Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Biopsi cair (LB) minangka konsep sing kanthi cepet entuk popularitas ing bidang biomedis.Konsep iki utamané adhedhasar deteksi fragmen DNA ekstraselular sirkulasi (ccfDNA), sing utamané dirilis minangka pecahan cilik sawisé mati sel ing macem-macem jaringan.Sebagéyan cilik saka pecahan kasebut asalé saka jaringan utawa organisme manca (manca).Ing karya saiki, kita wis ngetrapake konsep iki kanggo kerang, spesies sentinel sing dikenal kanthi kapasitas filtrasi banyu laut sing dhuwur.Kita nggunakake kemampuan kerang kanggo tumindak minangka saringan alam kanggo njupuk pecahan DNA lingkungan saka macem-macem sumber kanggo nyedhiyani informasi bab biodiversity ekosistem pesisir segara.Asil kita nuduhake yen hemolimfa kerang ngemot pecahan DNA sing ukurane beda-beda, saka 1 nganti 5 kb.Urutan shotgun nuduhake manawa akeh pecahan DNA asale saka mikroba asing.Antarane wong-wong mau, kita nemokake fragmen DNA saka bakteri, archaea, lan virus, kalebu virus sing dikenal bisa nginfèksi macem-macem inang sing umum ditemokake ing ekosistem segara pesisir.Kesimpulane, panliten kita nuduhake yen konsep LB sing ditrapake kanggo kerang nggambarake sumber kawruh sing sugih nanging durung diteliti babagan keragaman mikroba ing ekosistem pesisir segara.
Dampak owah-owahan iklim (CC) ing keanekaragaman hayati ekosistem laut minangka wilayah riset sing berkembang kanthi cepet.Pemanasan global ora mung nyebabake stres fisiologis sing penting, nanging uga nyurung watesan evolusi stabilitas termal organisme segara, sing mengaruhi habitat sawetara spesies, nyebabake dheweke golek kahanan sing luwih apik [1, 2].Saliyane mengaruhi keanekaragaman hayati metazoans, CC ngganggu keseimbangan interaksi host-mikroba sing alus.Dysbacteriosis mikroba iki nyebabake ancaman serius kanggo ekosistem segara amarga ndadekake organisme laut luwih rentan marang patogen infèksius [3, 4].Dipercaya yen SS nduweni peran penting ing pati massal, sing dadi masalah serius kanggo manajemen ekosistem laut global [5, 6].Iki minangka masalah penting amarga pengaruh ekonomi, ekologi lan nutrisi saka akeh spesies segara.Iki utamané bener kanggo bivalves sing manggon ing wilayah kutub, ngendi efek saka CK luwih langsung lan abot [6, 7].Nyatane, bivalvia kayata Mytilus spp.digunakake kanggo ngawasi efek CC ing ekosistem segara.Ora nggumunake, jumlah biomarker sing relatif akeh dikembangake kanggo ngawasi kesehatane, asring nggunakake pendekatan rong tingkat sing nglibatake biomarker fungsional adhedhasar aktivitas enzimatik utawa fungsi seluler kayata viabilitas sel lan aktivitas fagositik [8].Cara kasebut uga kalebu pangukuran konsentrasi indikator tekanan spesifik sing nglumpukake ing jaringan alus sawise nyerep banyu segara sing akeh.Nanging, kapasitas filtrasi sing dhuwur lan sistem sirkulasi semi-mbukak saka bivalves menehi kesempatan kanggo ngembangake biomarker hemolymph anyar kanthi nggunakake konsep biopsi cair (LB), pendekatan sing prasaja lan minimally invasif kanggo manajemen pasien.sampel getih [9, 10].Sanajan sawetara jinis molekul sirkulasi bisa ditemokake ing LB manungsa, konsep iki utamane adhedhasar analisis urutan DNA saka pecahan DNA ekstraselular (ccfDNA) ing plasma.Nyatane, anané sirkulasi DNA ing plasma manungsa wis dikenal wiwit pertengahan abad kaping-20 [11], nanging mung ing taun-taun pungkasan sing munculé metode urutan throughput dhuwur wis nyebabake diagnosa klinis adhedhasar ccfDNA.Anane fragmen DNA sing sirkulasi iki amarga sebagian saka pelepasan pasif DNA genomik (nuklir lan mitokondria) sawise mati sel. Ing wong sing sehat, konsentrasi ccfDNA biasane kurang (<10 ng/mL) nanging bisa tambah 5-10 kali ing pasien sing nandhang macem-macem patologi utawa ngalami stres, nyebabake karusakan jaringan. Ing wong sing sehat, konsentrasi ccfDNA biasane kurang (<10 ng/mL) nanging bisa tambah 5-10 kali ing pasien sing nandhang macem-macem patologi utawa ngalami stres, nyebabake karusakan jaringan. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухленой utawa подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Ing wong sing sehat, konsentrasi cccDNA biasane kurang (<10 ng / mL), nanging bisa nambah kaping 5-10 ing pasien kanthi macem-macem patologi utawa ing stres sing nyebabake karusakan jaringan.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压受受压加加5倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承叛 或 承叛加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз умлица ями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Konsentrasi ccfDNA biasane kurang (<10 ng / ml) ing wong sing sehat, nanging bisa tambah 5-10 kali lipat ing pasien kanthi macem-macem patologi utawa stres, nyebabake karusakan jaringan.Ukuran fragmen ccfDNA beda-beda, nanging biasane antara 150 nganti 200 bp.[12].Analisis ccfDNA sing asale dhewe, yaiku, ccfDNA saka sel inang normal utawa diowahi, bisa digunakake kanggo ndeteksi owah-owahan genetik lan epigenetik sing ana ing genom nuklir lan / utawa mitokondria, saéngga mbantu dokter milih terapi sing ditargetake molekuler spesifik [13].Nanging, ccfDNA bisa dipikolehi saka sumber manca kayata ccfDNA saka sel janin nalika ngandhut utawa saka organ transplantasi [14,15,16,17].ccfDNA uga minangka sumber informasi penting kanggo ndeteksi anané asam nukleat saka agen infèksius (manca), sing ngidini deteksi non-invasif saka infèksi nyebar sing ora diidentifikasi dening kultur getih, ngindhari biopsi invasif saka jaringan sing kena infeksi [18].Panaliten anyar pancen nuduhake manawa getih manungsa ngemot sumber informasi sing akeh sing bisa digunakake kanggo ngenali patogen virus lan bakteri, lan udakara 1% saka ccfDNA sing ditemokake ing plasma manungsa asale saka manca [19].Panaliten kasebut nuduhake manawa biodiversitas mikrobioma sirkulasi organisme bisa ditaksir nggunakake analisis ccfDNA.Nanging, nganti saiki, konsep iki digunakake sacara eksklusif ing manungsa lan, ing tingkat sing luwih cilik, ing vertebrata liyane [20, 21].
