გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
აჩვენებს კარუსელს სამი სლაიდისგან ერთდროულად.გამოიყენეთ წინა და შემდეგი ღილაკები ერთდროულად სამ სლაიდში გადასაადგილებლად, ან გამოიყენეთ სლაიდერის ღილაკები ბოლოს, რომ გადაადგილდეთ სამ სლაიდზე ერთდროულად.
ჰემატოენცეფალური ბარიერი და ჰემატოენცეფალური ბარიერი ხელს უშლის ბიოთერაპიულ აგენტებს ცენტრალურ ნერვულ სისტემაში მიზნების მიღწევაში, რითაც აფერხებს ნევროლოგიური დაავადებების ეფექტურ მკურნალობას.ტვინის ახალი გადამტანების აღმოსაჩენად in vivo, ჩვენ შემოვიღეთ T7 ფაგის პეპტიდის ბიბლიოთეკა და სერიულად შევაგროვეთ სისხლი და ცერებროსპინალური სითხე (CSF) ვირთხების კანულირებული ცნობიერი დიდი აუზის მოდელის გამოყენებით.სპეციფიური ფაგის კლონები ძალიან გამდიდრდა CSF-ში შერჩევის ოთხი რაუნდის შემდეგ.ინდივიდუალური კანდიდატი პეპტიდების ტესტირებამ გამოავლინა CSF-ის 1000-ჯერ მეტი გამდიდრება.ტვინში პეპტიდის შუამავლობით მიწოდების ბიოაქტიურობა დადასტურდა 40%-ით ამილოიდის-β დონის შემცირებით ცერებროსპინალურ სითხეში BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორის გამოყენებით, რომელიც დაკავშირებულია იდენტიფიცირებულ ახალ სატრანზიტო პეპტიდთან.ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ პეპტიდები, რომლებიც იდენტიფიცირებულია in vivo ფაგის შერჩევის მეთოდებით, შეიძლება იყოს სასარგებლო საშუალებები ტვინში მაკრომოლეკულების სისტემური მიწოდებისთვის თერაპიული ეფექტით.
ცენტრალური ნერვული სისტემის (ცნს) მიზნობრივი თერაპიის კვლევა დიდწილად ფოკუსირებულია ოპტიმიზირებული წამლებისა და აგენტების იდენტიფიცირებაზე, რომლებიც აჩვენებენ ცნს-ის დამიზნების თვისებებს, ნაკლები ძალისხმევით აღმოაჩინონ მექანიზმები, რომლებიც ახორციელებენ წამლის აქტიურ მიწოდებას ტვინში.ეს ახლა იწყებს ცვლილებას, რადგან წამლების მიწოდება, განსაკუთრებით დიდი მოლეკულები, თანამედროვე ნეირომეცნიერების წამლების განვითარების განუყოფელი ნაწილია.ცენტრალური ნერვული სისტემის გარემო კარგად არის დაცული ცერებროვასკულური ბარიერის სისტემით, რომელიც შედგება ჰემატოენცეფალური ბარიერისგან (BBB) ​​და ჰემატოენცეფალური ბარიერისგან (BCBB)1, რაც რთულს ხდის ტვინში წამლების მიწოდებას1,2.შეფასებულია, რომ თითქმის ყველა დიდი მოლეკულური წამალი და მცირე მოლეკულური წამლების 98%-ზე მეტი გამოიყოფა ტვინიდან3.ამიტომ ძალიან მნიშვნელოვანია ტვინის ახალი სატრანსპორტო სისტემების იდენტიფიცირება, რომლებიც უზრუნველყოფენ თერაპიული წამლების ეფექტურ და სპეციფიკურ მიწოდებას ცენტრალურ ნერვულ სისტემაში 4,5.თუმცა, BBB და BCSFB ასევე წარმოადგენს წამლის მიწოდების შესანიშნავ შესაძლებლობას, რადგან ისინი შეაღწევენ და შედიან ტვინის ყველა სტრუქტურაში მისი ფართო სისხლძარღვების მეშვეობით.ამრიგად, ტვინში მიწოდების არაინვაზიური მეთოდების გამოყენების ამჟამინდელი მცდელობები დიდწილად ეფუძნება რეცეპტორების შუამავლობით ტრანსპორტირების მექანიზმს (PMT) ენდოგენური BBB6 რეცეპტორის გამოყენებით.ტრანსფერინის რეცეპტორების გზის გამოყენებით ბოლოდროინდელი მნიშვნელოვანი მიღწევების მიუხედავად, საჭიროა ახალი მიწოდების სისტემების შემდგომი განვითარება გაუმჯობესებული თვისებებით.ამ მიზნით, ჩვენი მიზანი იყო პეპტიდების იდენტიფიცირება, რომლებსაც შეუძლიათ CSF ტრანსპორტის შუამავლობა, რადგან ისინი პრინციპში შეიძლება გამოყენებულ იქნას მაკრომოლეკულების ცნს-ში მიწოდებისთვის ან რეცეპტორების ახალი გზების გასახსნელად.კერძოდ, ცერებროვასკულური სისტემის სპეციფიკური რეცეპტორები და გადამტანები (BBB და BSCFB) შეიძლება იყოს პოტენციური სამიზნე ბიოთერაპიული მედიკამენტების აქტიური და სპეციფიკური მიწოდებისთვის.ცერებროსპინალური სითხე (CSF) არის ქოროიდული წნულის (CS) სეკრეტორული პროდუქტი და პირდაპირ კავშირშია თავის ტვინის ინტერსტიციულ სითხესთან სუბარაქნოიდული სივრცისა და პარკუჭოვანი სივრცის მეშვეობით4.ბოლო დროს დადასტურდა, რომ სუბარაქნოიდული ცერებროსპინალური სითხე ზედმეტად დიფუზირდება თავის ტვინის ინტერსტიციუმში9.ჩვენ ვიმედოვნებთ, რომ მივიღებთ პარენქიმულ სივრცეს ამ სუბარაქნოიდული შემოდინების ტრაქტის გამოყენებით ან პირდაპირ BBB-ის მეშვეობით.ამის მისაღწევად, ჩვენ განვახორციელეთ ძლიერი in vivo ფაგის შერჩევის სტრატეგია, რომელიც იდეალურად განსაზღვრავს პეპტიდებს, რომლებიც ტრანსპორტირებულია ამ ორი განსხვავებული გზით.
ჩვენ ახლა აღვწერთ თანმიმდევრულ in vivo ფაგების ჩვენების სკრინინგის მეთოდს CSF-ის შერჩევით, მაღალი გამტარუნარიანობის თანმიმდევრობით (HTS) საწყის შერჩევის რაუნდების მონიტორინგისთვის ბიბლიოთეკის უმაღლესი მრავალფეროვნებით.სკრინინგი ჩატარდა გონზე მყოფ ვირთხებზე მუდმივი იმპლანტირებული დიდი ცისტერნის (CM) კანულით, რათა თავიდან აიცილონ სისხლის დაბინძურება.მნიშვნელოვანია, რომ ეს მიდგომა ირჩევს როგორც ტვინის დამიზნებას, ასევე პეპტიდებს სატრანსპორტო აქტივობით ცერებროვასკულარულ ბარიერში.ჩვენ გამოვიყენეთ T7 ფაგები მათი მცირე ზომის გამო (~60 ნმ)10 და ვარაუდობთ, რომ ისინი ვარგისია ვეზიკულების ტრანსპორტირებისთვის, რომლებიც საშუალებას იძლევა ტრანსცელულარული გადაკვეთა ენდოთელური და/ან ეპითელური-მედულას ბარიერი.პანინგის ოთხი რაუნდის შემდეგ, იზოლირებული იყო ფაგების პოპულაციები, რომლებიც აჩვენებდნენ ძლიერ in vivo CSF-ის გამდიდრებას და ცერებრალური მიკროსისხლძარღვების ასოციაციას.მნიშვნელოვანია, რომ ჩვენ შევძელით ჩვენი დასკვნების დადასტურება იმის დემონსტრირებით, რომ სასურველ და ქიმიურად სინთეზირებულ საუკეთესო კანდიდატ პეპტიდებს შეუძლიათ ცილის ტვირთის გადატანა ცერებროსპინალურ სითხეში.პირველი, ცენტრალური ნერვული სისტემის ფარმაკოდინამიკური ეფექტები დადგინდა წამყვანი ტრანზიტული პეპტიდის BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორთან კომბინაციით.იმის დემონსტრირების გარდა, რომ in vivo ფუნქციური სკრინინგის სტრატეგიებს შეუძლიათ ახალი ტვინის სატრანსპორტო პეპტიდების იდენტიფიცირება, როგორც ეფექტური ცილის ტვირთის მატარებლები, ჩვენ ველით, რომ მსგავსი ფუნქციური შერჩევის მიდგომები ასევე მნიშვნელოვანი გახდება ახალი ტვინის ტრანსპორტის გზების იდენტიფიცირებაში.
დაფების წარმომქმნელი ერთეულების (PFU) საფუძველზე, ფაგის შეფუთვის ეტაპის შემდეგ, შეიქმნა და შეიქმნა შემთხვევითი 12-მერული ხაზოვანი T7 ფაგის პეპტიდების ბიბლიოთეკა, რომელთა მრავალფეროვნება დაახლოებით 109 იყო (იხ. მასალები და მეთოდები).მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ ჩვენ გულდასმით გავაანალიზეთ ეს ბიბლიოთეკა in vivo პანირების დაწყებამდე.ფაგის ბიბლიოთეკის ნიმუშების PCR გაძლიერება მოდიფიცირებული პრაიმერების გამოყენებით წარმოქმნის ამპლიკონებს, რომლებიც უშუალოდ გამოიყენება HTS-ზე (დამატებითი სურ. 1a).ა) HTS11 თანმიმდევრობის შეცდომების გამო, ბ) პრაიმერების ხარისხზე ზემოქმედების გამო (NNK)1-12 და გ) ველური ტიპის (wt) ფაგის (ჩონჩხის ჩასმა) ლოდინის ბიბლიოთეკაში, განხორციელდა თანმიმდევრობის ფილტრაციის პროცედურა მხოლოდ დამოწმებული თანმიმდევრობის ინფორმაციის ამოსაღებად (დამატებითი ნახ.ფილტრის ეს ნაბიჯები ვრცელდება ყველა HTS თანმიმდევრობის ბიბლიოთეკაზე.სტანდარტული ბიბლიოთეკისთვის მიღებული იქნა სულ 233,868 წაკითხული, რომელთაგან 39%-მა გაიარა ფილტრის კრიტერიუმები და გამოიყენებოდა ბიბლიოთეკის ანალიზისა და შემდგომი რაუნდების შერჩევისთვის (დამატებითი სურათი 1c–e).წაკითხული იყო უპირატესად 3 ბაზის წყვილის სიგრძის ჯერადი, პიკით 36 ნუკლეოტიდზე (დამატებითი სურ. 1c), რაც ადასტურებს ბიბლიოთეკის დიზაინს (NNK) 1-12.აღსანიშნავია, რომ ბიბლიოთეკის წევრების დაახლოებით 11% შეიცავდა 12-განზომილებიანი ველური ტიპის (wt) ხერხემლის PAGISRELVDKL ჩანართს და თანმიმდევრობების თითქმის ნახევარი (49%) შეიცავდა ჩანართებს ან წაშლას.ბიბლიოთეკის ბიბლიოთეკის HTS-მა დაადასტურა პეპტიდების მაღალი მრავალფეროვნება ბიბლიოთეკაში: პეპტიდური თანმიმდევრობების 81%-ზე მეტი ნაპოვნი იქნა მხოლოდ ერთხელ და მხოლოდ 1.5% იყო ≥4 ეგზემპლარად (დამატებითი ნახ. 2a).ამინომჟავების (aa) სიხშირეები რეპერტუარში 12-ვე პოზიციაზე კარგად იყო კორელირებული სიხშირეებთან, რომლებიც მოსალოდნელი იყო დეგენერირებული NKK რეპერტუარის მიერ წარმოქმნილი კოდონების რაოდენობისთვის (დამატებითი ნახ. 2b).ამ ჩანართებით კოდირებული aa ნარჩენების დაკვირვებული სიხშირე კარგად იყო კორელაციაში გამოთვლილ სიხშირესთან (r = 0,893) (დამატებითი ნახ. 2c).ინექციისთვის ფაგის ბიბლიოთეკების მომზადება მოიცავს ენდოტოქსინის გაძლიერებისა და მოცილების ეტაპებს.ადრე ნაჩვენები იყო, რომ ეს პოტენციურად ამცირებს ფაგების ბიბლიოთეკების მრავალფეროვნებას12,13.ამიტომ, ჩვენ შევადგინეთ ფირფიტებით გაძლიერებული ფაგის ბიბლიოთეკა, რომელსაც ჩაუტარდა ენდოტოქსინის მოცილება და შევადარეთ იგი თავდაპირველ ბიბლიოთეკასთან AA-ს სიხშირის შესაფასებლად.ძლიერი კორელაცია (r = 0.995) დაფიქსირდა თავდაპირველ აუზსა და გაძლიერებულ და გასუფთავებულ აუზს შორის (დამატებითი ნახ. 2d), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ კონკურენცია ფირფიტებზე გაძლიერებულ კლონებს შორის T7 ფაგის გამოყენებით არ იწვევდა დიდ მიკერძოებას.ეს შედარება ეფუძნება ტრიპეპტიდური მოტივების სიხშირეს თითოეულ ბიბლიოთეკაში, ვინაიდან ბიბლიოთეკების მრავალფეროვნება (~ 109) სრულად ვერ იქნება აღბეჭდილი თუნდაც HTS-ით.aa-ს სიხშირის ანალიზმა თითოეულ პოზიციაზე გამოავლინა მცირე პოზიციაზე დამოკიდებული მიკერძოება შეყვანილი რეპერტუარის ბოლო სამ პოზიციაზე (დამატებითი ნახ. 2e).დასასრულს, ჩვენ დავასკვენით, რომ ბიბლიოთეკის ხარისხი და მრავალფეროვნება მისაღები იყო და მრავალფეროვნებაში მხოლოდ მცირე ცვლილებები შეინიშნებოდა შერჩევის რამდენიმე რაუნდს შორის ფაგის ბიბლიოთეკების გაძლიერებისა და მომზადების გამო.
