Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) minangka tanduran legum sing digunakake kanggo produksi pangan lan perbaikan lemah.Ekspansi global NLL minangka potong wis narik akeh jamur patogen, kalebu lupine anthracnose, sing nyebabake penyakit antraknosa sing ngancurake.Loro alel, Lanr1 lan AnMan, sing menehi resistensi tambah, wis digunakake ing pembiakan NLL, nanging mekanisme molekuler sing ndasari tetep ora dingerteni.Ing panliten iki, tandha Lanr1 lan AnMan digunakake kanggo nampilake conto NLL Eropa.Tes vaksin ing lingkungan sing dikontrol dikonfirmasi khasiat saka donor sing tahan.Profil ekspresi gen diferensial ditindakake ing garis sing tahan lan rentan.Resistance anthracnose digandhengake karo overexpression istilah ontologi gene "GO: 0006952 Defense Response", "GO: 0055114 Redox Process", lan "GO: 0015979 Photosynthesis".Kajaba iku, garis Lanr1 (83A: 476) nuduhake reprogramming transkriptom sing signifikan kanthi cepet sawise inokulasi, dene garis liyane nuduhake wektu tundha ing respon iki kira-kira 42 jam.Tanggepan pertahanan digandhengake karo gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR lan NBS-LRR, 10 protein sing melu patogenesis, protein transfer lipid, endoglukan-1,3-β-glucosidase, protein tembok sel sing sugih glisin, lan gen saka jalur reaktif oksigen.Tanggapan awal kanggo 83A: 476, kalebu penindasan sing ati-ati saka gen sing ana gandhengane karo fotosintesis, bertepatan karo proteksi sing sukses sajrone fase pertumbuhan vegetatif biologi jamur, sing nuduhake yen efektor nyebabake kekebalan.Reaksi Mandeloop kalem mudhun, uga seret horisontal sakabèhé.
Lupin berdaun sempit (NLL, Lupinus angustifolius L.) minangka sereal protein dhuwur sing asale saka wilayah Mediterania kulon1,2.Saiki ditanam minangka tanduran panganan kanggo kewan lan manungsa.Iki uga dianggep minangka manure ijo ing sistem rotasi potong amarga fiksasi nitrogen dening bakteri fiksasi nitrogen simbiotik lan perbaikan struktur lemah sakabèhé.NLL wis ngalami proses domestikasi kanthi cepet ing abad kepungkur lan isih ana ing tekanan breeding dhuwur3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Kanthi nyebarake NLL, suksesi jamur patogen ngembangake ceruk pertanian anyar lan nyebabake penyakit sing ngrusak panen. Sing paling luar biasa kanggo petani lan peternak lupin yaiku munculé antraknosa, sing disebabake dening jamur patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Sing paling luar biasa kanggo petani lan peternak lupin yaiku munculé antraknosa, sing disebabake dening jamur patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного памогринеров люпина было появление антракноза, вызванного памогенгринборски , Feiler & Hagedorn13. Sing paling penting kanggo petani lan peternak lupin yaiku munculé antraknosa sing disebabake jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真由病原真由病原真tric菌引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌菌病原真菌 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогего приматор Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Sing paling narik kawigaten para petani lan peternak lupin yaiku muncule antraknosa sing disebabake dening jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan paling awal saka penyakit kasebut teka saka Brasil lan Amerika Serikat, kanthi gejala khas sing muncul ing taun 1912 lan 1929.Nanging, sawise udakara 30 taun, patogen kasebut diarani Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph saka Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld ing Morfologi Target. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.lan H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.lan H. Schlenk,.Fenotipe penyakit awal sing ditindakake ing pertengahan abad kaping 20 nuduhake sawetara resistensi ing NLL lan aksesi lupin kuning (L. luteus L.), nanging kabeh aksesi lupin putih (L. albus L.) sing diuji rentan banget15,16.Panaliten nuduhake yen pangembangan anthracnose digandhengake karo tambah udan (kelembapan udhara) lan suhu (ing kisaran 12-28 ° C), sing ndadékaké nglanggar resistensi ing suhu sing luwih dhuwur17, 18. Nyatane, wektu sing dibutuhake kanggo konidia kanggo germinate lan penyakit kasebut diwiwiti, kaping papat luwih cendhek ing 24 ° C (12 jam) luwih cendhek tinimbang 24 ° C (12 jam) tinimbang 12 jam.Dadi, pemanasan global sing terus-terusan nyebabake panyebaran anthracnose.Nanging, penyakit iki diamati ing Prancis (1982) lan Ukraina (1983) minangka harbinger saka ancaman mbesuk, nanging ketoke ora digatèkaké déning industri lupine ing wektu20,21.Sawetara taun sabanjure, penyakit sing ngrusak iki nyebar ing saindenging jagad lan uga kena pengaruh negara-negara produsen lupin kayata Australia, Polandia lan Jerman22,23,24.Sawisé wabah anthracnose ing pertengahan 1990-an, skrining ekstensif ngasilake identifikasi sawetara donor tahan ing conto NLL19.Resistensi NLL kanggo antraknosa dikontrol dening rong alel dominan sing kapisah sing ditemokake ing sumber plasma nutfah sing beda: Lanr1 ing kultivar Tanjil lan Wonga lan AnMan ing kultivar.Mandalay 25, 26. Alel iki nglengkapi penanda molekuler sing ndhukung pilihan plasma nutfah tahan ing program pemuliaan25,26,27,28,29,30.Baris breeding tahan 83A: 476 mbeta alel Lanr1 iki nyabrang karo garis alam bébas rentan P27255 kanggo njupuk populasi RIL segregating kanggo resistance anthracnose, kang wis bisa kanggo nemtokake lokus Lanr1 kanggo kromosom NLL-1131, 32, 33. Alignment saka flanthracnose framework saka framework NLL-1131, 32. dicethakaké lokasi kabeh telung alel ing kromosom padha (NLL-11), nanging ing posisi beda29,34,35.Nanging, amarga jumlah RIL sing cilik lan jarak genetis sing gedhe antarane panandha lan alel sing cocog, ora ana kesimpulan sing bisa dipercaya babagan gen sing ndasari.Ing sisih liya, panggunaan genetika terbalik ing lupin angel amarga potensial regenerasi sing sithik banget, sing nggawe manipulasi genetik dadi rumit37.
Pangembangan germplasm domestik mawa alel sing dikarepake ing negara homozigot, kayata 83A: 476 (Lanr1) lan Mandelup (AnMan), wis mbukak lawang kanggo nyinaoni resistensi anthracnose nalika ngadhepi kombinasi alel sing nentang ing populasi liar.Kemungkinan mekanisme molekuler.Mbandhingake respon pertahanan sing diasilake dening genotipe tartamtu.Panliten iki ngevaluasi respon transkriptom awal NLL marang vaksinasi C. lupini.Kaping pisanan, panel plasma nutfah NLL Eropa sing ngemot 215 garis disaring nggunakake spidol molekuler sing menehi tandha alel Lanr1 lan AnMan.Fenotip anthracnose banjur ditindakake ing 50 garis NLL, sing sadurunge dipilih kanggo penanda molekuler, ing kahanan sing dikontrol.Adhedhasar eksperimen kasebut, papat garis sing beda karo resistensi anthracnose lan komposisi alel Lanr1 / AnMan dipilih kanggo profil ekspresi gen pertahanan diferensial nggunakake rong pendekatan pelengkap: urutan RNA throughput dhuwur lan kuantifikasi PCR wektu nyata.
