Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Ana perlu kanggo sistem in vitro dipercaya sing bisa kanthi akurat ngasilake lingkungan fisiologis jantung kanggo tes obat.Kasedhiya sistem kultur jaringan jantung manungsa sing winates nyebabake interpretasi efek obat jantung sing ora akurat.Ing kene, kita wis ngembangake model kultur jaringan jantung (CTCM) sing sacara elektromekanik ngrangsang irisan jantung lan ngalami regangan fisiologis sajrone fase sistolik lan diastolik saka siklus jantung.Sawise 12 dina budaya, pendekatan iki sebagian nambah viabilitas bagean jantung, nanging ora bisa njaga integritas struktural.Mulane, sawise screening molekul cilik, kita nemokake yen tambahan 100 nM triiodothyronine (T3) lan 1 μM dexamethasone (Dex) menyang medium kita njaga mikrostruktur bagean kasebut sajrone 12 dina.Ing kombinasi karo perawatan T3 / Dex, sistem CTCM njaga profil transkripsi, viabilitas, aktivitas metabolik, lan integritas struktural ing tingkat sing padha karo jaringan jantung seger sajrone 12 dina.Kajaba iku, peregangan jaringan jantung sing berlebihan ing budaya nyebabake sinyal jantung hipertrofik, nyedhiyakake bukti kemampuan CTCM kanggo niru kahanan hipertrofik sing disebabake dening peregangan jantung.Kesimpulane, CTCM bisa menehi model fisiologi lan patofisiologi jantung ing budaya sajrone wektu sing suwe, ngidini screening obat sing dipercaya.
Sadurunge riset klinis, dibutuhake sistem in vitro sing dipercaya sing bisa ngasilake lingkungan fisiologis jantung manungsa kanthi akurat.Sistem kasebut kudu niru regangan mekanik, detak jantung, lan sifat elektrofisiologis sing diowahi.Model kewan umume digunakake minangka platform screening kanggo fisiologi jantung kanthi linuwih winates ing nggambarake efek obat ing jantung manungsa1,2.Pungkasane, Model Eksperimen Budaya Tisu Jantung Ideal (CTCM) minangka model sing sensitif banget lan spesifik kanggo macem-macem intervensi terapeutik lan farmakologis, kanthi akurat ngasilake fisiologi lan patofisiologi jantung manungsa3.Ora ana sistem kasebut mbatesi panemuan perawatan anyar kanggo gagal jantung4,5 lan nyebabake kardiotoksisitas obat minangka alasan utama kanggo metu saka pasar6.
Sajrone dekade kepungkur, wolung obat non-kardiovaskular wis ditarik saka panggunaan klinis amarga nyebabake pemanjangan interval QT sing nyebabake aritmia ventrikel lan pati dadakan7.Mangkono, ana kabutuhan tambah kanggo strategi screening praklinis sing dipercaya kanggo netepake khasiat lan keracunan kardiovaskular.Panggunaan kardiomiosit sing asale saka sel induk pluripotent sing diakibatake manungsa (hiPS-CM) ing screening obat lan tes keracunan nyedhiyakake solusi parsial kanggo masalah iki.Nanging, sifat hiPS-CM sing durung dewasa lan kekurangan kerumitan multiselular jaringan jantung minangka watesan utama metode iki.Panaliten anyar nuduhake manawa watesan iki bisa diatasi kanthi nggunakake hiPS-CM awal kanggo mbentuk hidrogel jaringan jantung sakcepete sawise kontraksi spontan lan nambah stimulasi listrik kanthi bertahap.Nanging, microtissues hiPS-CM iki ora nduweni sifat electrophysiological lan contractile diwasa saka miokardium diwasa.Kajaba iku, jaringan jantung manungsa nduweni struktur sing luwih kompleks, kalebu campuran heterogen saka macem-macem jinis sel, kalebu sel endothelial, neuron, lan fibroblast stromal, sing disambungake dening set spesifik protein matriks ekstraselular.Heterogenitas populasi non-kardiomiosit11,12,13 ing jantung mamalia diwasa minangka penghalang utama kanggo model jaringan jantung nggunakake jinis sel individu.Watesan utama iki nandheske pentinge ngembangake metode kanggo kultur jaringan miokard sing utuh ing kahanan fisiologis lan patologis.
Bagean jantung manungsa sing dibudidaya kanthi tipis (300 µm) wis kabukten minangka model miokardium manungsa sing apik.Cara iki nyedhiyakake akses menyang sistem multiselular 3D lengkap sing padha karo jaringan jantung manungsa.Nanging, nganti 2019, panggunaan bagean jantung kultur diwatesi dening kaslametan budaya sing cendhak (24 jam).Iki amarga sawetara faktor kalebu lack of fisik-mekanik stretch, antarmuka udara-cair, lan nggunakake media prasaja sing ora ndhukung kabutuhan jaringan jantung.Ing 2019, sawetara klompok riset nuduhake manawa nggabungake faktor mekanik menyang sistem kultur jaringan jantung bisa nambah umur kultur, nambah ekspresi jantung, lan niru patologi jantung.Rong studi elegan 17 lan 18 nuduhake yen beban mekanik uniaxial duweni efek positif marang fenotipe jantung sajrone kultur.Nanging, studi kasebut ora nggunakake beban fisiko-mekanik dinamis telung dimensi saka siklus jantung, amarga bagean jantung diisi karo gaya tarik isometrik 17 utawa beban auxotonic linear 18.Cara peregangan jaringan iki nyebabake nyuda akeh gen jantung utawa overexpression gen sing ana gandhengane karo respon regangan sing ora normal.Utamane, Pitoulis et al.19 ngembangake adus budaya irisan jantung dinamis kanggo rekonstruksi siklus jantung nggunakake umpan balik transduser pasukan lan drive tension.Sanajan sistem iki ngidini modeling siklus jantung in vitro sing luwih akurat, kerumitan lan throughput sing kurang saka metode kasebut mbatesi aplikasi sistem iki.Laboratorium kita bubar ngembangake sistem kultur sing disederhanakake nggunakake stimulasi listrik lan medium sing dioptimalake kanggo njaga kelangsungan bagean daging babi lan jaringan jantung manungsa nganti 6 dina20,21.
Ing manuskrip saiki, kita njlèntrèhaké model kultur jaringan jantung (CTCM) nggunakake bagean jantung babi sing nggabungake isyarat humoral kanggo rekapitulasi fisiologi jantung telung dimensi lan distensi patofisiologis sajrone siklus jantung.CTCM iki bisa nambah akurasi prediksi obat pra-klinis menyang tingkat sing durung tau digayuh kanthi nyedhiyakake sistem jantung mid-throughput sing hemat biaya sing niru fisiologi / patofisiologi jantung mamalia kanggo tes obat pra-klinis.
Sinyal mekanik hemodinamik nduweni peran penting kanggo njaga fungsi kardiomiosit ing vitro 22,23,24.Ing manuskrip saiki, kita wis ngembangake CTCM (Gambar 1a) sing bisa niru lingkungan jantung diwasa kanthi ngindhuksi stimulasi listrik lan mekanik ing frekuensi fisiologis (1.2 Hz, 72 denyut per menit).Kanggo ngindhari regangan jaringan sing gedhe banget sajrone diastole, piranti cetak 3D digunakake kanggo nambah ukuran jaringan kanthi 25% (Gambar 1b).Pacing listrik sing diakibatake dening sistem C-PACE diwenehi wektu kanggo miwiti 100 ms sadurunge systole nggunakake sistem akuisisi data kanggo ngasilake siklus jantung kanthi lengkap.Sistem kultur jaringan nggunakake aktuator pneumatik sing bisa diprogram (LB Engineering, Jerman) kanggo nggedhekake membran silikon fleksibel kanthi siklus kanggo nyebabake ekspansi irisan jantung ing ruang ndhuwur.Sistem kasebut disambungake menyang saluran udara eksternal liwat transduser tekanan, sing bisa nyetel tekanan kanthi akurat (± 1 mmHg) lan wektu (± 1 ms) (Gambar 1c).
a Pasang bagean tissue menyang ring support 7 mm, ditampilake ing biru, nang kamar budaya piranti.Kamar budaya dipisahake saka kamar udara kanthi membran silikon fleksibel sing tipis.Pasang gasket ing antarane saben kamar kanggo nyegah bocor.Tutup piranti kasebut ngemot elektroda grafit sing nyedhiyakake stimulasi listrik.b Perwakilan skematis saka piranti tissue gedhe, ring guide lan ring support.Bagean tissue (coklat) diselehake ing piranti kegedhen karo ring guide diselehake ing alur ing pinggiran njaba piranti.Nggunakake pandhuan kasebut, kanthi ati-ati nyelehake cincin dhukungan sing dilapisi adesif akrilik jaringan ing bagean jaringan jantung.c Grafik sing nuduhake wektu stimulasi listrik minangka fungsi tekanan ruang udara sing dikontrol dening aktuator pneumatik sing bisa diprogram (PPD).Piranti akuisisi data digunakake kanggo nyinkronake stimulasi listrik nggunakake sensor tekanan.Nalika tekanan ing kamar budaya tekan ambang sing disetel, sinyal pulsa dikirim menyang C-PACE-EM kanggo micu stimulasi listrik.d Gambar papat CTCM diselehake ing rak inkubator.Papat piranti disambungake menyang siji PPD liwat sirkuit pneumatik, lan sensor tekanan dilebokake ing katup hemostatic kanggo ngawasi tekanan ing sirkuit pneumatik.Saben piranti ngandhut enem bagean tissue.
