გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული მხარდაჭერა CSS-ისთვის. საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვაჩენთ საიტს სტილისა და JavaScript-ის გარეშე.
ადამიანის ნაწლავის მორფოგენეზი აყალიბებს 3D ეპითელური მიკროარქიტექტურისა და სივრცის ორგანიზაციის კრიპტა-ვილუსის მახასიათებლებს. ეს უნიკალური სტრუქტურა საჭიროა ნაწლავის ჰომეოსტაზის შესანარჩუნებლად ბაზალურ საძვალეში ღეროვანი უჯრედის ნიშის დაცვით ეგზოგენური მიკრობული ანტიგენებისა და მათი მეტაბოლიტებისაგან. გარდა ამისა, ნაწლავის ვილიები და ლორწოს ლორწოს გამოყოფა წინამდებარე ღეროვანი ფუნქციით იცავს. ზედაპირი. ამიტომ, 3D ეპითელური სტრუქტურების ხელახლა შექმნა გადამწყვეტია ინ ვიტრო ნაწლავის მოდელების კონსტრუქციისთვის. აღსანიშნავია, რომ ორგანულ მიამიტურ ნაწლავს ჩიპზე შეუძლია გამოიწვიოს ნაწლავის ეპითელიუმის სპონტანური 3D მორფოგენეზი გაძლიერებული ფიზიოლოგიური ფუნქციებით და ბიომექანიკის ხელახალი პროტოგენური უზრუნველყოფა. ნაწლავი მიკროსთხევად ჩიპზე, ისევე როგორც Transwell-ში ჩაშენებულ ჰიბრიდულ ჩიპში. ჩვენ აღვწერთ დეტალურ მეთოდებს მოწყობილობის წარმოებისთვის, Caco-2-ის ან ნაწლავის ორგანული ეპითელური უჯრედების კულტივირებისთვის ჩვეულებრივ პარამეტრებში, ასევე მიკროსთხევად პლატფორმაზე, 3D მორფოგენეზის ინდუქციას და ნაწლავის მრავლობითი გამოსახვის პროტოგენური ფუნქციის დახასიათებას. ბაზოლატერალური სითხის ნაკადის კონტროლით 5 დღის განმავლობაში. ჩვენი ინ ვიტრო მორფოგენეზის მეთოდი იყენებს ფიზიოლოგიურად შესაბამის ათვლის სტრესს და მექანიკურ მოძრაობას და არ საჭიროებს კომპლექსურ უჯრედულ ინჟინერიას ან მანიპულირებას, რაც შეიძლება აღემატებოდეს სხვა არსებულ ტექნიკას. და ფარმაცევტული აპლიკაციები.
ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ ნაწლავის ეპითელური Caco-2 უჯრედები, რომლებიც კულტივირებულია ნაწლავზე ჩიპზე1,2,3,4,5 ან ორფენიანი მიკროსთხევადი მოწყობილობებში6,7 შეიძლება გაიარონ სპონტანური 3D მორფოგენეზი in vitro ძირითადი მექანიზმის მკაფიო გაგების გარეშე. ჩვენს ბოლო კვლევაში, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ბაზოდუქციური ხელსაწყოების ამოღება საკმარისია ბაზოდუქციური ხელსაწყოებიდან 3D საკმარისად სეკრეტირებულია. მორფოგენეზი in vitro, რომელიც აჩვენა Caco-2-მა და პაციენტისგან მიღებული ნაწლავური ორგანოიდები.ეპითელური უჯრედები დადასტურდა. ამ კვლევაში ჩვენ კონკრეტულად გავამახვილეთ ყურადღება ძლიერი Wnt ანტაგონისტის, Dickkopf-1 (DKK-1) უჯრედების წარმოებასა და კონცენტრაციის განაწილებაზე, ჩიპზე ნაწლავში და მოდიფიცირებულ მიკროსთხევად მოწყობილობებში, რომლებიც შეიცავს ტრანსველის ჩანართებს, სახელწოდებით „ჰიბრიდული ჩიპი“. ჩიპზე მდებარე ნაწლავში სეკრეტირებული ფრიზელთან დაკავშირებული ცილა 1, ან Soggy-1) აფერხებს მორფოგენეზს ან არღვევს წინასწარ სტრუქტურირებულ 3D ეპითელიალურ შრეს, რაც ვარაუდობს, რომ კულტურის დროს ანტაგონისტური სტრესი პასუხისმგებელია ნაწლავის მორფოგენეზზე in vitro. ამიტომ, პრაქტიკული მიდგომაა მინიმალურ მორფოგენეზში მორფოგენეზის მძლავრი ან მინიმალურ მორფოგენეზში მოცილების ძლიერი დონის შესანარჩუნებლად. გვერდითი განყოფილება აქტიური გამორეცხვით (მაგ., ნაწლავის ჩიპზე ან ჰიბრიდულ ჩიპზე) ან დიფუზიით. ბაზოლატერალური მედია (მაგ. ტრანსველის ჩასვლებიდან ჭაბურღილების დიდ ბაზოლატერალურ რეზერვუარებში).
ამ პროტოკოლში ჩვენ გთავაზობთ დეტალურ მეთოდს ნაწლავის ნაწლავის ჩიპური მიკროდური და ტრანსუელ-ინციდენტული ჰიბრიდული ჩიპების (ნაბიჯები 1-5) კულტურის ნაწლავის ეპითელური უჯრედების კულტურაში, პოლიდიმეტილსილოქსანზე (PDMS)-ზე, 7A, 7A, 7A, 8, 9) 9) და გამოწვეული 3D მორფოგენეზი in vitro (ნაბიჯი 10). ჩვენ ასევე გამოვყავით უჯრედული და მოლეკულური თვისებები ქსოვილის სპეციფიკური ჰისტოგენეზისა და ხაზზე დამოკიდებული უჯრედული დიფერენციაციის მანიშნებელია მრავალჯერადი ვიზუალიზაციის მოდალობის გამოყენებით (ნაბიჯები 11-24). მემბრანები, 2D მონოლიტერების შექმნა და ნაწლავის ბიოქიმიური და ბიომექანიკური მიკრო გარემოს რეპროდუქცია. vitro. 3D მორფოგენეზის ჩასატარებლად 2D ეპითელური მონოლითისგან, ჩვენ მოვიყვანეთ მორფოგენური ანტაგონისტები ორივე კულტივირებულ ფორმებში. IAL ფენა, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას მორფოგენზე დამოკიდებული ეპითელური ზრდის, გრძივი მასპინძელი-მიკრობიუმის კო-კულტურების, პათოგენური ინფექციის, ანთებითი დაზიანების, ეპითელური ბარიერის დისფუნქციისა და პრობიოტიკზე დაფუძნებული თერაპიების მაგალითზე.