Screening sakumpulan plasma nutfah NLL (N = 215) kanthi marker Lanr1 (Anseq3 lan Anseq4) lan AnMan (Anseq4) lan AnMan (AnManM1) nuduhake yen mung siji baris (95726, cedhak Salamanca-b) nggedhekake alel "resistansi" kanggo kabeh marker, dene "presensi sing bisa ditemokake ing kabeh tandha" .5%) garis.Telulas garis ngasilake loro alel "tahan" saka penanda Lanr1, lan 8 garis ngasilake alel "tahan" Lanr1.panandha.Alel "resistance" saka panandha AnMan (Tabel Tambahan S1).Rong garis heterozigot kanggo panandha Anseq3 lan siji heterozigot kanggo panandha AnManM1.42 garis (19,5%) nindakake fase ngelawan saka alel Anseq3 lan Anseq4, sing nuduhake frekuensi rekombinasi sing dhuwur ing antarane rong lokus kasebut.Fenotipe anthracnose ing kahanan sing dikontrol (Tabel Tambahan S2) nuduhake variasi ing resistensi genotipe sing dites, sing dibayangke ing tingkat keruwetan anthracnose.Bedane skor rata-rata yaiku saka 1,8 (tahan moderat) nganti 6,9 (rentan) lan beda bobot tanduran antara 0,62 (rentan) nganti 4,45 g (tahan). Ana korélasi sing signifikan antarane nilai sing diamati ing rong replikasi eksperimen (0.51 kanggo skor keruwetan penyakit, P = 0.00017 lan 0.61 kanggo bobot tanduran, P <0.0001) uga antarane rong paramèter kasebut (- 0.59 lan - 0.77, P <0.00). Ana korélasi sing signifikan antarane nilai sing diamati ing rong réplikasi eksperimen (0.51 kanggo skor keruwetan penyakit, P = 0.00017 lan 0.61 kanggo bobot tanduran, P <0.0001) uga antarane rong paramèter kasebut (- 0.59 lan - 0.77, P <0.77, P <0.77). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для , 0,51 для бля, 0 0017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) . Korélasi sing signifikan ditemokake ing antarane nilai sing diamati ing rong pengulangan eksperimen (0.51 kanggo skor keruwetan penyakit, P = 0.00017 lan 0.61 kanggo bobot tanduran, P <0.0001), uga ing antarane rong paramèter kasebut (- 0.59 lan -0.77, P <0.0001) .在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分不程度评分不，0示评分不，0示0. 0.61，P <0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P <0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 了 评 庆 了 5 . ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（- 0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.5–5. 9 nganti 0,77, P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести видео, 0,0,0,0,0,0,0,0 сса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Ana korélasi sing signifikan antarane nilai sing diamati ing duplikat (skor keparahan penyakit 0,51, P = 0,00017 lan bobot tanduran 0,61, P <0,0001) lan antarane rong parameter kasebut (-0,59 lan -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Gejala khas katon ing tetanduran rentan kalebu kinking lan twisting saka gagang resembling struktur "Angon kang gandhewo", ngiring dening lesi oval karo oranye / pink sporozoites (Tambahan Gambar. 1).Aksesi Australia mawa gen Lanr1 (83A:476 lan Tanjil) lan AnMan (Mandelup) cukup tahan, 0,0331 lan 0,0036).Sawetara garis sing uga nggawa "tahan" Lanr1 lan / utawa alel AnMan nuduhake gejala penyakit kasebut.
Sing nggumunake, sawetara garis NLL sing ora duwe alel penanda "tahan" nuduhake tingkat resistensi antraknosa sing dhuwur (sebanding utawa luwih dhuwur tinimbang genotipe Lanr1 utawa AnMan), kayata Boregine (Nilai P <0.0001 kanggo loro parameter kasebut), Bojar (Nilai P <0.0001 kanggo skor lan 0.001 kanggo nilai Populasi B9-5) lan 0.001 kanggo bobot tanduran. skor lan ora signifikan kanggo bobot). Sing nggumunake, sawetara garis NLL sing ora duwe alel penanda "tahan" nuduhake tingkat resistensi antraknosa sing dhuwur (sebanding utawa luwih dhuwur tinimbang genotipe Lanr1 utawa AnMan), kayata Boregine (Nilai P <0.0001 kanggo loro parameter kasebut), Bojar (Nilai P <0.0001 kanggo skor lan 0.001 kanggo nilai Populasi B9-5) lan 0.001 kanggo bobot tanduran. skor lan ora signifikan kanggo bobot). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокний констного у (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0.0001 для обои обои (х парад 0), Boregine оценки и 0,001 для массы растения) lan популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массыя). Sing nggumunake, sawetara garis NLL sing ora duwe alel penanda 'tahan' nuduhake tingkat resistensi sing dhuwur kanggo antraknosa (sebanding karo utawa luwih dhuwur tinimbang genotipe Lanr1 utawa AnMan), kayata Boregine (Nilai P <0,0001 kanggo loro parameter), Bojar (Nilai P <0,0001 kanggo evaluasi lan 0,0001 kanggo bobot tanduran lan 0,0001 kanggo bobot tanduran lan 0,0001 B / 0,001 kanggo bobot tanduran. kanggo evaluasi lan ora signifikan kanggo bobot).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗他他们一上型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，里礍片B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. Apike yen sawetara sistem NLL sing ora duwe penanda "antigenik" nuduhake resistensi horisontal sing dhuwur (padha karo gen Lanr1 utawa AnMan utawa luwih dhuwur), kayata Boregine (loro paramèter P <0,0001), Bojar (nilai P <0,0001, bobot tanduran 0,001) lan nilai galur B-549 / 70b (P) ora signifikan. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уротники внимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значе0ние P ,0, мия) популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Sing nggumunake, sawetara garis NLL sing ora duwe alel penanda 'resistansi' nuduhake tingkat resistensi antraknosa sing dhuwur (bisa dibandhingake utawa luwih dhuwur tinimbang genotipe Lanr1 utawa AnMan), kayata Boregine (Nilai P kanggo loro parameter <0,0001), Bojar (nilai P <0,0001, bobot tanduran 0,0001, lan bobot tanduran 0,000-0,001) lan bobot ora signifikan).Fenomena iki nyaranake kemungkinan sumber genetik anyar saka resistensi, nerangake kekurangan korelasi antarane genotipe panandha lan fenotipe penyakit (nilai P saka ~0.42 nganti ~0.98).Mangkono, tes Kolmogorov-Smirnov nuduhake yen data babagan resistensi anthracnose kira-kira disebarake kanthi normal kanggo skor (nilai P 0,25 lan 0,11) lan massa tanduran (nilai P 0,47 lan 0,55), sing nuduhake hipotesis manawa luwih akeh alel tinimbang Lanr1 lan AnMan.
Adhedhasar asil screening resistance anthracnose, 4 baris dipilih kanggo analisis transkriptom: 83A: 476, Boregine, Mandelup, lan Populasi 22660. Garis-garis kasebut diuji maneh kanggo resistensi antraks ing eksperimen inokulasi kanthi urutan RNA, yen padha karo tes sadurunge.Nilai skor kasebut yaiku: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) lan populasi 22660 (6,11 ± 1,29 ).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 entuk rata-rata 40.5 pasangan Mread saben sampel (29.7 nganti 54.4 Mreads) (Tabel Tambahan S3).Skor keselarasan ing urutan referensi antara 75,5% nganti 88,6%.Korélasi rata-rata data count maca antarane varian eksperimen antarane replika biologis antara 0,812 nganti 0,997 (rata-rata 0,959). Saka 35.170 gen sing dianalisis, 2917 ora nuduhake ekspresi, lan 4785 gen liyane dituduhake ing tingkat sing bisa diabaikan (rata-rata dhasar <5). Saka 35.170 gen sing dianalisis, 2917 ora nuduhake ekspresi, lan 4785 gen liyane dituduhake ing tingkat sing bisa diabaikan (rata-rata dhasar <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспресировались на тельномировались è среднее <5). Saka 35.170 gen sing dianalisis, 2917 ora nuduhake ekspresi, lan 4785 gen sing isih ana ing tingkat sing bisa diabaikan (rata-rata dhasar <5).35.17035.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнупюбискиб значение <5). Saka 35.170 gen sing dianalisis, 2917 ora diungkapake lan sisa 4785 gen duwe ekspresi sing bisa diabaikan (rata-rata dhasar <5).Dadi, jumlah gen sing dianggep dituduhake (rata-rata dhasar ≥ 5) sajrone eksperimen yaiku 27.468 (78.1%) (Tabel Tambahan S4).