Nggunakake aktuator pneumatik siji, kita bisa ngontrol 4 piranti CTCM, sing saben bisa nyekel 6 bagean jaringan (Fig. 1d).Ing CTCM, tekanan udara ing ruang udara diowahi dadi tekanan sinkron ing ruang cairan lan nyebabake ekspansi fisiologis irisan jantung (Gambar 2a lan Film Tambahan 1).Evaluasi regangan jaringan ing 80 mm Hg.Art.nuduhake peregangan bagean jaringan kanthi 25% (Fig. 2b).Regangan persentase iki wis ditampilake cocog karo dawa sarkomer fisiologis 2.2-2.3 µm kanggo kontraktilitas bagean jantung normal17,19,25.Gerakan jaringan ditaksir nggunakake setelan kamera khusus (Tambahan Gambar 1).Amplitudo lan kecepatan gerakan jaringan (Gambar 2c, d) cocog kanggo babagan sajrone siklus jantung lan wektu sajrone systole lan diastole (Gambar 2b).Peregangan lan kecepatan jaringan jantung sajrone kontraksi lan relaksasi tetep konstan sajrone 12 dina ing kultur (Gambar 2f).Kanggo ngevaluasi efek stimulasi listrik ing kontraktilitas sajrone kultur, kita ngembangake metode kanggo nemtokake deformitas aktif nggunakake algoritma shading (Tambahan Gambar 2a, b) lan bisa mbedakake antarane deformitas kanthi lan tanpa stimulasi listrik.Bagean jantung sing padha (Gambar 2f).Ing wilayah sing bisa dipindhah saka potong (R6-9), voltase sajrone stimulasi listrik 20% luwih dhuwur tinimbang ora ana stimulasi listrik, sing nuduhake kontribusi stimulasi listrik kanggo fungsi kontraksi.
Tilak perwakilan tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, lan pangukuran gerakan jaringan ngonfirmasi yen tekanan kamar ngganti tekanan ruang cairan, nyebabake gerakan irisan jaringan sing cocog.b Representative tilas saka persen regane (biru) saka tissue bagean cocog persen regane (oranye).c Gerakan sing diukur saka irisan jantung konsisten karo kacepetan gerakan sing diukur.(d) Perwakilan lintasan gerakan siklik (garis biru) lan kecepatan (garis putus-putus oranye) ing irisan jantung.e Kuantifikasi wektu siklus (n = 19 irisan saben klompok, saka babi sing beda-beda), wektu kontraksi (n = 19 irisan saben kelompok), wektu relaksasi (n = 19 irisan saben kelompok, saka babi sing beda), gerakan jaringan (n = 25).irisan)/kelompok saka babi sing beda-beda), kecepatan sistolik puncak (n = 24(D0), 25(D12) irisan/kelompok saka babi sing beda) lan tingkat relaksasi puncak (n=24(D0), 25(D12) irisan/kelompok saka babi sing beda).Uji t Student two-tailed nuduhake ora ana bedane sing signifikan ing parameter apa wae.f Analisis galur perwakilan ngambah bagean jaringan kanthi stimulasi listrik (abang) lan tanpa (biru), sepuluh wilayah regional bagean jaringan saka bagean sing padha.Panel ngisor nuduhake kuantifikasi saka persentasi prabédan ing galur ing bagean tissue karo lan tanpa stimulasi electrical ing sepuluh wilayah saka bagean beda. (n = 8 irisan / klompok saka babi sing beda, Two-tailed Student t-test ditindakake; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). (n = 8 irisan / klompok saka babi sing beda, Two-tailed Student t-test ditindakake; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 bagean / klompok saka babi sing beda-beda, uji t Siswa loro-buntut; **** p<0,0001, ** p <0,01, * p <0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, saka разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bagean / klompok, saka babi sing beda-beda, uji t Siswa loro-buntut; **** p <0,0001, ** p <0,01, * p <0,05).Bar kesalahan nuduhake rata-rata ± standar deviasi.
Ing sistem kultur irisan jantung biomimetik statis sadurunge [20, 21], kita njaga viabilitas, fungsi, lan integritas struktural irisan jantung sajrone 6 dina kanthi nggunakake stimulasi listrik lan ngoptimalake komposisi medium.Nanging, sawise 10 dina, angka kasebut mudhun banget.Kita bakal ngrujuk menyang bagean sing dibudidayakake ing sistem kultur biomimetik statis sadurunge 20, 21 kahanan kontrol (Ctrl) lan kita bakal nggunakake media sing wis dioptimalake sadurunge minangka kahanan lan budaya MC ing stimulasi mekanik lan listrik (CTCM) bebarengan.diarani .Kaping pisanan, kita nemtokake manawa stimulasi mekanik tanpa stimulasi listrik ora cukup kanggo njaga daya tahan jaringan sajrone 6 dina (Tambahan Gambar 3a, b).Apike, kanthi introduksi stimulasi fisio-mekanik lan listrik nggunakake STCM, daya tahan bagean jantung 12 dina tetep padha karo bagean jantung sing seger ing kondisi MS, nanging ora ing kondisi Ctrl, kaya sing dituduhake dening analisis MTT (Gambar 1).3a).Iki nuduhake yen stimulasi mekanik lan simulasi siklus jantung bisa njaga bagean jaringan sing sregep kaping pindho kaya sing dilaporake ing sistem kultur statis sadurunge.Nanging, penilaian integritas struktural bagean jaringan kanthi immunolabeling troponin jantung T lan connexin 43 nuduhake yen ekspresi connexin 43 luwih dhuwur ing jaringan MC ing dina 12 tinimbang kontrol ing dina sing padha.Nanging, ekspresi connexin 43 seragam lan tatanan Z-disc ora dikelola kanthi lengkap (Gambar 3b).Kita nggunakake kerangka intelijen buatan (AI) kanggo ngitung integritas struktur jaringan26, pipa pembelajaran jero adhedhasar gambar adhedhasar pewarnaan troponin-T lan connexin43 kanggo ngitung integritas struktur lan fluoresensi irisan jantung kanthi otomatis babagan kekuatan lokalisasi.Cara iki nggunakake Convolutional Neural Network (CNN) lan kerangka sinau jero kanggo andal ngitung integritas struktural jaringan jantung kanthi otomatis lan ora bias, kaya sing diterangake ing referensi.26. Jaringan MC nuduhake podho struktural sing luwih apik kanggo dina 0 dibandhingake karo bagean kontrol statis.Kajaba iku, pewarnaan trichrome Masson nuduhake persentase fibrosis sing luwih murah ing kondisi MS dibandhingake karo kondisi kontrol ing dina 12 budaya (Fig. 3c).Nalika CTCM nambah daya tahan bagean jaringan jantung ing dina 12 nganti tingkat sing padha karo jaringan jantung sing seger, ora sacara signifikan ningkatake integritas struktural bagean jantung.
