ana gandhengane karo tandha-tandha transkriptom utama neurodevelopment nggunakake faktorisasi matriks non-negatif kaya sing wis diterangake sadurunge. Bobot sampel sing diitung nggunakake prosedur faktorisasi matriks non-negatif diplot ing Fig. 5b karo data ditambahi kanggo saben limang teken diterangake dening Zhu et al.38. Maneh, penanda transkripsional gumantung saka aktivitas ditemokake saka studi sing diterbitake sadurunge. Utamane, ERG lan LRG sacara signifikan diregulasi ing neuron glutamatergik sing diidentifikasi dening koleksi snRNA-seq korteks visual mouse sawise stimulasi visual saka Tabel Tambahan 3 Hrvatin et al.16. LRG sing diperkaya manungsa dipikolehi saka kultur otak janin manungsa sing diaktifake KCl lan dipanen 6 jam sawise stimulasi, lan gen sing disaring sacara signifikan diregulasi ing manungsa nanging ora ing rodents (Tabel Tambahan 4). Analisis pengayaan set gen nggunakake set gen kasebut ditindakake kanthi nggunakake tes pas Fisher siji arah.
Anesthetize tikus karo isoflurane, mbusak otak lan panggonan ing kadhemen (kira-kira 4 ° C) oksigen (95% O2 lan 5% CO2) solusi sukrosa kanggo bagean ngemot: 234 mM sukrosa, 11 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 lan 0,5 mM CaCl2 (udakara 310 mOsm). Bagian koronal otak tikus (300-400 µm) sing ngemot t-hCO digawe nggunakake vibratom Leica VT1200 kaya sing wis diterangake sadurunge39. Bagean kasebut banjur ditransfer menyang ruang bagean kanthi oksigenasi suhu kamar terus-terusan sing ngemot aCSF sing disiapake saka: 10 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 lan 126 mM NaCl (298 mO). paling 45 menit sadurunge ngrekam. Bagean kasebut dicathet ing kamar sing dicemplungake kanthi terus-terusan diwutahake karo aCSF (95% O2 lan 5% CO2 vial). Kabeh data direkam ing suhu kamar. Neuron t-hCO diakhiri nganggo pipet kaca borosilikat sing diisi larutan sing ngemot 127 mM kalium glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, lan 0.6 mM EGTA, pH 7.2, solusi internal diatur karo KOHs (m290 mO290). Kanggo pulih, biocytin (0,2%) ditambahake ing solusi rekaman.
Data dipikolehi kanthi nggunakake amplifier MultiClamp 700B (Piranti Molekuler) lan digitizer Digidata 1550B (Piranti Molekuler), disaring low-pass ing 2 kHz, didigital ing 20 kHz, lan dianalisis nggunakake Clampfit (Piranti Molekuler), Asal (OriginPro). 2021b, OriginLab). lan fungsi MATLAB khusus (Mathworks). Potensial persimpangan diwilang nggunakake JPCalc lan entri disetel menyang nilai sing diwilang -14 mV. Operasi IV kasusun saka seri langkah saiki ing 10-25 pA langkah, saka -250 kanggo 750 pA.
Thalamus, materi putih, lan aferen S1 dirangsang kanthi listrik ing irisan thalamocortical sajrone rekaman patch-clamp neuron hCO, kaya sing diterangake sadurunge. Sedhela, otak dilebokake ing meja cetak 3D sing diiringake ing sudut 10 °, lan ngarep otak dipotong kanthi sudut 35 °. Otak banjur ditempelake ing permukaan potong lan dipérang, njaga akson protruding thalamocortical. Elektroda tungsten bipolar (0,5 MΩ) dipasang ing micromanipulator kapindho lan kanthi posisi strategis kanggo ngrangsang papat wilayah saben sel (kapsul njero, materi putih, S1 lan hCO). Rekam respon sinaptik sawise 300 μA stimulasi phasic ing 0.03-0.1 Hz.