Saka titik pisanan, kabeh garis NLL nanggapi inokulasi C. lupini (galur Col-08) kanthi reprogramming transkriptom (Tabel 1), Nanging, beda sing signifikan diamati ing antarane garis kasebut.Mangkono, garis resistance 83A: 476 (mbeta gen Lanr1) nuduhake reprogramming transcriptome pinunjul ing titik pisanan (6 hpi) karo Tambah 31-69-fold ing nomer terisolasi munggah- lan mudhun-gen dibandhingake titik wektu liyane ing titik wektu iki.Kajaba iku, puncak iki ora suwe, amarga ekspresi mung sawetara gen tetep owah sacara signifikan ing titik kaping pindho (12 hpi).Apike, Boregine, sing uga nuduhake tingkat resistensi sing dhuwur ing tes korupsi, ora ngalami pemrograman ulang transkripsi sing gedhe banget sajrone eksperimen kasebut.Nanging, jumlah gen sing diungkapake kanthi beda (DEG) padha kanggo Boregine lan 83A: 476 ing 12 HPI.Loro-lorone Mandelup lan populasi 22660 nuduhake puncak DEG ing titik wektu pungkasan (48 l / s), nuduhake wektu tundha relatif ing respon pertahanan.
Amarga 83A: 476 ngalami reprogramming transcriptome massive kanggo nanggepi C. lupini ing 6 HPI dibandhingake kabeh baris liyane, ~ 91% saka DEGs diamati ing titik wektu iki garis-tartamtu (Fig. 1).Nanging, ana sawetara tumpang tindih ing respon awal antarane baris sinau, minangka 68,5%, 50,9%, lan 52,6% DEG ing Boregine, Mandelup, lan populasi 22660, mungguh, tumpang tindih karo sing ditemokaké ing 83A: 476 ing titik tartamtu ing wektu.Nanging, DEGs iki mung ana pecahan cilik (0.97-1.70%) kabeh DEG sing saiki dideteksi nggunakake 83A: 476.Kajaba iku, 11 DEG saka kabeh baris padha koheren ing wektu iki (Tabel Tambahan S4-S6), kalebu komponen umum saka respon pertahanan tanduran: protein transfer lipid (TanjilG_32225), enzim endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), loro protein sing bisa diinduksi stres kaya SAM22 (TanjilG_3225 lan protein dhasar SAM22 (TanjilG_3225) 32352), lan loro protein tembok sel sing sugih glisin (TanjilG_19701 lan TanjilG_19702).Ana uga tumpang tindih relatif dhuwur ing respon transcriptome antarane 83A: 476 lan Boregine ing 24 HPI (total 16-38% DEG) lan antarane Mandelup lan Populasi 22660 ing 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagram Venn sing nuduhake jumlah gen sing diungkapake kanthi beda (DEG) ing garis lupin berdaun sempit (NLL) sing disuntik karo Colletotrichum lupini (galur Col-08 sing dipikolehi saka lapangan lupin ing Wierzhenice, Polandia, 1999).Garis NLL sing dianalisis yaiku: 83A: 476 (tahan, nggawa alel Lanr1), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), Mandelup (tahan moderat, nggawa alel AnMan) lan populasi 22660 (banget rentan).Singkatan hpi iku kanggo sawetara jam sawise vaksinasi.Nilai nol wis dibusak kanggo nyederhanakake grafik.
Set gen overexpressed ing 6 hpi dianalisis kanggo anané domain gen R kanonik (Tabel Tambahan S7).Panaliten iki ngandharake induksi transkriptom saka gen resistensi penyakit klasik kanthi domain NBS-LRR mung ing 83A: 476.Set iki kasusun saka siji gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), limang gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, lan tanjilg_16162), lan Four NBS-LR16jilg2 (Tanjilg_16162) lan Four NBS-LR16jilg2 ) uga Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) lan Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Kabeh gen iki nduweni domain kanonik sing disusun ing urutan sing dikonservasi.Saliyane gen domain NBS-LRR, sawetara kinase RLL diaktifake ing 6 hpi, yaiku siji ing Boregine (TanjilG_19877), loro ing Mandelup (TanjilG_07141 lan TanjilG_19877) lan ing populasi 22660 (TanjilG_09014 lan TanjilG_14) lan loro ing 68877.
Gen kanthi ekspresi sing diowahi sacara signifikan kanggo nanggepi inokulasi karo C. lupini (galur Col-08) ditindakake analisis pengayaan Gene Ontology (GO) (Tabel Tambahan S8). Istilah proses biologis sing paling kerep diwakili yaiku "GO: 0006952 respon pertahanan" sing muncul ing kombinasi 6 saka 16 (wektu × line) kanthi signifikansi dhuwur (nilai P <0.001) (Gambar 2). Istilah proses biologis sing paling kerep diwakili yaiku "GO: 0006952 respon pertahanan" sing muncul ing kombinasi 6 saka 16 (wektu × line) kanthi signifikansi dhuwur (nilai P <0.001) (Gambar 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный отверный» 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (c. 2). Istilah proses biologis sing paling kerep diwakili yaiku 'GO: 0006952 respon pertahanan', sing muncul ing kombinasi 6 saka 16 (wektu × garis keturunan) kanthi signifikansi dhuwur (nilai P <0.001) (Gambar 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间（时间）中一一一一一一一一一一一一一一一一上具有高显着性（P ‼< 0.001）（Gambar 2）. Istilah proses biologis sing paling representatif yaiku "GO: 0006952 respon pertahanan", sing katon ing 6 saka 16 kombinasi (时间×线), kanthi signifikansi dhuwur (nilai P <0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», соторырыл 6 поского ий (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologis sing paling kerep diwakili yaiku 'GO: 0006952 Defense Response', sing muncul ing 6 saka 16 kombinasi (wektu × baris) kanthi signifikansi dhuwur (nilai P <0.001) (Gambar 2).Istilah iki overrepresented ing rong titik wektu ing 83A: 476 lan Boregine (6 lan 24 hpi) lan ing siji wektu ing Mandelup lan Populasi 22660 (12 lan 6 hpi, mungguh).Iki minangka asil sing dikarepake, nyorot respon antijamur saka garis tahan.Kajaba iku, 83A: 476 nanggapi C. lupini kanthi cepet ngindhuksi gen sing ana hubungane karo bledosan oksidatif sing diwakili dening istilah "GO: 0055114 proses redoks", nuduhake respon pertahanan tartamtu, nalika Boregine ngumumake respon pertahanan spesifik, sing ana hubungane karo istilah 'GO'.:0006950 Tanggapan stres”.Populasi 22660 ngaktifake respon resistensi horisontal sing nglibatake metabolit sekunder, nyoroti jumlah istilah sing akeh banget "GO: 0016104 Proses biosintesis triterpene" lan "GO: 0006722 Proses metabolisme triterpene" (loro-lorone istilah kasebut kalebu gen sing padha), kanthi njupuk asil saka analisis reaksi Bondel6. Populasi2. Kajaba iku, reaksi awal 83A: 476 (6 hpi) lan reaksi telat Mandelup lan Populasi 22660 kalebu istilah GO: 0015979 'fotosintesis' lan proses biologi liyane sing gegandhengan.
Istilah ontologi gen bioproses sing dipilih ing anotasi gen sing diungkapake kanthi beda sajrone respon transkriptom saka lupine berdaun sempit (NLL) sing disuntik karo lupin anthrax (galur Col-08 sing dipikolehi saka lapangan lupin ing Wierzhenice, Polandia, ing taun 1999) saya gedhe banget.Garis NLL sing dianalisis yaiku: 83A: 476 (tahan, mawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik sing ora dingerteni), Mandelup (tahan moderat, nggawa alel AnMan homozigot) lan populasi 22660 (rentan).