ჩვენი პროტოკოლი შეიძლება სასარგებლო იყოს მეცნიერთა ფართო სპექტრისთვის ძირითადი (მაგ., ნაწლავის ლორწოვანის ბიოლოგია, ღეროვანი უჯრედების ბიოლოგია და განვითარების ბიოლოგია) და გამოყენებითი კვლევები (მაგ., პრეკლინიკური წამლების ტესტირება, დაავადების მოდელირება, ქსოვილის ინჟინერია და გასტროენტეროლოგია) ფართო ზემოქმედებით. წარმოიდგინეთ, რომ ჩვენი ტექნიკური სტრატეგია შეიძლება გავრცელდეს აუდიტორიაში, რომელიც სწავლობს უჯრედული სიგნალიზაციის დინამიკას ნაწლავის განვითარების, რეგენერაციის ან ჰომეოსტაზის დროს. გარდა ამისა, ჩვენი პროტოკოლი სასარგებლოა ინფექციის გამოსაკვლევად სხვადასხვა ინფექციური აგენტის ქვეშ, როგორიცაა ნოროვირუსი 8, მძიმე მწვავე რესპირატორული სინდრომი, კორონავირუსი 2 (SARS-CoV-სტრიოიმიუმი დიუმი 2 (SARS-CoV) ქოლერა.დაავადების პათოლოგიისა და პათოგენეზის აუდიტორია ასევე სასარგებლოა. ნაწლავის მიკროფიზიოლოგიის სისტემის გამოყენებამ შეიძლება დაუშვას გრძივი კოკულტურა 10 და შემდგომი შეფასება მასპინძლის თავდაცვის, იმუნური რეაქციების და პათოგენთან დაკავშირებული დაზიანების შეკეთება კუჭ-ნაწლავის ტრაქტში 11 . პუჩიტის ან გაღიზიანებული ნაწლავის სინდრომის სიმულაცია შესაძლებელია, როდესაც ნაწლავის 3D ეპითელიუმის შრეები მზადდება პაციენტის ნაწლავის ეპითელიუმის 3D შრეების გამოყენებით. დაავადების გარემოში, მკითხველმა შეიძლება განიხილოს დაავადების შესაბამისი უჯრედების ტიპების დამატება, როგორიცაა პაციენტის პერიფერიული სისხლის მონობირთვული უჯრედები (PBMCs), მოდელებს, რომლებიც შეიცავს 3D ნაწლავის ვილუს-კრიპტის მიკროარქიტექტურებს.ქსოვილის სპეციფიკური იმუნური უჯრედები, 5.
ვინაიდან 3D ეპითელიუმის მიკროსტრუქტურის დაფიქსირება და ვიზუალიზაცია შესაძლებელია სექციური პროცესის გარეშე, მაყურებლები, რომლებიც მუშაობენ სივრცულ ტრანსკრიპტომიკაზე და მაღალი გარჩევადობის ან სუპერ გარჩევადობის გამოსახულებაზე, შეიძლება დაინტერესებულნი იყვნენ ეპითელური ნიშების გენებისა და ცილების სივრცითი დროითი დინამიკის ჩვენებით.დაინტერესებულია ტექნოლოგიით. რეაგირება მიკრობულ ან იმუნურ სტიმულებზე. გარდა ამისა, გრძივი მასპინძელი-მიკრობიომის ჯვარედინი 10, 14, რომელიც კოორდინაციას უწევს ნაწლავის ჰომეოსტაზს, შეიძლება დადგინდეს ნაწლავის ლორწოვანის 3D შრეში სხვადასხვა მიკრობული სახეობების, მიკრობული თემების ან ფეკალური მიკრობიოტაში ერთობლივი კულტივირებით.პლატფორმაში. ეს მიდგომა განსაკუთრებით მიმზიდველია აუდიტორიისთვის, რომელიც სწავლობს ლორწოვანის იმუნოლოგიას, გასტროენტეროლოგიას, ადამიანის მიკრობიომს, კულტურომიკასა და კლინიკურ მიკრობიოლოგიას, რომელიც ცდილობს ნაწლავის ადრე დაუმუშავებელი მიკრობიოტის კულტივირებას ლაბორატორიაში. თუ ჩვენი in vitro მორფოგენეზის პროტოკოლი შეიძლება ადაპტირებული იყოს მასშტაბირებად კულტურულ ფორმატებზე, როგორიცაა 6 ან 249 უწყვეტი კულტურის ფორმატებში. გვერდითი ნაწილები, პროტოკოლი ასევე შეიძლება გავრცელდეს მათზე, ვინც ავითარებს ფარმაცევტულ, ბიოსამედიცინო ან მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგის ან ვალიდაციის პლატფორმებს კვების მრეწველობისთვის. როგორც პრინციპის დამადასტურებელი საბუთი, ჩვენ ახლახან ვაჩვენეთ მულტიპლექსური მაღალი გამტარუნარიანობის მორფოგენეზის სისტემის მიზანშეწონილობა. ამრიგად, ჩვენი in vitro მორფოგენეზის მეთოდის ვალიდაცია შეიძლება დაჩქარდეს და პოტენციურად იქნას მიღებული მრავალი კვლევითი ლაბორატორიის, ინდუსტრიის ან მთავრობისა და მარეგულირებელი სააგენტოს მიერ, რათა გაიგოს ინ ვიტრო ნაწლავის მორფოგენეზის უჯრედული რეპროგრამირება ტრანსკრიპტომურ დონეზე წამლების ან ბიოთერაპიული საშუალებების შესამოწმებლად. ნაწლავის მორფოგენეზის პროცესის განმეორებადობა.
ნაწლავის ეპითელიუმის მორფოგენეზის შესასწავლად გამოყენებულია ადამიანის შესაბამისი ექსპერიმენტული მოდელების შეზღუდული რაოდენობა, ძირითადად განხორციელებული პროტოკოლების არარსებობის გამო 3D მორფოგენეზის in vitro გამოწვევის მიზნით. სინამდვილეში, ნაწლავის მორფოგენეზის შესახებ არსებული ცოდნის დიდი ნაწილი ეფუძნება ცხოველებზე კვლევებს (მაგ. რაც მთავარია, ზუსტად არ განსაზღვრავს ადამიანის განვითარების პროცესებს. ეს მოდელები ასევე ძალიან შეზღუდულია მრავალმხრივ მასშტაბირებადი გზით ტესტირების უნარით. ამიტომ, ჩვენი პროტოკოლი 3D ქსოვილის სტრუქტურების რეგენერაციისთვის in vitro აჯობებს in vivo ცხოველურ მოდელებს, ისევე როგორც სხვა ტრადიციულ სტატიკური 2D უჯრედების კულტურის მოდელებს. კრიპტა-ვილუსის ღერძი სხვადასხვა ლორწოვანის ან იმუნური სტიმულის საპასუხოდ. 3D ეპითელიალურ შრეებს შეუძლიათ შესწავლილ იქნას, თუ როგორ ეჯიბრებიან მიკრობული უჯრედები სივრცის ნიშებისა და ეკოლოგიური ევოლუციის შექმნას მასპინძელი ფაქტორების საპასუხოდ (მაგ., ლორწოს შიდა და გარე შრეები, IgA-ს სეკრეცია და ანტიმიკრობული კვებითი პეპტიდები. აყალიბებს თავის საზოგადოებებს და სინერგიულად აწარმოებს მიკრობულ მეტაბოლიტებს (მაგ., მოკლე ჯაჭვის ცხიმოვან მჟავებს), რომლებიც აყალიბებენ უჯრედულ ორგანიზაციას და ღეროვანი უჯრედების ნიშებს ბაზალურ კრიპტებში. ამ მახასიათებლების დემონსტრირება შესაძლებელია მხოლოდ მაშინ, როდესაც 3D ეპითელური შრეები ჩამოყალიბდება in vitro.
ნაწლავის 3D ეპითელური სტრუქტურების შექმნის ჩვენი მეთოდის გარდა, არსებობს რამდენიმე ინ ვიტრო მეთოდი. ნაწლავის ორგანოიდური კულტურა არის ქსოვილის ინჟინერიის უახლესი ტექნიკა, რომელიც დაფუძნებულია ნაწლავის ღეროვანი უჯრედების კულტივაციაზე სპეციფიკურ მორფოგენურ პირობებში23,24,25. თუმცა, 3D ორგანოიდური მოდელების გამოყენება ხშირად არის სატრანსპორტო ანალიზისთვის. დახურულია ორგანოიდის შიგნით და, შესაბამისად, სანათურის კომპონენტების, როგორიცაა მიკრობული უჯრედები ან ეგზოგენური ანტიგენების შეყვანა შეზღუდულია.ორგანოიდულ სანათურზე წვდომა შეიძლება გაუმჯობესდეს მიკროინჟექტორის გამოყენებით,26,27, მაგრამ ეს მეთოდი ინვაზიური და შრომატევადია და შესასრულებლად მოითხოვს სპეციალიზებულ ცოდნას. გარდა ამისა, ჰიდროგელის ხარაჩოებში შენარჩუნებული ტრადიციული ორგანოიდური კულტურები სტატიკური პირობებში ზუსტად არ ასახავს აქტიურ in vivo ბიომექანიკას.