Grafik batang nuduhake kuantifikasi daya tahan MTT saka irisan jantung seger (D0) utawa kultur irisan jantung sajrone 12 dina ing kultur statis (D12 Ctrl) utawa ing CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan / klompok saka siji cara D## p, lan <12 MC (D12 MC) irisan / kelompok saka AN##p lan <1 cara sing beda-beda. **p <0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl). Grafik batang nuduhake kuantifikasi daya tahan MTT saka irisan jantung seger (D0) utawa kultur irisan jantung sajrone 12 dina ing kultur statis (D12 Ctrl) utawa ing CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) irisan / klompok saka ##0. lan **p <0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl).histogram nuduhake kuantifikasi daya tahan MTT bagean jantung seger (D0) utawa budaya bagean jantung kanggo 12 dina ing salah siji kultur statis (kontrol D12) utawa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12). ) ), 12 (D12 MC) bagean / klompok dileksanakake siji-waya babi ANOVA, a.####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001 dibandhingake karo D0 lan **p <0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切幇(D12 MC) 幇(D0) 片12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与 D0 ， 与与 D0 ， tr000 D0.相比，**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 猇(D12 MC) 12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogram sing nuduhake kuantifikasi daya tahan MTT ing bagean jantung seger (D0) utawa bagean jantung sing dibudidaya sajrone 12 dina ing kultur statis (kontrol D12) utawa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12)), 12 (D12 MC) bagean / klompok saka tes ANOVA siji-wayah, siji-wayah test ANOVA;####p < 0,0001 saka сравнению с D0, **p < 0,01 saka сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001 dibandhingake karo D0, **p <0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl).b Troponin-T (ijo), connexin 43 (abang) lan DAPI (biru) ing bagean jantung sing anyar diisolasi (D0) utawa bagean jantung sing dibudidaya ing kahanan statis (Ctrl) utawa kahanan CTCM (MC) suwene 12 dina) saka gambar immunofluoresensi perwakilan (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi intelijen buatan saka integritas struktur jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan / klompok saben saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah ditindakake; ####p <0.0001 dibandhingake karo D0 lan ****p <0.0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). Kuantifikasi intelijen buatan saka integritas struktur jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan / klompok saben saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah ditindakake; ####p <0.0001 dibandhingake karo D0 lan ****p <0.0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl2), 7 (D12 Ctrl2), MC зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung kanthi intelijen buatan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagean / klompok saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji-arah sing ditindakake; ####p <0.0001 vs. karo D0 lan ****p <0.0001 dibandhingake karo D012 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/grup saben babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah;####p0 相0.****p01 ，0.****p01 ，0.****p01 相0.****p 001 与 D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/grup saben babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah;##p 0 田 0.****p < 0. 001 与 D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D12) Ctrl (D12) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12). Kecerdasan buatan kanggo ngitung integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagean / klompok saben babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah; #### p<0.0001 vs .D0 Kanggo mbandhingake **** p <0.0001 dibandhingake karo D). c Gambar perwakilan (kiwa) lan kuantifikasi (tengen) kanggo irisan jantung sing diwarnai karo pewarnaan trichrome Masson (Skala gundhul = 500 µm) (n = 10 irisan / klompok saben saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji-arah ditindakake; ####p <0.0001 dibandhingake karo D0 lan ***p <0.0001 dibandhingake karo D0 lan ***p <0.001 Ctrl). c Gambar perwakilan (kiwa) lan kuantifikasi (tengen) kanggo irisan jantung sing diwarnai karo pewarnaan trichrome Masson (Skala bare = 500 µm) (n = 10 irisan / klompok saben saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah ditindakake; #### p <0.0001 dibandhingake karo D0 lan ***ptr <0.0001 dibandhingake D0 lan ***p <0.0). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красМалете ытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0.0001 по синей, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0.0001 по сювран <1 сравн нию с D12 Ctrl). c Gambar perwakilan (kiwa) lan kuantifikasi (tengen) bagean jantung sing diwarnai karo pewarnaan trichrome Masson (skala ora dilapisi = 500 µm) (n = 10 bagean / klompok saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah ditindakake; #### p <0 .0001 dibandhingake karo D0 lan ***p <0.001 dibandhingake karo D0 lan ***p <0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 （裸尺度 （裸尺度 50片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与缔D1. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸度500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测##0 p1；0##**0；0.## p < 0.001 与 D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихроямным краситель 5 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсиов;#0 сионсионный;#0 сионный нению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar perwakilan (kiwa) lan jumlah (tengen) bagean jantung sing diwarnai karo pewarnaan trichrome Masson (kosong = 500 µm) (n = 10 bagean / klompok, saben saka babi sing beda, diuji kanthi analisis varians siji arah ;### # p <0,0001 dibandhingake karo D0, ***p <0,0001 dibandhingake karo D0, ***p <0,0001).Bar kesalahan nuduhake rata-rata ± standar deviasi.
Kita hipotesis yen kanthi nambahake molekul cilik menyang medium kultur, integritas kardiomiosit bisa ditingkatake lan pangembangan fibrosis suda sajrone kultur CTCM.Mulane kita disaring kanggo molekul cilik nggunakake kultur kontrol statis20,21 amarga jumlah faktor sing bingung.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), lan SB431542 (SB) dipilih kanggo layar iki.Molekul cilik iki sadurunge wis digunakake ing kultur hiPSC-CM kanggo ngindhuksi mateng kardiomiosit kanthi nambah dawa sarkomer, T-tubulus, lan kecepatan konduksi.Kajaba iku, loro Dex (glukokortikoid) lan SB dikenal kanggo nyuda inflamasi29,30.Mulane, kita nyoba apa inklusi siji utawa kombinasi saka molekul cilik iki bakal nambah integritas struktural bagean jantung.Kanggo screening awal, dosis saben senyawa dipilih adhedhasar konsentrasi sing umum digunakake ing model kultur sel (1 μM Dex27, 100 nM T327, lan 2.5 μM SB31).Sawise 12 dina kultur, kombinasi T3 lan Dex ngasilake integritas struktur kardiomiosit sing optimal lan remodeling fibrous minimal (Gambar Tambahan 4 lan 5).Kajaba iku, panggunaan kaping pindho utawa kaping pindho konsentrasi T3 lan Dex iki ngasilake efek sing mbebayani dibandhingake karo konsentrasi normal (Tambahan Gambar 6a, b).
Sawise screening awal, kita nindakake perbandingan head-to-head saka 4 kondisi budaya (Gambar 4a): Ctrl: bagean jantung sing dibudidaya ing budaya statis sing wis diterangake sadurunge nggunakake media sing dioptimalake;20.21 TD: T3 lan Ctrl s Added Dex ana;MC: bagean jantung sing dibudidaya ing CTCM nggunakake media sing wis dioptimalake sadurunge;lan MT: CTCM karo T3 lan Dex ditambahake menyang medium.Sawise 12 dina budidaya, kelangsungan jaringan MS lan MT tetep padha karo jaringan seger sing ditaksir dening uji MTT (Gambar 4b).Apike, tambahan T3 lan Dex kanggo budaya transwell (TD) ora nyebabake peningkatan sing signifikan ing viabilitas dibandhingake karo kondisi Ctrl, nuduhake peran penting stimulasi mekanik kanggo njaga kelangsungan bagian jantung.
diagram desain eksperimental sing nggambarake kondisi kultur papat sing digunakake kanggo ngevaluasi efek stimulasi mekanik lan suplemen T3 / Dex ing medium suwene 12 dina. b Grafik bar nuduhake kuantifikasi viabilitas 12 dina pasca kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo irisan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MT), 12 (D12 MC, MC, lan MT) dibandhingake irisan / kelompok siji-wayahe (D12 MC, ##0, AN##0, AN##0, AN##0. p <0,001 dibandhingake karo D0 lan **p <0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl). b Grafik bar nuduhake kuantifikasi viabilitas 12 dina pasca kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo irisan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MT), 12 (D12 MC, MC, lan MT) dibandhingake irisan / kelompok siji-wayahe (D12 MC, ##0, AN##0, AN##0, AN##0. p <0,001 dibandhingake karo D0 lan **p <0,01 dibandhingake karo D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселоникрот 4 роль, TD, MC и MT) saka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC/успрус) й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ##p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafik bar nuduhake kuantitas viabilitas ing 12 dina pasca kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo bagean jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, lan D12 MT), 12 (D12 AN MC) bagean / klompok saka siji cara, ##0 tes babi ##0, ##0, ## 0 OVA, ##0. p <0,001 vs D0 lan **p <0,01 dening dibandhingake karo D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) 、 12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与比与与 D0 ，D0. ）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) kanggo сравнению со свежими сежими (сежими седирования (контроль, TD, MC и MT) kanggo сравнению со свежими сердими (сежими седирования (контроль, TD, MC и MT) kanggo сравнению со свежими сердими сердими (сежими сердими) сердими (сежими сердими сердими) (8 D) 12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), saka разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ####p <0,001 спон внению с контролем D12). b Histogram nuduhake kabeh kondisi kultur 4 (kontrol, TD, MC lan MT) dibandhingake karo bagean jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MT), saka macem-macem babi 12 (D12 MC) bagean / klompok, test ANOVA siji-arah; ####p<0.0. 1 vs. kontrol D12). c Grafik bar nuduhake kuantifikasi fluks glukosa 12 dina pasca kultur ing kabeh kondisi kultur 4 (Ctrl, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo irisan jantung seger (D0) (n = 6 irisan / klompok saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah ditindakake; ###p <0.001, dibandhingake karo D0 lan ***p <0.001). c Grafik bar nuduhake kuantifikasi fluks glukosa 12 dina pasca kultur ing kabeh kondisi kultur 4 (Ctrl, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo irisan jantung seger (D0) (n = 6 irisan / klompok saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah ditindakake; ###p <0.001, dibandhingake karo D0 lan ***p <0.001). c Гистограма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 луски ь, TD, MC и MT) saka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одностостолннин, одностотяннин 0; по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram nuduhake kuantifikasi fluks glukosa 12 dina sawise kultur ing kabeh 4 kondisi budaya (kontrol, TD, MC lan MT) dibandhingake karo bagean jantung seger (D0) (n = 6 bagean / klompok saka babi beda, siji-cara ANOVA test dileksanakake; ###p <0.001 dibandhingake D0 lan *** p <0.001 Ctrl dibandhingake D1). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比 的吹埅通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p1 。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 ， 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执 猪单向执曌行 #0.0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмама, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования дло4 вселькорования нтроль, TD, MC, и MT) saka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, saka разных свиней, терднострово; ##p < 0,001 saka сравнению с D0, ***p < 0,001 kanggo сравнению с D12 (контроль). c Histogram nuduhake kuantifikasi fluks glukosa ing 12 dina post-kultur kanggo kabeh 4 kondisi budaya (kontrol, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo bagean jantung seger (D0) (n = 6 bagean / klompok, saka babi beda, unilateral Were ANOVA tes padha dileksanakake, ###p <0.001 dibandhingake D0, *** p <0.001 dibandhingake D0, ***p <0.001).d Plot analisis galur jaringan seger (biru), dina 12 MC (ijo), lan dina 12 MT (abang) ing sepuluh titik bagean jaringan regional (n = 4 irisan / klompok, tes ANOVA siji arah; ora ana prabédan sing signifikan antarane klompok).e Plot gunung geni nuduhake gen sing diekspresikake kanthi beda ing bagean jantung seger (D0) dibandhingake karo bagean jantung sing dibudidaya ing kahanan statis (Ctrl) utawa ing kondisi MT (MT) suwene 10-12 dina.f Peta panas gen sarkomer kanggo bagean jantung sing dibudidaya ing saben kondisi kultur.Bar kesalahan nuduhake rata-rata ± standar deviasi.