Amarga panliten iki ngarahake kanggo ngenali gen sing nyumbang kanggo resistensi anthracnose, gen sing ditugasake kanggo istilah GO "GO: 0006952 Respon defensif" lan "GO: 0055114 Proses Redox" dianalisis kanthi potongan amarga garis dasar tegese ≥ 30 kanthi paling ora siji baris.× titik wektu nggabungake nilai log2 sing signifikan sacara statistik (perubahan lipatan).Jumlah gen sing cocog karo kriteria kasebut yaiku 65 kanggo GO:0006952 lan 524 kanggo GO:0055114.
83A: 476 ngungkapake rong puncak DEG sing dianotasi nganggo istilah GO: 0006952, sing pisanan ing 6 gen saben inci (64 gen, regulasi munggah lan mudhun) lan sing kapindho ing 24 gen saben inci (15 gen, mung regulasi munggah).Boregine uga nuduhake yen GO: 0006952 puncak ing titik wektu sing padha, nanging kanthi kurang DEG (11 lan 8) lan aktivasi preferensial.Mandeloop nuduhake rong puncak GO: 0006952 ing 12 lan 48 HPI, loro-lorone nggawa 12 gen (pisanan kanthi gen aktivasi, lan sing kapindho kanthi mung gen suppressive), dene populasi 22660 ing 6 HPI (13 gen) duwe dominasi sing luwih dhuwur saka puncak paningkatan.angger-angger.Perlu dicathet yen 96,4% saka GO: 0006952 DEG ing puncak kasebut nduweni jinis respon sing padha (munggah utawa mudhun), nuduhake tumpang tindih sing signifikan ing respon pertahanan sanajan beda-beda ing jumlah gen sing melu.Klompok urutan paling gedhe sing ana hubungane karo istilah GO: 0006952 nyandi Protein Pesen Starvation Stress-Associated 22 (SAM22-like), sing kalebu kelas protein kelas 10 sing ana gandhengane karo patogenesis (PR-10) lan lateks protein inti.protein sing padha (kaya MLP) protein (Gambar 3).Klompok loro kasebut beda-beda ing sifat ekspresi lan arah respon.Gen sing ngode protein kaya SAM22 nuduhake induksi sing konsisten lan signifikan ing titik wektu awal (6 utawa 12 hpi) lan umume ora responsif ing pungkasan eksperimen (48 hpi), dene protein kaya MLP nuduhake koordinasi ing 6 hpi.hpi.83A: 476 lan Mandelup ing 48 hp / ing, meh kabeh titik data liyane padha unresponsive.Kajaba iku, beda-beda ing profil ekspresi gen protein kaya SAM22 ngetutake variasi sing diamati ing resistensi antraknosa, amarga garis sing luwih tahan duwe titik wektu sing luwih akeh nyebabake gen kasebut tinimbang gen sing luwih rentan.Gen PR-10 kaya LlR18A/B liyane nuduhake pola ekspresi sing padha karo gen protein kaya SAM22.
Komponen utama istilah proses biologis "GO: 0006952 Defense Response" lan pola ekspresi gen calon saka alel Lanr1 lan AnMan diidentifikasi.Skala Log2 nggambarake nilai log2 (perubahan lipatan) antarane inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dipikolehi saka lapangan lupine, Wizhenica, Polandia, 1999) lan kontrol (sham-inoculated) tanduran ing wektu sing padha.Garis lupine narrowleaf ing ngisor iki dianalisis: 83A: 476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), Mandelup (tahan moderat, nggawa alel AnMan homozigot), lan Populasi 22660 (rentan).
Kajaba iku, profil ekspresi gen calon RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) lan AnMan (TanjilG_12861) dievaluasi (Gambar 3).Gen TanjilG_05042 nuduhake respon sing signifikan (aktivasi) ing 83A: 476 mung ing titik pisanan (6 hpi), nalika TanjilG_12861 signifikan ing Mandeloop mung ing rong titik wektu: 6 hpi (regulasi mudhun) lan 24 hpi (6 hpi).karo.).luwes)).
Gen sing paling overexpressed ing istilah GO: 0055114 "proses redoks" yaiku gen sing ngode protein sitokrom P450 lan peroksidase (Gambar 4).Kanggo conto sing diisolasi saka 83A: 476 ing 6 HPI, nilai log2 maksimum utawa minimal (kanggo 86,6% gen) umume diamati ing antarane tanduran sing diinokulasi lan kontrol, nyoroti respon dhuwur saka genotipe iki marang jinis inokulasi.83A: 476 nuduhake GO paling pinunjul: 0055114 DEG ing 6 hpi (503 gen), nalika liyane saka garis ing 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; lan Populasi 22660, 78 gen)).Ing umume gen saka kulawarga GO: 0055114, rong jinis respon kanggo vaksinasi (aktivasi lan inhibisi) diamati.Apike, nganti 97,6% saka DEG sing diidentifikasi kanggo istilah GO: 0055114 ing Mandelupe ing 48 hp.Ing Boregine lan Populasi 22660, konvergensi iki luwih murah tinimbang 51,6% lan 75,6%.
Pola ekspresi komponen utama istilah proses biologis "GO: 0055114 proses Redox" dicethakaké.Skala Log2 nggambarake nilai log2 (perubahan lipatan) antarane inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dipikolehi saka lapangan lupine, Wizhenica, Polandia, 1999) lan kontrol (sham-inoculated) tanduran ing wektu sing padha.Garis lupine narrowleaf ing ngisor iki dianalisis: 83A: 476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), Mandelup (tahan moderat, nggawa alel AnMan homozigot), lan Populasi 22660 (rentan).
83A: 476 Tanggepan transkriptomik kanggo inokulasi karo C. lupini (galur Col-08) uga kalebu silencing terkoordinasi gen sing digandhengake karo istilah GO: 0015979 "fotosintesis" lan proses biologi liyane sing gegandhengan (Gambar 5).GO:0015979 DEG set iki ngemot 105 gen sing ditindhes sacara signifikan ing 6 hpi ing 83A: 476.Ing subset iki, 37 gen uga diregulasi ing Mandelup kanthi 48 HPI lan 35 ing wektu sing padha ing populasi 22660, kalebu 19 DEG sing umum kanggo genotipe kasebut.Ora ana DEG sing ana gandhengane karo istilah GO: 0015979 diaktifake kanthi signifikan ing kombinasi apa wae (baris x wektu).
Pola ekspresi komponen utama istilah proses biologis "GO: 0015979 Fotosintesis" dicethakaké.Skala Log2 nggambarake nilai log2 (perubahan lipatan) antarane inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dipikolehi saka lapangan lupine, Wizhenica, Polandia, 1999) lan kontrol (sham-inoculated) tanduran ing wektu sing padha.Garis lupine narrowleaf ing ngisor iki dianalisis: 83A: 476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), Mandelup (tahan moderat, nggawa alel AnMan homozigot), lan Populasi 22660 (rentan).
Adhedhasar asil analisis ekspresi diferensial lan bisa uga melu respon pertahanan marang jamur patogen, set pitung gen iki dipilih kanggo kuantifikasi profil ekspresi kanthi PCR wektu nyata (Tabel Tambahan S9).
Gen protein putative TanjilG_10657 sacara signifikan diinduksi ing kabeh garis lan titik wektu sing diteliti dibandhingake karo tanduran kontrol (mimik) (Tabel Tambahan S10, S11).Kajaba iku, profil ekspresi TanjilG_10657 nuduhake tren tambah sajrone eksperimen kanggo kabeh garis.Populasi 22660 nuduhake sensitivitas paling dhuwur saka TanjilG_10657 kanggo inokulasi kanthi aktivasi 114 kali lan tingkat ekspresi relatif paling dhuwur (4.4 ± 0.4) ing 24 HPI (Gambar 6a).Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 uga nuduhake aktivasi ing kabeh garis lan titik wektu, kanthi signifikan statistik ing paling titik data (Gambar 6b).Padha karo TanjilG_10657, tingkat ekspresi relatif paling dhuwur saka TanjilG_27015 diamati ing 22660 populasi inokulasi ing 24 HPI (19,5 ± 2,4).Asam endochitinase gen TanjilG_04706 Ngartekno upregulated ing kabeh baris lan ing kabeh titik wektu kajaba Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Iki banget induksi ing titik pisanan (6 HPI) ing 83A: 476 (ing 10,5 kaping) lan moderat tambah ing baris liyane (dening 6,6-7,5 kaping).Sajrone eksperimen, ekspresi TanjilG_04706 tetep ing tingkat sing padha ing 83A: 476 lan Boregine, nalika ing Mandelup lan Populasi 22660 mundhak kanthi signifikan, tekan angka sing relatif dhuwur (5.9 ± 1.5 lan 6.2 ± 1.5, masing-masing).Gen TanjilG_23384 sing kaya endoglukan-1,3-β-glucosidase nuduhake aktivasi dhuwur ing rong titik wektu pisanan (6 lan 12 hpi) ing kabeh baris kajaba populasi 22660 (Gambar 6d).Tingkat ekspresi relatif paling dhuwur saka TanjilG_23384 diamati ing titik kaping pindho (12 hpi) ing Mandelup (2,7 ± 0,3) lan 83A: 476 (1,5 ± 0,1).Ing 24 HPI, ekspresi TanjilG_23384 relatif kurang ing kabeh baris sing ditliti (saka 0,04 ± 0,009 nganti 0,44 ± 0,12).