Ing makalah iki, kita nggunakake potensial LB kanggo nganalisa ccfDNA saka Aulacomya atra, spesies kidul sing umum ditemokake ing Kapuloan Kerguelen subantarctic, klompok pulo ing ndhuwur dataran gedhe sing dibentuk 35 yuta taun kepungkur.jeblugan gunung.Nggunakake sistem eksperimen in vitro, kita nemokake manawa pecahan DNA ing banyu segara cepet dijupuk dening kerang lan mlebu ing kompartemen hemolymph.Urutan senapan nedahake manawa ccfDNA hemolymph mussel ngemot fragmen DNA sing asale dhewe lan non-diri, kalebu bakteri simbiotik lan fragmen DNA saka bioma khas ekosistem pesisir segara vulkanik sing adhem.Hemolymph ccfDNA uga ngemot urutan virus sing asale saka virus kanthi kisaran host sing beda.Kita uga nemokake pecahan DNA saka kewan multiseluler kayata iwak balung, anemone segara, ganggang lan serangga.Kesimpulane, panliten kita nuduhake yen konsep LB bisa ditrapake kanthi sukses ing invertebrata segara kanggo ngasilake repertoar genom sing sugih ing ekosistem laut.
Wong diwasa (55-70 mm dawa) Mytilus platensis (M. platensis) lan Aulacomya atra (A. atra) diklumpukake saka intertidal rocky gisik Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Kapuloan Kerguelen ing Desember 2018. Kerang biru dewasa liyane (Mytilus spp.) Dipikolehi saka pemasok komersial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) lan diselehake ing tank aerasi sing dikontrol suhu (4 ° C) sing ngemot 10-20 L saka 32‰ brine buatan.(garam laut gawean Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Kanggo saben eksperimen, dawa lan bobot cangkang individu diukur.
Protokol akses mbukak gratis kanggo program iki kasedhiya online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Sedhela, hemolymph LB diklumpukake saka otot abductor kaya sing diterangake [22].Hemolymph diklarifikasi kanthi sentrifugasi ing 1200 × g sajrone 3 menit, supernatan beku (-20 ° C) nganti digunakake.Kanggo ngisolasi lan pemurnian cfDNA, conto (1.5-2.0 ml) dicairake lan diproses nggunakake kit cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) miturut pandhuan pabrikan.ccfDNA disimpen ing -80 ° C nganti analisis luwih lanjut.Ing sawetara eksperimen, ccfDNA diisolasi lan diresiki nggunakake Kit Penyelidik DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).DNA sing dimurnèkaké diukur nganggo uji PicoGreen standar.Distribusi fragmen saka ccfDNA terisolasi dianalisis kanthi elektroforesis kapiler nggunakake bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) nggunakake Kit DNA Sensitivitas Tinggi.Assay ditindakake kanthi nggunakake 1 µl sampel ccfDNA miturut instruksi pabrikan.
Kanggo urutan fragmen hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) nyiapake perpustakaan shotgun nggunakake kit Campuran DNA Illumina saka kit Illumina MiSeq PE75.A adaptor standar (BioO) digunakake.File data mentah kasedhiya saka NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 lan SRR8924809).Kualitas maca dhasar ditaksir nggunakake FastQC [23].Trimmomatic [24] wis digunakake kanggo clipping adaptor lan kualitas apik maca.Shotgun maca kanthi ujung sing dipasangake yaiku FLASH digabung dadi siji sing luwih dawa kanthi tumpang tindih minimal 20 bp supaya ora cocog [25]. Wacan sing digabung diwènèhi anotasi karo BLASTN nggunakake basis data Taksonomi NCBI bivalve (nilai e <1e−3 lan 90% homologi), lan masking urutan kerumitan kurang ditindakake nggunakake DUST [26]. Wacan sing digabung diwènèhi anotasi karo BLASTN nggunakake basis data Taksonomi NCBI bivalve (nilai e <1e−3 lan 90% homologi), lan masking urutan kerumitan kurang ditindakake nggunakake DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчорчозлылюм 3 lan 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Wacan sing digabung karo BLASTN nggunakake basis data taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e-3 lan 90% homologi), lan masking urutan kerumitan sing kurang ditindakake nggunakake DUST [26].使用双壳类 NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数的读数，广使用 6复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 读数 ， 2复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двузвочникмча <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Wacan sing dikumpulake diwutahake karo BLASTN nggunakake basis data taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e-3 lan 90% homologi), lan masking urutan kerumitan sing kurang ditindakake nggunakake DUST [26].Wacan dipérang dadi rong klompok: sing ana hubungane karo urutan bivalve (ing kene diarani self-reads) lan ora ana hubungane (non-self-reads).Rong klompok dirakit kanthi kapisah nggunakake MEGAHIT kanggo ngasilake contigs [27].Sauntara kuwi, distribusi taksonomi mikrobioma asing diklasifikasikake nggunakake Kraken2 [28] lan diwakili kanthi grafis kanthi grafik pie Krona ing Galaxy [29, 30].Kmers optimal ditemtokake dadi kmers-59 saka eksperimen awal. Contigs dhewe banjur diidentifikasi kanthi alignment karo BLASTN (database NCBI bivalve, nilai e <1e-10 lan 60% homologi) kanggo anotasi pungkasan. Contigs dhewe banjur diidentifikasi kanthi alignment karo BLASTN (database NCBI bivalve, nilai e <1e-10 lan 60% homologi) kanggo anotasi pungkasan. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюгения с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиск, 1 мозлючения ология 60%) для окончательной аннотации. Self-contigs banjur diidentifikasi kanthi cocog karo BLASTN (database bivalve NCBI, nilai e <1e-10 lan 60% homologi) kanggo anotasi pungkasan.