Neuron hCO-expressing hChR2 diaktifake ing 480 nm lan pulsa cahya sing diasilake dening LED (Prizmatix) ditrapake liwat obyektif × 40 (0.9 NA; Olympus) kanggo ngrekam ekspresi hChR2 ing cedhak sel. Diameter lapangan sing dipadhangi kira-kira 0,5 mm lan daya total 10-20 mW. Lebar pulsa disetel dadi 10 ms, sing cocog karo pulsa sing diwenehake sajrone eksperimen sinau prilaku. Macem-macem frekuensi stimulasi digunakake, saka 1 nganti 20 Hz, nanging mung pulsa pisanan saka seri iki digunakake kanggo kuantifikasi. Interval antarane sepur biasane luwih saka 30 s kanggo nyilikake efek ing ngalangi sinaptik utawa facilitating pathways. Kanggo nguji yen respon hChR2 monosynaptic, kita nggunakake TTX (1 μM) menyang adus nganti reaksi EPSC ilang, banjur ditrapake 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Biasane, respon dibalekake sajrone sawetara menit, kanthi wektu tundha rada suwe ing antarane tembak LED lan generasi EPSC. NBQX (10 μM) digunakake kanggo nguji manawa respon kasebut didorong dening reseptor AMPA.
Bagean hCO sing cetha digawe kaya sing diterangake sadurunge. Sedhela, bagean hCO ditempelake ing 4% agarose lan ditransfer menyang sel sing ngemot 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 lan 10 mM d-(+) -0glucose ing Bagean (+) -0-glucose. µm ing suhu kamar nggunakake vibrator Leica VT1200 lan disimpen ing ASF ing suhu kamar. Banjur, rekaman patch-camp kabeh sel ditindakake ing bagean hCO ing mikroskop SliceScope langsung (Scientifica). Bagean kasebut perfused karo aCSF (95% O2 lan 5% CO2) lan sinyal sel direkam ing suhu kamar. Neuron hCO ditrapake kanthi nggunakake pipet kaca borosilikat sing diisi larutan sing ngemot 127 mM kalium glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, lan 0,6 mM EGTA, pH internal 7, 2, diatur karo KOH (osmolaritas). Kanggo tujuan pemulihan, tambahake 0,2% Biocytin menyang solusi internal.
Data dipikolehi dening Clampex (Clampex 11.1, Piranti Molekuler) nggunakake amplifier MultiClamp 700B (Piranti Molekuler) lan digitizer Digidata 1550B (Piranti Molekuler), low-pass disaring ing 2 kHz, didigitalisasi ing 20 kHz, lan dianalisis nggunakake piranti Clampfit (versi 10 lan MAT) khusus. (MATLAB 2019b, Mathworks). Potensial persimpangan diwilang nggunakake JPCalc lan entri disetel menyang potensial persimpangan sing diwilang -14 mV. Operasi IV kasusun saka seri langkah saiki ing 5-10 pA langkah saka -50 kanggo 250 pA.
Kanggo rekonstruksi morfologis neuron pinched, 0,2% biocytin (Sigma-Aldrich) ditambahake ing solusi internal. Sèl-sèl kasebut disiapake paling sethithik 15 menit sawise hacking. Pipet kasebut banjur ditarik alon-alon sajrone 1-2 menit nganti membran sing kadhaptar rampung disegel. Dipuntedahaken prosedur fisiologi bagean, bagean tetep sewengi ing 4 ° C. ing 4% PFA, sakabeheng karo PBS X3, lan diencerke 1: 1000 karo streptavidin-conjugated DyLight 549 utawa DyLight 405 (Vector Labs). Sel sing diisi biocytin (2%; Sigma-Aldrich) diwenehi label sajrone rekaman clamp patch ing suhu kamar suwene 2 jam. Bagean kasebut banjur dipasang ing slide mikroskop kanthi nggunakake Aquamount (Thermo Scientific) lan digambarake dina sabanjure ing mikroskop confocal Leica TCS SP8 nggunakake objektif kecemplung lenga kanthi aperture numerik × 40 1.3, pembesaran × 0.9-1.0, xy. Tingkat sampling kira-kira 7 piksel saben mikron. Tumpukan Z ing interval 1 µm dipikolehi kanthi serial, lan mozaik tumpukan z lan jahitan otomatis adhedhasar Leica ditindakake kanggo nutupi kabeh wit dendritik saben neuron. Neuron banjur dilacak kanthi manual nggunakake antarmuka neuTube 40 lan file SWC digawe. File kasebut banjur diunggah menyang plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versi 2.1.0; NIH).