რამდენიმე კვლევის ჯგუფის მიერ გამოყენებული სხვა მიდგომები იყენებს წინასწარ სტრუქტურირებულ 3D ჰიდროგელის ხარაჩოებს ნაწლავის ეპითელური სტრუქტურის იმიტაციისთვის ადამიანის ნაწლავის იზოლირებული უჯრედების გელის ზედაპირზე კულტივირებით. გრადიენტები, მაღალი ასპექტის თანაფარდობის ეპითელური სტრუქტურისა და სტრომა-ეპითელიუმის ჯვარედინი შეჯვარების დამყარება სტრომული უჯრედების ჩართვით ხარაჩოში. თუმცა, წინასწარ სტრუქტურირებული ხარაჩოების ბუნებამ შეიძლება ხელი შეუშალოს თავად სპონტანური მორფოგენეტიკური პროცესის ჩვენებას. ეს მოდელები ასევე არ საჭიროებენ დინამიურ ლუმინალურ ან ინტერსტიციულ უჯრედებს დინამიურ ლუმინალურ ან სტრესს. ფიზიოლოგიური ფუნქცია. სხვა ბოლოდროინდელმა კვლევამ გამოიყენა ჰიდროგელის ხარაჩოები მიკროსთხევად პლატფორმაზე და ნაწლავის ეპითელიუმის ნიმუშიანი სტრუქტურები ლაზერული ამოღების ტექნიკის გამოყენებით. თაგვის ნაწლავის ორგანოიდები მიჰყვებიან ამოტვიფრულ შაბლონებს ნაწლავის მილაკოვანი სტრუქტურების შესაქმნელად, ხოლო სითხის შიდა ნაკადი არ შეიძლება შეჯამებული იყოს არც morowbit egut egut მოდულის გამოყენებით. მექანიკური ბიოლოგიური მოძრაობები. იმავე ჯგუფის 3D ბეჭდვის ტექნიკამ შეძლო მინიატურული ნაწლავის მილების შექმნა სპონტანური მორფოგენეტიკური პროცესებით. მილის შიგნით ნაწლავის სხვადასხვა სეგმენტების რთული წარმოების მიუხედავად, ამ მოდელს ასევე აკლია სანათური სითხის ნაკადი და მექანიკური დეფორმაცია. გარდა ამისა, მოდელის ფუნქციონირება შეიძლება შეზღუდული იყოს, განსაკუთრებით ბიუჯრედული ბეჭდვის პროცესის დასრულებამდე. ამის ნაცვლად, ჩვენი შემოთავაზებული პროტოკოლი უზრუნველყოფს ნაწლავის სპონტანურ მორფოგენეზს, ფიზიოლოგიურად შესაბამის ათვლის სტრესს, ბიომექანიკას, რომელიც ასახავს ნაწლავის მოძრაობას, დამოუკიდებელი აპიკალური და ბაზოლატერალური ნაწილების ხელმისაწვდომობას და მოდულარობის რთული ბიოლოგიური მიკროგარემოს ხელახლა შექმნას. ამიტომ, ჩვენმა in vitro 3D მორფოგენეზის პროტოკოლის არსებული გამოწვევა შეიძლება უზრუნველყოს.
ჩვენი პროტოკოლი მთლიანად ორიენტირებულია 3D ეპითელური მორფოგენეზზე, კულტურაში მხოლოდ ეპითელური უჯრედებით და არ არის სხვა ტიპის მიმდებარე უჯრედები, როგორიცაა მეზენქიმული უჯრედები, ენდოთელური უჯრედები და იმუნური უჯრედები. როგორც ადრე იყო აღწერილი, ჩვენი პროტოკოლის არსი არის ეპითელური მორფოგენეზის ინდუქცია, მორფოგენის მოცილებით, რომელიც აშორებს ჩვენს გვერდითი რობუსის ინჰიბიტორებს. ნაწლავი-ჩიპზე და ჰიბრიდი-ჩიპზე საშუალებას გვაძლევს ხელახლა შევქმნათ ტალღოვანი 3D ეპითელიუმის ფენა, დამატებითი ბიოლოგიური სირთულეები, როგორიცაა ეპითელური-მეზენქიმული ურთიერთქმედება33,34, უჯრედგარე მატრიქსის (ECM) დეპონირება 35 და, ჩვენს მოდელში, კრიპტო-ღეროვანი ღეროვანი უჯრედების შემდგომი განხილვა. ფიბრობლასტები) მეზენქიმში მთავარ როლს ასრულებენ ECM ცილების წარმოებაში და ნაწლავის მორფოგენეზის რეგულირებაში in vivo35,37,38. მეზენქიმული უჯრედების დამატებამ ჩვენს მოდელში გაზარდა მორფოგენეტიკური პროცესი და უჯრედების მიმაგრების ეფექტურობა. ნაწლავის მიკროგარემოში. გარდა ამისა, სისხლძარღვთა კომპონენტები, რომლებიც შეიძლება დაკავშირებული იყოს ქსოვილის მოდელებს შორის, წინაპირობაა, როდესაც ქსოვილის მოდელები შექმნილია მრავალორგანული ურთიერთქმედების დემონსტრირებისთვის. ამიტომ, ენდოთელური უჯრედების ჩართვა შეიძლება საჭირო გახდეს უფრო ზუსტი ფიზიოლოგიური მახასიათებლების მოდელირებისთვის, ორგანოს დონის გარჩევადობით. პაციენტის წარმოშობის იმუნური პასუხის საწინააღმდეგოდ, იმუნური ადაპტაციისთვის აუცილებელია. k და ქსოვილის სპეციფიკური იმუნიტეტი ნაწლავური დაავადების იმიტაციის კონტექსტში.
ჰიბრიდული ჩიპების გამოყენება უფრო მარტივია, ვიდრე ნაწლავის ჩიპზე, რადგან მოწყობილობის დაყენება უფრო მარტივია და ტრანსველის ჩანართების გამოყენება იძლევა ნაწლავის ეპითელიუმის მასშტაბურ კულტურას. თუმცა, კომერციულად ხელმისაწვდომი ტრანსველის ჩანართები პოლიესტერის მემბრანებით არ არის ელასტიური და ვერ ახდენს პერისტალტიკის მსგავსი მოძრაობების სიმულაციას. აპიკალურ მხარეს ათვლის სტრესის გარეშე. ცხადია, აპიკალურ ნაწილში სტატიკური თვისებები იშვიათად იძლევა ჰიბრიდულ ჩიპებში ბაქტერიების ხანგრძლივ კოკულტურას. მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ შეგვიძლია მძლავრად გამოვიწვიოთ 3D მორფოგენეზი ტრანსველის ჩანართებში ჰიბრიდული ჩიპების გამოყენებისას, ჩიპების ნაკლებობამ შეიძლება შეზღუდოს ფიზიოლოგიურად რელევანტური ჩიპების პოტენციალი ბიომექანიკა.
ადამიანის საძვალე-ღერძის სრულმასშტაბიანი რეკონსტრუქცია ნაწლავის ჩიპზე და ჰიბრიდულ ჩიპზე კულტურებში ბოლომდე არ არის დადგენილი. ვინაიდან მორფოგენეზი იწყება ეპითელური მონოშრიდან, 3D მიკროარქიტექტურები სულაც არ იძლევა მორფოლოგიურ მსგავსებას კრიპტებთან კრიპტულ პოპულაციასთან, რომელიც ჩვენ ვივო-უჯრედთან ახლოს ახასიათებს. ჩანერგილი 3D ეპითელიუმი, საძვალე და ღვარცოფული რეგიონები მკაფიოდ არ იყო გამოყოფილი. მიუხედავად იმისა, რომ ჩიპზე უფრო მაღალი ზედა არხები იწვევს მიკროინჟინერიული ეპითელიუმის სიმაღლეს, მაქსიმალური სიმაღლე მაინც შემოიფარგლება ~300-400 μm. წვრილი ნაწლავის ღრძილების ~600 μm41.