Ketergantungan metabolik ing ngalih saka oksidasi asam lemak menyang glikolisis minangka ciri khas dediferensiasi kardiomiosit.Kardiomiosit sing durung diwasa utamane nggunakake glukosa kanggo produksi ATP lan duwe mitokondria hipoplastik kanthi sawetara krista5,32.Analisis panggunaan glukosa nuduhake yen ing kahanan MC lan MT, panggunaan glukosa padha karo jaringan 0 dina (Gambar 4c).Nanging, conto Ctrl nuduhake peningkatan sing signifikan ing panggunaan glukosa dibandhingake karo jaringan seger.Iki nuduhake yen kombinasi CTCM lan T3 / Dex nambah daya tahan jaringan lan ngreksa fenotipe metabolik saka bagean jantung kultur 12 dina.Kajaba iku, analisis galur nuduhake yen tingkat galur tetep padha karo jaringan jantung seger sajrone 12 dina ing kondisi MT lan MS (Gambar 4d).
Kanggo nganalisa dampak sakabèhé saka CTCM lan T3 / Dex ing lanskap transkripsi global jaringan irisan jantung, kita nindakake RNAseq ing irisan jantung saka kabeh patang kondisi budaya sing beda (Data Tambahan 1).Sing nggumunake, bagean MT nuduhake persamaan transkripsi sing dhuwur karo jaringan jantung sing seger, kanthi mung 16 sing dibedakake saka 13,642 gen.Nanging, kaya sing dituduhake sadurunge, irisan Ctrl nampilake 1229 gen sing diungkapake kanthi beda sawise 10-12 dina ing budaya (Gambar 4e).Data kasebut dikonfirmasi dening qRT-PCR gen jantung lan fibroblast (Tambahan Gambar 7a-c).Sing nggumunake, bagean Ctrl nuduhake downregulation saka gen siklus jantung lan sel lan aktivasi program gen inflamasi.Data kasebut nuduhake yen dedifferentiation, sing biasane kedadeyan sawise kultur jangka panjang, wis dikurangi ing kondisi MT (Tambahan Gambar 8a, b).Panliten kanthi ati-ati babagan gen sarcomere nuduhake yen mung ing kondisi MT yaiku gen sing ngode sarcomere (Gambar 4f) lan saluran ion (Gambar Tambahan 9) sing diawetake, nglindhungi saka penindasan ing kahanan Ctrl, TD, lan MC.Data kasebut nuduhake yen kanthi kombinasi stimulasi mekanik lan humoral (T3 / Dex), transkriptom irisan jantung bisa tetep padha karo irisan jantung seger sawise 12 dina ing budaya.
Temuan transkripsi kasebut didhukung dening kasunyatan manawa integritas struktural kardiomiosit ing bagean jantung paling apik disimpen ing kondisi MT sajrone 12 dina, kaya sing dituduhake dening connexin 43 sing utuh lan lokal (Gambar 5a).Kajaba iku, fibrosis ing bagean jantung ing kondisi MT wis suda sacara signifikan dibandhingake karo Ctrl lan padha karo bagean jantung seger (Gambar 5b).Data kasebut nuduhake yen kombinasi stimulasi mekanik lan perawatan T3 / Dex kanthi efektif njaga struktur jantung ing bagean jantung ing budaya.
Gambar immunofluoresensi perwakilan saka troponin-T (ijo), connexin 43 (abang), lan DAPI (biru) ing bagean jantung sing anyar diisolasi (D0) utawa dikultur sajrone 12 dina ing kabeh kondisi kultur bagean jantung papat (bar skala = 100 µm).). Kuantifikasi intelijen buatan saka integritas struktur jaringan jantung (n = 7 (D0 lan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC lan D12 MT) irisan / klompok saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah ditindakake; ####p <0.0001 dibandhingake karo D0 lan *p <0.000.05, utawa D0 lan *p <0.005. Kuantifikasi intelijen buatan saka integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 lan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC lan D12 MT) irisan / klompok saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah ditindakake; #### p <0.0001 dibandhingake karo D0 lan *p <0.000.05, utawa D0 lan *p <0.000.05 . Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 2 и TD, D12), MT (D0 2 D15) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,005 ил 2 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung nggunakake intelijen buatan (n = 7 (D0 lan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC lan D12 MT) bagean / klompok saka babi sing beda-beda, tes ANOVA siji-arah sing ditindakake; #### p <0.0001 dibandhingake karo D0 lan *p <0.000.000 utawa D0 lan *p <0.000.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和人/廇祇）智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与缔 ） Ctr.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 癄和 d1量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****0 p < 2.Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung nggunakake intelijen buatan ing babi sing beda-beda (n = 7 (D0 lan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC lan D12 MT) bagean / klompok) kanthi tes ANOVA siji arah;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 utawa ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0,0001 dibandhingake karo D0 lan *p <0,05 utawa ****p <0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). b Gambar perwakilan lan kuantifikasi kanggo irisan jantung sing diwarnai karo pewarnaan trichrome Masson (Skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, lan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/grup saka babi sing beda, tes ANOVA siji-arah <0.##0 <0.00 lan ##0. ***p <0.0000 dilakokaké. 1, utawa ****p <0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). b Gambar perwakilan lan kuantifikasi kanggo irisan jantung sing diwarnai karo pewarnaan trichrome Masson (Skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, lan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/grup saka babi sing beda, tes ANOVA siji-arah <0.##0 <0.00 lan ##0. ***p <0.0000 dilakokaké. 1, utawa ****p <0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (массона) = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ,## 0 , ## 0 ***p < 0,001 utawa ****p < 0,0001 saka сравнению с D12 Ctrl). b Gambar perwakilan lan kuantifikasi bagean jantung sing diwarnai karo pewarnaan trichrome Masson (bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MC), 9 (D12 MT) bagean/kelompok saka babi sing beda-beda, dileksanakake <1-arah ANOVA; ####0 lan <1p. p <0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！D = 10）！D = 2、Dl MC D12 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （ ） （ ） （ ） （ ） ） ） ） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 ， 万 01 ， 盠 方差分析； ####p < 0.0001 ， 丯有1，丯放****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = 1,0йn = 1,000) 2 Ctrl, D12 TD lan D12 MC), 9 (D12 MT) срезов saka разных свиней / группы, один- способ ANOVA; по сравнению с D12 Ctrl). b Gambar perwakilan lan kuantifikasi bagean jantung sing diwarnai karo trichrome Masson (bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MC), 9 (D12 MT) bagean saka babi / kelompok sing beda, siji metode ANOVA; ####p <0. .0001 dibandhingake karo D12 Ctrl).Bar kesalahan nuduhake rata-rata ± standar deviasi.
Pungkasan, kemampuan CTCM kanggo niru hipertrofi jantung ditaksir kanthi nambah regangan jaringan jantung.Ing CTCM, tekanan ruang udara puncak mundhak saka 80 mmHg dadi 80 mmHg.Art.(regangan normal) nganti 140 mmHg Art.(Gambar 6a).Iki cocog karo 32% Tambah ing babagan (Fig. 6b), kang sadurunge ditampilake minangka persentasi regangan cocog kanggo bagean jantung kanggo entuk dawa sarcomere padha katon ing hypertrophy.Peregangan lan kecepatan jaringan jantung sajrone kontraksi lan relaksasi tetep konstan sajrone kultur enem dina (Gambar 6c).Jaringan jantung saka kondisi MT ngalami regangan normal (MT (Normal)) utawa kondisi overstretch (MT (OS)) sajrone nem dina.Wis sawise patang dina ing kultur, biomarker hipertrofik NT-ProBNP mundhak sacara signifikan ing medium ing kondisi MT (OS) dibandhingake karo kondisi MT (normal) (Gambar 7a).Kajaba iku, sawise nem dina kultur, ukuran sel ing MT (OS) (Gambar 7b) tambah akeh dibandhingake karo bagean jantung MT (normal).Kajaba iku, translokasi nuklir NFATC4 tambah akeh ing jaringan sing overstretched (Gambar 7c).Asil kasebut nuduhake pangembangan progresif remodeling patologis sawise hyperdistension lan ndhukung konsep yen piranti CTCM bisa digunakake minangka platform kanggo nyinaoni sinyal hipertrofi jantung sing disebabake peregangan.