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别据自终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал хдмун оллюсков, значение e <1e-10 lan гомология 60%). Self-contigs banjur diidentifikasi kanggo anotasi pungkasan kanthi cocog karo BLASTN (database bivalve NCBI, nilai e <1e-10 lan 60% homologi). Ing paralel, nonself group contigs dianotasi karo BLASTN (nt database NCBI, nilai e <1e−10 lan 60% homologi). Ing paralel, nonself group contigs dianotasi karo BLASTN (nt database NCBI, nilai e <1e−10 lan 60% homologi). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 % Ing paralel, contigs klompok manca dianotasi karo BLASTN (database NT NCBI, nilai e <1e-10 lan 60% homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныгих nt 1 60%). Ing paralel, contigs non-self group dianotasi karo BLASTN (nt database NCBI, nilai e <1e-10 lan 60% homologi). BLASTX uga ditindakake ing nonself contigs nggunakake database NCBI protein nr lan RefSeq (nilai e <1e−10 lan 60% homologi). BLASTX uga ditindakake ing nonself contigs nggunakake database NCBI protein nr lan RefSeq (nilai e <1e−10 lan 60% homologi). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значологие использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значогение о 6%-10 e <1e%) BLASTX uga dileksanakake ing non-self contigs nggunakake nr lan RefSeq NCBI database protein (e nilai <1e-10 lan 60% homologi).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) BLASTX uga dileksanakake ing non-self contigs nggunakake nr lan RefSeq NCBI database protein (e nilai <1e-10 lan 60% homologi).Kolam BLASTN lan BLASTX saka non-self-contigs makili contigs pungkasan (pirsani file tambahan).
Primer sing digunakake kanggo PCR kapacak ing Tabel S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) digunakake kanggo nggedhekake gen target ccfDNA.Kondisi reaksi ing ngisor iki digunakake: denaturasi ing 95 ° C kanggo 3 menit, 95 ° C kanggo 1 menit, nyetel suhu anil kanggo 1 menit, elongation ing 72 ° C kanggo 1 menit, 35 siklus, lan pungkasanipun 72 ° C ing 10 menit..Produk PCR dipisahake kanthi elektroforesis ing gel agarose (1,5%) sing ngemot Stain Gel DNA Aman SYBRTM (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) ing 95 V.
Kerang (Mytilus spp.) diaklimatisasi ing 500 ml banyu laut beroksigen (32 PSU) suwene 24 jam ing suhu 4°C.DNA plasmid sing ngemot insert encoding urutan cDNA galectin-7 manungsa (nomer aksesi NCBI L07769) ditambahake ing vial kanthi konsentrasi pungkasan 190 μg / μl.Kerang sing diinkubasi ing kahanan sing padha tanpa tambahan DNA minangka kontrol.Tangki kontrol katelu ngemot DNA tanpa kerang.Kanggo ngawasi kualitas DNA ing banyu segara, sampel banyu laut (20 μl; telung repetisi) dijupuk saka saben tank ing wektu sing dituduhake.Kanggo traceability DNA plasmid, kerang LB dipanen ing wektu sing dituduhake lan dianalisis kanthi qPCR lan ddPCR.Amarga kandungan uyah sing dhuwur ing banyu laut, alikuot diencerake ing banyu kualitas PCR (1:10) sadurunge kabeh tes PCR.
Digital droplet PCR (ddPCR) ditindakake nggunakake protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).Gunakake profil suhu kanggo nemtokake suhu paling luweh (Tabel S1).Tetes digawe nggunakake generator gulung QX200 (BioRad).ddPCR ditindakake kaya ing ngisor iki: 95 ° C suwene 5 menit, 50 siklus 95 ° C sajrone 30 detik lan suhu anil sing diwenehake sajrone 1 menit lan 72 ° C sajrone 30 detik, 4 ° C sajrone 5 menit lan 90 ° C sajrone 5 menit.Jumlah tetes lan reaksi positif (jumlah salinan / µl) diukur nggunakake maca tetes QX200 (BioRad).Sampel sing kurang saka 10.000 tetesan ditolak.Kontrol pola ora ditindakake saben ddPCR ditindakake.
qPCR dileksanakake nggunakake Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) lan LGALS7 primers tartamtu.Kabeh PCR kuantitatif ditindakake ing 20 µl nggunakake Kit PCR Hijau SYBR QuantiFast (QIAGEN).qPCR diwiwiti kanthi inkubasi 15 menit ing 95 ° C banjur 40 siklus ing 95 ° C suwene 10 detik lan ing 60 ° C suwene 60 detik kanthi siji koleksi data.Kurva lebur digawe kanthi nggunakake pangukuran berturut-turut ing 95 ° C sajrone 5 detik, 65 ° C sajrone 60 detik, lan 97 ° C ing pungkasan qPCR.Saben qPCR dileksanakake ing telung, kajaba kanggo conto kontrol.
Wiwit kerang dikenal kanthi tingkat filtrasi sing dhuwur, mula kita nyelidiki apa bisa nyaring lan nahan pecahan DNA sing ana ing banyu segara.Kita uga kasengsem apa fragmen kasebut nglumpukake ing sistem limfatik semi-mbukak.Kita ngrampungake masalah iki kanthi eksperimen kanthi nglacak nasib pecahan DNA sing larut sing ditambahake ing tangki kerang biru.Kanggo nggampangake nelusuri fragmen DNA, kita nggunakake DNA plasmid asing (ora dhewe) sing ngemot gen galectin-7 manungsa.ddPCR nglacak fragmen DNA plasmid ing banyu laut lan kerang.Asil kita nuduhake yen jumlah fragmen DNA ing banyu segara tetep relatif konstan sajrone wektu (nganti 7 dina) tanpa ana kerang, banjur ing ngarsane kerang tingkat iki meh ilang ing 8 jam (Gambar 1a, b).Fragmen DNA eksogen gampang dideteksi sajrone 15 menit ing cairan intravalvular lan hemolymph (Gambar 1c).Pecahan iki isih bisa dideteksi nganti 4 jam sawise cahya.Aktivitas nyaring babagan fragmen DNA iki bisa dibandhingake karo aktivitas nyaring bakteri lan ganggang [31].Asil kasebut nuduhake yen kerang bisa nyaring lan nglumpukake DNA asing ing kompartemen cairan.