ცერებროსპინალური სითხის სერიული აღება შეიძლება ჩატარდეს გონიერი ვირთხების CM-ში კანულის ქირურგიული ჩანერგვით, რათა ხელი შეუწყოს T7 ფაგის იდენტიფიკაციას ინტრავენურად (iv) BBB და/ან BCSFB (ნახ. 1a-b).ჩვენ გამოვიყენეთ ორი დამოუკიდებელი შერჩევის იარაღი (მკლავები A და B) in vivo შერჩევის პირველ სამ რაუნდში (ნახ. 1c).ჩვენ თანდათან გავზარდეთ შერჩევის სიმკაცრე შერჩევის პირველ სამ რაუნდში შეყვანილი ფაგის საერთო რაოდენობის შემცირებით.პანირების მეოთხე რაუნდისთვის ჩვენ გავაერთიანეთ ნიმუშები A და B ტოტებიდან და შევასრულეთ სამი დამატებითი დამოუკიდებელი შერჩევა.ამ მოდელში T7 ფაგის ნაწილაკების in vivo თვისებების შესასწავლად, ველური ტიპის ფაგი (PAGISRELVDKL სამაგისტრო ჩანართი) შეიყვანეს ვირთხებში კუდის ვენის მეშვეობით.ფაგების აღდგენა ცერებროსპინალური სითხიდან და სისხლიდან სხვადასხვა დროს აჩვენა, რომ შედარებით მცირე T7 იკოსაედრული ფაგები ჰქონდათ სწრაფი საწყისი კლირენსის ფაზა სისხლის განყოფილებიდან (დამატებითი სურ. 3).შეყვანილი ტიტრებისა და ვირთხების სისხლის მოცულობის საფუძველზე, ჩვენ გამოვთვალეთ, რომ მხოლოდ დაახლოებით 1% wt.შეყვანილი დოზიდან ფაგი გამოვლინდა სისხლში ინტრავენური ინექციიდან 10 წუთის შემდეგ.ამ საწყისი სწრაფი შემცირების შემდეგ, პირველადი კლირენსი გაზომილი იყო ნელი, ნახევარგამოყოფის პერიოდით 27,7 წუთი.მნიშვნელოვანია, რომ მხოლოდ ძალიან ცოტა ფაგი იქნა ამოღებული CSF განყოფილებიდან, რაც მიუთითებს ველური ტიპის ფაგის მიგრაციის დაბალ ფონზე CSF განყოფილებაში (დამატებითი სურ. 3).საშუალოდ, მხოლოდ დაახლოებით 1 x 10-3% T7 ფაგის ტიტრი სისხლში და 4 x 10-8% თავდაპირველი ინფუზიის ფაგები იყო გამოვლენილი ცერებროსპინალურ სითხეში სინჯის მთელი პერიოდის განმავლობაში (0-250 წთ).აღსანიშნავია, რომ ველური ტიპის ფაგის ნახევარგამოყოფის პერიოდი (25.7 წთ) ცერებროსპინალურ სითხეში მსგავსი იყო სისხლში დაფიქსირებული.ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ ბარიერი, რომელიც გამოყოფს CSF განყოფილებას სისხლიდან, ხელუხლებელია CM-კანულირებული ვირთხებში, რაც საშუალებას აძლევს ფაგების ბიბლიოთეკების in vivo შერჩევის საშუალებას იდენტიფიცირდეს კლონები, რომლებიც ადვილად ტრანსპორტირდება სისხლიდან CSF განყოფილებაში.
(ა) ცერებროსპინალური სითხის (CSF) ხელახალი სინჯის აღების მეთოდის დაყენება დიდი აუზიდან.(ბ) დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს ცენტრალური ნერვული სისტემის (ცნს) ბარიერის უჯრედულ მდებარეობას და შერჩევის სტრატეგიას, რომელიც გამოიყენება პეპტიდების იდენტიფიცირებისთვის, რომლებიც კვეთენ ჰემატოენცეფალურ ბარიერს (BBB) ​​და ჰემატოენცეფალურ ბარიერს.(გ) in vivo ფაგის ჩვენების სკრინინგის სქემა.შერჩევის თითოეულ რაუნდში, ფაგები (ცხოველების იდენტიფიკატორები ისრებში) შეჰყავდათ ინტრავენურად.ორი დამოუკიდებელი ალტერნატიული ფილიალი (A, B) ინახება ცალ-ცალკე შერჩევის მე-4 ტურამდე.შერჩევის მე-3 და მე-4 რაუნდისთვის, CSF-დან ამოღებული თითოეული ფაგის კლონი იყო ხელით დახარისხებული.(დ) სისხლიდან (წითელი წრეები) და ცერებროსპინალური სითხისგან (მწვანე სამკუთხედები) გამოყოფილი ფაგის კინეტიკა შერჩევის პირველი რაუნდის დროს ორ კანულირებული ვირთხებში T7 პეპტიდის ბიბლიოთეკის ინტრავენური ინექციის შემდეგ (2 x 1012 ფაგი/ცხოველი).ცისფერი კვადრატები მიუთითებს სისხლში ფაგის საშუალო საწყისი კონცენტრაციაზე, რომელიც გამოითვლება შეყვანილი ფაგის რაოდენობით, სისხლის საერთო მოცულობის გათვალისწინებით.შავი კვადრატები მიუთითებს სისხლის ფაგის კონცენტრაციიდან ექსტრაპოლირებული y ხაზის გადაკვეთის წერტილს.(ე, ვ) წარმოადგინეთ პეპტიდში ნაპოვნი ყველა შესაძლო გადახურვის ტრიპეპტიდური მოტივის ფარდობითი სიხშირე და განაწილება.ნაჩვენებია 1000 კითხვაში აღმოჩენილი მოტივების რაოდენობა.მნიშვნელოვნად (p <0.001) გამდიდრებული მოტივები აღინიშნება წითელი წერტილებით.(ე) კორელაციური გაფანტვა, რომელიც ადარებს შეყვანილი ბიბლიოთეკის ტრიპეპტიდური მოტივის ფარდობით სიხშირეს ცხოველთა #1.1 და #1.2 სისხლით წარმოებულ ფაგთან.(ვ) კორელაციური გაფანტვა, რომელიც ადარებს სისხლში და ცერებროსპინალურ სითხეში გამოყოფილი ცხოველის ფაგის ტრიპეპტიდური მოტივების #1.1 და #1.2 ფარდობით სიხშირეებს.(გ, თ) სისხლით გამდიდრებული ფაგის თანმიმდევრობის ID წარმოდგენა (გ) ინექციურ ბიბლიოთეკებთან და CSF-ით გამდიდრებული ფაგი (თ) სისხლით, ორივე ცხოველში in vivo შერჩევის რაუნდის შემდეგ.ერთი ასო კოდის ზომა მიუთითებს იმაზე, თუ რამდენად ხშირად ჩნდება ეს ამინომჟავა ამ პოზიციაზე.მწვანე = პოლარული, მეწამული = ნეიტრალური, ლურჯი = ძირითადი, წითელი = მჟავე და შავი = ​​ჰიდროფობიური ამინომჟავები.სურათი 1a, b შექმნილია ედუარდ ურიხის მიერ.