Profil ekspresi gen sing dipilih (ag) dicethakaké dening PCR kuantitatif.Angka 6, 12 lan 24 nuduhake jam sawise vaksinasi.Gen LanDExH7 lan LanTUB6 digunakake kanggo normalisasi lan LanTUB6 digunakake kanggo kalibrasi antar-seri.Bar kesalahan makili standar deviasi adhedhasar telung replika biologis, saben kang rata-rata telung replika technical. Signifikansi statistik beda ing tingkat ekspresi antarane inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dipikolehi ing taun 1999 saka lapangan lupine ing Wierzenica, Polandia) lan tanduran kontrol (mock-inoculated) ditandhani ing ndhuwur titik data (* P value < 0,05, ** P nilai ≤ 0,01, *** P 0,01, *** P 0,01). Signifikansi statistik beda ing tingkat ekspresi antarane inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dipikolehi ing taun 1999 saka lapangan lupine ing Wierzenica, Polandia) lan tanduran kontrol (mock-inoculated) ditandhani ing ndhuwur titik data (* P value < 0,05, ** P nilai ≤ 0,01, *** P 0,01, *** P 0,01). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен гля в 1999 г. женице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P, **, значение P < 0,05 P ≤ 0,001). Beda statistik sing signifikan ing tingkat ekspresi antarane inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi ing taun 1999 saka lapangan lupine ing Wierzhenice, Polandia) lan tanduran kontrol (sham-inoculated) kacathet ing ndhuwur titik data (* P value <0,05, ** P-value ≤ 0,01, ≤ 0, *** P-).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种義中文差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （ 接秉差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p ‼ <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученплый спо, полученный спод Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* P, **, 0,00 з, 0,000 p. ***P-значение ≤ 0,001). Beda statistik sing signifikan ing tingkat ekspresi antarane inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dipikolehi saka lapangan lupine ing Verzhenice, Polandia, ing 1999) lan tanduran kontrol (sham-inoculated) kacathet ing ndhuwur titik data (* P value < 0,05 , ** P-value ≤ 0,01 , ≤ 0, *** P-1).Garis NLL sing dianalisis yaiku: 83A: 476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan moderat, nggawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik sing ora dingerteni) lan populasi 22660 (rentan).
Gen calon TanjilG_05042 ing lokus Lanr1 nuduhake pola ekspresi sing beda banget saka profil sing dipikolehi saka studi RNA-seq (Fig. 6e).Aktivasi gen iki diamati ing Mandelup lan populasi 22660 (nganti 39,7 lan 11,7 kaping, mungguh), nyebabake tingkat ekspresi sing relatif dhuwur (nganti 1,4 ± 0,14 lan 7,2 ± 1,3, masing-masing).83A: 476 uga nuduhake sawetara upregulasi gen TanjilG_05042 (nganti 3,8 kali lipat), nanging tingkat ekspresi relatif sing diraih (0,044 ± 0,002) luwih saka 30 kali luwih murah tinimbang sing diamati ing Mandelup lan populasi 22660.dianalisis dening qPCR nuduhake prabédan pinunjul ing tingkat ekspresi antarane genotipe ing varian mock-vaksinasi (kontrol), sik njongko prabédan 58-fold antarane populasi 22660 lan 83A: 476, uga antarane populasi 22660 lan 22660. A prabédan kaping pindho wis ngrambah antarane Boregine lan Mandalup.
Gen calon ing lokus AnMan, TanjilG_12861, diaktifake kanggo nanggepi vaksinasi ing 83A: 476 lan Mandelup, netral ing populasi 22660, lan dikurangi ing Boregine (Gambar 6f).Ekspresi relatif gen TanjilG_12861 paling dhuwur ing inokulasi 83A: 476 (0.14±0.01).Gen protein kejut panas 17,4 kDa kelas I TanjilG_05080 HSP17.4 nuduhake tingkat ekspresi relatif sing luwih murah ing kabeh galur lan titik wektu sing ditliti (Fig. 6g).Nilai paling dhuwur diamati ing 24 HPI ing populasi 22660 (0,14 ± 0,02, mundhak wolung kali lipat kanggo nanggepi vaksinasi).
Perbandingan profil ekspresi gen (Gambar 7) nuduhake korélasi sing dhuwur antarane TanjilG_10657 lan papat gen liyane: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80), lan TanjilG_9 (r = 0,80), lan TanjilG_0.Asil kasebut bisa nuduhake co-regulasi gen kasebut sajrone respon pertahanan.Gen TanjilG_12861 lan TanjilG_23384 nuduhake profil ekspresi sing beda kanthi nilai koefisien korelasi Pearson sing luwih murah (saka 0,08 nganti 0,43 lan -0,19 nganti 0,28, masing-masing) dibandhingake karo gen liyane.
Korelasi antarane profil ekspresi gen dideteksi nggunakake PCR kuantitatif.Garis lupine narrowleaf ing ngisor iki dianalisis: 83A: 476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan moderat, nggawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), lan Populasi 22660 (rentan).Telung titik wektu diwilang (6, 12 lan 24 jam sawise inokulasi), kalebu inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dipikolehi saka lapangan lupine ing Wierzhenice, Polandia, ing 1999) lan kontrol (sham-inoculated) tetanduran.Skala kasebut nuduhake nilai koefisien korelasi Pearson.
Adhedhasar data sing dipikolehi ing 6 tenaga kuda saben inci, WGCNA ditindakake ing 9981 DEG sing diidentifikasi kanthi mbandhingake tanduran sing diinokulasi lan kontrol kanggo fokus ing respon pertahanan awal (Tabel Tambahan S12).Rong puluh loro modul gen (kluster) ditemokake kanthi profil ekspresi sing ana hubungane (positif utawa negatif) antarane genotipe lan varian eksperimen. Rata-rata, tingkat ekspresi gen mudhun kanthi urutan 83A: 476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging ing loro varian, tren iki luwih kuat ing tanduran kontrol). Rata-rata, tingkat ekspresi gen mudhun kanthi urutan 83A: 476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging ing loro varian, tren iki luwih kuat ing tanduran kontrol). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, одытакиеньуд, балет контрольных растений). Rata-rata, tingkat ekspresi gen mudhun ing urutan 83A: 476> Mandelup> Boregine> Populasi 22660 (ing loro varian, nanging tren iki luwih kuat ing tanduran kontrol).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 的顺序下降（然而，在两种变住照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 在 种 中中 更） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 рольных растений). Rata-rata, tingkat ekspresi gen mudhun ing seri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging, ing loro varian, tren iki luwih kuat ing tanduran kontrol).Vaksinasi nyebabake upregulation ekspresi gen, utamane ing modul 18, 19, 14, 6 lan 1 (ing urutan efek mudhun), regulasi negatif (umpamane modul 9 lan 20) utawa kanthi efek netral (umpamane modul 11, 22, 8 lan 13).Ganti Analisis Pengeluaran Terhigy (Tabel Tambahan S13) Dikandhani "Go: Modul Proteksi (18) kanthi Modul Paling Dhuwur, Tanjil_2806, Uga Tanjil_2806), uga Tanjil_2806), uga akeh modul fotosintesis paling gedhe (9) Waca rangkeng-.Konsentrator modul 18 (Gambar 8) diidentifikasi minangka gen TanjilG_26536 sing ngode protein LlR18B kaya PR-10, lan konsentrator modul 9 diidentifikasi minangka gen TanjilG_28955 sing ngode protein fotosistem II PsbQ.A calon anthracnose resistance gen Lanr1, TanjilG_05042, ditemokaké ing modul 22 (Fig. 9) lan digandhengake karo istilah "GO: 0044260 Selular pangolahan metabolis macromolecular" lan "GO: 0006355 angger-angger Transcriptional, DNA templating "mbeta hub TanjilG_01212.gen kasebut mengkode faktor transkripsi stres panas A-4a (HSFA4a).