ვიზუალიზაციის თვალსაზრისით, 3D მიკროარქიტექტურების in situ სუპერ გარჩევადობის გამოსახულება შეიძლება შემოიფარგლოს ჩიპზე ნაწლავით, რადგან ობიექტური ლინზიდან ეპითელიუმის შრემდე სამუშაო მანძილი რამდენიმე მილიმეტრის ტოლია. გარდა ამისა, ვინაიდან ჩიპზე ნაწლავის ფენა-ფენა მიკროფაბრიკაცია გულისხმობს მუდმივ ადჰეზიას თითოეულ ფენას შორის, უკიდურესად რთულია ზედა ფენის გახსნა ან ამოღება ეპითელური შრის ზედაპირის სტრუქტურის შესამოწმებლად. მაგალითად, სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპის (SEM) გამოყენებით.
PDMS-ის ჰიდროფობიურობა შემაკავებელი ფაქტორი იყო მიკროსთხევად დაფუძნებულ კვლევებში, რომლებიც ეხება ჰიდროფობიურ მცირე მოლეკულებს, ვინაიდან PDMS-ს შეუძლია არასპეციფიკურად ადსორბირება ასეთი ჰიდროფობიური მოლეკულების. ჰიდროფობიური მოლეკულების ადსორბციის მინიმუმამდე შემცირება.
დაბოლოს, ჩვენი მეთოდი კარგად არ არის დახასიათებული მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგის ან მომხმარებლისთვის მოსახერხებელი ექსპერიმენტული პლატფორმის უზრუნველყოფის თვალსაზრისით. მიმდინარე პროტოკოლი მოითხოვს შპრიცის ტუმბოს თითოეულ მიკრო მოწყობილობაზე, რომელიც იკავებს ადგილს CO2 ინკუბატორში და ხელს უშლის ფართომასშტაბიან ექსპერიმენტებს. ფოროვანი ჩანართები, რომლებიც იძლევა ბაზოლატერალური მედიის უწყვეტი შევსების და მოცილების საშუალებას).
ადამიანის ნაწლავის ეპითელიუმის 3D მორფოგენეზის ინ ვიტროში გამოსაწვევად, ჩვენ გამოვიყენეთ მიკროფლუიდური ჩიპური ნაწლავის მოწყობილობა, რომელიც შეიცავს ორ პარალელურ მიკროარხს და ელასტიურ ფოროვან მემბრანას შორის სანათურ-კაპილარული ინტერფეისის შესაქმნელად. ორივე პლატფორმაზე, ადამიანის ნაწლავის სხვადასხვა ეპითელური უჯრედების მორფოგენეზის დემონსტრირება შესაძლებელია დინების მიმართული მანიპულაციის გამოყენებით ბაზოლატერალური განყოფილებიდან მორფოგენის ანტაგონისტების მოსაშორებლად. მთელი ექსპერიმენტული პროცედურა (სურათი 1) შედგება ხუთი ნაწილისგან: (i) ნაწლავის ჩიპის მიკროფაბრიკაცია ან ტრანსუელში ჩასმული ჰიბრიდული ჩიპი1-ტესტი უჯრედები (Caco-2 უჯრედები) ან ადამიანის ნაწლავის ორგანოიდები;უჯრები 2-5), (iii) ნაწლავის ეპითელური უჯრედების კულტურა ნაწლავის ჩიპებზე ან ჰიბრიდულ ჩიპებზე (ეტაპები 6-9), (iv) 3D მორფოგენეზის ინდუქცია in vitro (ნაბიჯი 10) და (v) ) 3D ეპითელიუმის მიკროსტრუქტურის დასახასიათებლად (ეტაპები 11-24-მდე იყო შესაბამისი კონტროლის ეფექტურობა შემუშავებული ჯგუფში 11-24). in vitro მორფოგენეზი ეპითელური მორფოგენეზის სივრცულ, დროებით, პირობით ან პროცედურულ კონტროლებთან შედარებით.
ჩვენ გამოვიყენეთ ორი განსხვავებული კულტურის პლატფორმა: ნაწლავის ჩიპზე სწორი არხებით ან არაწრფივი ჩახლართული არხებით, ან ჰიბრიდული ჩიპები, რომლებიც შეიცავს Transwell (TW) ჩანართებს მიკროფლუიდური მოწყობილობაში, შემუშავებული, როგორც აღწერილია უჯრა 1-ში, და ნაბიჯი 1 -5. Device Fabrication“ გვიჩვენებს ჩიპის დამზადების ძირითად ნაბიჯებს (ახსნის ჩიპის ჰიბრიდული უჯრედის ჰიბრიდული C წყაროს“ (HubridC ჩიპის ჰიბრიდული ტესტი). aco-2 ან ადამიანის ნაწლავის ორგანოიდები) და ამ პროტოკოლში გამოყენებული კულტურის პროცედურა. ”In vitro მორფოგენეზი” გვიჩვენებს საერთო საფეხურებს, რომლებშიც Caco-2 ან ორგანოიდისაგან მიღებული ეპითელური უჯრედები კულტივირებულია ნაწლავის ჩიპზე ან ჰიბრიდული ჩიპის ტრანსუელის ჩანართებზე, რასაც მოჰყვება 3D arrow-ის ინდუქცია და ყოველი საფეხურის მორფოგენეზის პროგრამის ფორმირება. მაგალითები, თუ როგორ შეიძლება გამოყენებულ იქნას ნაწლავის ეპითელური ფენების ჩამოყალიბება, მაგალითად, უჯრედების დიფერენციაციის დახასიათებაში, ნაწლავის ფიზიოლოგიის კვლევებში, მასპინძელი მიკრობიომის ეკოსისტემების ჩამოყალიბებაში და დაავადების მოდელირებაში. იმუნოფლუორესცენციის გამოსახულებები "უჯრედების დიფერენციაციაში" გვიჩვენებს ბირთვებს, F-actin და MUC3D ჩიპის ჩიპს 2 გამოსახულებას. წარმოდგენილია თასების უჯრედებში და ლორწოვანი გარსის ზედაპირებიდან გამოყოფილ ლორწოვანში. ნაწლავის ფიზიოლოგიაში ფლუორესცენტური გამოსახულებები გვიჩვენებს ლორწოს, რომელიც წარმოიქმნება სიალიუმის მჟავისა და N-აცეტილგლუკოზამინის ნარჩენების შეღებვის შედეგად ფლუორესცენტური ხორბლის ჩანასახის აგლუტინინის გამოყენებით. ორ გადახურულ სურათზე ნაჩვენებია "მასპინძელი-მიკრობული ჩიპური კო-ნაწლავის მარცხნივ" პანელი. გვიჩვენებს E. coli-ს, რომელიც გამოხატავს მწვანე ფლუორესცენტურ პროტეინს (GFP) მიკროინჟინერიულ 3D Caco-2 ეპითელიალურ უჯრედებთან ერთად. მარჯვენა პანელი აჩვენებს GFP E. coli-ს ლოკალიზაციას, რომელიც კულტივირებულია 3D Caco-2 ეპითელიალურ უჯრედებთან, რასაც მოჰყვება იმუნოფლუორესცენციული შეღებვა F-აქტინოზური (ჯანმრთელი) და დიაქტინეზური (ჯანსაღი) მოდელით. ნაწლავის ანთება ჩიპებს ფიზიოლოგიურ გამოწვევას ბაქტერიული ანტიგენებით (მაგ., ლიპოპოლისაქარიდი, LPS) და იმუნური უჯრედებით (მაგ., PBMC;მწვანე). Caco-2 უჯრედები კულტივირებული იყო 3D ეპითელური შრის დასამყარებლად. მასშტაბის ზოლი, 50 μm. სურათები ქვედა რიგში: „უჯრედების დიფერენციაცია“ ადაპტირებულია მითითების ნებართვით.2.ოქსფორდის უნივერსიტეტის გამომცემლობა;რეპროდუცირებულია Ref.5-ის ნებართვით.NAS;„მასპინძელი-მიკრობული კო-კულტურა“ ადაპტირებულია ref.3-ის ნებართვით.NAS;„დაავადების მოდელირება“ ადაპტირებულია მითითების ნებართვით.5.NAS.