ჩვენ შევიყვანეთ ფაგის პეპტიდის ბიბლიოთეკა ორ CM ინსტრუმენტულ ვირთხაში (კლადები A და B) და გამოვყავით ფაგი ცერებროსპინალური სითხიდან და სისხლიდან (სურათი 1d).ბიბლიოთეკის საწყისი სწრაფი კლირენსი ნაკლებად გამოხატული იყო ველური ტიპის ფაგთან შედარებით.ინექციური ბიბლიოთეკის საშუალო ნახევარგამოყოფის პერიოდი ორივე ცხოველში იყო 24.8 წუთი სისხლში, ველური ტიპის ფაგის მსგავსი და 38.5 წუთი CSF-ში.თითოეული ცხოველისგან სისხლისა და ცერებროსპინალური სითხის ფაგის ნიმუშები დაექვემდებარა HTS-ს და ყველა იდენტიფიცირებული პეპტიდი გაანალიზდა მოკლე ტრიპეპტიდური მოტივის არსებობისთვის.ტრიპეპტიდური მოტივები შეირჩა, რადგან ისინი უზრუნველყოფენ მინიმალურ საფუძველს სტრუქტურის ფორმირებისთვის და პეპტიდ-ცილის ურთიერთქმედებისთვის14,15.ჩვენ ვიპოვეთ კარგი კორელაცია მოტივების განაწილებაში ინექციურ ფაგის ბიბლიოთეკასა და ორივე ცხოველის სისხლიდან ამოღებულ კლონებს შორის (ნახ. 1e).მონაცემები მიუთითებს, რომ ბიბლიოთეკის შემადგენლობა მხოლოდ უმნიშვნელოდ არის გამდიდრებული სისხლის განყოფილებაში.ამინომჟავების სიხშირეები და კონსენსუსის თანმიმდევრობები შემდგომში გაანალიზდა თითოეულ პოზიციაზე Weblogo16 პროგრამული უზრუნველყოფის ადაპტაციის გამოყენებით.საინტერესოა, რომ ჩვენ აღმოვაჩინეთ ძლიერი გამდიდრება სისხლში გლიცინის ნარჩენებში (ნახ. 1გ).როდესაც სისხლი შედარებულია CSF-დან შერჩეულ კლონებთან, დაფიქსირდა ძლიერი შერჩევა და მოტივების გარკვეული არჩევა (ნახ. 1f), და გარკვეული ამინომჟავები უპირატესად იმყოფებოდნენ წინასწარ განსაზღვრულ პოზიციებზე 12 წევრში (ნახ. 1h).აღსანიშნავია, რომ ცალკეული ცხოველები მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდნენ ცერებროსპინალურ სითხეში, მაშინ როცა სისხლის გლიცინის გამდიდრება დაფიქსირდა ორივე ცხოველში (დამატებითი სურ. 4a-j).ცხოველთა #1.1 და #1.2 ცერებროსპინალურ სითხეში თანმიმდევრობის მონაცემების მკაცრი ფილტრაციის შემდეგ მიღებული იქნა სულ 964 და 420 უნიკალური 12-მერიანი პეპტიდი (დამატებითი სურ. 1d–e).იზოლირებული ფაგის კლონები გაძლიერდა და დაექვემდებარა in vivo შერჩევის მეორე ტურს.შერჩევის მეორე რაუნდიდან ამოღებული ფაგები დაექვემდებარა HTS-ს თითოეულ ცხოველში და ყველა იდენტიფიცირებული პეპტიდი გამოიყენებოდა როგორც მოტივის ამოცნობის პროგრამაში ტრიპეპტიდური მოტივების არსებობის გასაანალიზებლად (ნახ. 2a, b, ef).CSF-დან ამოღებული ფაგის პირველ ციკლთან შედარებით, ჩვენ დავაკვირდით CSF-ში მრავალი მოტივის შემდგომ შერჩევას და არჩევას A და B ტოტებში (ნახ. 2).ქსელის იდენტიფიკაციის ალგორითმი იქნა გამოყენებული იმის დასადგენად, წარმოადგენდნენ თუ არა ისინი თანმიმდევრული თანმიმდევრობის სხვადასხვა ნიმუშებს.აშკარა მსგავსება დაფიქსირდა 12-განზომილებიანი თანმიმდევრობების აღდგენის CSF-ის მიერ ალტერნატიულ კლადში A (ნახ. 2c, d) და კლადში B (ნახ. 2g, h).გაერთიანებულმა ანალიზმა თითოეულ ფილიალში გამოავლინა სხვადასხვა შერჩევის პროფილები 12-მერული პეპტიდებისთვის (დამატებითი სურ. 5c,d) და CSF/სისხლის ტიტრის თანაფარდობის ზრდა დროთა განმავლობაში გაერთიანებული კლონებისთვის შერჩევის მეორე რაუნდის შემდეგ შერჩევის პირველ რაუნდთან შედარებით (დამატებითი ნახ. 5e).).
ცერებროსპინალურ სითხეში მოტივებისა და პეპტიდების გამდიდრება in vivo ფუნქციური ფაგის ჩვენების შერჩევის ორი თანმიმდევრული რაუნდით.
ყველა ცერებროსპინალური სითხის ფაგები ამოღებული თითოეული ცხოველის პირველი რაუნდიდან (ცხოველები #1.1 და #1.2) იყო გაერთიანებული, გაძლიერებული, HT-სევენირება და ხელახალი ინექციები ერთად (2 x 1010 ფაგი/ცხოველი) 2 SM კანულირებული ვირთხები (#1.1 → #).2.1 და 2.2, 1.2 → 2.3 და 2.4).(a,b,e,f) კორელაციური გაფანტვა, რომელიც ადარებს ტრიპეპტიდური მოტივების ფარდობით სიხშირეს CSF-დან მიღებული ყველა ფაგების პირველ და მეორე შერჩევის რაუნდში.მოტივების შედარებითი სიხშირე და განაწილება, რომლებიც წარმოადგენენ პეპტიდებში ნაპოვნი ყველა შესაძლო გადახურვის ტრიპეპტიდს ორივე ორიენტაციაში.ნაჩვენებია 1000 კითხვაში აღმოჩენილი მოტივების რაოდენობა.მოტივები, რომლებიც მნიშვნელოვნად (p < 0.001) იყო შერჩეული ან გამორიცხული ერთ-ერთ შედარებულ ბიბლიოთეკაში, მონიშნულია წითელი წერტილებით.(c, d, g, h) თანმიმდევრობის ლოგოს წარმოდგენა ყველა CSF-ით მდიდარი 12 ამინომჟავით გრძელი თანმიმდევრობის შესახებ, რომელიც ეფუძნება in vivo შერჩევის მე-2 და 1 რაუნდს.ერთი ასო კოდის ზომა მიუთითებს იმაზე, თუ რამდენად ხშირად ჩნდება ეს ამინომჟავა ამ პოზიციაზე.ლოგოს წარმოსადგენად შედარებულია ცალკეული ცხოველებისგან ამოღებული CSF თანმიმდევრობების სიხშირე შერჩევის ორ რაუნდს შორის და ნაჩვენებია გამდიდრებული თანმიმდევრობები მეორე რაუნდში: (c) #1.1–#2.1 (დ) #1.1–#2.2 (გ) #1.2–#2.3 და (თ) #1.2–#2.4.ყველაზე გამდიდრებული ამინომჟავები მოცემულ პოზიციაზე (c, d) ცხოველებში No.2.1 და არა.2.2 ან (გ, თ) ცხოველებში No.2.3 და არა.2.4 ნაჩვენებია ფერად.მწვანე = პოლარული, მეწამული = ნეიტრალური, ლურჯი = ძირითადი, წითელი = მჟავე და შავი = ​​ჰიდროფობიური ამინომჟავები.
შერჩევის მესამე რაუნდის შემდეგ, ჩვენ გამოვავლინეთ 124 უნიკალური პეპტიდური თანმიმდევრობა (#3.1 და #3.2) 332 CSF-ით აღდგენილი ფაგის კლონიდან, რომლებიც იზოლირებულია ორი ცხოველისგან (დამატებითი სურ. 6a).თანმიმდევრობას LGSVS (18.7%) ჰქონდა ყველაზე მაღალი ფარდობითი პროპორცია, რასაც მოჰყვა ველური ტიპის ჩანართები PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) და SARGSWREIVSLS (2.2%).ბოლო მეოთხე რაუნდში გავაერთიანეთ სამი ცალკეული ცხოველისგან დამოუკიდებლად შერჩეული ორი ტოტი (ნახ. 1c).925 თანმიმდევრული ფაგის კლონიდან ამოღებული CSF-დან, მეოთხე რაუნდში აღმოვაჩინეთ 64 უნიკალური პეპტიდური თანმიმდევრობა (დამატებითი სურ. 6b), რომელთა შორის ველური ტიპის ფაგის ფარდობითი პროპორცია დაეცა 0,8%-მდე.CSF-ის ყველაზე გავრცელებული კლონები მეოთხე რაუნდში იყო LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) (3.6%).%)).შერჩეული პეპტიდების სიგრძის დიაპაზონი განპირობებულია ნუკლეოტიდის ჩასვლებით/წაშლით ან ნაადრევი გაჩერების კოდონებით ბიბლიოთეკის პრაიმერებში დეგენერირებული კოდონების გამოყენებისას NNK ბიბლიოთეკის დიზაინისთვის.ნაადრევი გაჩერების კოდონები წარმოქმნიან უფრო მოკლე პეპტიდებს და შერჩეულია, რადგან ისინი შეიცავენ ხელსაყრელ aa მოტივს.უფრო გრძელი პეპტიდები შეიძლება იყოს სინთეზური ბიბლიოთეკების პრაიმერებში ჩასმა/წაშლის შედეგად.ეს განათავსებს შემუშავებულ გაჩერების კოდონს ჩარჩოს გარეთ და კითხულობს მას, სანამ ახალი გაჩერების კოდონი გამოჩნდება ქვემოთ.ზოგადად, ჩვენ გამოვთვალეთ გამდიდრების ფაქტორები ოთხივე შერჩევის რაუნდისთვის შეყვანის მონაცემების ნიმუშის გამომავალი მონაცემების შედარებით.სკრინინგის პირველი რაუნდისთვის, ჩვენ გამოვიყენეთ ველური ტიპის ფაგის ტიტრები, როგორც არასპეციფიკური ფონის მითითება.საინტერესოა, რომ ნეგატიური ფაგების შერჩევა იყო ძალიან ძლიერი CSF-ის პირველ ციკლში, მაგრამ არა სისხლში (ნახ. 3a), რაც შეიძლება გამოწვეული იყოს პეპტიდური ბიბლიოთეკის უმრავლესობის წევრების პასიური დიფუზიის დაბალი ალბათობით CSF განყოფილებაში ან შედარებით ფაგები, როგორც წესი, უფრო ეფექტურად ინარჩუნებენ ან ამოიღებენ სისხლის ნაკადს, ვიდრე ბაქტერიოფაგები.თუმცა, პანინგის მეორე რაუნდში, CSF-ში ფაგების ძლიერი შერჩევა დაფიქსირდა ორივე კლადში, რაც ვარაუდობს, რომ წინა რაუნდი გამდიდრებული იყო ფაგებით, რომლებიც აჩვენებდნენ პეპტიდებს, რომლებიც ხელს უწყობენ CSF-ის შეთვისებას (ნახ. 3a).ისევ, სისხლის მნიშვნელოვანი გამდიდრების გარეშე.ასევე მესამე და მეოთხე რაუნდში ფაგის კლონები მნიშვნელოვნად გამდიდრდა CSF-ში.თითოეული უნიკალური პეპტიდური თანმიმდევრობის შედარებითი სიხშირის შედარებისას შერჩევის ბოლო ორ რაუნდს შორის, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ რიგითობა კიდევ უფრო გამდიდრდა შერჩევის მეოთხე რაუნდში (ნახ. 3b).სულ 931 ტრიპეპტიდური მოტივი იქნა ამოღებული 64 უნიკალური პეპტიდური თანმიმდევრობიდან ორივე პეპტიდური ორიენტაციის გამოყენებით.მეოთხე რაუნდში ყველაზე გამდიდრებული მოტივები უფრო მჭიდროდ იქნა შესწავლილი მათი გამდიდრების პროფილებისთვის ყველა რაუნდში, ინექციურ ბიბლიოთეკასთან შედარებით (შეკვეთა: 10% გამდიდრება) (დამატებითი სურ. 6c).შერჩევის ზოგადმა შაბლონებმა აჩვენა, რომ შესწავლილი მოტივების უმეტესობა გამდიდრდა შერჩევის ორივე ფილიალის ყველა წინა რაუნდში.თუმცა, ზოგიერთი მოტივი (მაგ. SGL, VSG, LGS GSV) ძირითადად იყო ალტერნატიული A კლადიდან, ხოლო სხვები (მაგ. FGW, RTN, WGF, NTR) გამდიდრებული იყო ალტერნატიული B კლადით.
CSF-ის ტრანსპორტირების ვალიდაცია CSF-ით გამდიდრებული ფაგებით გამოსახული პეპტიდების და ბიოტინილირებული ლიდერი პეპტიდების, რომლებიც კონიუგირებულია სტრეპტავიდინის დატვირთვასთან.