Tilak perwakilan tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, lan pangukuran gerakan jaringan ngonfirmasi yen tekanan kamar ngganti tekanan ruang cairan, nyebabake gerakan irisan jaringan sing cocog.b Persentase regangan perwakilan lan kurva tingkat regane kanggo bagean jaringan sing biasane mbentang (oranye) lan overstretched (biru).c Grafik batang nuduhake wektu siklus (n = 19 irisan saben kelompok, saka babi sing beda), wektu kontraksi (n = 18-19 irisan saben kelompok, saka babi sing beda), wektu relaksasi (n = 19 irisan saben kelompok, saka babi sing beda) ), amplitudo gerakan jaringan (n = 14 irisan / grup, saka babi sing beda-beda), irisan puncak (n = 1 kelompok babi sing beda), irisan puncak (n = 19 irisan saben kelompok, saka babi sing beda) n = 14 (D0), 15 (D6) ) bagean / kelompok) saka babi sing beda-beda), t-test Student loro-tailed ora nuduhake prabédan sing signifikan ing parameter apa wae, nuduhake yen paramèter kasebut tetep konstan sajrone 6 dina budaya kanthi overvoltage.Bar kesalahan nuduhake rata-rata ± standar deviasi.
kuantifikasi grafik Bar konsentrasi NT-ProBNP ing media kultur saka irisan jantung sing dibudidaya miturut kondisi MT normal stretch (Norm) utawa overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, lan D4 MTOS) irisan / klompok saka babi sing beda, ANOVA rong arah ditindakake; **p <0.01. kuantifikasi grafik Bar konsentrasi NT-ProBNP ing media kultur saka irisan jantung sing dibudidaya miturut kondisi MT normal stretch (Norm) utawa overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, lan D4 MTOS) irisan/kelompok saka babi sing beda-beda, ANOVA rong arah ditindakake; **p <0.01.Histogram kuantitatif konsentrasi NT-ProBNP ing medium kultur saka irisan jantung sing dibudidaya ing kondisi regangan MT normal (norma) utawa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, lan D4).MTOS) irisan / kelompok saka babi sing beda-beda, analisis loro-faktor saka varians ditindakake;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 dibandhingake karo regangan normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的浓度的2 Norm)、3（D2 MTOS,D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片的切片/组，进行双向方差分析；**与正伯三与正帯。 a Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP ing irisan jantung sing dikultur miturut kondisi MT normal stretch (Norm) utawa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) saka macem-macem , p <0,01).histogram Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP ing irisan jantung sing dibudidaya ing kondisi regangan MT normal (norma) utawa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) lan D4 MTOS) irisan / klompok saka babi sing beda-beda, analisis loro-lorone saka varian;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 dibandhingake karo regangan normal). b Gambar perwakilan kanggo irisan jantung sing diwarnai karo troponin-T lan WGA (kiwa) lan kuantifikasi ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel / klompok saka 10 irisan beda saka babi sing beda, Two-tailed Student t-test dileksanakake; **** p <0.0001 dibandhingake regangan normal). b Gambar perwakilan kanggo irisan jantung sing diwarnai karo troponin-T lan WGA (kiwa) lan kuantifikasi ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel / klompok saka 10 irisan beda saka babi sing beda, Two-tailed Student t-test dileksanakake; **** p <0.0001 dibandhingake regangan normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опленикрада (слева) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-крид **** хвостовой t-крию; сравнению с нормальным растяжением). b Gambar perwakilan bagean jantung sing diwarnai karo troponin-T lan AZP (kiwa) lan kuantifikasi ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel / klompok saka 10 bagean sing beda saka babi sing beda-beda, tes t Siswa loro buntut ditindakake; **** p <0.001 dibandhingake galur normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图（右）染色的心脏切片的代表性图，D0n／表性图的心脏切片的代表性图，D0n（代表性图的心脏切片的代表性图，D0n（图图图的心脏切片的代表性图图图切自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与曉学生t 检验；与曉学0. ）. b Gambar perwakilan irisan jantung sing diwarnai karo calcarein-T lan WGA (kiwa) lan ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 saka 10 irisan sing beda (D6 MTNorm)) Sel/组，两方法有尾学生pred test；0 normal. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленка (рассленский) 6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) saka 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента0, ****0рат Стьюдента; льным растяжением). b Gambar perwakilan saka bagean jantung sing diwarnai karo troponin-T lan AZP (kiwa) lan kuantifikasi ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) saka 10 bagean sing beda saka babi sing beda-beda) Sel / klompok, kriteria loro buntut Siswa t;****p <0,0001 dibandhingake galur normal). c Gambar perwakilan kanggo dina 0 lan dina 6 irisan jantung MTOS immunolabeled kanggo troponin-T lan NFATC4 lan kuantifikasi translokasi NFATC4 menyang inti CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan / klompok saka babi sing beda, Two-tailed Student t-test ditindakake; * p <0.05). c Gambar perwakilan kanggo dina 0 lan dina 6 irisan jantung MTOS immunolabeled kanggo troponin-T lan NFATC4 lan kuantifikasi translokasi NFATC4 menyang inti CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan / klompok saka babi sing beda-beda, Two-tailed Student t-test ditindakake; * p <0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и кленкация FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двустононсий инюд двустононей , выполняется двустонюд 5 * . c Gambar perwakilan kanggo bagean jantung ing 0 lan 6 dina MTOS, immunolabeled kanggo troponin-T lan NFATC4, lan kuantifikasi translokasi NFATC4 ing inti sel cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan / klompok saka babi sing beda) nindakake t-test Siswa loro-tailed;*p <0,05). c.易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 。 c Gambar perwakilan immunolabeling calcanin-T lan NFATC4 第0天和第6天MTOS irisan jantung, lan NFATC4 saka macem-macem NFATC4 易位至CM inti sel 的 quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 制 猗缗, 制 北 / 猗生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS ing 0 и 6 день для иммуномаркировки трононином-Т и NFATC4 столоцинч FATC4 ing CM saka разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Gambar perwakilan irisan jantung MTOS ing dina 0 lan 6 kanggo immunolabeling troponin-T lan NFATC4 lan kuantifikasi translokasi NFATC4 ing inti CM saka babi sing beda-beda (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan / klompok, loro-tailed t -kriteria Siswa; * p <0.05).Bar kesalahan nuduhake rata-rata ± standar deviasi.
Panaliten kardiovaskular translasi mbutuhake model seluler sing ngasilake lingkungan jantung kanthi akurat.Ing panliten iki, piranti CTCM dikembangake lan ditondoi sing bisa ngrangsang bagean ultrathin jantung.Sistem CTCM kalebu stimulasi elektromekanis sing disinkronake sacara fisiologis lan pengayaan cairan T3 lan Dex.Nalika bagean jantung porcine kapapar faktor kasebut, daya tahan, integritas struktural, aktivitas metabolik, lan ekspresi transkripsi tetep padha karo jaringan jantung seger sawise 12 dina budaya.Kajaba iku, peregangan jaringan jantung sing berlebihan bisa nyebabake hipertrofi jantung sing disebabake hiperekstensi.Sakabèhé, asil kasebut ndhukung peran kritis kondisi budaya fisiologis kanggo njaga fenotipe jantung normal lan nyedhiyakake platform kanggo screening obat.
Akeh faktor nyumbang kanggo nggawe lingkungan optimal kanggo fungsi lan kaslametané kardiomiosit.Sing paling jelas saka faktor kasebut ana hubungane karo (1) interaksi antarsel, (2) stimulasi elektromekanis, (3) faktor humoral, lan (4) substrat metabolik.Interaksi sel-kanggo-sel fisiologis mbutuhake jaringan telung dimensi kompleks saka macem-macem jinis sel sing didhukung dening matriks ekstraselular.Interaksi selular sing kompleks kuwi angel direkonstruksi kanthi in vitro kanthi kultur bebarengan saka jinis sel individu, nanging bisa gampang digayuh kanthi nggunakake sifat organotipik saka bagean jantung.
Peregangan mekanik lan stimulasi listrik kardiomiosit penting kanggo njaga fenotipe jantung33,34,35.Nalika stimulasi mekanik wis akeh digunakake kanggo kahanan hiPSC-CM lan mateng, sawetara pasinaon elegan bubar nyoba stimulasi mekanik irisan jantung ing budaya nggunakake uniaxial loading.Panaliten kasebut nuduhake manawa beban mekanik uniaksial 2D duweni pengaruh positif marang fenotipe jantung sajrone kultur.Ing panliten iki, bagean jantung diisi karo gaya tarik isometrik17, beban auxotonic linear18, utawa siklus jantung digawe maneh nggunakake umpan balik transduser gaya lan drive tension.Nanging, cara iki nggunakake uniaxial jaringan regangan tanpa optimasi lingkungan, asil ing dipatèni saka akeh gen jantung utawa overexpression gen gadhah respon regangan abnormal.CTCM sing diterangake ing kene nyedhiyakake rangsangan elektromekanik 3D sing niru siklus jantung alami ing babagan wektu siklus lan regangan fisiologis (25% regangan, 40% systole, 60% diastole, lan 72 denyut per menit).Sanajan stimulasi mekanik telung dimensi iki mung ora cukup kanggo njaga integritas jaringan, kombinasi stimulasi humoral lan mekanik nggunakake T3 / Dex dibutuhake kanggo njaga viabilitas, fungsi, lan integritas jaringan kanthi cukup.