Konsentrasi relatif DNA plasmid ing banyu segara ing ngarsane (A) utawa ora ana (B) saka kerang, diukur dening ddPCR.Ing A, asil kasebut dituduhake minangka persentase, kanthi wates kothak nuduhake persentil kaping 75 lan 25.Kurva logaritma sing dipasang dituduhake kanthi warna abang, lan area sing diwarnai abu-abu nggambarake interval kapercayan 95%.Ing B, garis abang nuduhake rata-rata lan garis biru nuduhake interval kapercayan 95% kanggo konsentrasi.C Akumulasi DNA plasmid ing hemolymph lan cairan katup kerang ing wektu sing beda-beda sawise tambahan DNA plasmid.Asil ditampilake minangka salinan absolut sing dideteksi / mL (± SE).
Sabanjure, kita nyelidiki asal usul ccfDNA ing kerang sing diklumpukake saka amben kerang ing Kapuloan Kerguelen, sawijining klompok pulo sing adoh karo pengaruh antropogenik sing winates.Kanggo tujuan iki, cccDNA saka hemolymphs kerang diisolasi lan diresiki kanthi cara sing umum digunakake kanggo ngresiki cccDNA manungsa [32, 33].Kita nemokake yen konsentrasi hemolymph ccfDNA rata-rata ing kerang ana ing micrograms per ml kisaran hemolymph (pirsani Tabel S2, Informasi Tambahan).Kisaran konsentrasi iki luwih gedhe tinimbang wong sing sehat (nanograms saben mililiter kurang), nanging ing kasus sing jarang, ing pasien kanker, tingkat ccfDNA bisa tekan sawetara mikrogram saben mililiter [34, 35].Analisis distribusi ukuran hemolymph ccfDNA nuduhake manawa fragmen kasebut beda-beda ukurane, wiwit saka 1000 bp nganti 1000 bp.nganti 5000 bp (Fig. 2).Asil sing padha dipikolehi nggunakake Kit Penyelidik QIAamp basis silika, cara sing umum digunakake ing ilmu forensik kanggo ngisolasi lan ngresiki DNA genom kanthi cepet saka conto DNA konsentrasi rendah, kalebu ccfDNA [36].
Elektroforegram ccfDNA perwakilan saka hemolimfa kerang.Diekstrak nganggo Kit Plasma NucleoSnap (ndhuwur) lan Kit Penyelidik DNA QIAamp.B Plot biola nuduhake distribusi konsentrasi ccfDNA hemolymph (± SE) ing kerang.Garis ireng lan abang makili median lan kuartil pisanan lan katelu.
Kira-kira 1% ccfDNA ing manungsa lan primata nduweni sumber manca [21, 37].Amarga sistem sirkulasi semi-mbukak saka bivalves, banyu segara sing sugih mikroba, lan distribusi ukuran ccfDNA kerang, kita duwe hipotesis manawa ccfDNA hemolimfa kerang bisa ngemot kumpulan DNA mikroba sing sugih lan macem-macem.Kanggo nguji hipotesis iki, kita ngurutake hemolymph ccfDNA saka conto Aulacomya atra sing diklumpukake saka Kapuloan Kerguelen, ngasilake luwih saka 10 yuta maca, 97,6% sing lulus kontrol kualitas.Wacan kasebut banjur diklasifikasikake miturut sumber dhewe lan non-diri nggunakake basis data bivalve BLASTN lan NCBI (Gambar S1, Informasi Tambahan).
Ing manungsa, DNA nuklir lan mitokondria bisa dibebasake menyang aliran getih [38].Nanging, ing panliten iki, ora bisa njlentrehake kanthi rinci babagan DNA genomik nuklir saka kerang, amarga genom A. atra durung diurutake utawa diterangake.Nanging, kita bisa ngenali sawetara pecahan ccfDNA saka asal kita dhewe nggunakake perpustakaan bivalve (Fig. S2, Informasi Tambahan).Kita uga ngonfirmasi anané fragmen DNA saka asal-usul kita kanthi amplifikasi PCR sing diarahake saka gen A. atra sing diurutake (Gambar 3).Kajaba iku, amarga genom mitokondria A. atra kasedhiya ing basis data umum, siji bisa nemokake bukti anané fragmen ccfDNA mitokondria ing hemolimfa A. atra.Anane fragmen DNA mitokondria dikonfirmasi kanthi amplifikasi PCR (Gambar 3).
Macem-macem gen mitokondria ana ing hemolymph saka A. atra (titik abang - nomer saham: SRX5705969) lan M. platensis (titik biru - nomer saham: SRX5705968) digedhekake dening PCR.Gambar diadaptasi saka Breton et al., 2011 B Amplifikasi supernatan hemolimfa saka A. atra Disimpen ing kertas FTA.Gunakake pukulan 3 mm kanggo nambah langsung menyang tabung PCR sing ngemot campuran PCR.