ორივე ჩიპზე და ჰიბრიდული ჩიპები დამზადდა PDMS ასლების გამოყენებით, რომლებიც ჩამოსხმული იყო სილიკონის ყალიბებიდან რბილი ლითოგრაფიით1,44 და SU-8-ის ნიმუშით. მიკროარხების დიზაინი თითოეულ ჩიპში განისაზღვრება ჰიდროდინამიკის გათვალისწინებით, როგორიცაა ათვლის სტრესი და ჰიდროდინამიკური წნევა1,4,12. ერთმანეთის მიყოლებით დაყენებული პარალელური სწორი მიკროარხები, გადაიქცა კომპლექსურ ნაწლავად-ჩიპზე (გაფართოებული მონაცემები ნახ. 1ბ), რომელიც მოიცავს წყვილ მრუდი მიკროარხებს სითხის ბინადრობის გაზრდის მიზნით, არაწრფივი ნაკადის შაბლონების და კულტივირებული უჯრედების მრავალღერძულ დეფორმაციას (ნახ. 2a. შეიძლება არჩეული იყოს on-a-chip. ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ ჩახლართული Gut-Chip ასევე ძლიერად იწვევს 3D მორფოგენეზს მსგავს ვადებში, იგივე ხარისხით ეპითელიუმის ზრდასთან შედარებით თავდაპირველ Gut-Chip-თან შედარებით, მიუხედავად კულტივირებული უჯრედის ტიპისა. ამიტომ, 3D მორფოგენეზის გამოწვევის მიზნით, ხაზოვანი და რთული ნაწლავის მოლფოგენეზირება ხდება MS-ზე. SU-8 შაბლონებმა აჩვენეს უარყოფითი თვისებები ჩამონგრევის შემდეგ (ნახ.2a). ჩიპზე ნაწლავის გასაკეთებლად, მომზადებული ზედა PDMS ფენა თანმიმდევრულად იყო მიბმული ფოროვან PDMS ფილაზე და შემდეგ შეუქცევადი შემაკავშირებლობით კორონა დამმუშავებლის გამოყენებით (ნახ. 2b–f). ჰიბრიდული ჩიპების გასაკეთებლად, გამაგრილ PDMS რეპლიკას შეეძლო მიმაგრებულიყო ერთჯერადი მინის მოწყობილობებზე. s (ნახ. 2სთ და გაფართოებული მონაცემები ნახ. 2). შემაკავშირებელი პროცესი ხორციელდება PDMS რეპლიკასა და შუშის ზედაპირების დამუშავებით ჟანგბადის პლაზმურით ან კორონით დამუშავებით. სილიკონის მილზე მიმაგრებული მიკროფაბრიკატური მოწყობილობის სტერილიზაციის შემდეგ, მოწყობილობის დაყენება მზად იყო ჩაეტარებინა 3D მორფოგენეზური ტესტირება.
a, PDMS ნაწილების მომზადების სქემატური ილუსტრაცია SU-8 შაბლონიანი სილიკონის ყალიბებიდან. დაუმუშავებელი PDMS ხსნარი დაასხით სილიკონის ფორმაზე (მარცხნივ), გამკვრივდა 60 °C-ზე (შუაში) და ჩამოსხმა (მარჯვნივ). ჩამოსხმული PDMS დაჭრა ნაწილებად და გაიწმინდა შემდგომი გამოყენებისთვის. ყალიბი, რომელიც გამოიყენება PDMS ფოროვანი მემბრანის დასამზადებლად.d, ზედა და ქვედა PDMS კომპონენტების ფოტოების სერია და აწყობილი ჩიპზე ნაწლავის მოწყობილობა.ე, ზედა, მემბრანის და ქვედა PDMS კომპონენტების განლაგების სქემა. თითოეული ფენა შეუქცევადად არის შეკრული პლაზმური, შხამიანი გუგური დამუშავების პლაზმური, გუგუნიური დამუშავებით. ed microchannels and vacuum chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell კულტურისთვის. გამოგონილი ნაწლავი ჩიპზე, რომელიც აწყობილია სილიკონის მილით და შპრიცით, მოთავსდა საფარზე. ჩიპური მოწყობილობა მოთავსებული იყო 150 მმ პეტრის ჭურჭლის სახურავზე დასამუშავებლად. ბაინდერი გამოიყენება ქსოვილის დასაკეტად. და 3D მორფოგენეზი ჰიბრიდული ჩიპების გამოყენებით. დამოუკიდებლად მომზადებული ტრანსველის ჩანართები ნაწლავის ეპითელური უჯრედების 2D მონოფენების კულტივირებისთვის იყო ჩასმული ჰიბრიდულ ჩიპში ნაწლავის 3D მორფოგენეზის გამოწვევის მიზნით. გარემოს პერფუზია ხდება მიკროარხებით უჯრედის ფენის ქვეშ, რომელიც დაფუძნებულია ტრანსმისიის ბარიერის ჩანართზე, სმ1-დან.ელზევიე.
ამ პროტოკოლში, Caco-2 უჯრედის ხაზი და ნაწლავის ორგანოიდები გამოიყენებოდა ეპითელური წყაროების სახით (ნახ. 3a). ორივე ტიპის უჯრედი დამოუკიდებლად კულტივირებული იყო (ყუთი 2 და ყუთი 5) და გამოიყენებოდა ECM-დაფარული მიკროარხების დასათესად ჩიპზე ნაწლავის ან ტრანსუელის ჩანართებით. პასაჟები 10 და 50) T-კოლბებში გროვდება ტრიფსინიზაციის სითხით დისოცირებული უჯრედის სუსპენზიების მოსამზადებლად (ყუთი 2). ადამიანის ნაწლავური ორგანოიდები ნაწლავის ბიოფსიიდან ან ქირურგიული რეზექციისგან კულტივირებული იყო მატრიგელის ხარაჩოების გუმბათებში 24 ჭაბურღილების ფირფიტებში, რომელიც შეიცავს მიკროფოგენის სტრუქტურას. პონდინი და ნოგგინი) და ზრდის ფაქტორები, რომლებიც მომზადებული იყო მე-3 ჩანართში, ავსებდნენ ყოველ მეორე დღეს, სანამ ორგანოიდები არ გაიზრდებოდა ~500 მკმ დიამეტრამდე. სრულად მოზრდილი ორგანოიდები გროვდება და ნაწილდება ერთ უჯრედებად ჩიპზე ნაწლავის ან ტრანსუელის ჩანართებზე დასათესად (ჩანართი 5). , კოლორექტალური კიბო ან ნორმალური დონორი), დაზიანების ადგილი (მაგ., დაზიანება არადაზიანებული უბნის წინააღმდეგ) და კუჭ-ნაწლავის მდებარეობა ტრაქტში (მაგ., თორმეტგოჯა ნაწლავი, ჯეჯუნუმი, ილეუმი, ბრმა ნაწლავი, მსხვილი ნაწლავი ან სწორი ნაწლავი). ჩვენ გთავაზობთ ოპტიმიზებულ პროტოკოლს 5-ში მსხვილი ნაწლავის ორგანოების კულტივირებისთვის, რომლებიც ჩვეულებრივ მოითხოვს მსხვილი ნაწლავის ორგანოოიდების მაღალ კონცენტრაციას (კოლოიდებს).