Faktor humoral nduweni peran penting ing modulasi fenotip jantung diwasa.Iki disorot ing studi HiPS-CM ing ngendi T3 lan Dex ditambahake menyang media kultur kanggo nyepetake mateng sel.T3 bisa mengaruhi transportasi asam amino, gula lan kalsium ngliwati membran sel36.Kajaba iku, T3 ningkatake ekspresi MHC-α lan downregulation MHC-β, ningkatake pembentukan myofibrils twitch cepet ing kardiomiosit diwasa dibandhingake myofibrils twitch alon ing CM janin.Kekurangan T3 ing pasien hipotiroid nyebabake ilang pita myofibrillar lan nyuda pangembangan nada37.Dex tumindak ing reseptor glukokortikoid lan wis ditampilake kanggo nambah contractility miokard ing ati perfused terisolasi;38 asil dandan iki dianggep ana hubungane karo efek ing calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40.Kajaba iku, Dex ikatan karo reseptor, nyebabake respon intraselular sing amba sing nyuda fungsi kekebalan lan inflamasi30.
Asil kita nuduhake yen stimulasi mekanik fisik (MS) ningkatake kinerja budaya sakabèhé dibandhingake karo Ctrl, nanging gagal njaga viabilitas, integritas struktural, lan ekspresi jantung sajrone 12 dina ing budaya.Dibandhingake karo Ctrl, tambahan budaya T3 lan Dex menyang CTCM (MT) ningkatake kelangsungan hidup lan njaga profil transkripsi sing padha, integritas struktural, lan aktivitas metabolik kanthi jaringan jantung seger sajrone 12 dina.Kajaba iku, kanthi ngontrol tingkat regangan jaringan, model hipertrofi jantung sing diakibatake hyperextension digawe nggunakake STCM, nggambarake versatility sistem STCM.Perlu dicathet yen sanajan remodeling jantung lan fibrosis biasane nyangkut organ sing utuh sing sel sirkulasi bisa nyedhiyakake sitokin sing cocog uga fagositosis lan faktor remodeling liyane, bagean jantung isih bisa niru proses fibrotik minangka respon kanggo stres lan trauma.menyang myofibroblasts.Iki wis dievaluasi sadurunge ing model irisan jantung iki.Perlu dicathet yen paramèter CTCM bisa dimodulasi kanthi ngganti amplitudo tekanan / listrik lan frekuensi kanggo nyontokake akeh kondisi kayata tachycardia, bradycardia, lan dhukungan sirkulasi mekanik (jantung sing dibongkar mekanik).Iki ndadekake sistem minangka throughput medium kanggo tes obat.Kemampuan CTCM kanggo model hipertrofi jantung sing disebabake overexertion menehi cara kanggo nguji sistem iki kanggo terapi pribadi.Kesimpulane, panliten iki nuduhake manawa stimulasi mekanik lan stimulasi humoral penting kanggo njaga budaya bagean jaringan jantung.
Sanajan data sing ditampilake ing kene nuduhake yen CTCM minangka platform sing apik banget kanggo modeling miokardium sing utuh, metode budaya iki duwe sawetara watesan.Watesan utama budaya CTCM yaiku ngetrapake tekanan mekanik dinamis sing terus-terusan ing irisan, sing nyegah kemampuan kanggo ngawasi kontraksi irisan jantung kanthi aktif sajrone saben siklus.Kajaba iku, amarga ukuran cilik saka bagean jantung (7 mm), kemampuan kanggo ngevaluasi fungsi systolic njaba sistem budaya nggunakake sensor gaya tradisional diwatesi.Ing naskah saiki, kita sebagian ngatasi watesan iki kanthi ngevaluasi voltase optik minangka indikator fungsi kontraktil.Nanging, watesan iki mbutuhake karya luwih lanjut lan bisa ditindakake ing mangsa ngarep kanthi ngenalake cara kanggo ngawasi optik fungsi irisan jantung ing budaya, kayata pemetaan optik nggunakake pewarna kalsium lan sensitif voltase.Watesan liyane saka CTCM yaiku model kerja ora ngapusi stres fisiologis (preload lan afterload).Ing CTCM, tekanan diinduksi ing arah sing ngelawan kanggo ngasilake 25% regangan fisiologis ing diastole (regangan lengkap) lan systole (dawa kontraksi sajrone stimulasi listrik) ing jaringan sing gedhe banget.Watesan iki kudu diilangi ing desain CTCM sing bakal teka kanthi tekanan sing nyukupi ing jaringan jantung saka loro-lorone lan kanthi nggunakake hubungan tekanan-volume sing tepat sing kedadeyan ing kamar jantung.
Remodeling overstretch-induced sing dilapurake ing naskah iki diwatesi kanggo niru sinyal hyperstretch hipertrofik.Mangkono, model iki bisa mbantu sinau babagan sinyal hipertrofik sing diakibatake stretch tanpa perlu faktor humoral utawa saraf (sing ora ana ing sistem iki).Panaliten luwih lanjut dibutuhake kanggo nambah multiplicity CTCM, contone, co-culturing karo sel imun, sirkulasi faktor humoral plasma, lan innervation nalika co-culturing karo sel neuronal bakal nambah kemungkinan modeling penyakit karo CTCM.
Telulas babi digunakake ing panliten iki.Kabeh prosedur kewan ditindakake miturut pedoman institusi lan disetujoni dening Komite Perawatan lan Penggunaan Kewan Institusi Universitas Louisville.Lengkungan aorta dijepit lan jantung diwutahake karo 1 L cardioplegia steril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U / mL heparin, pH nganti 7,4); ati padha wadi ing solusi kardioplegi es-kadhemen nganti diangkut menyang Lab ing es kang biasane <10 min. ati padha wadi ing solusi kardioplegi es-kadhemen nganti diangkut menyang Lab ing es kang biasane <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <. ati disimpen ing larutan kardioplegik sing adhem nganti diangkut menyang laboratorium nganggo es, sing biasane njupuk kurang saka 10 menit.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Simpen jantung ing kardioplegia es nganti diangkut menyang laboratorium nganggo es, biasane <10 menit.
Piranti CTCM dikembangake ing piranti lunak SolidWorks computer-aided design (CAD).Kamar budaya, pembagi lan kamar udara digawe saka plastik akrilik sing cetha CNC.Ring back-up diameteripun 7mm digawe saka poliethelin Kapadhetan dhuwur (HDPE) ing tengah lan duwe alur o-ring kanggo nampung silikon o-ring digunakake kanggo segel media ing ngisor.Membran silika tipis misahake ruang budaya saka piring pemisah.Membran silikon dipotong laser saka lembaran silikon sing kandel 0.02″ lan nduweni atose 35A.Gasket silikon ngisor lan ndhuwur dipotong laser saka lembaran silikon kandel 1/16″ lan kekerasane 50A.Sekrup stainless steel 316L lan kacang swiwi digunakake kanggo nyepetake blok lan nggawe segel kedap udara.
Papan sirkuit cetak khusus (PCB) dirancang kanggo digabungake karo sistem C-PACE-EM.Sockets konektor mesin swiss ing PCB disambungake menyang elektrods grafit dening kabel tembaga dilapisi salaka lan tembaga 0-60 ngawut-awut ngaco menyang elektrods.Papan sirkuit dicithak diselehake ing tutup printer 3D.
Piranti CTCM dikontrol dening aktuator pneumatik sing bisa diprogram (PPD) sing nggawe tekanan sirkulasi sing dikontrol padha karo siklus jantung.Nalika tekanan ing njero ruangan udara mundhak, membran silikon fleksibel mundhak munggah, meksa medium ing ngisor situs jaringan.Area jaringan banjur bakal digawe dowo dening pengusiran cairan iki, niru ekspansi fisiologis jantung nalika diastole.Ing puncak istirahat, stimulasi listrik ditrapake liwat elektroda grafit, sing nyuda tekanan ing ruang udara lan nyebabake kontraksi bagean jaringan.Ing njero pipa ana katup hemostatik kanthi sensor tekanan kanggo ndeteksi tekanan ing sistem udara.Tekanan sing dirasakake dening sensor tekanan ditrapake menyang kolektor data sing disambungake menyang laptop.Iki ngidini ngawasi terus-terusan tekanan ing njero ruangan gas.Nalika tekanan kamar maksimal tekan (standar 80 mmHg, 140 mmHg OS), piranti akuisisi data diprentahake ngirim sinyal menyang sistem C-PACE-EM kanggo ngasilake sinyal voltase biphasic kanggo 2 ms, disetel dadi 4 V.
Bagean jantung dipikolehi lan kondisi kultur ing 6 sumur ditindakake kaya ing ngisor iki: Transfer ati sing dipanen saka wadhah transfer menyang tray sing ngemot kardioplegia kadhemen (4° C.).Ventrikel kiwa diisolasi nganggo pisau steril lan dipotong dadi potongan 1-2 cm3.Blok jaringan kasebut ditempelake ing penyangga jaringan kanthi adesif jaringan lan dilebokake ing adus jaringan mikrotom sing kedher sing ngemot larutan Tyrode lan terus-terusan oksigen (3 g / L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.407 mM), 6 mM KCl (0.447 m) PES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solusi), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M solusi), nganti 1 L ddH2O).Mikrotom geter disetel kanggo ngethok irisan kandel 300 µm kanthi frekuensi 80 Hz, amplitudo getaran horisontal 2 mm, lan laju maju 0,03 mm/s.Bath tissue diubengi es supaya solusi tetep adhem lan suhu tetep ing 4 ° C.Transfer bagean jaringan saka adus microtome menyang adus inkubasi sing ngemot solusi Tyrode oksigen terus-terusan ing es nganti bagean sing cukup kanggo siji piring budaya.Kanggo kultur transwell, bagean jaringan dipasang ing dhukungan poliuretan lebar 6 mm steril lan diselehake ing 6 ml medium sing dioptimalake (199 medium, 1x suplemen ITS, 10% FBS, 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml FGF-alkaline lan 2X antibiotik-antijamur).Stimulasi listrik (10 V, frekuensi 1.2 Hz) ditrapake ing bagean jaringan liwat C-Pace.Kanggo kondisi TD, T3 lan Dex seger ditambahake ing 100 nM lan 1 μM ing saben owah-owahan medium.Media kasebut jenuh karo oksigen sadurunge diganti kaping 3 dina.Bagean jaringan dikultur ing inkubator ing suhu 37 ° C lan 5% CO2.