(ა) გამდიდრების კოეფიციენტები გამოითვლება ოთხივე რაუნდში (R1-R4) ინექციური (შეყვანილი = I) ფაგის (PFU) ტიტრების და განსაზღვრული CSF ფაგის ტიტრების საფუძველზე (გამომავალი = O).გამდიდრების ფაქტორები ბოლო სამი რაუნდისთვის (R2-R4) გამოითვალა წინა რაუნდთან და პირველ რაუნდთან (R1) წონის მონაცემებით.ღია ზოლები არის ცერებროსპინალური სითხე, დაჩრდილული ზოლები არის პლაზმა.(***p<0.001, სტუდენტის t-ტესტის საფუძველზე).(ბ) ყველაზე უხვი ფაგური პეპტიდების სია, რანჟირებული მათი ფარდობითი პროპორციის მიხედვით ყველა ფაგთან, რომლებიც შეგროვდა CSF-ში შერჩევის მე-4 რაუნდის შემდეგ.ექვსი ყველაზე გავრცელებული ფაგის კლონი ხაზგასმულია ფერით, დანომრილი და მათი გამდიდრების ფაქტორები შერჩევის მე-3 და მე-4 რაუნდებს შორის.(გ, დ) ექვსი ყველაზე გამდიდრებული ფაგის კლონი, ცარიელი ფაგის და მშობლის ფაგის პეპტიდის ბიბლიოთეკები მე-4 რაუნდიდან ინდივიდუალურად გაანალიზდა CSF-ის შერჩევის მოდელში.CSF და სისხლის ნიმუშები აღებული იქნა მითითებულ დროში.(c) თანაბარი რაოდენობით 6 კანდიდატი ფაგის კლონი (2 x 1010 ფაგი/ცხოველი), ცარიელი ფაგები (#1779) (2 x 1010 ფაგი/ცხოველი) და მარაგის ფაგების პეპტიდური ბიბლიოთეკები (2 x 1012 ფაგი/ცხოველი).ნაჩვენებია CSF-ის ფარმაკოკინეტიკა თითოეული ინექციური ფაგის კლონისა და ფაგის პეპტიდური ბიბლიოთეკის დროთა განმავლობაში.(დ) აჩვენებს CSF/სისხლის საშუალო თანაფარდობას ყველა აღდგენილი ფაგისთვის/მლ სინჯის აღების დროის განმავლობაში.(ე) ოთხი სინთეზური ლიდერი პეპტიდი და ერთი შერეული კონტროლი დაკავშირებული იყო ბიოტინთან სტრეპტავიდინთან მათი N-ბოლოით (ტეტრამერის ჩვენება), რასაც მოჰყვა ინექცია (კუდის ვენა iv, 10 მგ სტრეპტავიდინი/კგ).სულ მცირე სამი ინტუბირებული ვირთხა (N = 3).).CSF ნიმუშები შეგროვდა მითითებულ დროში და სტრეპტავიდინის კონცენტრაცია გაზომილი იყო CSF ანტი-სტრეპტავიდინის ELISA-ით (nd = არ არის გამოვლენილი).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ტესტის საფუძველზე).(ვ) ყველაზე გამდიდრებული ფაგის პეპტიდური კლონის #2002 (იისფერი) ამინომჟავების თანმიმდევრობის შედარება სხვა შერჩეულ ფაგ პეპტიდურ კლონებთან შერჩევის მე-4 რაუნდიდან.იდენტური და მსგავსი ამინომჟავების ფრაგმენტები ფერადი კოდირებულია.
მეოთხე რაუნდში ყველა გამდიდრებული ფაგიდან (ნახ. 3b), შეირჩა ექვსი კანდიდატი კლონი შემდგომი ინდივიდუალური ანალიზისთვის CSF შერჩევის მოდელში.ექვსი კანდიდატი ფაგის, ცარიელი ფაგის (ჩასმის გარეშე) და პროფაგის პეპტიდის ბიბლიოთეკების თანაბარი რაოდენობა შეყვანილი იქნა სამ კანულირებული CM ცხოველში და ფარმაკოკინეტიკა განისაზღვრა CSF (ნახ. 3c) და სისხლის (დამატებითი სურ. 7) ანალიზებში.ყველა შემოწმებული ფაგის კლონი მიზნად ისახავს CSF განყოფილებას 10-1000-ჯერ უფრო მაღალ დონეზე, ვიდრე ცარიელი საკონტროლო ფაგის დონე (#1779).მაგალითად, #2020 და #2077 კლონებს ჰქონდათ დაახლოებით 1000-ჯერ უფრო მაღალი CSF ტიტრი, ვიდრე საკონტროლო ფაგს.თითოეული შერჩეული პეპტიდის ფარმაკოკინეტიკური პროფილი განსხვავებულია, მაგრამ ყველა მათგანს აქვს CSF-ის დასახლების მაღალი უნარი.ჩვენ დავაფიქსირეთ მუდმივი შემცირება დროთა განმავლობაში #1903 და #2011 კლონებისთვის, ხოლო #2077, #2002 და #2009 კლონებისთვის ზრდა პირველი 10 წუთის განმავლობაში შეიძლება მიუთითებდეს აქტიურ ტრანსპორტზე, მაგრამ საჭიროებს შემოწმებას.კლონები #2020, #2002 და #2077 სტაბილიზირებულია მაღალ დონეზე, ხოლო კლონი #2009 CSF კონცენტრაცია ნელა მცირდება საწყისი ზრდის შემდეგ.ჩვენ შემდეგ შევადარეთ CSF თითოეული კანდიდატის ფარდობითი სიხშირე მის სისხლში კონცენტრაციასთან (ნახ. 3d).CSF თითოეული კანდიდატის საშუალო ტიტრის კორელაციამ მის სისხლის ტიტრთან ყველა სინჯის დროს აჩვენა, რომ ექვსი კანდიდატიდან სამი მნიშვნელოვნად გამდიდრებული იყო სისხლის CSF-ით.საინტერესოა, რომ კლონმა #2077 აჩვენა სისხლის უფრო მაღალი სტაბილურობა (დამატებითი სურათი 7).იმის დასადასტურებლად, რომ პეპტიდებს შეუძლიათ აქტიურად გადაიტანონ ტვირთი, გარდა ფაგის ნაწილაკებისა, CSF განყოფილებაში, ჩვენ მოვახდინეთ სინთეზირებული ოთხი ლიდერი პეპტიდი, რომლებიც წარმოიქმნება ბიოტინთან N-ბოლოზე, სადაც პეპტიდები მიმაგრებულია ფაგის ნაწილაკზე.ბიოტინილირებული პეპტიდები (2002, 2009, 2020 და 2077) კონიუგირებული იყო სტრეპტავიდინთან (SA) მულტიმერული ფორმების მისაღებად, რომლებიც გარკვეულწილად იმიტირებდნენ ფაგის გეომეტრიას.ამ ფორმატმა ასევე მოგვცა საშუალება გაგვეზომა SA ექსპოზიცია სისხლში და ცერებროსპინალურ სითხეში, როგორც ტვირთის გადამტანი ცილის პეპტიდები.მნიშვნელოვანია, რომ ფაგის მონაცემების რეპროდუცირება ხშირად შეიძლებოდა, როდესაც სინთეზური პეპტიდები შეყვანილი იყო ამ SA-კონიუგირებული ფორმატში (ნახ. 3e).დაბნეულ პეპტიდებს ჰქონდათ ნაკლები საწყისი ექსპოზიცია და უფრო სწრაფი CSF კლირენსი შეუცნობელი დონეებით 48 საათის განმავლობაში.ამ პეპტიდური ფაგის კლონების მიწოდების გზების შესახებ CSF სივრცეში შესასწავლად, ჩვენ გავაანალიზეთ ფაგის პეპტიდის ცალკეული დარტყმების ლოკალიზაცია იმუნოჰისტოქიმიის გამოყენებით (IHC), რათა უშუალოდ აღმოვაჩინოთ ფაგის ნაწილაკები ინტრავენური ინექციიდან 1 საათის შემდეგ in vivo.აღსანიშნავია, რომ #2002, #2077 და #2009 კლონები შეიძლება გამოვლინდეს ძლიერი შეღებვით ტვინის კაპილარებში, ხოლო საკონტროლო ფაგი (#1779) და კლონი #2020 არ იყო გამოვლენილი (დამატებითი სურათი 8).ეს იმაზე მეტყველებს, რომ ეს პეპტიდები ხელს უწყობენ ტვინზე ეფექტს ზუსტად BBB-ს გადაკვეთით.შემდგომი დეტალური ანალიზია საჭირო ამ ჰიპოთეზის შესამოწმებლად, რადგან შესაძლოა ჩართული იყოს BSCFB მარშრუტიც.ყველაზე გამდიდრებული კლონის (#2002) ამინომჟავების თანმიმდევრობის შედარებისას სხვა შერჩეულ პეპტიდებთან, აღინიშნა, რომ ზოგიერთ მათგანს აქვს მსგავსი ამინომჟავების გაფართოება, რაც შეიძლება მიუთითებდეს მსგავს სატრანსპორტო მექანიზმზე (ნახ. 3f).
მისი უნიკალური პლაზმური პროფილის და CSF-ის მნიშვნელოვანი ზრდის გამო დროთა განმავლობაში, ფაგის ჩვენების კლონი #2077 შემდგომში იქნა გამოკვლეული 48 საათიანი პერიოდის განმავლობაში და შეძლო CSF-ის სწრაფი მატების რეპროდუცირება, რომელიც დაფიქსირდა SA მდგრად დონეზე (ნახ. 4a).რაც შეეხება სხვა იდენტიფიცირებულ ფაგის კლონებს, #2077 ძლიერად შეიღება თავის ტვინის კაპილარებისთვის და აჩვენა მნიშვნელოვანი კოლოკალიზაცია კაპილარული მარკერის ლექტინით, როდესაც ჩანდა უფრო მაღალი გარჩევადობით და შესაძლოა გარკვეული შეღებვა პარენქიმულ სივრცეში (სურათი 4b).გამოსაკვლევად შეიძლებოდა თუ არა პეპტიდის შუამავლობით გამოწვეული ფარმაკოლოგიური ეფექტების მიღება ცნს-ში, ჩვენ ჩავატარეთ ექსპერიმენტი, რომელშიც i) #2077 სატრანზიტო პეპტიდის და ii) BACE1 ინჰიბიტორის პეპტიდის ბიოტინილირებული ვერსიები შერეული იყო SA-სთან ორი განსხვავებული თანაფარდობით.ერთი კომბინაციისთვის ჩვენ გამოვიყენეთ მხოლოდ BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორი, ხოლო მეორესთვის გამოვიყენეთ BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორის 1:3 თანაფარდობა #2077 პეპტიდთან.ორივე ნიმუში შეყვანილი იყო ინტრავენურად და სისხლში და ცერებროსპინალურ სითხეში ბეტა-ამილოიდური პეპტიდი 40 (აბეტა40) გაზომილი იყო დროთა განმავლობაში.Abeta40 გაზომილი იყო CSF-ში, რადგან ის ასახავს BACE1 ინჰიბიციას თავის ტვინის პარენქიმაში.როგორც მოსალოდნელი იყო, ორივე კომპლექსმა მნიშვნელოვნად შეამცირა სისხლში Abeta40 დონე (ნახ. 4c, d).თუმცა, მხოლოდ ნიმუშები, რომლებიც შეიცავს პეპტიდის No.2077 და BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორმა, რომელიც კონიუგირებულია SA-სთან, გამოიწვია Abeta40-ის მნიშვნელოვანი შემცირება ცერებროსპინალურ სითხეში (ნახ. 4c).მონაცემები აჩვენებს, რომ პეპტიდი No.2077-ს შეუძლია 60 kDa SA ცილის ტრანსპორტირება ცნს-ში და ასევე იწვევს ფარმაკოლოგიურ ეფექტებს BACE1 პეპტიდის SA-კონიუგირებული ინჰიბიტორებით.