Amarga kandungan mikroba sing akeh banget ing banyu segara, mula kita fokus ing karakterisasi urutan DNA mikroba ing hemolymph.Kanggo nindakake iki, kita nggunakake rong strategi sing beda.Strategi pisanan nggunakake Kraken2, program klasifikasi urutan adhedhasar algoritma sing bisa ngenali urutan mikroba kanthi akurasi sing bisa dibandhingake karo BLAST lan alat liyane [28].Luwih saka 6719 diwaca ditemtokake asale saka bakteri, dene 124 lan 64 saka archaea lan virus (Gambar 4).Fragmen DNA bakteri sing paling akeh yaiku Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), lan Bacteroidetes (17%) (Gambar 4a).Distribusi iki konsisten karo studi sadurunge microbiome kerang biru laut [39, 40].Gammaproteobacteria minangka kelas utama Proteobacteria (44%), kalebu akeh Vibrionales (Gambar 4b).Cara ddPCR dikonfirmasi anané fragmen DNA Vibrio ing ccfDNA saka A. atra hemolymph (Gambar 4c) [41].Kanggo njupuk informasi luwih lengkap babagan asal bakteri saka ccfDNA, pendekatan tambahan dijupuk (Gambar S2, Informasi Tambahan). Ing kasus iki, wacan sing tumpang tindih dirakit minangka wacan sing dipasangake lan diklasifikasikake minangka asal (bivalves) utawa nonself nggunakake BLASTN lan nilai e 1e−3 lan cutoff kanthi homologi> 90%. Ing kasus iki, wacan sing tumpang tindih dirakit minangka wacan sing dipasangake lan diklasifikasikake minangka asal (bivalves) utawa nonself nggunakake BLASTN lan nilai e 1e−3 lan cutoff kanthi homologi> 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы какдлуныство юски) utawa чужие по происхождению с использованием BLASTN lan значения e 1e-3 lan отсечения с гомологией> 90%. Ing kasus iki, wacan sing tumpang tindih diklumpukake minangka wacan sing dipasangake lan diklasifikasikake minangka asli (bivalve) utawa non-asli nggunakake BLASTN lan nilai e 1e-3 lan cutoff kanthi homologi> 90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 会和>90% 我家为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 使用 的 9% 和 的 和 9 % 和同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身………………….. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собстовленски и) utawa ora ana sing ora bisa ditindakake dening происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 lan порога гомологии> 90%. Ing kasus iki, wacan sing tumpang tindih diklumpukake minangka wacan sing dipasangake lan diklasifikasikake minangka dhewe (bivalves) utawa non-asli nggunakake nilai e BLASTN lan 1e-3 lan ambang homologi> 90%.Wiwit genom A. atra durung diurutake, kita nggunakake strategi perakitan de novo saka assembler MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Gunggunge 147.188 contigs wis diidentifikasi minangka gumantung (bivalves) asal.Contigs iki banjur njeblug karo e-nilai 1e-10 nggunakake BLASTN lan BLASTX.Strategi iki ngidini kita ngenali 482 pecahan non-bivalve sing ana ing A. atra ccfDNA.Luwih saka setengah (57%) fragmen DNA iki dipikolehi saka bakteri, utamane saka simbion insang, kalebu simbion sulfotrofik, lan saka simbion insang Solemya velum (Gbr. 5).
Kelimpahan relatif ing tingkat jinis.B Keragaman mikroba saka rong filum utama (Firmicutes lan Proteobacteria).Amplifikasi perwakilan ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmen gen 16S rRNA (biru) ing telung atra hemolymphs.
Gunggunge 482 contigs sing diklumpukake dianalisis.Profil umum distribusi taksonomi saka anotasi contig metagenomik (prokariota lan eukariota).B Distribusi rinci fragmen DNA bakteri sing diidentifikasi dening BLASTN lan BLASTX.
Analisis Kraken2 uga nuduhake yen ccfDNA kerang ngemot fragmen DNA archaeal, kalebu fragmen DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), lan Thaurmarcheota (11%) (Gambar 6a).Anane fragmen DNA sing asale saka Euryarchaeota lan Crenarchaeota, sing sadurunge ditemokake ing komunitas mikroba kerang California, mesthine ora kaget [42].Sanajan Euryarchaeota asring digandhengake karo kahanan sing ekstrem, saiki diakoni manawa Euryarchaeota lan Crenarcheota kalebu prokariota sing paling umum ing lingkungan kriogenik segara [43, 44].Anane mikroorganisme metanogen ing kerang ora nggumunake, amarga ana laporan anyar babagan bocor metana sing akeh saka bocor ngisor ing Dataran Tinggi Kerguelen [45] lan kemungkinan produksi metana mikroba sing diamati ing pesisir Kapuloan Kerguelen [46].
Kawigatosan kita banjur pindhah menyang maca saka virus DNA.Kanggo kawruh sing paling apik, iki minangka panaliten pertama sing ora ditargetake babagan konten virus kerang.Kaya sing dikarepake, kita nemokake fragmen DNA bakteriofag (Caudovirales) (Gambar 6b).Nanging, DNA virus sing paling umum asalé saka filum nucleocytoviruses, uga dikenal minangka nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), sing duwé génom paling gedhé saka virus apa waé.Ing filum iki, akèh-akèhé urutan DNA kalebu kulawarga Mimimidoviridae (58%) lan Poxviridae (21%), sing inang alamé kalebu vertebrata lan arthropoda, déné sapérangan cilik saka urutan DNA kasebut kalebu ganggang virologi sing dikenal.Nginfèksi ganggang eukariotik segara.Urutan kasebut uga dipikolehi saka virus Pandora, virus raksasa kanthi ukuran genom paling gedhe saka genera virus sing dikenal.Sing nggumunake, sawetara host sing dikenal kena infeksi virus, kaya sing ditemtokake dening urutan hemolymph ccfDNA, relatif gedhe (Gambar S3, Informasi Tambahan).Iki kalebu virus sing nginfeksi serangga kayata Baculoviridae lan Iridoviridae, uga virus sing nginfeksi amoeba, ganggang lan vertebrata.Kita uga nemokake urutan sing cocog karo genom Pithovirus sibericum.Pitoviruses (uga dikenal minangka "virus zombie") pisanan diisolasi saka permafrost umur 30.000 taun ing Siberia [47].Mangkono, asil kita konsisten karo laporan sadurunge sing nuduhake manawa ora kabeh spesies modern saka virus iki wis punah [48] lan virus kasebut bisa uga ana ing ekosistem laut subarctic sing adoh.
Pungkasan, kita nyoba kanggo ndeleng apa kita bisa nemokake fragmen DNA saka kewan multiselular liyane.Gunggunge 482 contigs manca diidentifikasi dening BLASTN lan BLASTX karo perpustakaan nt, nr lan RefSeq (genomik lan protein).Asil kita nuduhake yen ing antarane fragmen asing ccfDNA saka kewan multiselular DNA balung balung predominates (Gambar 5).Pecahan DNA saka serangga lan spesies liyane uga ditemokake.Bagéyan fragmen DNA sing relatif gedhé durung diidentifikasi, bisa uga amarga kurang representasi spesies segara ing basis data genomik dibandhingake karo spesies terrestrial [49].