Kanggo kultur CTCM, bagean jaringan diselehake ing printer 3D sing digawe khusus ing sajian Petri sing ngemot solusi Tyrode sing diowahi.Piranti kasebut dirancang kanggo nambah ukuran irisan jantung kanthi 25% saka area cincin dhukungan.Iki ditindakake supaya bagean jantung ora mbentang sawise ditransfer saka solusi Tyrode menyang medium lan sajrone diastole.Nggunakake lem histoakrilik, bagean sing kandel 300 µm dipasang ing cincin penyangga kanthi diameter 7 mm.Sawise masang bagean tissue menyang ring support, Cut mati bagean tissue keluwihan lan sijine bagean tissue ditempelake bali menyang perlu saka solusi Tyrode ing es (4 ° C) nganti cukup bagean wis disiapake kanggo siji piranti.Total wektu pangolahan kanggo kabeh piranti ngirim ora ngluwihi 2 jam.Sawise 6 bagean jaringan ditempelake ing dering dhukungan, piranti CTCM dipasang.Kamar kultur CTCM wis diisi karo medium pra-oksigen 21 ml.Transfer bagean jaringan menyang kamar kultur lan kanthi ati-ati mbusak gelembung udara kanthi pipette.Bagean tissue banjur dituntun menyang bolongan lan ditekan alon-alon menyang panggonan.Pungkasan, pasang tutup elektroda ing piranti lan transfer piranti menyang inkubator.Banjur sambungake CTCM menyang tabung udara lan sistem C-PACE-EM.Aktuator pneumatik mbukak lan katup udara mbukak CTCM.Sistem C-PACE-EM dikonfigurasi kanggo ngirim 4 V ing 1,2 Hz sajrone pacing biphasic kanggo 2 ms.Medium diganti kaping pindho dina lan elektroda diganti sapisan dina kanggo nyegah akumulasi grafit ing elektroda.Yen perlu, bagean jaringan bisa dicopot saka sumur kultur kanggo ngusir gelembung udara sing ana ing ngisore.Kanggo kondisi perawatan MT, T3 / Dex ditambahake seger kanthi saben owah-owahan medium kanthi 100 nM T3 lan 1 μM Dex.Piranti CTCM dikultur ing inkubator ing suhu 37 ° C lan 5% CO2.
Kanggo entuk lintasan irisan jantung sing dawa, sistem kamera khusus dikembangake.Kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) digunakake karo lensa makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Visualisasi ditindakake ing suhu kamar sawise ngganti medium kanthi medium seger.Kamera dipanggonke ing sudut 51° lan video direkam ing 30 pigura per detik.Pisanan, piranti lunak open source (MUSCLEMOTION43) digunakake karo Image-J kanggo ngitung gerakan irisan jantung.Topeng kasebut digawe nggunakake MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) kanggo nemtokake wilayah sing disenengi kanggo ngalahake irisan jantung supaya ora ana swara.Topeng sing dipisahake kanthi manual ditrapake kanggo kabeh gambar ing urutan pigura banjur diterusake menyang plug-in MUSCLEMOTION.Gerakan Otot nggunakake intensitas rata-rata piksel ing saben pigura kanggo ngitung gerakane relatif marang pigura referensi.Data direkam, disaring lan digunakake kanggo ngitung wektu siklus lan netepake babagan jaringan sajrone siklus jantung.Video sing direkam diproses sawise nggunakake filter digital fase nol urutan pertama.Kanggo ngitung regangan jaringan (puncak-kanggo-puncak), analisis puncak-kanggo-puncak ditindakake kanggo mbedakake antarane puncak lan palung ing sinyal sing direkam.Kajaba iku, detrending ditindakake nggunakake polinomial urutan kaping 6 kanggo ngilangi drift sinyal.Kode program dikembangake ing MATLAB kanggo nemtokake gerakan jaringan global, wektu siklus, wektu istirahat, lan wektu kontraksi (Kode Program Tambahan 44).
Kanggo analisis galur, nggunakake video sing padha digawe kanggo evaluasi regangan mekanik, kita pisanan nglacak rong gambar sing nuduhake puncak gerakan (titik gerakan paling dhuwur (ndhuwur) lan paling ngisor) miturut piranti lunak MUSCLEMOTION.Kita banjur dibagi wilayah jaringan lan aplikasi wangun algoritma shading menyang jaringan segmented (Tambahan Gambar. 2a).Jaringan segmen banjur dipérang dadi sepuluh subsurfaces, lan kaku ing saben lumahing wis diwilang nggunakake persamaan ing ngisor iki: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, ngendi Sup lan Sdown iku jarak saka wangun saka bayangan ndhuwur lan ngisor saka kain, mungguh (Tambahan Fig. 2b).
Bagean jantung dipasang ing paraformaldehida 4% suwene 48 jam.Jaringan tetep didehidrasi ing 10% lan 20% sukrosa sajrone 1 jam, banjur ing 30% sukrosa sewengi.Bagian kasebut banjur dilebokake ing senyawa suhu pemotongan sing paling optimal (senyawa OCT) lan mboko sithik beku ing adus es isopentane / garing.Simpen blok embedding OCT ing -80 °C nganti misahake.Geser disiapake minangka bagean kanthi kekandelan 8 μm.
Kanggo mbusak OCT saka bagean jantung, panasake slide ing blok pemanas kanthi suhu 95 °C suwene 5 menit.Tambah 1 ml PBS kanggo saben slide lan inkubasi kanggo 30 menit ing suhu kamar, banjur permeate bagean kanthi nyetel 0,1% Triton-X ing PBS kanggo 15 menit ing suhu kamar.Kanggo nyegah antibodi non-spesifik saka naleni sampel, nambah 1 ml saka 3% solusi BSA kanggo minger lan inkubasi kanggo 1 jam ing suhu kamar.BSA banjur dibusak lan minger wis sakabeheng karo PBS.Tandhani saben sampel nganggo potlot.Antibodi primer (diencerke 1:200 ing 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) lan troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ditambahake liwat 90 menit, banjur antibodi sekunder 1 (FluSA) 1 (Alexa 208): Thermo Scientific; #A16079), nglawan terwelu Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) kanggo tambahan 90 menit Dikumbah kaping 3 nganggo PBS Kanggo mbedakake pewarnaan target saka latar mburi, kita mung nggunakake antibodi sekunder minangka kontrol. Pungkasan, noda nuklir DAPI ditambahake lan dilebokake ing polesan vectalator (x) karo stains nuklir DAPI lan selektor protektor. perbesaran) lan mikroskop Keyence kanthi perbesaran 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ing 5 μg / ml ing PBS digunakake kanggo pewarnaan WGA lan ditrapake ing bagean tetep sajrone 30 menit ing suhu kamar.Geser banjur dikumbah nganggo PBS lan ireng Sudan ditambahake ing saben slide lan diinkubasi nganti 30 menit.Geser banjur dikumbah nganggo PBS lan ditambahake medium embedding vectashield.Geser digambarake ing mikroskop Keyence kanthi perbesaran 40x.
OCT dibusak saka conto kaya sing kasebut ing ndhuwur.Sawise njabut OCT, kacemplungaken minger ing solusi Bouin kang sewengi.Slide kasebut banjur dibilas nganggo banyu suling suwene 1 jam banjur dilebokake ing larutan fuchsin asam aloe Bibrich suwene 10 menit.Banjur slide dikumbah nganggo banyu sing disuling lan dilebokake ing larutan 5% phosphomolybdenum / 5% asam fosfotungstik suwene 10 menit.Tanpa mbilas, transfer slide langsung menyang larutan biru aniline suwene 15 menit.Banjur slides dicuci nganggo banyu sing disuling lan dilebokake ing larutan asam asetat 1% suwene 2 menit.Geser dikeringake ing etanol 200 N lan ditransfer menyang xylene.Slide diwarnai divisualisasikan menggunakan mikroskop Keyence dengan objektif 10x.Persentase area fibrosis diukur nggunakake piranti lunak Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nomer katalog V13154, miturut protokol pabrikan kanthi sawetara modifikasi.Utamane, pukulan bedhah kanthi diameter 6 mm digunakake kanggo njamin ukuran jaringan seragam sajrone analisis MTT.Tisu dilapisi siji-sijine menyang sumur ing piring 12 sumur sing ngemot substrat MTT miturut protokol pabrikan.Bagian kasebut diinkubasi ing 37 ° C. suwene 3 jam lan jaringan urip ngmetabolisme substrat MTT kanggo mbentuk senyawa formazan ungu.Ganti solusi MTT karo 1 ml DMSO lan inkubasi ing 37 °C kanggo 15 menit kanggo extract formazan ungu saka bagean jantung.Sampel diencerke 1:10 ing DMSO ing piring ngisor 96 sumur sing cetha lan intensitas warna ungu diukur ing 570 nm nggunakake pembaca piring Cytation (BioTek).Wacan dinormalisasi kanthi bobot saben irisan jantung.