Jaringan korteks manungsa dipikolehi kanthi persetujuan miturut protokol sing disetujoni dening Dewan Review Institusi Universitas Stanford. Loro conto jaringan postpartum manungsa (3 lan 18 taun) dijupuk kanthi reseksi korteks frontal (gyrus frontal tengah) minangka bagéan saka operasi kanggo epilepsi refraktori. Sawise reseksi, panen jaringan ing NMDG-aCSF kadhemen es sing ngemot: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukosa, 2 mM thiourea, 5 mM bate natrium 0,5 mM CaCl2 4H2O lan 10 mM MgSO4 7H2O. Titrate nganti pH 7,3-7,4 kanthi asam klorida pekat. Tisu dikirim menyang laboratorium sajrone 30 menit lan bagean koronal dijupuk miturut prosedur kasebut ing ndhuwur.
Kabeh prosedur kewan ditindakake miturut pedoman perawatan kewan sing disetujoni APLAC Universitas Stanford. Tikus (luwih saka 140 dina sawise transplantasi) diinduksi kanthi anestesi isoflurane 5% lan dibius kanthi isoflurane 1-3% intraoperatif. Kéwan diselehake ing pigura stereotaxic (Kopf) lan sustained release buprenorphine (SR) disuntikake subkutan. Tengkorak katon, di resiki lan 3-5 sekrup balung dipasang. Kanggo target t-hCO, kita ngasilake koordinat stereotaxic saka gambar MRI. Lubang burr dibor ing situs sing dikarepake lan serat (diameter 400 µm, NA 0.48, Doric) diturunake 100 µm ing ngisor permukaan hCO lan diamanake ing tengkorak kanthi semen dental sing bisa diobati UV (Relyx).
Rekaman fotometri serat ditindakake kaya sing wis diandharake sadurunge42. Kanggo ngrekam aktivitas spontan, tikus dilebokake ing kandhang sing resik lan kabel patch serat optik (Doric) diameter 400 µm sing disambungake menyang sistem akuisisi data fotometri serat optik disambungake menyang kabel serat optik sing ditanem. Sajrone rekaman aktivitas motor 10 menit, kewan kasebut bebas njelajah kandhang. Kanggo ngrekam aktivitas evoked, tikus (luwih saka 140 dina sawise transplantasi) padha anesthetized karo 5% isoflurane kanggo induksi lan 1-3% isoflurane kanggo pangopènan. Selehake kewan ing pigura stereotactic (Kopf) lan kumis ing sisih ngelawan t-hCO dipangkas nganti kira-kira 2 cm lan liwat bolong sing disambungake menyang aktuator piezoelektrik (PI). Kabel patch serat optik 400 µm (Doric) disambungake menyang serat sing ditanem lan disambungake menyang sistem akuisisi data. Kumis ing sisih ngelawan t-hCO banjur deflected 50 kaping (2 mm ing 20 Hz, 2 s saben presentation) ing kaping acak dening drive piezoelektrik liwat 20 wektu rekaman menit. Gunakake Paket Dhukungan Arduino MATLAB kanggo ngontrol wektu defleksi kanthi kode MATLAB khusus. Acara disinkronake menyang piranti lunak akuisisi data nggunakake pulsa transistor-transistor logic (TTL).
Tikus (luwih saka 140 dina sawise transplantasi) diinduksi kanthi anestesi isoflurane 5% lan dibius kanthi isoflurane 1-3% intraoperatif. Kéwan diselehake ing pigura stereotaxic (Kopf) lan buprenorphine SR lan dexamethasone disuntikake subkutan. Tengkorak katon, di resiki lan 3-5 sekrup balung dipasang. Kanggo target t-hCO, kita ngasilake koordinat stereotaxic saka gambar MRI. Craniotomy bunder (kira-kira diameteripun 1 cm) ditindakake kanthi pengeboran kacepetan dhuwur langsung liwat hCO sing ditransplantasikan. Sawise balung dadi tipis sabisa, nanging sadurunge ngebor kabeh balung, gunakake forceps kanggo mbusak cakram panggul sing isih utuh kanggo mbukak t-hCO sing ndasari. Craniotomy kapenuhan saline steril, lan tutup tutup lan pin sirah khusus ditempelake ing tengkorak karo semen dental UV-cured (Relyx).