(ა) T7 ფაგის კლონური ინექცია (2 × 10 ფაგი/ცხოველი), რომელიც აჩვენებს CSF პეპტიდის #2077 (RLSSVDSDLSGC) და არაინექციური საკონტროლო ფაგის (#1779) ხანგრძლივ ფარმაკოკინეტიკური პროფილებს მინიმუმ სამ CM-ინტუბირებულ ვირთხებში.(ბ) წარმომადგენლობითი კორტიკალური მიკროსისხლძარღვების კონფოკალური მიკროსკოპული გამოსახულება ფაგის ინექციურ ვირთხებში (2 × 10 10 ფაგი/ცხოველი), რომელიც აჩვენებს პეპტიდის #2077 და გემების (ლექტინი) კონტრშეღებვას.ეს ფაგის კლონები შეჰყავდათ 3 ვირთხას და აძლევდნენ ცირკულირებას პერფუზიამდე 1 საათით ადრე.ტვინი დაიჭრა და შეიღება პოლიკლონური FITC-ის მარკირებული ანტისხეულებით T7 ფაგის კაფსიდის წინააღმდეგ.პერფუზიამდე და შემდგომ ფიქსაციამდე ათი წუთით ადრე, DyLight594-ზე მარკირებული ლექტინი შეჰყავდათ ინტრავენურად.ფლუორესცენტური გამოსახულებები გვიჩვენებს მიკროსისხლძარღვების სანათური მხარის ლექტინის შეღებვას (წითლად) და ფაგებს (მწვანე) კაპილარების სანათურში და ტვინის პერივასკულარულ ქსოვილში.მასშტაბის ზოლი შეესაბამება 10 μm.(გ, დ) ბიოტინილირებული BACE1 ინჰიბიტორული პეპტიდი ცალკე ან ბიოტინილირებულ სატრანზიტო პეპტიდ #2077-თან ერთად იყო შერწყმული სტრეპტავიდინთან, რასაც მოჰყვა ინტრავენური ინექცია მინიმუმ სამი კანულირებული CM ვირთხების (10 მგ სტრეპტავიდინი/კგ).BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორის შუამავლობით Aβ40 შემცირება გაზომილი იყო Aβ1-40 ELISA სისხლში (წითელი) და ცერებროსპინალურ სითხეში (ნარინჯისფერი) მითითებულ დროში.უკეთესი სიცხადისთვის, 100%-იანი სკალით დიაგრამაზე დახაზულია წერტილოვანი ხაზი.(გ) Aβ40-ის პროცენტული შემცირება სისხლში (წითელი სამკუთხედები) და ცერებროსპინალურ სითხეში (ნარინჯისფერი სამკუთხედები) ვირთხებში, რომლებიც მკურნალობდნენ სტრეპტავიდინით კონიუგირებული ტრანზიტ პეპტიდთან #2077 და BACE1 ინჰიბიტორ პეპტიდთან 3:1 თანაფარდობით.(დ) ვირთხების სისხლში Aβ40 (წითელი წრეები) და თავზურგტვინის სითხის (ნარინჯისფერი წრეები) პროცენტული შემცირება სტრეპტავიდინით დაწყვილებული მხოლოდ BACE1 ინჰიბიტორ პეპტიდთან.Aβ კონცენტრაცია კონტროლში იყო 420 pg/ml (სტანდარტული გადახრა = 101 pg/ml).
ფაგის ჩვენება წარმატებით იქნა გამოყენებული ბიოსამედიცინო კვლევის რამდენიმე სფეროში17.ეს მეთოდი გამოიყენება in vivo სისხლძარღვთა მრავალფეროვნების კვლევებისთვის18,19, ისევე როგორც კვლევებისთვის, რომლებიც მიზნად ისახავს ცერებრალური გემების20,21,22,23,24,25,26.ამ კვლევაში, ჩვენ გავაფართოვეთ ამ შერჩევის მეთოდის გამოყენება არა მხოლოდ პეპტიდების პირდაპირი იდენტიფიკაციისთვის, რომლებიც მიზნად ისახავს ცერებრალური გემების, არამედ აქტიური სატრანსპორტო თვისებების მქონე კანდიდატების აღმოჩენას ჰემატოენცეფალური ბარიერის გადაკვეთისთვის.ჩვენ ახლა აღვწერთ ინ ვივო შერჩევის პროცედურის შემუშავებას CM ინტუბირებულ ვირთხებში და ვაჩვენებთ მის პოტენციალს პეპტიდების იდენტიფიცირებისთვის CSF-ის დასახლების თვისებებით.T7 ფაგის გამოყენებით, რომელიც აჩვენებს 12-მერი შემთხვევითი პეპტიდების ბიბლიოთეკას, ჩვენ შევძელით იმის დემონსტრირება, რომ T7 ფაგი საკმარისად მცირეა (დაახლოებით 60 ნმ დიამეტრით)10, რათა მოერგოს ჰემატოენცეფალურ ბარიერს, რითაც პირდაპირ გადაკვეთს ჰემატოენცეფალურ ბარიერს ან ქოროიდულ პლექსუსს.ჩვენ დავაკვირდით, რომ CSF-ის აღება კანულირებული CM ვირთხებიდან იყო კარგად კონტროლირებადი in vivo ფუნქციური სკრინინგის მეთოდი და რომ ამოღებული ფაგი არა მხოლოდ შეკრული იყო სისხლძარღვებთან, არამედ ფუნქციონირებდა როგორც გადამტანი ჰემატოენცეფალურ ბარიერში.გარდა ამისა, სისხლის ერთდროული შეგროვებით და HTS-ის გამოყენებით CSF-ზე და სისხლიდან წარმოებულ ფაგებზე, ჩვენ დავადასტურეთ, რომ ჩვენს არჩევანზე CSF გავლენას არ ახდენს სისხლის გამდიდრება ან ვარგისიანობა შერჩევის რაუნდებს შორის გაფართოებისთვის.თუმცა, სისხლის განყოფილება შერჩევის პროცედურის ნაწილია, ვინაიდან ფაგები, რომლებსაც შეუძლიათ CSF განყოფილებამდე მიაღწიონ, უნდა გადარჩნენ და იმდენ ხანს იმოძრაონ სისხლში, რომ გამდიდრდნენ ტვინში.HTS-ის დაუმუშავებელი მონაცემებიდან საიმედო თანმიმდევრობის ინფორმაციის ამოღების მიზნით, ჩვენ დავაყენეთ ფილტრები, რომლებიც ადაპტირებულია პლატფორმის სპეციფიკურ თანმიმდევრობის შეცდომებზე ანალიზის სამუშაო პროცესში.სკრინინგის მეთოდში კინეტიკური პარამეტრების ჩართვით, ჩვენ დავადასტურეთ ველური ტიპის T7 ფაგების სწრაფი ფარმაკოკინეტიკა (t½ ~ 28 წთ) სისხლში24, 27, 28 და ასევე დავადგინეთ მათი ნახევარგამოყოფის პერიოდი ცერებროსპინალურ სითხეში (t½ ~ 26 წთ) წუთში).სისხლში და CSF-ში მსგავსი ფარმაკოკინეტიკური პროფილის მიუხედავად, ფაგის სისხლში კონცენტრაციის მხოლოდ 0.001% შეიძლება გამოვლინდეს CSF-ში, რაც მიუთითებს ველური ტიპის T7 ფაგის დაბალი ფონური მობილურობა ჰემატოენცეფალურ ბარიერზე.ეს ნაშრომი ხაზს უსვამს შერჩევის პირველი რაუნდის მნიშვნელობას in vivo პანინგის სტრატეგიების გამოყენებისას, განსაკუთრებით ფაგური სისტემებისთვის, რომლებიც სწრაფად იშლება ცირკულაციისგან, რადგან რამდენიმე კლონს შეუძლია მიაღწიოს ცნს განყოფილებას.ამრიგად, პირველ რაუნდში, ბიბლიოთეკის მრავალფეროვნების შემცირება ძალიან დიდი იყო, რადგან კლონების მხოლოდ შეზღუდული რაოდენობა საბოლოოდ შეგროვდა ამ ძალიან მკაცრ CSF მოდელში.ეს in vivo პანინგის სტრატეგია მოიცავდა შერჩევის რამდენიმე საფეხურს, როგორიცაა აქტიური დაგროვება CSF განყოფილებაში, კლონის გადარჩენა სისხლის განყოფილებაში და T7 ფაგის კლონების სწრაფი მოცილება სისხლიდან პირველი 10 წუთის განმავლობაში (ნახ. 1d და დამატებითი ნახ. 4M).).ამრიგად, პირველი რაუნდის შემდეგ, CSF-ში გამოვლინდა სხვადასხვა ფაგის კლონი, თუმცა ერთი და იგივე საწყისი აუზი გამოიყენებოდა ცალკეულ ცხოველებზე.ეს ვარაუდობს, რომ მრავალი მკაცრი შერჩევის ნაბიჯი წყარო ბიბლიოთეკებისთვის ბიბლიოთეკის წევრების დიდი რაოდენობით იწვევს მრავალფეროვნების მნიშვნელოვან შემცირებას.ამიტომ, შემთხვევითი მოვლენები გახდება საწყისი შერჩევის პროცესის განუყოფელი ნაწილი, რაც დიდ გავლენას მოახდენს შედეგზე.სავარაუდოა, რომ თავდაპირველი ბიბლიოთეკის ბევრ კლონს ჰქონდა CSF გამდიდრების ძალიან მსგავსი მიდრეკილება.თუმცა, იმავე ექსპერიმენტულ პირობებშიც კი, შერჩევის შედეგები შეიძლება განსხვავდებოდეს საწყის აუზში თითოეული კონკრეტული კლონის მცირე რაოდენობის გამო.