Media irisan jantung diganti karo media sing ngemot 1 μCi / ml [5-3H] -glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) kanggo uji pemanfaatan glukosa kaya sing diterangake sadurunge.Sawise 4 jam inkubasi, tambahake 100 µl medium menyang tabung microcentrifuge mbukak sing ngemot 100 µl HCl 0,2 N.Banjur tabung dilebokake ing tabung scintillation sing isine 500 μl dH2O kanggo nguap [3H]2O suwene 72 jam ing suhu 37°C.Banjur copot tabung microcentrifuge saka tabung scintillation lan nambah 10 ml adi scintillation.Cacah scintillation ditindakake kanthi nggunakake penganalisa scintillation cair Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Pemanfaatan glukosa banjur diitung kanthi nimbang aktivitas spesifik [5-3H]-glukosa, keseimbangan lan latar mburi sing ora lengkap, pengenceran glukosa [5-3H]-kanggo sing ora dilabeli, lan efisiensi counter scintillation.Data kasebut dinormalisasi menyang massa bagean jantung.
Sawise homogenisasi jaringan ing Trizol, RNA diisolasi saka bagean jantung nggunakake Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 miturut protokol pabrikan.Persiapan perpustakaan RNAsec, urutan lan analisis data ditindakake kaya ing ngisor iki:
1 μg RNA saben sampel digunakake minangka bahan wiwitan kanggo nyiapake perpustakaan RNA.Sequencing perpustakaan kui nggunakake NEBNext Ultra TM RNA Library Preparation Kit kanggo Illumina (NEB, USA) sawise Rekomendasi pabrikan, lan kode indeks ditambahake kanggo urutan atribut kanggo saben sampel.Sedhela, mRNA diresiki saka total RNA nggunakake manik-manik magnet sing ditempelake karo oligonukleotida poli-T.Fragmentasi ditindakake nggunakake kation divalen ing suhu dhuwur ing NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).CDNA untai pisanan disintesis nggunakake primer heksamer acak lan M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).Untaian kapindho cDNA banjur disintesis nganggo DNA polimerase I lan RNase H. Sisa overhang diowahi dadi tumpul kanthi aktivitas exonuclease/polimerase.Sawise adenilasi saka 3' mburi fragmen DNA, Adaptor NEBNext kanthi struktur loop jepit rambut dipasang kanggo nyiapake hibridisasi.Kanggo pilihan fragmen cDNA saka dawa sing disenengi 150-200 bp.pecahan perpustakaan padha diresiki nggunakake sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Banjur, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) kanthi cDNA sing dipilih ukuran sing diikat karo adaptor digunakake kanggo 15 menit ing 37 ° C lan banjur kanggo 5 menit ing 95 ° C sadurunge PCR.PCR banjur ditindakake nggunakake polimerase DNA Phusion High-Fidelity, primer PCR universal, lan primer Indeks (X).Pungkasan, produk PCR diresiki (sistem AMPure XP) lan kualitas perpustakaan ditaksir ing sistem Agilent Bioanalyzer 2100.Pustaka cDNA banjur diurutake nggunakake sequencer Novaseq.File gambar mentah saka Illumina diowahi dadi maca mentah nggunakake CASAVA Base Calling.Data mentah disimpen ing file format FASTQ(fq) sing ngemot urutan diwaca lan kualitas dhasar sing cocog.Pilih HISAT2 kanggo cocog saring urutan maca kanggo genom referensi Sscrofa11.1.Umumé, HISAT2 ndhukung génom saka ukuran apa wae, kalebu génom sing luwih gedhe tinimbang 4 milyar basis, lan nilai standar disetel kanggo umume paramèter.Splicing maca saka data RNA Seq bisa diselarasake kanthi efisien nggunakake HISAT2, sistem paling cepet sing kasedhiya saiki, kanthi akurasi sing padha utawa luwih apik tinimbang metode liyane.
Kelimpahan transkrip langsung nggambarake tingkat ekspresi gen.Tingkat ekspresi gen ditaksir kanthi akeh transkrip (jumlah urutan) sing ana gandhengane karo genom utawa ekson.Jumlah sing diwaca sebanding karo tingkat ekspresi gen, dawa gen, lan kedalaman urutan.FPKM (fragmen saben sewu pasangan basa transkrip sing diurutake saben yuta pasangan basa) diwilang lan P-nilai ekspresi diferensial ditemtokake nggunakake paket DESeq2.Kita banjur ngetung tingkat panemuan palsu (FDR) kanggo saben nilai P nggunakake method9 Benjamini-Hochberg adhedhasar dibangun ing R-fungsi "p.adjust".
RNA sing diisolasi saka bagean jantung diowahi dadi cDNA kanthi konsentrasi 200 ng / μl nggunakake campuran SuperScript IV Vilo Master saka Thermo (Thermo, cat. No. 11756050).Kuantitatif RT-PCR iki dileksanakake nggunakake Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent plate reaksi (Thermo, cat. No. 4483319) lan microamp adesif optik (Thermo, cat. No. 4311971).Campuran reaksi kasebut kalebu 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer lan 3.5 µl H2O dicampur saben sumur.Siklus qPCR standar ditindakake lan nilai CT diukur nggunakake instrumen PCR Applied Biosystems Quantstudio 5 wektu nyata (modul 384 sumur; produk # A28135).Primer Taqman dituku saka Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1) ), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)
Rilis media NT-ProBNP ditaksir nggunakake kit NT-ProBNP (babi) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) miturut protokol pabrikan.Sedhela, 250 µl saben sampel lan standar ditambahake ing duplikat kanggo saben sumur.Sanalika sawise nambah sampel, nambah 50 µl Assay Reagent A kanggo saben sumur.Alon-alon goyangake piring lan tutup nganggo sealant.Banjur tablet kasebut diinkubasi ing suhu 37 ° C suwene 1 jam.Banjur aspirate solusi lan wisuh sumur kaping 4 kanthi 350 µl larutan cuci 1X, inkubasi larutan cuci kanggo 1-2 menit saben wektu.Banjur tambahake 100 µl Assay Reagent B saben sumur lan tutup nganggo plate sealant.Tablet kasebut digoyang alon-alon lan diinkubasi ing 37 ° C suwene 30 menit.Aspirate solusi kasebut lan cuci sumur 5 kaping kanthi 350 µl larutan cuci 1X.Tambahake 90 µl larutan substrat kanggo saben sumur lan tutup piring kasebut.Inkubasi piring ing 37 ° C suwene 10-20 menit.Tambah 50 µl Stop Solution kanggo saben sumur.Piring kasebut langsung diukur nggunakake piranti maca piring Cytation (BioTek) ing 450 nm.
Analisis daya ditindakake kanggo milih ukuran klompok sing bakal nyedhiyakake daya> 80% kanggo ndeteksi owah-owahan mutlak 10% ing parameter kanthi tingkat kesalahan Tipe I 5%. Analisis daya ditindakake kanggo milih ukuran klompok sing bakal nyedhiyakake daya> 80% kanggo ndeteksi owah-owahan mutlak 10% ing parameter kanthi tingkat kesalahan Tipe I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% раметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis daya ditindakake kanggo milih ukuran klompok sing bakal nyedhiyakake daya> 80% kanggo ndeteksi 10% owah-owahan parameter absolut kanthi tingkat kesalahan Tipe I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I减的生。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I减的生。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнарузлегнибня 10% я параметров и 5% частоты ошибок типа I. Analisis daya ditindakake kanggo milih ukuran klompok sing bakal nyedhiyakake daya> 80% kanggo ndeteksi 10% owah-owahan parameter absolut lan 5% tingkat kesalahan tipe I.Bagean jaringan dipilih kanthi acak sadurunge eksperimen.Kabeh analisis padha wuta kondisi lan conto decoded mung sawise kabeh data wis analisa.Piranti lunak GraphPad Prism (San Diego, CA) digunakake kanggo nindakake kabeh analisis statistik. Kanggo kabeh statistik, nilai-p dianggep signifikan ing nilai <0,05. Kanggo kabeh statistik, nilai-p dianggep signifikan ing nilai <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kanggo kabeh statistik, nilai-p dianggep signifikan ing nilai <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kanggo kabeh statistik, nilai-p dianggep signifikan ing nilai <0.05.Uji t Student two-tailed ditindakake ing data kanthi mung 2 perbandingan.ANOVA siji-arah utawa loro-lorone digunakake kanggo nemtokake pinunjul antarane sawetara klompok.Nalika nindakake tes post hoc, koreksi Tukey ditrapake kanggo ngitung macem-macem perbandingan.data RNAsec wis anggit statistik khusus nalika ngitung FDR lan p.adjust minangka diterangake ing bagean Metode.
Kanggo informasi luwih lengkap babagan desain sinau, waca abstrak Laporan Riset Alam sing ana gandhengane karo artikel iki.