Analisis jaringan bobot saka ekspresi gen modul karo istilah proses biologi sing overrepresented "GO: 0006952 Respon pertahanan".Ligasi disederhanakake kanggo nyorot papat gen sing dianalisis dening qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 lan TanjilG_27015).
Analisis jaringan bobot saka ekspresi gen saka modul kanthi istilah proses biologis sing overrepresented "GO: 0006355: Regulasi transkripsi, templating DNA" lan nggawa gen resistensi anthracnose calon Lanr1 TanjilG_05042.Ligasi disederhanakake kanggo ngisolasi gen TanjilG_05042 lan gen TanjilG_01212 pusat.
Skrining resistensi anthracnose sing diklumpukake ing Australia nuduhake yen umume kultivar sing dirilis awal rentan;Kalya, Coromup tuwin Mandelup kasêbut tahan agêng, dene Wonga, Tanjil tuwin 83A:476 kasêbut awrat sanget26,27,31.wis alel resistance padha, ditetepake Lanr1, lan Coromup lan Mandelup wis alel beda, ditetepake AnMan10, 26, 39, nalika Kalya liwati ing alel beda., Lan2.Screening kanggo resistensi anthracnose ing Jerman ngasilake identifikasi garis tahan Bo7212 karo alel calon liyane saka Lanr1, sing ditunjuk LanrBo36.
Panaliten kita nuduhake frekuensi sing sithik (udakara 6%) saka alel Lanr1 ing plasma nutfah sing diuji.Observasi iki konsisten karo asil screening germplasm Eropah Timur nggunakake spidol Anseq3 lan Anseq4, kang nuduhake yen alel Lanr1 mung ana ing rong baris Belarusian.Iki nuduhake manawa alel Lanr1 durung akeh digunakake dening program pemuliaan lokal, ora kaya ing Australia, sing dadi salah sawijining alel kunci kanggo breeding sing dibantu karo marker.Iki bisa uga amarga tingkat resistensi sing luwih murah sing diwenehake dening alel Lanr1 ing kahanan lapangan Eropa dibandhingake karo laporan Australia.Kajaba iku, studi babagan anthracnose ing wilayah curah udan sing dhuwur ing Australia nuduhake yen respon resistensi sing ditengahi dening alel Lanr1 bisa uga ora efektif ing kondisi cuaca sing nyengkuyung pertumbuhan lan perkembangan cepet saka pathogen19,42.Nyatane, ing panliten iki, sawetara gejala anthracnose uga diamati ing genotipe sing nggawa alel Lanr1, nuduhake yen resistensi bisa ilang ing kondisi optimal kanggo pangembangan C. lupini.Kajaba iku, interpretasi positif palsu saka anané tandha Anseq3 lan Anseq4, sing kira-kira 1 cM saka lokus Lanr1, bisa uga 28,30,43.
Panliten kita nuduhake yen 83A: 476, nggawa alel Lanr1, nanggapi inokulasi C. lupini kanthi reprogramming transkriptom skala gedhe ing titik wektu sing dianalisis pisanan (6 hpi), nalika ing Mandelup, nggawa alel AnMan, respon transkriptomi diamati luwih akeh mengko.(saka 24 kanggo 48 hp).Variasi temporal iki ing respon pertahanan digandhengake karo beda ing gejala penyakit, nyoroti pentinge pangenalan patogen awal kanggo respon sing sukses marang resistensi.Kanggo nginfèksi jaringan tanduran, spora anthrax kudu ngliwati sawetara tahap perkembangan ing permukaan inang, kalebu germinasi, divisi sel, lan pembentukan appressorium.Appendage minangka struktur infèksi sing nempel ing permukaan inang lan nggampangake penetrasi menyang jaringan inang.Mangkono, spora C. gloeosporioides ing ekstrak kacang polong nuduhake divisi pisanan saka inti sawise 75-90 menit inkubasi, pembentukan tabung kuman sawise 90-120 menit, lan penindasan sawise 4 jam 45.Mango C. gloeosporioides nuduhake luwih saka 40% germination conidial sawise 3 jam inkubasi lan kira-kira 20% tatanan saka apppressors sawise 4 jam.Gen CAP20 sing gegandhengan karo virulensi saka C. gloeosporioides nuduhake aktivitas transkripsi ing konidia pembentuk epifit sawise inkubasi 3,5 jam ing lilin permukaan alpukat kanthi konsentrasi protein CAP20 sing dhuwur sawise 4 jam 46 menit.Kajaba iku, aktivitas gen biosintesis melanin ing C. trifolii diinduksi sajrone inkubasi 2 jam banjur dibentuk appressorium sawise 1 jam.Panaliten babagan jaringan godhong nedahaken bilih stroberi ingkang dipun inokulasi kaliyan C. acutatum gadhah supresi ingkang sepisanan wonten ing 8 hpi, dene tomat ingkang dipun inokulasi kaliyan C. coccodes gadhah supresi sepisanan ing 4 hpi48,49.umume konsisten karo skala wektu Colletotrichum spp.proses infèksius.Tanggepan pertahanan cepet kanggo 83A: 476 nyaranake keterlibatan resistensi tanduran lan gen kekebalan (ETI) sing dipicu efektor ing baris iki, dene respon telat Mandelup ndhukung hipotesis kekebalan sing dipicu pola molekul mikro (MTI) 50. Tanggapan awal kanggo 83A: 476Tumpang tindih parsial ing antarane gen sing diatur munggah utawa mudhun ing respon telat uga ndhukung konsep iki, amarga ETI asring dianggep minangka respon MTI sing dipercepat lan ditingkatake sing puncake mati sel sing diprogram ing lokasi infeksi, sing dikenal minangka kejutan anafilaksis 51,52.
Umume gen sing digandhengake karo istilah sing overrepresented Gene Ontology GO: 0006952 "Tanggapan Pertahanan" yaiku 11 homolog saka pesen pasa sing disebabake stres 22 protein (padha karo SAM22) lan pitung utama sing seneng protein lateks (MLP).-kaya protein 31, 34, 43 lan 423 nuduhake podho urutan.Gen kaya SAM22 nuduhake aktivasi sing signifikan sing luwih suwe, nuduhake tingkat resistensi antraknosa (83A: 476 lan Boregine).Nanging, gen kaya MLP mung dikurangi ing garis sing nggawa alel resistensi calon (83A: 476 / Lanr1 ing 6 hpi lan Mandelup / AnMan ing 24 hpi).Perlu dicathet yen kabeh homolog kaya SAM22 sing diidentifikasi asale saka kluster gen sing dawane kira-kira 105 kb, dene gen kaya MLP asale saka wilayah genom sing kapisah.Aktivasi terkoordinasi saka gen kaya SAM22 kasebut uga ditemokake ing panaliten sadurunge babagan resistensi NLL kanggo inokulasi Diaporthetoxica, sing nuduhake yen dheweke melu komponen horisontal saka respon pertahanan.Kesimpulan iki uga didhukung dening laporan respon positif saka gen kaya SAM22 kanggo tatu utawa perawatan karo asam salisilat, induksi jamur, utawa hidrogen peroksida.