a, სამუშაო ნაკადი ნაწლავის მორფოგენეზის ინდუქციისთვის ნაწლავის ჩიპში. Caco-2 ადამიანის ნაწლავის ეპითელიუმი და ნაწლავის ორგანოიდები გამოიყენება ამ პროტოკოლში 3D მორფოგენეზის დემონსტრირებისთვის. იზოლირებული ეპითელური უჯრედები დათესეს მომზადებულ ნაწლავზე ჩიპზე მოწყობილ მოწყობილობაში (ჩიპის მომზადება) და მიმაგრებული (ფდ) უჯრედები (მიმაგრებულია PD-ზე). მემბრანა 0 (D0) დღეს, აპიკალური (AP) ნაკადი იწყება და შენარჩუნებულია პირველი 2 დღის განმავლობაში (ნაკადი, AP, D0-D2). ბაზოლატერალური (BL) ნაკადი ასევე იწყება ციკლურ გაჭიმვის მოძრაობებთან ერთად (გაჭიმვა, ნაკადი, AP და BL), როდესაც წარმოიქმნება სრული 2D მონოიდური ფენა. ფოგენეზი, D5). ფაზის კონტრასტის გამოსახულებები აჩვენებს Caco-2 უჯრედების წარმომადგენლობით მორფოლოგიას თითოეულ ექსპერიმენტულ საფეხურზე ან დროის მომენტში (სტრიქონიანი დიაგრამა, 100 μm). ნაწლავის მორფოგენეზის შესაბამის კასკადებს ასახავს ოთხი სქემა. ft). ჩანართი, რომელიც ხაზს უსვამს გადიდებულ არეალს (თეთრი წყვეტილი ყუთი) აჩვენებს რეგენერირებულ მიკროვილებს 3D Caco-2 ფენაზე (მარჯვნივ).c, ჩამოყალიბებული Caco-2 3D-ის ჰორიზონტალური შუბლის ხედი, კლაუდინი (ZO-1, წითელი) და უწყვეტი ფუნჯის სასაზღვრო მემბრანები ეტიკეტირებული F-აქტინის ვიზუალური ფოკუსირებულ უჯრედებზე (მწვანე) სათესლე ჩიპები. ისრები, რომლებიც მიუთითებენ შუა სქემაზე, მიუთითებს ფოკუსური სიბრტყის მდებარეობას თითოეული კონფოკალური ხედისთვის.d, ფაზური კონტრასტული მიკროსკოპით მიღებულ ჩიპზე კულტივირებული ორგანოიდების მორფოლოგიური ცვლილებების დრო 3, 7, 9, 11 და 13 დღეებში. ჩასმა (ზედა მარჯვნივ) გვიჩვენებს მაღალი გადიდება D organoidmi croeoid IC-ზე. ნაჭერი, გადაღებული 7.f დღეს, გადაფარული იმუნოფლუორესცენციის სურათები, რომლებიც აჩვენებს მარკერებს ღეროვანი უჯრედებისთვის (LGR5;მაგენტა), გობლის უჯრედები (MUC2; მწვანე), F-აქტინი (ნაცრისფერი) და ბირთვები (ცისფერი) გაზრდილი ნაწლავის ჩიპებზე 3 დღის განმავლობაში, შესაბამისად (მარცხნივ) და 13-დღიანი (შუა) ორგანოიდები ეპითელიუმის შრეზე. აგრეთვე იხილეთ გაფართოებული მონაცემთა სურათი 3, რომელიც ხაზს უსვამს LGR5-ის გამოსახულების სიგნალიზაციის გარეშე. 3D ორგანული ეპითელიუმის ure (მარჯვნივ) ჩამოყალიბებული ნაწლავში ჩიპზე პლაზმური მემბრანის შეღებვით CellMask საღებავით (მარჯვნივ) კულტურის მე-13 დღეს. მასშტაბის ზოლი არის 50 μm, თუ სხვა რამ არ არის მითითებული.b ხელახლა დაბეჭდილია მითითებიდან გამომდინარე.2.ოქსფორდის უნივერსიტეტის გამომცემლობა;c ადაპტირებულია მითითების ნებართვით.2.ოქსფორდის უნივერსიტეტის გამომცემლობა;e და f ადაპტირებულია ნებართვით მითითებით.12 Creative Commons License CC BY 4.0.
ჩიპზე ნაწლავში აუცილებელია PDMS ფოროვანი მემბრანის ჰიდროფობიური ზედაპირის მოდიფიცირება წარმატებული ECM-ის დაფარვისთვის. ამ პროტოკოლში ჩვენ ვიყენებთ ორ განსხვავებულ მეთოდს PDMS მემბრანების ჰიდროფობიურობის შესაცვლელად. Caco-2 უჯრედების კულტივირებისთვის, ზედაპირის გააქტიურება მხოლოდ UV/ოზონით იყო საკმარისი იმისათვის, რომ შემცირდეს PD- EC მემბრანის ჰიდროფობიურობა და MS EC-ის უჯრედების ჰიდროფობიურობა. ე. თუმცა, ორგანული ეპითელიუმის მიკროფლუიდური კულტურა მოითხოვს ქიმიურ საფუძველზე ზედაპირის ფუნქციონალიზაციას ECM ცილების ეფექტური დეპონირების მისაღწევად პოლიეთილენიმინისა (PEI) და გლუტარალდეჰიდის თანმიმდევრული გამოყენებით PDMS მიკროარხებზე. ზედაპირის მოდიფიკაციის შემდეგ, ECM პროტეინები დეპონირდება, რათა დაიფაროს ორგანული უჯრედები და შემდეგ ფუნქციონირებს PDMS უჯრედებში. მიკროფლუიდური უჯრედის კულტურა იწყება მხოლოდ მედიუმის პერფუზიით ზედა მიკროარხში, სანამ უჯრედები არ შექმნიან სრულ მონოფენას, ხოლო ქვედა მიკროარხი ინარჩუნებს სტატიკურ პირობებს. ზედაპირის გააქტიურებისა და ECM საფარის ეს ოპტიმიზირებული მეთოდი საშუალებას აძლევს ორგანული ეპითელიუმის მიმაგრებას, გამოიწვიოს 3D მორფოგენეზი PDMS ზედაპირზე.
ტრანსველის კულტურებს ასევე სჭირდებათ ECM საფარი უჯრედის დათესვამდე;თუმცა, ტრანსველის კულტურებს არ სჭირდებათ წინასწარი დამუშავების რთული ეტაპები ფოროვანი ჩანართების ზედაპირის გასააქტიურებლად. ტრანსველების ჩანართებზე Caco-2 უჯრედების გასაზრდელად, ფოროვან ჩანართებზე ECM საფარი აჩქარებს დისოცირებული Caco-2 უჯრედების მიმაგრებას (<1 საათი) და მჭიდრო გადაკვეთის ბარიერის წარმოქმნას (<1-2 დღე). ჩანართები, მიმაგრებული მემბრანის ზედაპირზე (<3 სთ) და შენარჩუნებულია მანამ, სანამ ორგანოიდები არ შექმნიან სრულ მონოფენას ბარიერის მთლიანობით. ტრანსველის კულტურები ტარდება 24 ჭაბურღილიან ფირფიტებში ჰიბრიდული ჩიპების გამოყენების გარეშე.
In vitro 3D მორფოგენეზი შეიძლება დაიწყოს სითხის ნაკადის გამოყენებით დადგენილი ეპითელიუმის ფენის ბაზოლატერალურ ასპექტზე. ჩიპზე ნაწლავში ეპითელიუმის მორფოგენეზი დაიწყო, როდესაც გარემო შედიოდა ზედა და ქვედა მიკროარხებში (ნახ. 3a). ors. ფოროვან მემბრანებზე შეკრული უჯრედებისთვის საკმარისი საკვები ნივთიერებებისა და შრატის უზრუნველსაყოფად და სანათურის ათვლის სტრესის წარმოქმნის მიზნით, ჩვენ ჩვეულებრივ ვატარებთ ორმაგ ნაკადს ნაწლავში ჩიპზე. ჰიბრიდულ ჩიპებში, ტრანსუელის ჩანართები ეპითელური მონოშრეების შემცველი იყო ჩასმული ჰიბრიდულ ჩიპებში. შემდეგ, გარემო გამოყენებული იქნა ფოროვანი ცალმხრივი ცალმხრივი 3 დღის განმავლობაში. ბაზოლატერალური ნაკადის დაწყების შემდეგ ორივე კულტურის პლატფორმაზე.