CSF-ით გამდიდრებული მოტივები განსხვავდება სისხლში მოტივებისგან.საინტერესოა, რომ ჩვენ აღვნიშნეთ პირველი გადასვლა გლიცინით მდიდარი პეპტიდებისკენ ცალკეული ცხოველების სისხლში.(ნახ. 1გ, დამატებითი ნახ. 4e, 4f).გლიცინის პეპტიდების შემცველი ფაგები შეიძლება იყოს უფრო სტაბილური და ნაკლებად სავარაუდოა, რომ ისინი ამოღებულნი არიან მიმოქცევიდან.თუმცა, ეს გლიცინით მდიდარი პეპტიდები არ იქნა აღმოჩენილი ცერებროსპინალურ სითხეში, რაც იმაზე მეტყველებს, რომ კურირებულმა ბიბლიოთეკებმა გაიარეს შერჩევის ორი განსხვავებული ეტაპი: ერთი სისხლში და მეორეს საშუალება მისცა დაგროვილიყო ცერებროსპინალურ სითხეში.CSF-ით გამდიდრებული კლონები, რომლებიც მიღებულია შერჩევის მეოთხე რაუნდის შედეგად, ინტენსიურად იქნა გამოცდილი.თითქმის ყველა ინდივიდუალურად შემოწმებული კლონი დადასტურდა, რომ გამდიდრებულია CSF-ით ბლანკ საკონტროლო ფაგთან შედარებით.ერთი პეპტიდის დარტყმა (#2077) უფრო დეტალურად იქნა შესწავლილი.მან აჩვენა პლაზმის ნახევარგამოყოფის უფრო გრძელი პერიოდი სხვა დარტყმებთან შედარებით (სურათი 3d და დამატებითი სურათი 7) და საინტერესოა, რომ ეს პეპტიდი შეიცავდა ცისტეინის ნარჩენს C-ბოლოზე.ცოტა ხნის წინ დადასტურდა, რომ პეპტიდებში ცისტეინის დამატებამ შეიძლება გააუმჯობესოს მათი ფარმაკოკინეტიკური თვისებები ალბუმინ 29-თან შეკავშირების გზით.ეს ამჟამად უცნობია პეპტიდ #2077-ისთვის და საჭიროებს შემდგომ შესწავლას.ზოგიერთმა პეპტიდმა აჩვენა ვალენტურობა-დამოკიდებულება CSF გამდიდრებაში (მონაცემები არ არის ნაჩვენები), რაც შეიძლება დაკავშირებული იყოს T7 კაფსიდის ასახულ ზედაპირის გეომეტრიასთან.ჩვენ მიერ გამოყენებული T7 სისტემა აჩვენებდა თითოეული პეპტიდის 5-15 ასლს ფაგის ნაწილაკზე.IHC ჩატარდა კანდიდატ ტყვიის ფაგის კლონებზე, რომლებიც ინტრავენურად შეიყვანეს ვირთხების ცერებრალური ქერქში (დამატებითი სურ. 8).მონაცემებმა აჩვენა, რომ სულ მცირე სამი კლონი (No. 2002, No. 2009 და No. 2077) ურთიერთქმედებს BBB-თან.გასარკვევია, ეს BBB ურთიერთქმედება იწვევს CSF-ის დაგროვებას თუ ამ კლონების პირდაპირ გადაადგილებას BCSFB-ში.მნიშვნელოვანია, რომ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ შერჩეული პეპტიდები ინარჩუნებენ CSF-ის სატრანსპორტო უნარს, როდესაც სინთეზირდება და უკავშირდება ცილოვან ტვირთს.N-ტერმინალური ბიოტინილირებული პეპტიდების SA-სთან შეკავშირება არსებითად იმეორებს მიღებულ შედეგებს მათი შესაბამისი ფაგის კლონებით სისხლში და ცერებროსპინალურ სითხეში (ნახ. 3e).დაბოლოს, ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ტყვიის პეპტიდს #2077 შეუძლია ხელი შეუწყოს BACE1-ის ბიოტინილირებული პეპტიდის ინჰიბიტორის ტვინის მოქმედებას, რომელიც კონიუგირებულია SA-სთან, რაც იწვევს გამოხატულ ფარმაკოდინამიკურ ეფექტებს ცნს-ში Abeta40 დონის მნიშვნელოვანი შემცირებით CSF-ში (ნახ. 4).ჩვენ ვერ მოვახერხეთ მონაცემთა ბაზაში რომელიმე ჰომოლოგის იდენტიფიცირება პეპტიდური თანმიმდევრობის ჰომოლოგიური ძიების შესრულებით ყველა დარტყმაზე.მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ T7 ბიბლიოთეკის ზომა არის დაახლოებით 109, ხოლო თეორიული ბიბლიოთეკის ზომა 12-მერისთვის არის 4 x 1015. ამიტომ, ჩვენ შევარჩიეთ 12-მერიანი პეპტიდის ბიბლიოთეკის მრავალფეროვნების სივრცის მხოლოდ მცირე ნაწილი, რაც შეიძლება ნიშნავს, რომ უფრო ოპტიმიზირებული პეპტიდები შეიძლება გამოვლინდეს ამ სივრცის ადვოკატირებით.ჰიპოთეტურად, ერთ-ერთი მიზეზი, რის გამოც ჩვენ ვერ ვიპოვეთ ამ პეპტიდების ბუნებრივი ჰომოლოგები, შეიძლება იყოს ევოლუციის დროს არჩევა, რათა თავიდან აიცილოს გარკვეული პეპტიდური მოტივების უკონტროლო შეყვანა ტვინში.
ერთობლივად, ჩვენი შედეგები იძლევა საფუძველს სამომავლო სამუშაოებისთვის ცერებროვასკულური ბარიერის სატრანსპორტო სისტემების უფრო დეტალურად იდენტიფიცირებისა და დახასიათების მიზნით.ამ მეთოდის ძირითადი კონფიგურაცია ემყარება ფუნქციური შერჩევის სტრატეგიას, რომელიც არა მხოლოდ განსაზღვრავს კლონებს ცერებრალური სისხლძარღვთა დამაკავშირებელი თვისებებით, არამედ მოიცავს კრიტიკულ საფეხურს, რომელშიც წარმატებულ კლონებს აქვთ შინაგანი აქტივობა ბიოლოგიური ბარიერების გადალახვაში in vivo ცნს განყოფილებაში.არის ამ პეპტიდების ტრანსპორტირების მექანიზმის გარკვევა და მათი უპირატესობა ტვინის რეგიონისთვის სპეციფიკურ მიკროვასკულატურასთან შეკავშირების მიზნით.ამან შეიძლება გამოიწვიოს BBB-ისა და რეცეპტორების ტრანსპორტირების ახალი გზების აღმოჩენა.ჩვენ ველით, რომ იდენტიფიცირებულ პეპტიდებს შეუძლიათ პირდაპირ დაუკავშირდნენ ცერებროვასკულარულ რეცეპტორებს ან ცირკულირებულ ლიგანდებს, რომლებიც ტრანსპორტირებულია BBB ან BCSFB-ით.ამ ნაშრომში აღმოჩენილი CSF-ის სატრანსპორტო აქტივობის მქონე პეპტიდური ვექტორები შემდგომში იქნება გამოკვლეული.ჩვენ ამჟამად ვიკვლევთ ამ პეპტიდების თავის ტვინის სპეციფიკას BBB და/ან BCSFB-ის გადაკვეთის უნარის გამო.ეს ახალი პეპტიდები იქნება უაღრესად ღირებული იარაღები ახალი რეცეპტორების ან გზების პოტენციური აღმოჩენისთვის და ახალი მაღალეფექტური პლატფორმების განვითარებისთვის მაკრომოლეკულების, როგორიცაა ბიოლოგიური საშუალებების ტვინში მიწოდებისთვის.
დიდი ცისტერნის (CM) კანულირება ადრე აღწერილი მეთოდის მოდიფიკაციის გამოყენებით.ანესთეზირებული ვისტარის ვირთხები (200-350 გ) დამონტაჟდა სტერეოტაქსიკურ აპარატზე და გაკეთდა მედიანური ჭრილობა გაპარსულ და ასეპტიკურად მომზადებულ სკალპზე თავის ქალას გამოსავლენად.გაბურღეთ ორი ხვრელი ზედა საფენის მიდამოში და დაამაგრეთ ხვრელების სამაგრი ხრახნები.დამატებითი ხვრელი გაბურღული იყო გვერდითი კეფის კედელში უჟანგავი ფოლადის კანულის სტერეოტაქტიკური ხელმძღვანელობისთვის CM-ში.წაისვით სტომატოლოგიური ცემენტი კანულას გარშემო და დაამაგრეთ ხრახნებით.ფოტოგამყარებისა და ცემენტის გამკვრივების შემდეგ კანის ჭრილობა დაიხურა 4/0 სუპრამიდული ნაკერით.კანულის სწორად განთავსება დასტურდება ცერებროსპინალური სითხის (CSF) სპონტანური გაჟონვით.ამოიღეთ ვირთხა სტერეოტაქსიური აპარატიდან, მიიღეთ შესაბამისი პოსტოპერაციული მოვლა და ტკივილის მართვა და მიეცით საშუალება გამოჯანმრთელდეს მინიმუმ ერთი კვირის განმავლობაში, სანამ ცერებროსპინალურ სითხეში სისხლის ნიშნები არ შეინიშნება.ვისტარის ვირთხები (Crl:WI/Han) მიღებულ იქნა მდინარე ჩარლზიდან (საფრანგეთი).ყველა ვირთხა ინახებოდა სპეციფიკურ პათოგენისგან თავისუფალ პირობებში.ცხოველებზე ყველა ექსპერიმენტი დამტკიცებული იყო ქალაქ ბაზელის ვეტერინარული ოფისის მიერ, შვეიცარია და ჩატარდა ცხოველთა ლიცენზიის No. 2474 (ტვინის აქტიური ტრანსპორტის შეფასება თერაპიული კანდიდატების დონის გაზომვით ცერებროსპინალურ სითხეში და ვირთხების ტვინში).
ნაზად შეინახეთ ვირთხა გონზე CM კანულით ხელში.ამოიღეთ დატურა კანულადან და შეაგროვეთ 10 μl სპონტანურად მომდინარე ცერებროსპინალური სითხე.ვინაიდან კანულის გამტარიანობა საბოლოოდ დაირღვა, ამ კვლევაში ჩართული იყო მხოლოდ ცერებროსპინალური სითხის გამჭვირვალე ნიმუშები სისხლის დაბინძურების ან გაუფერულების მტკიცებულების გარეშე.პარალელურად, დაახლოებით 10-20 მკლ სისხლი აღებული იქნა კუდის წვერზე მცირე ჭრილიდან ჰეპარინთან ერთად მილებში (სიგმა-ოლდრიხი).CSF და სისხლი შეგროვდა სხვადასხვა დროს T7 ფაგის ინტრავენური ინექციის შემდეგ.დაახლოებით 5-10 μl სითხე იქნა გადაყრილი თითოეული CSF ნიმუშის შეგროვებამდე, რაც შეესაბამება კათეტერის მკვდარ მოცულობას.
ბიბლიოთეკები შეიქმნა T7Select 10-3b ვექტორის გამოყენებით, როგორც აღწერილია T7Select სისტემის სახელმძღვანელოში (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).მოკლედ, შემთხვევითი 12-მერიანი დნმ-ის ჩანართი სინთეზირებულია შემდეგ ფორმატში:
NNK კოდონი გამოიყენებოდა ჩანართში ორმაგი გაჩერების კოდონების და ამინომჟავების გადაჭარბებული გამოხატვის თავიდან ასაცილებლად.N არის თითოეული ნუკლეოტიდის ხელით შერეული ექვიმოლური თანაფარდობა, ხოლო K არის ადენინის და ციტოზინის ნუკლეოტიდების ხელით შერეული ექვიმოლური თანაფარდობა.ერთჯაჭვიანი რეგიონები გადაკეთდა ორჯაჭვიან დნმ-ში შემდგომი ინკუბაციით dNTP (Novagen) და Klenow ფერმენტით (New England Biolabs) Klenow ბუფერში (New England Biolabs) 3 საათის განმავლობაში 37°C-ზე.რეაქციის შემდეგ, ორჯაჭვიანი დნმ აღდგენილია EtOH ნალექით.მიღებული დნმ მონელებული იქნა შემაკავებელი ფერმენტებით EcoRI და HindIII (ორივე Roche-სგან).გახლეჩილი და გასუფთავებული (QIAquick, Qiagen) ჩანართი (T4 ლიგაზა, New England Biolabs) შემდეგ იყო ლიგირებული ჩარჩოში წინასწარ გაწყვეტილ T7 ვექტორში 10B კაფსიდის გენის ამინომჟავის 348-ის შემდეგ.ლიგაციის რეაქციები ინკუბირებული იყო 16°C-ზე 18 საათის განმავლობაში ინ ვიტრო შეფუთვამდე.ფაგის შეფუთვა in vitro განხორციელდა T7Select 10-3b კლონირების ნაკრებით (Novagen) მოწოდებული ინსტრუქციის მიხედვით და შეფუთვის ხსნარი გაძლიერდა ერთხელ ლიზისამდე Escherichia coli-ის გამოყენებით (BLT5615, Novagen).ლიზატები იყო ცენტრიფუგირებული, ტიტრირებული და გაყინული -80°C-ზე, როგორც გლიცეროლის საფონდო ხსნარი.
ბულიონში ან ფირფიტაში გაძლიერებული ფაგის ცვლადი რეგიონების პირდაპირი PCR გაძლიერება საკუთრებაში არსებული 454/Roche-amplicon fusion პრაიმერების გამოყენებით.წინა შერწყმის პრაიმერი შეიცავს ცვლადი რეგიონის (NNK) 12 (სპეციფიკური შაბლონის), GS FLX ტიტანის ადაპტერს A და ბიბლიოთეკის ოთხი ბაზის საკვანძო თანმიმდევრობას (TCAG) (დამატებითი სურათი 1a) გვერდით.