Gen kaya MLP wis ditampilake nanggapi macem-macem tekanan abiotik lan biotik, kalebu infeksi jamur bakteri, virus lan patogen ing akeh spesies tanduran55.Pandhuan kanggo nanggepi interaksi tartamtu antarane tetanduran lan patogen wiwit saka mundhak banget (yaiku, nalika infestasi kapas karo Verticillium dahliae) nganti mudhun kanthi signifikan (yaiku, sawise infeksi wit apel karo Alternaria spp.)56,57.Penurunan regulasi sing signifikan saka gen 423 kaya MLP wis diamati nalika pertahanan alpukat kanggo infeksi F. niger lan nalika infeksi wit apel Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola lan Alternaria alternata minangka pathotypes apel58,59.Kajaba iku, apple calli overexpressing gen 423 kaya MLP duwe ekspresi gen sing gegandhengan karo resistensi lan luwih rentan kanggo infeksi jamur59.Sawise Fusarium oxysporum f, gen 423 kaya MLP uga ditindhes ing plasma nutfah kacang umum sing tahan.cn.Infeksi kacang 60.
Anggota kulawarga PR-10 liyane sing diidentifikasi ing panaliten RNA-seq yaiku gen LlR18A lan LlR18B kanggo nanggepi upregulation, uga gen upregulated (1 gen) utawa downregulated (3 gen) kanggo protein transfer lipid DIR1..Kajaba iku, WGCNA nyorot gen LlR18B minangka hub ing modul iki, sing rentan banget kanggo vaksinasi lan nggawa sawetara gen respon protèktif.Gen LlR18A lan LlR18B diinduksi ing godhong lupin kuning kanggo nanggepi bakteri patogen, uga ing batang NLL sawise inokulasi D. toksika, dene homolog beras saka gen kasebut, RSOsPR10, kanthi cepet diakibatake dening infeksi jamur sing diduga melu ing jalur transpor asam jasmonic non-lipid 1,62, gen transpor lipid1,62, gen 63 lipid. sing dibutuhake kanggo wiwitan resistance sistemik (SAR).Kanthi pangembangan reaksi protèktif, protein DIR1 diangkut saka fokus infèksi liwat phloem kanggo ngindhuksi SAR ing organ sing adoh.Sing nggumunake, gen TanjilG_02313 DIR1 sacara signifikan diinduksi ing titik pisanan ing baris 84A: 476 lan Populasi 22660, nanging resistensi anthracnose dikembangake mung ing baris 84A: 476.Iki bisa uga nuduhake sawetara subfunctionalization saka gen DIR1 ing NLL, amarga telung homologues isih nanggapi inokulasi mung ing 83A: 476 baris ing 6 hpi, lan respon iki diarahake mudhun.
Ing panliten kita, komponen sing paling umum sing cocog karo proses biologis sing diarani "GO: 0055114 proses Redox" yaiku protein sitokrom P450, peroksidase, asam linoleat 9S-/13S-lipoxygenase, lan 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase.Kajaba iku, WGCNA kita nemtokake homolog HSFA4a minangka hub mawa modul kayata calon gen resistensi Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a minangka komponèn saka regulasi transkripsi nuklir sing gumantung saka redoks ing tetanduran.
Protein Cytochrome P450 minangka oksidoreduktase sing ngangkat reaksi hidroksilasi NADPH lan / utawa O2-gumantung ing metabolisme primer lan sekunder, kalebu metabolisme xenobiotik, uga hormon, asam lemak, sterol, komponen tembok sel, biopolimer, lan biosintesis senyawa protèktif 69. Ing variabilitas ing log 502 tanduran, ana owah-owahan. owah-owahan lipatan) dadi 5,7 amarga akeh homolog sing diowahi (37) lan beda pola respon antarane gen tartamtu, nggambarake revisi munggah..Mung nggunakake data RNA-seq kanggo njlentrehake fungsi biologis putative saka gen NLL ing superfamili protein sing gedhe banget bakal spekulatif banget.Nanging, perlu dicathet yen sawetara gen sitokrom P450 digandhengake karo tambah resistensi kanggo jamur utawa bakteri patogen, kalebu kontribusi kanggo reaksi alergi69,70,71.
Peroksidase kelas III minangka enzim tanduran multifungsi sing melu macem-macem proses metabolisme sajrone tuwuh lan pangembangan tanduran, uga kanggo nanggepi stres lingkungan kayata salinitas, kekeringan, intensitas cahya sing dhuwur, lan serangan patogen72.Peroksidase melu interaksi sawetara spesies tanduran karo Anthracis, kalebu Stylosanthes humilis lan C. gloeosporioides, Lens culinaris lan C. truncatum, Phaseolus vulgaris lan C. lindemuthianum, Cucumis sativus lan C. lagenarium73,74,75,76.Respon cepet banget, kadhangkala malah ing 4 HPI, sadurunge jamur nembus jaringan tanduran73.Gen peroksidase uga nanggapi inokulasi D. toxica NLL.Saliyane fungsi khas kanggo ngatur bledosan oksidatif utawa ngilangi stres oksidatif, peroksidase bisa ngganggu pertumbuhan patogen kanthi nggawe alangan fisik adhedhasar penguatan tembok sel sajrone lignifikasi, subunit utawa salib-sambungan senyawa tartamtu.Fungsi iki bisa digandhengake ing silico karo gen TanjilG_03329 sing ngodhe peroksidase anion pembentuk lignin sing dikonfigurasi sacara signifikan ing panliten kita ing garis tahan 83A: 476 ing 6 HPI, nanging ora ing galur lan titik wektu liyane sing ora nanggapi.
9S-/13S-lipoxygenase saka asam linoleat minangka langkah pisanan ing jalur oksidatif biosintesis lipid78.Produk saka jalur iki nduweni macem-macem fungsi ing pertahanan tanduran, kalebu nguatake tembok sel liwat pambentukan endapan callose lan pektin, lan regulasi stres oksidatif liwat produksi spesies oksigen reaktif79,80,81,82,83.Ing panliten iki, ekspresi asam linoleat 9S- / 13S-lipoxygenase diowahi ing kabeh galur, nanging ing populasi sing rentan 22660, upregulasi ditindakake ing titik wektu sing beda-beda, nalika ing galur sing nggawa Lanr1 lan alel AnMan sing tahan, nandheske diversifikasi reaksi protèktif anthratype ing antarane lapisan anthralipinx.
Homolog 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) sacara signifikan upregulated (9 gen) utawa downregulated (2 gen) nalika inokulasi karo lupin.Kanthi rong pangecualian, kabeh respon kasebut dumadi ing 6 hp.ing 83A:476.Reaksi enzimatik sing dimediasi dening protèin ACO minangka langkah matesi tingkat ing produksi etilena lan mulane diatur banget84.Etilena minangka hormon tanduran sing main macem-macem peran kanggo ngatur pangembangan tanduran lan nanggepi kahanan stres abiotik lan biotik.Induksi transkripsi ACO lan aktivasi jalur sinyal etilena melu nambah resistensi beras marang jamur hemibiotrophic oryzae oryzae kanthi ngatur produksi spesies oksigen reaktif lan fitoaleksin.A proses infèksi rwaning banget padha ditemokaké antarane M. oryzae lan C. lupini88,89, ing latar mburi upregulation pinunjul saka homologues ACO ing 83A: 476 baris kacarita ing panaliten iki, owah-owahan kamungkinan conferring resistance kanggo NLL anthracnose Ethylene langkah tengah signaling ing jalur molekul.
Ing panliten iki, penindasan skala gedhe saka akeh gen sing ana gandhengane karo fotosintesis diamati ing 6 hpi ing 83A: 476 lan ing 48 hpi ing Mandeloop lan populasi 22660.Tingkat lan kemajuan owah-owahan kasebut sebanding karo tingkat.Rintangan anthracnose diamati ing eksperimen iki.Bubar, penindasan sing kuat lan awal saka transkrip sing ana hubungane karo fotosintesis wis dilapurake ing sawetara model interaksi tanduran-patogen, kalebu bakteri patogen lan jamur.Cepet (saka 2 HPI ing sawetara interaksi) lan dipatèni global gen sing digandhengake karo fotosintesis kanggo nanggepi infèksi bisa micu kakebalan tanduran adhedhasar panyebaran spesies oksigen reaktif lan interaksi karo jalur asam salisilat kanggo mediasi reaksi alergi 90,94.