მიკროინჟინერიული 3D ეპითელური ფენების მორფოლოგიური მახასიათებლები შეიძლება გაანალიზდეს გამოსახულების სხვადასხვა მოდალობის გამოყენებით, მათ შორის ფაზური კონტრასტის მიკროსკოპია, დიფერენციალური ჩარევის კონტრასტის (DIC) მიკროსკოპია, SEM ან იმუნოფლუორესცენტული კონფოკალური მიკროსკოპია (სურათები 3 და 4). PDMS-ისა და პოლიესტერის ფილმების ოპტიკური გამჭვირვალობის გამო, ორივე ჩიპზე და ჰიბრიდულ პლატფორმას შეუძლია უზრუნველყოს რეალურ დროში in situ გამოსახულება მოწყობილობის განყოფილების ან დაშლის საჭიროების გარეშე. იმუნოფლუორესცენციული გამოსახულების შესრულებისას (სურათები 1, 3c, f და 4b, voltformed, f and 4b) მოჰყვება Triton X-100 და 2% (wt/vol) მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინი (BSA), თანმიმდევრობით. უჯრედის ტიპის მიხედვით, შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა ფიქსატორები, გამტარიანები და ბლოკატორები. პირველადი ანტისხეულები, რომლებიც მიზნად ისახავს შთამომავლობაზე დამოკიდებულ უჯრედს ან რეგიონის მარკერებს ხაზგასმით აღსანიშნავად, მეორე სამიზნე უჯრედებთან ერთად იმობილიზებული ჩიპებით. 4',6-დიამიდინო-2-ფენილენი) ინდოლი, DAPI) ან F-აქტინი (მაგ., ფლუორესცენტურად მონიშნული ფალოიდინი). ფლუორესცენტზე დაფუძნებული ცოცხალი გამოსახულება ასევე შეიძლება შესრულდეს ადგილზე ლორწოს წარმოების გამოსავლენად (ნახ.1, „უჯრედების დიფერენციაცია“ და „ნაწლავის ფიზიოლოგია“), მიკრობული უჯრედების შემთხვევითი კოლონიზაცია (ნახ. 1, „მასპინძლისა და მიკრობების ერთობლივი კულტურა“), იმუნური უჯრედების რეკრუტირება (ნახ. 1, „დაავადების მოდელირება“) ან 3D ეპითელიუმის მორფოლოგიის გამოყოფა (ნახ. თითო ფენის ქვედა მიკროარხის შრედან, როგორც აღწერილია ref. როგორც ნახ. 2-შია ნაჩვენები, 3D ეპითელიუმის მორფოლოგია, ისევე როგორც მიკროვილები აპიკალური ფუნჯის საზღვარზე, შეიძლება ვიზუალურად გამოიყურებოდეს SEM-ით (ნახ. 3b). Brid ჩიპებს იღებენ ტრიფსინიზაციის გზით და შემდეგ გამოიყენება მოლეკულური ან გენეტიკური ანალიზისთვის.
a, სამუშაო ნაკადი ჰიბრიდულ ჩიპში ნაწლავის მორფოგენეზის ინდუქციისთვის. Caco-2 და ნაწლავის ორგანოიდები გამოიყენება ამ პროტოკოლში 3D მორფოგენეზის დემონსტრირებისთვის ჰიბრიდული ჩიპის პლატფორმაში. დისოცირებული ეპითელური უჯრედები დათესეს ტრანსუელის მომზადებულ ჩანართებში (TW prep; იხილეთ ნახაზი ქვემოთ). ყველა უჯრედი კულტივირებული იყო სტატიკურ პირობებში (TW კულტურა). 7 დღის შემდეგ, ერთი ტრანსველის ჩანართი, რომელიც შეიცავდა ეპითელური უჯრედების 2D მონოფენას, ინტეგრირებული იყო ჰიბრიდულ ჩიპში ბაზოლატერალური ნაკადის დასანერგად (Flow, BL), რამაც საბოლოოდ გამოიწვია 3D ეპითელური ფენის წარმოქმნა (ადამიანის ეპითელური უჯრედების ნორმალური მიკროგრაფიული კონტრასტული ფენის წარმოქმნა). 103 ხაზი) ​​აღმავალი მსხვილი ნაწლავი თითოეულ ექსპერიმენტულ საფეხურზე ან დროის მომენტში. ზედა ფენების სქემები ასახავს ექსპერიმენტულ კონფიგურაციას თითოეული საფეხურისთვის.b, ჰიბრიდულმა ჩიპებმა (მარცხნივ სქემატურად) შეიძლება გამოიწვიოს ორგანული ეპითელური უჯრედების 3D მორფოგენეზი ზემოდან ქვემოდან კონფოკალური მიკროსკოპის ხედებით (შუა, ზემოდან განსხვავებული პოზიციით გადაღებული).იხილეთ მარჯვენა სქემატური და შესაბამისი წერტილოვანი ხაზები).აჩვენა აშკარა მორფოლოგიური მახასიათებლები. F-აქტინი (ციანი), ბირთვი (ნაცრისფერი).c, ფლუორესცენციური კონფოკალური მიკროგრაფები (3D კუთხიანი ხედი) ორგანოიდური წარმოშობის ეპითელური უჯრედების კულტივირებული სტატიკური ტრანსუელში (TW; ჩასმული თეთრი წყვეტილი ყუთში) ჰიბრიდულ ჩიპთან (ყველაზე დიდი სრული კადრი) 2D ჯვარედინი ხედის შედარება. ჩასმული ზედა მარჯვენა კუთხეში; "XZ") ასევე აჩვენებს 2D და 3D მახასიათებლებს. მასშტაბის ზოლი, 100 μm.c ხელახლა დაბეჭდილი მითითების ნებართვით.4.ელზევიე.
კონტროლის მომზადება შესაძლებელია იმავე უჯრედების (CACO-2 ან ნაწლავის ორგანოიდული ეპითელური უჯრედების) კულტივირებით ორგანზომილებიან მონოლიტებად, ჩვეულებრივი სტატიკური კულტურის პირობებში. რაც არ უნდა გამოიწვიოს საკვები ნივთიერებების დაქვეითებამ შეიძლება გამოიწვიოს მიკროკანელების შეზღუდული მოცულობის სიმძლავრე (IE ~ 4 μL– ს წინაშე. .
რბილი ლითოგრაფიის პროცესი უნდა ჩატარდეს სუფთა ოთახში. ჩიპზე (ზედა და ქვედა ფენები და მემბრანები) და ჰიბრიდული ჩიპების თითოეული ფენისთვის გამოყენებული იყო სხვადასხვა ფოტონიღბები და დამზადდა ცალკე სილიკონის ვაფლებზე, რადგან მიკროარხების სიმაღლეები განსხვავებული იყო. ჩიპზე ნაწლავის ზედა და ქვედა მიკროარხების სამიზნე სიმაღლეები ჩიპზე ნაწლავის ზედა და ქვედა მიკროარხების სამიზნე სიმაღლეებია ჩიპზე არხის სამიზნე 2000. 200 მკმ.
მოათავსეთ 3 დიუმიანი სილიკონის ვაფლი აცეტონით ჭურჭელში. ნაზად მოურიეთ ფირფიტა 30 წამის განმავლობაში, შემდეგ გააშრეთ ვაფლი. გადაიტანეთ ვაფლი თეფშზე IPA-ით, შემდეგ დაატრიალეთ ფირფიტა 30 წამის განმავლობაში გასაწმენდად.