საპირისპირო შერწყმის პრაიმერი ასევე შეიცავს ბიოტინს, რომელიც მიმაგრებულია მძივებზე და GS FLX ტიტანის ადაპტერ B, რომელიც საჭიროა კლონური გაძლიერებისთვის ემულსიური PCR-ის დროს:
ამპლიკონები შემდეგ დაექვემდებარა 454/Roche პიროთანმიმდევრულობას 454 GS-FLX ტიტანის პროტოკოლის მიხედვით.Sanger-ის ხელით თანმიმდევრობისთვის (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl დნმ-ის ანალიზატორი), T7 ფაგის დნმ გაძლიერდა PCR-ით და დახარისხდა შემდეგი პრაიმერის წყვილებით:
ცალკეული დაფებიდან ჩანართები ექვემდებარებოდა PCR გაძლიერებას Roche Fast Start დნმ პოლიმერაზას ნაკრების გამოყენებით (მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით).შეასრულეთ ცხელი დაწყება (10 წუთი 95 °C-ზე) და 35 გამაძლიერებელი ციკლი (50 წმ 95 °C-ზე, 1 წუთი 50 °C-ზე და 1 წუთი 72 °C-ზე).
ფაგი ბიბლიოთეკებიდან, ველური ტიპის ფაგი, CSF-დან და სისხლიდან ამოღებული ფაგი ან ცალკეული კლონები გაძლიერდა Escherichia coli BL5615-ში ტუბერკულოზის ბულიონში (Sigma Aldrich) ან 500 სმ2 ჭურჭელში (Thermo Scientific) 4 საათის განმავლობაში 37°C-ზე.ფაგები ამოღებულ იქნა ფირფიტებიდან ფირფიტების გამორეცხვით Tris-EDTA ბუფერით (Fluka Analytical) ან დაფების შეგროვებით სტერილური პიპეტის წვერით.ფაგები იზოლირებული იყო კულტურის ზენატანიდან ან ექსტრაქციის ბუფერიდან პოლიეთილენ გლიკოლის (PEG 8000) ნალექის ერთი რაუნდით (Promega) და ხელახლა სუსპენდირებულ იქნა Tris-EDTA ბუფერში.
გაძლიერებული ფაგი დაექვემდებარა ენდოტოქსინის მოცილების 2-3 რაუნდს ენდოტოქსინის მოცილების მარცვლების გამოყენებით (Miltenyi Biotec) ინტრავენური (IV) ინექციის წინ (500 μl/ცხოველი).პირველ რაუნდში შემოიტანეს 2×1012 ფაგები;მეორეში 2×1010 ფაგები;მესამე და მეოთხე შერჩევის რაუნდში, 2×109 ფაგი ცხოველზე.ფაგის შემცველობა CSF-ში და მითითებულ დროში შეგროვებული სისხლის ნიმუშები განისაზღვრა დაფების დათვლით მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით (T7Select სისტემის სახელმძღვანელო).ფაგის შერჩევა განხორციელდა გასუფთავებული ბიბლიოთეკების ინტრავენური ინექციით კუდის ვენაში ან წინა შერჩევის რაუნდიდან CSF-დან ამოღებული ფაგის ხელახალი ინექციით, ხოლო შემდგომი აღება ჩატარდა 10 წთ, 30 წთ, 60 წთ, 90 წთ, 120 წთ, 180 წთ და 240 წთ სისხლის სინჯებზე შესაბამისად.სულ ჩატარდა in vivo პანინგის ოთხი რაუნდი, რომლებშიც ორი შერჩეული ტოტი ცალ-ცალკე ინახებოდა და გაანალიზდა შერჩევის პირველი სამი რაუნდის განმავლობაში.შერჩევის პირველი ორი რაუნდიდან CSF-დან ამოღებული ყველა ფაგის ჩანართი დაექვემდებარა 454/როშის პიროსეკვენციირებას, ხოლო შერჩევის ბოლო ორი რაუნდიდან CSF-დან ამოღებული ყველა კლონი ხელით იყო დახარისხებული.ყველა სისხლის ფაგი შერჩევის პირველი რაუნდიდან ასევე დაექვემდებარა 454/როშის პიროსეკვენციას.ფაგის კლონების ინექციისთვის, შერჩეული ფაგები გაძლიერდა E. coli-ში (BL5615) 500 სმ2 თეფშზე 37°C-ზე 4 საათის განმავლობაში.ინდივიდუალურად შერჩეული და ხელით თანმიმდევრული კლონები გამრავლდა ტუბერკულოზის გარემოში.ფაგის ექსტრაქციის, გაწმენდისა და ენდოტოქსინის მოცილების შემდეგ (როგორც ზემოთ იყო აღწერილი), 2×1010 ფაგები/ცხოველი 300 μl-ში შეყვანილი იქნა ინტრავენურად ერთ კუდის ვენაში.
თანმიმდევრობის მონაცემების წინასწარი დამუშავება და ხარისხობრივი გაფილტვრა.Raw 454/Roche მონაცემები გადაკეთდა ბინარული სტანდარტული ნაკადის რუქის ფორმატიდან (sff) Pearson ადამიანის წაკითხვადი ფორმატში (fasta) გამყიდველის პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობის შემდგომი დამუშავება განხორციელდა საკუთრების C პროგრამებისა და სკრიპტების გამოყენებით (გამოუქვეყნებელი პროგრამული პაკეტი), როგორც ეს აღწერილია ქვემოთ.პირველადი მონაცემების ანალიზი მოიცავს მკაცრ მრავალეტაპიან ფილტრაციის პროცედურებს.წაკითხულის გასაფილტრად, რომელიც არ შეიცავდა 12-მერიანი ჩასმის დნმ-ის მოქმედ თანმიმდევრობას, წაკითხვები თანმიმდევრულად გასწორდა დაწყების ლეიბლთან (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), გაჩერების ეტიკეტთან (TAAGCTTGCGGGCCGCACTCGAGTA) და ფონის ჩასმასთან (CCCTGCAGGGATATCCCGTCGGAATTCT გლობალური ტესტის გამოყენებით.გასწორება, რომელიც იძლევა 2-მდე შეუსაბამობის საშუალებას თითო გასწორებაზე31.ამიტომ, წაკითხული დაწყების და გაჩერების გარეშე თეგები და წაკითხვები, რომლებიც შეიცავს ფონურ ჩანართებს, ანუ გასწორებები, რომლებიც აღემატება შეუსაბამობების დასაშვებ რაოდენობას, ამოღებულ იქნა ბიბლიოთეკიდან.რაც შეეხება დარჩენილ წაკითხვებს, N-mer დნმ-ის თანმიმდევრობა, რომელიც ვრცელდება საწყისი ნიშნიდან და მთავრდება გაჩერების ნიშნულამდე, ამოღებულია საწყისი წაკითხული თანმიმდევრობიდან და შემდგომ დამუშავებულია (შემდგომში „ჩასმა“).ჩანართის გადათარგმნის შემდეგ, ნაწილი პირველი გაჩერების კოდონის შემდეგ პრაიმერის 5′ ბოლოში ამოღებულია ჩასმადან.გარდა ამისა, ასევე ამოიღეს ნუკლეოტიდები, რომლებიც მიჰყავდათ არასრულ კოდონებამდე პრაიმერის 3' ბოლოს.მხოლოდ ფონის თანმიმდევრობების შემცველი ჩანართების გამორიცხვის მიზნით, ასევე ამოიღეს ნათარგმნი ჩანართები, რომლებიც იწყება ამინომჟავის ნიმუშით „PAG“.ბიბლიოთეკიდან ამოღებულ იქნა პეპტიდები, რომელთა თარგმნის შემდგომი სიგრძე 3 ამინომჟავაზე ნაკლები იყო.დაბოლოს, ამოიღეთ ზედმეტობა ჩანართის აუზში და განსაზღვრეთ თითოეული უნიკალური ჩანართის სიხშირე.ამ ანალიზის შედეგები მოიცავდა ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობების (ჩანართების) და მათ (წაკითხული) სიხშირეების ჩამონათვალს (დამატებითი ნახატები 1c და 2).
ჯგუფის N-mer დნმ-ის ჩანართები თანმიმდევრობის მსგავსების მიხედვით: 454/Roche-ს სპეციფიკური თანმიმდევრობის შეცდომების აღმოსაფხვრელად (როგორიცაა ჰომოპოლიმერული გაფართოებების თანმიმდევრობის პრობლემები) და ნაკლებად მნიშვნელოვანი ზედმეტობების მოსაშორებლად, ადრე გაფილტრული N-mer დნმ-ის თანმიმდევრობის ჩანართები (ჩანართები) დალაგებულია მსგავსების მიხედვით.ჩასმა (დაშვებულია 2-მდე შეუსაბამო ფუძე) განმეორებითი ალგორითმის გამოყენებით, რომელიც განისაზღვრება შემდეგნაირად: ჩასმა დალაგებულია ჯერ მათი სიხშირის მიხედვით (უმაღლესიდან ყველაზე დაბალამდე), ხოლო თუ ისინი ერთნაირია, მეორადი დახარისხების მიხედვით სიგრძის მიხედვით (გრძელიდან უმოკლესამდე) .ამრიგად, ყველაზე ხშირი და გრძელი ჩასმა განსაზღვრავს პირველ "ჯგუფს".ჯგუფის სიხშირე დაყენებულია საკვანძო სიხშირეზე.შემდეგ, დალაგებულ სიაში დარჩენილი თითოეული ჩასმა ცდილობდა დაემატებინა ჯგუფში წყვილი Needleman-Wunsch გასწორებით.თუ შეუსაბამობების, ჩასმის ან წაშლის რაოდენობა გასწორებაში არ აღემატება 2-ის ზღურბლს, ჯგუფს ემატება ჩასმა და ჯგუფის საერთო სიხშირე იზრდება იმ სიხშირით, თუ რამდენჯერ დაემატა ჩასმა.ჯგუფში დამატებული ჩანართები მონიშნულია როგორც გამოყენებული და გამორიცხულია შემდგომი დამუშავებისგან.თუ ჩასმის თანმიმდევრობა ვერ დაემატება უკვე არსებულ ჯგუფს, ჩასმის თანმიმდევრობა გამოიყენება ახალი ჯგუფის შესაქმნელად შესაბამისი ჩასმის სიხშირით და აღინიშნება როგორც გამოყენებული.გამეორება მთავრდება, როდესაც ყოველი ჩასმის თანმიმდევრობა გამოყენებული იქნება ახალი ჯგუფის შესაქმნელად, ან შეიძლება შევიდეს უკვე არსებულ ჯგუფში.ბოლოს და ბოლოს, ნუკლეოტიდებისგან შემდგარი დაჯგუფებული ჩანართები საბოლოოდ ითარგმნება პეპტიდურ თანმიმდევრობებად (პეპტიდური ბიბლიოთეკები).ამ ანალიზის შედეგი არის ჩასმათა ნაკრები და მათი შესაბამისი სიხშირეები, რომლებიც ქმნიან თანმიმდევრული წაკითხვის რაოდენობას (დამატებითი ნახ. 2).