Ing makalah iki, kita aplikasi konsep LB kanggo kerang, arguing sing hemolymph ccfDNA dijupuk urutan bisa nyedhiyani kaweruh menyang komposisi ekosistem pesisir segara.Utamane, kita nemokake yen 1) hemolymph kerang ngemot konsentrasi sing relatif dhuwur (tingkat mikrogram) saka fragmen DNA sirkulasi sing relatif gedhe (~1-5 kb);2) fragmen DNA iki loro independen lan non-independen 3) Antarane sumber asing saka fragmen DNA iki, kita nemokake DNA bakteri, archaeal lan virus, uga DNA kewan multiselular liyane;4) Akumulasi pecahan ccfDNA asing kasebut ing hemolymph dumadi kanthi cepet lan nyumbang kanggo aktivitas nyaring internal kerang.Kesimpulane, panliten kita nuduhake yen konsep LB, sing saiki wis diterapake utamane ing bidang biomedis, nyandi sumber kawruh sing sugih nanging durung ditelusuri sing bisa digunakake kanggo luwih ngerti interaksi antarane spesies sentinel lan lingkungane.
Saliyane primata, isolasi ccfDNA wis dilaporake ing mamalia, kalebu tikus, asu, kucing, lan jaran [50, 51, 52].Nanging, miturut kawruh kita, panliten kita minangka sing pertama nglaporake deteksi lan urutan ccfDNA ing spesies laut kanthi sistem sirkulasi terbuka.Fitur anatomi lan kemampuan nyaring kerang iki, paling ora sebagian, bisa nerangake karakteristik ukuran sing beda-beda saka pecahan DNA sing ana ing sirkulasi dibandhingake spesies liyane.Ing manungsa, umume fragmen DNA sing sirkulasi ing getih minangka fragmen cilik ukurane saka 150 nganti 200 bp.kanthi puncak maksimal 167 bp [34, 53].Sapérangan fragmen DNA sing cilik nanging signifikan ukurané antara 300 lan 500 bp, lan udakara 5% luwih dawa tinimbang 900 bp.[54].Alesan kanggo distribusi ukuran iki yaiku sumber utama ccfDNA ing plasma minangka akibat saka pati sel, amarga mati sel utawa amarga nekrosis sel hematopoietik sing sirkulasi ing individu sing sehat utawa amarga apoptosis sel tumor ing pasien kanker (dikenal minangka DNA tumor sirkulasi)., ctDNA).Distribusi ukuran ccfDNA hemolymph sing ditemokake ing kerang antara 1000 nganti 5000 bp, nuduhake yen ccfDNA kerang nduweni asal sing beda.Iki minangka hipotesis logis, amarga kerang duwe sistem pembuluh darah semi-mbukak lan urip ing lingkungan akuatik segara sing ngemot DNA genomik mikroba sing dhuwur.Nyatane, eksperimen laboratorium nggunakake DNA eksogen wis nuduhake yen kerang nglumpukake pecahan DNA ing banyu segara, paling ora sawise sawetara jam, dheweke bakal rusak sawise njupuk sel lan / utawa dirilis lan / utawa disimpen ing macem-macem organisasi.Amarga langka sel (loro prokariotik lan eukariotik), panggunaan kompartemen intravalvular bakal nyuda jumlah ccfDNA saka sumber dhewe uga saka sumber manca.Ngelingi pentinge kakebalan bawaan bivalve lan akeh fagosit sing sirkulasi, kita luwih ngira yen ccfDNA asing uga diperkaya ing fagosit sirkulasi sing nglumpukake DNA asing nalika ngonsumsi mikroorganisme lan/utawa puing seluler.Yen dijupuk bebarengan, asil kita nuduhake yen bivalve hemolymph ccfDNA minangka gudang unik informasi molekuler lan nguatake statuse minangka spesies sentinel.
Data kita nuduhake manawa urutan lan analisis fragmen hemolymph ccfDNA sing asale saka bakteri bisa menehi informasi penting babagan flora bakteri inang lan bakteri sing ana ing ekosistem segara ing saubengé.Techniques urutan dijupuk wis dicethakaké urutan saka bakteri commensal A. insang atra sing bakal wis ora kejawab yen cara 16S rRNA identifikasi conventional wis digunakake, amarga ing bagean bias perpustakaan referensi.Nyatane, panggunaan data LB sing diklumpukake saka M. platensis ing lapisan kerang sing padha ing Kerguelen nuduhake yen komposisi simbion bakteri sing ana gandhengane karo insang padha kanggo loro spesies kerang (Gambar S4, Informasi Tambahan).Persamaan saka rong kerang sing beda-beda sacara genetis bisa uga nggambarake komposisi komunitas bakteri ing endapan dingin, belerang, lan vulkanik ing Kerguelen [55, 56, 57, 58].Tingkat mikroorganisme sing nyuda belerang sing luwih dhuwur wis diterangake kanthi apik nalika panen kerang saka wilayah pesisir bioturbated [59], kayata pesisir Port-au-France.Kemungkinan liyane yaiku flora kerang komensal bisa kena pengaruh transmisi horisontal [60, 61].Panaliten luwih akeh dibutuhake kanggo nemtokake korélasi antara lingkungan segara, permukaan dasar laut, lan komposisi bakteri simbiosis ing kerang.Pasinaon kasebut saiki ditindakake.