პირანას ხსნარი (წყალბადის ზეჟანგის და კონცენტრირებული გოგირდის მჟავის ნაზავი, 1:3 (მოც./მოც.)) შეიძლება გამოყენებულ იქნას სილიციუმის ვაფლის ზედაპირიდან ორგანული ნარჩენების მაქსიმალურად მოცილების მიზნით.
Piranha-ს ხსნარი უკიდურესად კოროზიულია და წარმოქმნის სითბოს. საჭიროა უსაფრთხოების დამატებითი ზომები. ნარჩენების განადგურებისთვის ნება მიეცით ხსნარი გაცივდეს და გადაიტანოთ სუფთა, მშრალ ნარჩენების კონტეინერში. გამოიყენეთ მეორადი კონტეინერები და სათანადოდ მონიშნეთ ნარჩენების კონტეინერები. გთხოვთ, მიჰყვეთ დაწესებულების უსაფრთხოების სახელმძღვანელო მითითებებს უფრო დეტალური პროცედურებისთვის.
ვაფლის დეჰიდრატაცია მოათავსეთ 200 °C ცხელ თეფშზე 10 წუთის განმავლობაში. დეჰიდრატაციის შემდეგ ვაფლი ხუთჯერ შეანჯღრიეთ ჰაერში გასაციებლად.
გაწმენდილი სილიკონის ვაფლის ცენტრში დაასხით ~ 10 გ ფოტორეზისტი SU-8 2100. გამოიყენეთ პინცეტი, რომ თანაბრად გაანაწილოთ ფოტორეზისტი ვაფლზე. ზოგჯერ ვაფლი დადეთ 65°C ცხელ თეფშზე, რათა ფოტორეზისტი ნაკლებად წებოვანი და ადვილად გავრცელდეს. არ დადოთ ვაფლი პირდაპირ ცხელ თეფშზე.
SU-8 თანაბრად ნაწილდებოდა ვაფლზე დაწნული საფარის გაშვებით. დაპროგრამეთ SU-8 შემომავალი ბრუნვა 5–10 წამის განმავლობაში 500 rpm–ზე 100 μm/წმ აჩქარების დროს. ჩიპზე ნაწლავის ზედა ფენა; იხილეთ „კრიტიკული ნაბიჯები“ ქვემოთ) დაყენებულია 300 rpm/s აჩქარებაზე 30 წამში 1200 rpm-ზე.
ძირითადი ბრუნვის სიჩქარე შეიძლება დარეგულირდეს სილიკონის ვაფლის SU-8 ნიმუშის სამიზნე სისქის მიხედვით.
ჩიპზე ნაწლავის ზედა ფენისთვის 500 μm სიმაღლის SU-8 შაბლონების დასამზადებლად, ამ ყუთის დაწნული საფარი და რბილი გამოცხობის საფეხურები (7 და 8 ნაბიჯები) თანმიმდევრულად განმეორდა (იხ. ნაბიჯი 9) 250 μm სისქის SU-8 ფენის ორი ფენის წარმოებისთვის, რომელიც შეიძლება დაიყოს 1 ფენით, U0 ფენით და ჯოზერით. მაღალი.
რბილად გამოაცხვეთ SU-8 დაფარული ვაფლები, ფრთხილად დადგით ვაფლები ცხელ თეფშზე 65 °C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში, შემდეგ შეცვალეთ პარამეტრი 95 °C-ზე და ინკუბაცია დამატებით 40 წუთის განმავლობაში.
ზედა მიკროარხში SU-8 ნიმუშის 500 მკმ სიმაღლის მისაღწევად, გაიმეორეთ ნაბიჯები 7 და 8, რათა წარმოქმნათ ორი 250 მკმ სისქის SU-8 ფენა.
UV Mask Aligner-ის გამოყენებით, შეასრულეთ ნათურის ტესტი მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით ვაფლის ექსპოზიციის დროის გამოსათვლელად. (ექსპოზიციის დრო, ms) = (ექსპოზიციის დოზა, mJ/cm2)/(ნათურის სიმძლავრე, mW/cm2).
ექსპოზიციის დროის განსაზღვრის შემდეგ, მოათავსეთ ფოტონიღაბი UV ნიღბის გასწორების ნიღბის დამჭერზე და მოათავსეთ ფოტონიღაბი SU-8 დაფარულ ვაფლზე.
მოათავსეთ ფოტონიღბის დაბეჭდილი ზედაპირი პირდაპირ სილიკონის ვაფლის SU-8 დაფარულ მხარეს, რათა მინიმუმამდე დაიყვანოთ ულტრაიისფერი სხივები.
SU-8 დაფარული ვაფლი და ფოტონიღაბი ვერტიკალურად გამოაშკარავეთ 260 მჯ/სმ2 ულტრაიისფერი შუქის წინასწარ განსაზღვრული ექსპოზიციის დროისთვის (იხ. ნაბიჯი 10 ამ ველში).
ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედების შემდეგ, SU-8 დაფარული სილიკონის ვაფლები ცხვებოდა 65°C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში და 95°C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში თითოეულ ცხელ თეფშზე 200 მკმ სიმაღლის შაბლონების დასამზადებლად. გამოცხობის შემდგომი დრო 95°C-დან 30 μm-მდე გააგრძელეთ 500 მ სიმაღლის შაბლონების დასამზადებლად.
დეველოპერს ასხამენ შუშის ჭურჭელში და გამომცხვარ ვაფლს ათავსებენ ჭურჭელში. SU-8 დეველოპერის მოცულობა შეიძლება განსხვავდებოდეს შუშის ფირფიტის ზომის მიხედვით. დარწმუნდით, რომ გამოიყენეთ საკმარისი SU-8 დეველოპერი, რომ მთლიანად ამოიღოთ გაუხსნელი SU-8. მაგალითად, 150 მმ დიამეტრის შუშის ჭურჭლის გამოყენებისას 1 ლ-25 მმ-იანი ტევადობით. ნაზი როტაცია.
ჩამოიბანეთ განვითარებული ფორმა ~10 მლ ახალი დეველოპერით, რასაც მოჰყვება IPA ხსნარის შესხურებით პიპეტის გამოყენებით.
მოათავსეთ ვაფლი პლაზმის გამწმენდში და გაუშვით ჟანგბადის პლაზმაში (ატმოსფერული გაზი, სამიზნე წნევა 1 × 10−5 Torr, სიმძლავრე 125 W) 1,5 წუთის განმავლობაში.
მოათავსეთ ვაფლი ვაკუუმში შუშის სლაიდთან ერთად. ვაფლები და სლაიდები შეიძლება განთავსდეს გვერდიგვერდ. თუ ვაკუუმ-საშრობი ფირფიტით იყოფა რამდენიმე ფენად, მოათავსეთ სლაიდები ქვედა კამერაში, ვაფლები კი ზედა კამერაში. დაასხით 100 μL ტრიქლოროზილი, 1H2,H2,H) მინის სრიალებს და ვაკუუმს წაუსვით სილანიზაციისთვის.
გაალღვეთ გაყინული Caco-2 უჯრედების ფლაკონი 37°C წყლის აბაზანაში, შემდეგ გადაიტანეთ გალღობილი უჯრედები T75 კოლბაში, რომელიც შეიცავს 15 მლ 37°C წინასწარ გახურებულ Caco-2 გარემოს.
Caco-2 უჯრედების გადასატანად ~90% შესართავზე, ჯერ გაათბეთ Caco-2 საშუალო, PBS და 0,25% ტრიპსინი/1 მმ EDTA 37°C წყლის აბაზანაში.
გარემოს ასპირაცია ვაკუუმური ასპირაციით. გარეცხეთ უჯრედები ორჯერ 5 მლ თბილი PBS-ით ვაკუუმ ასპირაციის განმეორებით და ახალი PBS-ის დამატებით.