Kesimpulane, mekanisme respon pertahanan sing diusulake kanggo garis keturunan sing paling tahan (83A: 476) kalebu pangenalan patogen kanthi cepet dening gen R (mungkin TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) lan asam salisilat lan etilena sing dimediasi respon alergi, diterusake kanthi panyiapan SAR jarak jauh.tumindak didhukung dening protein DIR-1.Perlu dicathet menawa periode biotrofik kanggo infeksi C. lupini cendhak banget (kira-kira 2 dina), diikuti karo pertumbuhan nekrotik95.Transisi ing antarane tahapan kasebut bisa uga ana gandhengane karo nekrosis lan ekspresi protein sing bisa diinduksi etilena sing tumindak minangka pemicu reaksi hipersensitivitas ing tanduran inang.Mulane, jendhela wektu kanggo sukses nyekel C. lupini ing tahap biotrophic banget sempit.Pemrograman ulang gen sing ana hubungane karo redoks lan fotosintesis sing diamati ing 83A: 476 ing 6 hpi konsisten karo perkembangan hifa jamur lan nyatakake pangembangan respon protèktif sing sukses ing tahap biotrofik.Tanggepan transkriptomik Mandelup lan populasi 22660 bisa uga telat banget kanggo nangkep jamur sadurunge pindhah menyang pertumbuhan nekrotik, nanging Mandelup bisa uga luwih efektif tinimbang populasi 22660 amarga regulasi protein PR-10 sing relatif cepet ningkatake resistensi horisontal.
ETI, sing didorong dening gen R kanonik, katon minangka mekanisme umum kanggo resistensi kacang anthracnose.Mangkono, ing model legum Medicago truncatula, resistensi kanggo antraknosa diwenehake dening gen RCT1, anggota saka kelas gen tanduran R TIR-NBS-LRR97.Gen iki uga menehi resistensi anthracnose spektrum sing amba ing alfalfa nalika ditransfer menyang tanduran sing rentan.Ing kacang buncis umum (P. vulgaris), luwih saka rong lusin gen resistensi anthracnose wis diidentifikasi nganti saiki.Sawetara gen kasebut ditemokake ing wilayah sing ora duwe gen R kanonik, nanging akeh liyane sing ana ing pinggir kromosom sing nggawa klompok gen NBS-LRR, kalebu TIR-NBS-LRRs99.Panaliten SSR genom uga ngonfirmasi asosiasi gen NBS-LRR kanthi resistensi anthracnose ing kacang buncis.Gen R kanonik uga ditemokake ing wilayah genom mawa lokus tahan antraknosa utama ing lupin putih 101.
Pakaryan kita nuduhake yen reaksi perlawanan langsung, diaktifake ing tahap awal infeksi tanduran (luwih becik ora luwih saka 12 hpi), kanthi efektif nglindhungi lupine sing sempit saka anthracnose sing disebabake dening jamur patogen Collelotrichum lupini.Nggunakake urutan throughput dhuwur, kita nuduhake profil ekspresi diferensial gen resistensi antraknosa ing tanduran NLL sing ditengahi dening gen resistensi Lanr1 lan AnMan.Pertahanan sing sukses kalebu ngrancang kanthi ati-ati gen kanggo protein sing ana ing redoks, fotosintesis, lan patogenesis sajrone sawetara jam sawise kontak pertama tanduran karo patogen.Reaksi protèktif sing padha, nanging telat ing wektu, kurang efektif kanggo nglindhungi tetanduran saka penyakit.Resistensi anthrax sing ditengahi dening gen Lanr1 meh padha karo respon cepet khas saka gen R (kekebalan sing dipicu dening efek), dene gen AnMan sing paling mungkin menehi respon horisontal (kekebalan sing dipicu dening pola molekul sing ana gandhengane karo mikroba), nyedhiyakake tingkat kelestarian sing moderat.
215 garis NLL sing digunakake kanggo nyaring tandha antraknosa dumadi saka 74 kultivar, 60 garis sing dipikolehi kanthi nyebrang utawa breeding, 5 mutan, lan 76 germplasma liar utawa asli.Garis kasebut teka saka 17 negara, utamane saka Polandia (58), Spanyol (47), Jerman (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Italia (5) lan garis liyane.saka 10 negara.Set kasebut uga kalebu garis tahan referensi: 83A: 476, Tanjil, Wonga mawa alel Lanr1, lan Mandelup mawa alel AnMan.Garis kasebut dijupuk saka Database Sumber Daya Genetik Lupin Eropa sing dikelola dening Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polandia (Tabel Tambahan S1).
Tanduran ditanam ing kahanan sing dikontrol (fotoperiode 16 jam, suhu 25 ° C ing wayah awan lan 18 ° C ing wayah wengi).Loro replika biologi dianalisis.DNA diisolasi saka godhong umur telung minggu nggunakake Kit Mini DNeasy Plant (Qiagen, Hilden, Jerman) miturut protokol kasebut.Kualitas lan konsentrasi DNA sing diisolasi ditaksir kanthi metode spektrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Tandha AnManM1 menehi tandha gen resistensi antraknosa AnMan (asal saka cv. Mandelup) lan tandha Anseq3 lan Anseq4 sing ana ing gen Lanr1 (asal saka cv. Tanjil) dianalisis 11,26,28.Homozigot kanggo alel tahan diwenehi skor "1", rentan - minangka "0", lan heterozigot - minangka 0,5.
Adhedhasar asil screening kanggo marker AnManM1, AnSeq3 lan AnSeq4 lan kasedhiyan wiji kanggo eksperimen tindak lanjut pungkasan, 50 garis NLL dipilih kanggo fenotipe resistensi antraknosa.Analisis ditindakake kanthi duplikat ing griya ijo sing dikontrol komputer kanthi fotoperiode 14 jam kanthi kisaran suhu 22 ° C ing wayah awan lan 19 ° C ing wayah wengi.Wiji digores (ngethok jas wiji ing sisih ngelawan embrio kanthi lading sing cetha) sadurunge nyebar kanggo nyegah dormansi wiji amarga lapisan wiji dadi atos lan kanggo njamin germination seragam.Tanduran ditanam ing pot (11 × 11 × 21 cm) kanthi lemah steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Polandia).Inokulasi ditindakake kanthi galur Colletotrichum lupini Col-08, thukul ing taun 1999 saka batang tanduran lupine kanthi godhong sempit sing ditanam ing sawah ing Verzhenitsa, Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Njaluk wilayah.Isolat dibudidayakake ing medium SNA ing 20 ° C. ing cahya ireng kanggo 21 dina kanggo ngindhuksi sporulasi.Patang minggu sawise nyebar, nalika tanduran wis tekan tahap 4-6 godhong, inokulasi ditindakake kanthi nyemprotake suspensi konidia kanthi konsentrasi 0,5 x 106 konidia saben ml.Sawise inokulasi, tanduran kasebut disimpen ing peteng sajrone 24 jam kanthi kelembapan sekitar 98% lan suhu 25 ° C kanggo nggampangake germination konidia lan proses infeksi.Tetanduran kasebut banjur ditanam ing fotoperiode 14 jam kanthi suhu 22 ° C dina / 19 ° C wengi lan kelembapan 70%.Skor penyakit digawe 22 dina sawise inokulasi lan berkisar antara 0 (imun) nganti 9 (rentan banget) gumantung ana utawa ora ana lesi nekrotik ing batang lan godhong.Kajaba iku, sawise menehi skor, bobot tanduran diukur.Hubungan antarane genotipe panandha lan fenotipe penyakit diitung minangka korélasi loro-urutan titik (ora ana tandha heterozigot ing set garis kanggo analisis fenotipe resistensi anthracnose).