Dawane lan konsentrasi ccfDNA hemolymph, gampang dimurnèkaké, lan kualitas dhuwur kanggo ngidini urutan shotgun kanthi cepet minangka sawetara kaluwihan saka nggunakake ccfDNA kerang kanggo netepake keanekaragaman hayati ing ekosistem pesisir segara.Pendekatan iki utamané efektif kanggo ciri komunitas virus (virome) ing ekosistem tartamtu [62, 63].Ora kaya bakteri, archaea, lan eukariota, genom virus ora ngemot gen sing dikonservasi sacara filogenetik kayata urutan 16S.Asil kita nuduhake yen biopsi cair saka spesies indikator kayata kerang bisa digunakake kanggo ngenali fragmen virus ccfDNA sing relatif akeh sing dikenal bisa nginfeksi inang sing biasane manggon ing ekosistem segara pesisir.Iki kalebu virus sing dikenal bisa nginfeksi protozoa, arthropoda, serangga, tanduran, lan virus bakteri (contone, bakteriofag).Distribusi sing padha ditemokake nalika kita mriksa virome hemolymph ccfDNA saka kerang biru (M. platensis) sing diklumpukake ing lapisan kerang sing padha ing Kerguelen (Tabel S2, Informasi Tambahan).Urutan shotgun saka ccfDNA pancen minangka pendekatan anyar sing entuk momentum ing sinau babagan virome manungsa utawa spesies liyane [21, 37, 64].Pendekatan iki utamané migunani kanggo nyinaoni virus DNA untai ganda, amarga ora ana gen siji-sijine sing disimpen ing antarane kabeh virus DNA untai ganda, sing makili kelas virus sing paling maneka warna lan jembar ing Baltimore [65].Sanajan umume virus iki tetep ora diklasifikasikake lan bisa uga kalebu virus saka bagean sing ora dingerteni ing jagad virus [66], kita nemokake manawa virome lan kisaran host kerang A. atra lan M. platensis ana ing antarane rong spesies kasebut.padha (ndeleng tokoh S3, informasi tambahan).Persamaan iki ora nggumunake, amarga bisa uga nggambarake kekurangan selektivitas ing penyerapan DNA sing ana ing lingkungan.Panaliten ing mangsa ngarep nggunakake RNA sing wis dimurnèkaké saiki dibutuhake kanggo njlèntrèhaké virome RNA.
Ing panaliten kita, kita nggunakake pipa banget kaku diadaptasi saka karya Kowarski lan kolega [37], sing nggunakake pambusakan loro-langkah saka pooled maos lan contigs sadurunge lan sawise perakitan ccfDNA native, asil ing babagan dhuwur saka unmapped diwaca.Mula, kita ora bisa nolak manawa sawetara wacan sing ora dipetakan iki isih duwe asal-usul dhewe, utamane amarga kita ora duwe genom referensi kanggo spesies kerang iki.Kita uga nggunakake pipa iki amarga kita prihatin babagan chimeras ing antarane maca dhewe lan non-poto lan dawa maca sing digawe dening Illumina MiSeq PE75.Alesan liya kanggo mayoritas wacan sing durung dipetakan yaiku akeh mikroba segara, utamane ing wilayah terpencil kayata Kerguelen, durung dianotasi.Kita nggunakake Illumina MiSeq PE75, kanthi nganggep dawa fragmen ccfDNA padha karo ccfDNA manungsa.Kanggo pasinaon ing mangsa ngarep, amarga asil kita nuduhake yen hemolymph ccfDNA wis maca luwih suwe tinimbang manungsa lan / utawa mamalia, disaranake nggunakake platform urutan sing luwih cocog kanggo fragmen ccfDNA sing luwih dawa.Praktek iki bakal luwih gampang kanggo ngenali indikasi liyane kanggo analisis sing luwih jero.Entuk urutan genom nuklir A. atra lengkap sing saiki ora kasedhiya uga bakal nggampangake diskriminasi ccfDNA saka sumber dhewe lan non-diri.Amarga riset kita wis fokus ing kamungkinan nglamar konsep biopsi cair kanggo kerang, kita ngarep-arep yen konsep iki digunakake ing riset mangsa, piranti anyar lan pipelines bakal dikembangaké kanggo nambah potensial saka cara iki kanggo sinau bhinéka microbial saka kerang.ekosistem laut.
Minangka biomarker klinis non-invasif, tingkat plasma manungsa sing dhuwur saka ccfDNA digandhengake karo macem-macem penyakit, karusakan jaringan, lan kondisi stres [67,68,69].Peningkatan iki digandhengake karo pelepasan fragmen DNA saka asale dhewe sawise karusakan jaringan.Kita ngatasi masalah iki kanthi nggunakake stres panas akut, ing ngendi kerang dipapar kanthi cepet ing suhu 30 °C.Kita nindakake analisis iki ing telung macem-macem jinis kerang ing telung eksperimen independen.Nanging, kita ora nemokake owah-owahan ing tingkat ccfDNA sawise stres panas akut (pirsani Gambar S5, informasi tambahan).Panemuan iki bisa uga nerangake, paling ora sebagian, kasunyatan manawa kerang duwe sistem sirkulasi semi-mbukak lan nglumpukake jumlah DNA asing sing akeh amarga aktivitas nyaring sing dhuwur.Ing tangan liyane, kerang, kaya akeh invertebrata, bisa uga luwih tahan kanggo karusakan jaringan sing disebabake stres, saéngga mbatesi pelepasan ccfDNA ing hemolimfa [70, 71].