Pencitraan rong foton ditindakake nggunakake mikroskop multifoton Bruker kanthi objektif Nikon LWD (× 16, 0.8 NA). Pencitraan GCaMP6 ditindakake ing 920 nm kanthi pembesaran z-bidang tunggal 1.4x lan rata-rata 8x 7.5 fps. Tikus diinduksi kanthi anestesi isoflurane 5% lan dijaga kanthi isoflurane 1-3%. Tikus kasebut diselehake ing piranti sirah sing digawe khusus lan dipasang ing ngisor lensa. Rekaman latar mburi 3 menit saka aktivitas motor dipikolehi. Sajrone 20 menit rekaman, 50 puffs (saben presentation dawane 100 ms) dikirim kanthi acak menyang whisker pad ngelawan t-hCO nggunakake picospricer. Gunakake Paket Dhukungan Arduino MATLAB kanggo ngontrol wektu bledosan nganggo kode MATLAB khusus. Nyelarasake acara karo piranti lunak akuisisi data (PrairieView 5.5) nggunakake pulsa TTL. Kanggo analisis, gambar kasebut didandani kanggo gerakan xy nggunakake koreksi affine ing program MoCo sing diluncurake ing Fiji. Ekstraksi jejak fluoresensi saka sel individu nggunakake CNMF-E43. Fluoresensi diekstrak kanggo saben wilayah kapentingan, diowahi dadi kurva dF/F, banjur diowahi dadi z-skor.
Tikus (luwih saka 140 dina sawise transplantasi) diinduksi kanthi anestesi isoflurane 5% lan dibius kanthi isoflurane 1-3% intraoperatif. Kéwan diselehake ing pigura stereotaxic (Kopf) lan buprenorphine SR lan dexamethasone disuntikake subkutan. Kumis ing sisih ngelawan t-hCO dipotong nganti kira-kira 2 cm lan diikat liwat bolong sing disambungake menyang aktuator piezoelektrik. Tengkorak katon lan diresiki. Sekrup lemah stainless steel dipasang ing tengkorak. Kanggo target t-hCO, kita ngasilake koordinat stereotaxic saka gambar MRI. Nindakake craniotomy bunder (kira-kira diameteripun 1 cm) kanthi pengeboran kacepetan dhuwur ing sadhuwure t-hCO. Sawise balung dadi tipis sabisa, nanging sadurunge ngebor kabeh balung, gunakake forceps kanggo mbusak cakram panggul sing isih utuh kanggo mbukak t-hCO sing ndasari. Sel individu direkam nggunakake probe silikon kapadhetan dhuwur 32-saluran utawa 64-saluran (Cambridge Neurotech) sing digandhengake karo sekrup lemah lan wis dikuatake nganggo amplifier RHD (Intan). Gunakake manipulator kanggo ngedhunake elektroda menyang situs target liwat craniotomy, sing diisi saline steril. Pangumpulan data ditindakake kanthi frekuensi 30 kHz nggunakake sistem akuisisi data Open Ephys. Rekaman kasebut diterusake mung nalika kita ndeteksi aktivitas spontan ritmik sing ana hubungane ing luwih saka saluran 10, nuduhake yen elektroda kasebut ana ing graft (adhedhasar data pencitraan kalsium rong foton). Rekaman latar mburi 10 menit saka aktivitas motor dipikolehi. Kumis ing sisih ngelawan t-hCO banjur deflected 50 kaping (2 mm ing 20 Hz, 2 s saben presentation) ing kaping acak dening drive piezoelektrik liwat 20 wektu rekaman menit. Nggunakake Paket Dhukungan MATLAB kanggo Arduino (MATLAB 2019b), ngontrol wektu defleksi nganggo kode MATLAB khusus. Gunakake pulsa TTL kanggo nyinkronake acara karo piranti lunak akuisisi data.
Kanggo eksperimen menehi tandha optik, kabel patch optik 200 µm (Doric) disambungake menyang laser 473 nm (Omicron) disambungake menyang serat optik 200 µm sing diselehake ing kraniotomi. Sanalika sadurunge iki, nyetel daya jumper kanggo 20 mW. Gunakake manipulator kanggo ngedhunake elektroda menyang situs target liwat craniotomy, sing diisi saline steril. Ing wiwitan rekaman, sepuluh pulsa cahya 473 nm (frekuensi 2 Hz, durasi pulsa 10 ms) dipancarake. Sel fotosensitif ditetepake minangka sel sing nuduhake respon spike sajrone 10 ms cahya ing 70% utawa luwih saka uji coba.