მოტივის გენერაცია: უნიკალური პეპტიდების სიის საფუძველზე შეიქმნა ბიბლიოთეკა, რომელიც შეიცავს ყველა შესაძლო ამინომჟავის შაბლონს (aa), როგორც ეს ნაჩვენებია ქვემოთ.3 სიგრძის თითოეული შესაძლო ნიმუში ამოღებულ იქნა პეპტიდიდან და მისი შებრუნებული ნიმუში დაემატა საერთო მოტივის ბიბლიოთეკას, რომელიც შეიცავს ყველა შაბლონს (ტრიპეპტიდებს).უაღრესად განმეორებადი მოტივების ბიბლიოთეკები იყო თანმიმდევრული და ამოღებულია სიჭარბე.შემდეგ, თითოეული ტრიპეპტიდის მოტივების ბიბლიოთეკაში, ჩვენ შევამოწმეთ მისი არსებობა ბიბლიოთეკაში გამოთვლითი ხელსაწყოების გამოყენებით.ამ შემთხვევაში, ნაპოვნი მოტივის ტრიპეპტიდის შემცველი პეპტიდის სიხშირე ემატება და ენიჭება მოტივს მოტივების ბიბლიოთეკაში („მოტივების რაოდენობა“).მოტივის გენერირების შედეგი არის ორგანზომილებიანი მასივი, რომელიც შეიცავს ტრიპეპტიდების (მოტივების) ყველა შემთხვევას და მათ შესაბამის მნიშვნელობებს, რაც არის თანმიმდევრული წაკითხვის რაოდენობა, რაც იწვევს შესაბამის მოტივს, როდესაც წაკითხულის გაფილტვრა, დაჯგუფება და თარგმნა ხდება.მეტრიკა, როგორც ზემოთ აღწერილია დეტალურად.
მოტივების რაოდენობის ნორმალიზება და შესაბამისი გაფანტული ნახაზები: თითოეული ნიმუშისთვის მოტივების რაოდენობა ნორმალიზებული იყო გამოყენებით
სადაც ni არის i თემის შემცველი წაკითხვის რაოდენობა.ამრიგად, vi წარმოადგენს წაკითხვის პროცენტულ სიხშირეს (ან პეპტიდებს), რომლებიც შეიცავს ნიმუშში i მოტივს.P-მნიშვნელობები მოტივების არანორმალიზებული რაოდენობისთვის გამოითვალა ფიშერის ზუსტი ტესტის გამოყენებით.რაც შეეხება მოტივების რაოდენობის კორელოგრამებს, სპირმანის კორელაციები გამოითვალა მოტივების ნორმალიზებული რაოდენობის გამოყენებით რ.
პეპტიდების ბიბლიოთეკის თითოეულ პოზიციაზე ამინომჟავების შემცველობის ვიზუალიზაციისთვის შეიქმნა ვებ ლოგოგრამები 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).პირველ რიგში, ამინომჟავების შემცველობა 12-მერიანი პეპტიდის თითოეულ პოზიციაზე ინახება 20×12 მატრიცაში.შემდეგ, 1000 პეპტიდის ნაკრები, რომელიც შეიცავს ერთსა და იმავე ფარდობითი ამინომჟავის შემცველობას თითოეულ პოზიციაზე, გენერირებულია სწრაფი მიმდევრობის ფორმატში და მიეწოდება შესვლის ვებ-ლოგო 3-ს, რომელიც წარმოქმნის ამინომჟავების ფარდობითი შემცველობის გრაფიკულ წარმოდგენას თითოეულ პოზიციაზე.მოცემული პეპტიდური ბიბლიოთეკისთვის.მრავალგანზომილებიანი მონაცემთა ნაკრების ვიზუალიზაციისთვის, სითბოს რუქები შეიქმნა R-ში შიგნიდან შემუშავებული ხელსაწყოს გამოყენებით (biosHeatmap, R პაკეტი ჯერ არ გამოშვებული).სითბოს რუქებში წარმოდგენილი დენდროგრამები გამოთვლილია უორდის იერარქიული კლასტერიზაციის მეთოდით ევკლიდეს მანძილის მეტრიკით.მოტივის ქულების მონაცემების სტატისტიკური ანალიზისთვის, P მნიშვნელობები არანორმალიზებული ქულების გამოთვლილი იყო ფიშერის ზუსტი ტესტის გამოყენებით.P-მნიშვნელობები სხვა მონაცემთა ნაკრებისთვის გამოითვლებოდა R-ში Student's t-ტესტის ან ANOVA-ს გამოყენებით.
შერჩეული ფაგის კლონები და ფაგები ჩანართების გარეშე შეყვანილი იქნა ინტრავენურად კუდის ვენის მეშვეობით (2×1010 ფაგი/ცხოველი 300 μl PBS).პერფუზიამდე და შემდგომ ფიქსაციამდე ათი წუთით ადრე, იმავე ცხოველებს ინტრავენურად გაუკეთეს 100 μl DyLight594 მარკირებული ლექტინი (Vector Laboratories Inc., DL-1177).ფაგის ინექციიდან 60 წუთის შემდეგ, ვირთხებს გაუკეთეს პერფუზია გულში 50 მლ PBS, რასაც მოჰყვა 50 მლ 4% PFA/PBS.ტვინის ნიმუშები დამატებით დაფიქსირდა ღამით 4% PFA/PBS-ში და გაჟღენთილია 30% საქაროზაში ღამით 4°C-ზე.ნიმუშები გაყინულია OCT ნარევში.გაყინული ნიმუშების იმუნოჰისტოქიმიური ანალიზი ჩატარდა ოთახის ტემპერატურაზე 30 μm კრიოსექციაზე დაბლოკილი 1% BSA-ით და ინკუბირებული პოლიკლონური FITC ეტიკეტირებული ანტისხეულებით T7 ფაგის წინააღმდეგ (Novus NB 600-376A) 4 °C-ზე.ინკუბაცია ღამით.საბოლოოდ, სექციები გაირეცხა 3-ჯერ PBS-ით და გამოკვლეული იქნა კონფოკალური ლაზერული მიკროსკოპით (Leica TCS SP5).
ყველა პეპტიდი მინიმალური სისუფთავით 98% იყო სინთეზირებული GenScript USA-ს მიერ, ბიოტინილირებული და ლიოფილიზებული.ბიოტინი შეკრულია დამატებითი სამმაგი გლიცინის დისპანსერით N-ბოლოზე.შეამოწმეთ ყველა პეპტიდი მასსპექტრომეტრიის გამოყენებით.
სტრეპტავიდინი (Sigma S0677) შერეული იყო ბიოტინილირებული პეპტიდის, ბიოტინილირებული BACE1 ინჰიბიტორული პეპტიდის 5-ჯერ ექვიმოლარულ სიჭარბესთან, ან ბიოტინილირებული BACE1 ინჰიბიტორული პეპტიდის (3:1 თანაფარდობით) და BACE1 ინჰიბიტორული პეპტიდის DM5-10-ში.ინექციამდე 1 საათი ოთახის ტემპერატურაზე.სტრეპტავიდინთან კონიუგირებული პეპტიდები შეყვანილი იქნა ინტრავენურად დოზით 10 მგ/კგ ვირთხების ერთ-ერთ კუდის ვენაში თავის ტვინის ღრუში.
სტრეპტავიდინ-პეპტიდური კომპლექსების კონცენტრაცია შეფასდა ELISA-ით.Nunc Maxisorp მიკროტიტრული ფირფიტები (Sigma) დაფარული იყო ღამით 4°C ტემპერატურაზე 1.5 მკგ/მლ თაგვის ანტისტრეპტავიდინის ანტისხეულით (თერმო, MA1-20011).ბლოკირების შემდეგ (დაბლოკვის ბუფერი: 140 ნმ NaCL, 5 მმ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% ჟელატინი, 1% BSA) ოთახის ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში, დაიბანეთ ფირფიტა 0,05% Tween-20/PBS (სარეცხი პლაზმური ბუფერი) 3 წამის განმავლობაში (პლაზმის ბლოკის ბუფერი დამატებული იყო 1 ჭაბურღილში CSF-ის ნიმუშებით). 0,000, CSF 1:115).შემდეგ ფირფიტა ინკუბირებული იყო ღამით 4°C-ზე გამოვლენის ანტისხეულით (1 მკგ/მლ, ანტი-სტრეპტავიდინ-HRP, Novus NB120-7239).რეცხვის სამი ეტაპის შემდეგ, სტრეპტავიდინი გამოვლინდა ინკუბაციით TMB სუბსტრატის ხსნარში (Roche) 20 წთ-მდე.ფერის განვითარების შეწყვეტის შემდეგ 1M H2SO4-ით, გაზომეთ შთანთქმა 450 ნმ.
სტრეპტავიდინ-პეპტიდ-BACE1 ინჰიბიტორის კომპლექსის ფუნქცია შეფასებული იყო Aβ(1-40) ELISA-ით მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით (Wako, 294-64701).მოკლედ, CSF-ის ნიმუშები განზავებული იყო სტანდარტულ გამხსნელში (1:23) და ინკუბირებული იყო ღამით 4°C ტემპერატურაზე 96 ჭაბურღილის ფირფიტებში, დაფარული BNT77 დაჭერის ანტისხეულით.რეცხვის ხუთი ეტაპის შემდეგ, HRP-კონიუგირებული BA27 ანტისხეული დაემატა და ინკუბირებული იყო 2 საათის განმავლობაში 4°C-ზე, რასაც მოჰყვა რეცხვის ხუთი ეტაპი.Aβ(1-40) გამოვლინდა ინკუბაციით TMB ხსნარში 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.მას შემდეგ, რაც ფერის განვითარება შეჩერებულია გაჩერების ხსნარით, გაზომეთ შთანთქმა 450 ნმ.პლაზმის ნიმუშები დაექვემდებარა მყარი ფაზის ექსტრაქციას Aβ(1-40) ELISA-მდე.პლაზმა დაემატა 0.2% DEA-ს (Sigma) 96 ჭაბურღილიან თეფშებში და ინკუბირებული იყო ოთახის ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში.SPE ფირფიტების (Oasis, 186000679) თანმიმდევრული გარეცხვის შემდეგ წყლით და 100% მეთანოლით, პლაზმის ნიმუშები დაემატა SPE ფირფიტებს და მთელი სითხე მოიხსნა.ნიმუშები გარეცხილი იყო (ჯერ 5% მეთანოლით, შემდეგ 30% მეთანოლით) და გაირეცხა 2% NH4OH/90% მეთანოლით.გამორეცხვის გაშრობის შემდეგ 55°C-ზე 99 წუთის განმავლობაში მუდმივი N2 დენით, ნიმუშები შემცირდა სტანდარტულ გამხსნელებში და Aβ(1-40) გაზომეს, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი.
როგორ მოვიყვანოთ ეს სტატია: Urich, E. et al.ტვირთის მიწოდება ტვინში ტრანზიტული პეპტიდების გამოყენებით, რომლებიც იდენტიფიცირებულია in vivo.მეცნიერება.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB and Moos T. მაკრომოლეკულური პრეპარატების მიწოდება ტვინში მიზნობრივი თერაპიის გამოყენებით.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. პეპტიდური და ცილოვანი პრეპარატების მიწოდება ჰემატოენცეფალურ ბარიერში.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
პარდრიჯი, WM ჰემატოენცეფალური ბარიერი: შეფერხება ტვინის წამლების შემუშავებაში.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. წამლის გაუმჯობესებული მიწოდებისა და ტვინზე დამიზნების პერსპექტივები ქოროიდული წნულის-CSF გზის მეშვეობით.ფარმაცევტული კვლევა 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM ბიოფარმაცევტული საშუალებების მოდერნიზაცია მოლეკულური ტროას ცხენებით ტვინის მიწოდებისთვის.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
პარდრიჯი, WM რეცეპტორის შუამავლობით პეპტიდური ტრანსპორტი ჰემატოენცეფალურ ბარიერში.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.გაიზარდოს ტვინში შეღწევა და თერაპიული ანტისხეულების ეფექტურობა მონოვალენტური მოლეკულური შატლების გამოყენებით.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
ბიენ-ლი, ნ. და სხვ.ტრანსფერინის რეცეპტორის (TfR) ტრანსპორტი განსაზღვრავს TfR ანტისხეულების აფინური ვარიანტების ტვინში ათვისებას.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).