Nganti saiki, analisis DNA babagan biodiversitas ing ekosistem akuatik utamane fokus ing metabarcoding DNA lingkungan (eDNA).Nanging, cara iki biasane diwatesi ing analisis keanekaragaman hayati nalika primer digunakake.Panggunaan shotgun sequencing circumvents watesan saka PCR lan pilihan bias set primer.Mangkono, ing pangertèn, cara kita luwih cedhak karo metode sekuensing eDNA Shotgun sing bubar digunakake, sing bisa langsung ngurutake DNA fragmentasi lan nganalisa meh kabeh organisme [72, 73].Nanging, ana sawetara masalah dhasar sing mbedakake LB saka metode eDNA standar.Mesthi, prabédan utama antarane eDNA lan LB yaiku panggunaan host filter alami.Panggunaan spesies segara kayata spons lan bivalves (Dresseina spp.) minangka panyaring alami kanggo sinau eDNA wis dilaporake [74, 75].Nanging, studi Dreissena nggunakake biopsi jaringan sing diekstrak DNA.Analisis ccfDNA saka LB ora mbutuhake biopsi jaringan, peralatan lan logistik khusus lan kadhangkala larang sing ana gandhengane karo eDNA utawa biopsi jaringan.Nyatane, kita bubar nyatakake yen ccfDNA saka LB bisa disimpen lan dianalisis kanthi dhukungan FTA tanpa njaga rantai kadhemen, sing dadi tantangan utama kanggo riset ing wilayah terpencil [76].Ekstraksi ccfDNA saka biopsi cair uga prasaja lan nyedhiyakake DNA kualitas dhuwur kanggo urutan shotgun lan analisis PCR.Iki minangka kauntungan gedhe amarga sawetara watesan teknis sing ana gandhengane karo analisis eDNA [77].Kesederhanaan lan biaya metode sampling sing murah uga cocog kanggo program pemantauan jangka panjang.Saliyane kemampuan nyaring sing dhuwur, fitur bivalves liyane sing misuwur yaiku komposisi mucopolysaccharide kimia saka lendir, sing ningkatake panyerepan virus [78, 79].Iki ndadekake bivalves minangka panyaring alami sing cocog kanggo menehi ciri keanekaragaman hayati lan dampak saka owah-owahan iklim ing ekosistem akuatik tartamtu.Sanajan anané fragmen DNA sing asalé saka inang bisa dideleng minangka watesan saka cara dibandhingake karo eDNA, biaya sing ana gandhengane karo ccfDNA asli kasebut dibandhingake karo eDNA bisa dingerteni kanthi akeh informasi sing kasedhiya kanggo pasinaon kesehatan.ngimbangi host.Iki kalebu anané urutan virus sing digabungake menyang génom host inang.Iki penting banget kanggo kerang, amarga anane retrovirus leukemia sing ditularake sacara horisontal ing bivalves [80, 81].Kauntungan liyane saka LB tinimbang eDNA yaiku ngeksploitasi aktivitas fagositik saka sirkulasi sel getih ing hemolymph, sing ngubengi mikroorganisme (lan genome).Fagositosis minangka fungsi utama sel getih ing bivalvia [82].Pungkasan, metode kasebut njupuk kauntungan saka kapasitas nyaring kerang sing dhuwur (rata-rata 1,5 l / h banyu laut) lan sirkulasi rong dina, sing nambah campuran lapisan banyu laut sing beda-beda, saéngga bisa nyekel eDNA heterolog.[83, 84].Dadi, analisis ccfDNA kerang minangka cara sing menarik amarga pengaruh nutrisi, ekonomi, lan lingkungan saka kerang.Kaya karo analisis LB sing diklumpukake saka manungsa, cara iki uga mbukak kemungkinan kanggo ngukur owah-owahan genetik lan epigenetik ing DNA inang kanggo nanggepi zat eksogen.Contone, teknologi urutan generasi katelu bisa dibayangake kanggo nindakake analisis metilasi genom ing ccfDNA asli nggunakake urutan nanopore.Proses iki kudu difasilitasi kanthi kasunyatan manawa dawa potongan ccfDNA kerang cocog karo platform urutan sing dawa diwaca sing ngidini analisis metilasi DNA genom saka siji urutan tanpa mbutuhake transformasi kimia.Mula, bisa menehi wawasan sing penting babagan mekanisme dhasar sing ngatur respon sawise paparan owah-owahan iklim utawa polutan [87].Nanging, panggunaan LB ora tanpa watesan.Ora perlu dingerteni, iki mbutuhake anané spesies indikator ing ekosistem.Kaya sing kasebut ing ndhuwur, nggunakake LB kanggo netepake keanekaragaman hayati ekosistem tartamtu uga mbutuhake pipa bioinformatika sing ketat sing nganggep anané fragmen DNA saka sumber kasebut.Masalah utama liyane yaiku kasedhiyan genom referensi kanggo spesies laut.Dikarepake yen inisiatif kayata Marine Mammal Genomes Project lan proyek Fish10k sing mentas diadegake [88] bakal nggampangake analisis kasebut ing mangsa ngarep.Aplikasi konsep LB kanggo organisme panyaring segara uga kompatibel karo kemajuan paling anyar ing teknologi urutan, saéngga cocog kanggo pangembangan biomarker multi-ohm kanggo nyedhiyakake informasi penting babagan kesehatan habitat segara kanggo nanggepi stres lingkungan.
Data urutan genom wis disimpen ing NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ing Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dampak owah-owahan iklim ing urip lan ekosistem segara.Biologi Cole.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Coba pengaruh gabungan saka owah-owahan iklim lan stres lokal liyane ing lingkungan segara.lingkungan ilmiah umum.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Ilmu pisanan Maret.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Suda toleransi panas ing kahanan stres panas sing bola-bali nerangake kematian musim panas dhuwur saka kerang biru.Laporan Ilmiah 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Owah-owahan anyar ing frekuensi, panyebab lan ombone saka pati kewan.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Akeh patogen non-spesies spesifik bisa nyebabake kematian massal Pinna nobilis.urip.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Dampak potensial saka owah-owahan iklim ing penyakit zoonosis Arktik.Int J Circumpolar kesehatan.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Kerang biru (Mytilus edulis spp.) minangka organisme sinyal ing pemantauan polusi pesisir: review.Mar Lingkungan Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasi biopsi cair ing perawatan kanker.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Kematangan biopsi cair: Ngidini DNA tumor sirkulasi.Nat Rev Kanker.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asam nukleat ing plasma manungsa.Notulen rapat anak perusahaan Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peran anyar kanggo DNA bebas sel minangka penanda molekuler kanggo perawatan kanker.Kuantifikasi analisis biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Cairan biopsi lumebu ing klinik - masalah implementasine lan tantangan mangsa.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW lan liya-liyane.DNA janin ana ing plasma lan serum ibu.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Study of course of pregnancy and its complications using circulating extracellular RNA in the blood of women during pregnancy.Dopediatrik.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsi cair: DNA tanpa sel donor digunakake kanggo ndeteksi lesi alogenik ing graft ginjel.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi ing diagnostik prenatal: urutan genom plasma ibu.Ana MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Deteksi patogen kanthi cepet kanthi urutan metagenomik generasi sabanjure saka cairan awak sing kena infeksi.Obat Nat.2021;27:115-24.