LC-ის პრობლემების მოგვარების ზოგიერთი თემა არასდროს არის მოძველებული, რადგან LC პრაქტიკაში არსებობს პრობლემები, მაშინაც კი, როდესაც ინსტრუმენტების ტექნოლოგია დროთა განმავლობაში იხვეწება. LC სისტემაში პრობლემების წარმოშობის მრავალი გზა არსებობს და ისინი პიკის ფორმაში ცუდ შედეგს იძლევა. როდესაც პიკის ფორმასთან დაკავშირებული პრობლემები წარმოიქმნება, ამ შედეგების შესაძლო მიზეზების მოკლე სია პრობლემების მოგვარების ჩვენი გამოცდილების გამარტივებაში გვეხმარება.
სახალისო იყო ამ სვეტის „LC პრობლემების მოგვარება“ წერა და ყოველთვიურად თემებზე ფიქრი, რადგან ზოგიერთი თემა არასდროს გადადის მოდიდან. ქრომატოგრაფიის კვლევის სფეროში გარკვეული თემები ან იდეები მოძველებულია, რადგან მათ ახალი და უკეთესი იდეები ცვლის, პრობლემების მოგვარების სფეროში კი, მას შემდეგ, რაც პირველი სტატია პრობლემების მოგვარების შესახებ გამოჩნდა ამ ჟურნალში (იმ დროს LC ჟურნალი), რადგან ზოგიერთი თემა კვლავ აქტუალურია) 1983 წელს (1). ბოლო რამდენიმე წლის განმავლობაში, LC პრობლემების მოგვარების რამდენიმე განყოფილება გავამახვილე თხევად ქრომატოგრაფიაზე (LC) მოქმედ თანამედროვე ტენდენციებზე (მაგალითად, წნევის შეკავებაზე ჩვენი გავლენის გაგების შედარებითი შედარება [2] ახალი მიღწევები), LC შედეგების ჩვენი ინტერპრეტაცია და თანამედროვე LC ინსტრუმენტებით პრობლემების მოგვარების გზები. ამ თვის ნაწილში ვაგრძელებ ჩემს სერიას (3), რომელიც დაიწყო 2021 წლის დეკემბერში და ფოკუსირებული იყო LC პრობლემების მოგვარების ზოგიერთ „სიცოცხლისა და სიკვდილის“ თემაზე - ელემენტები, რომლებიც შესანიშნავია ნებისმიერი პრობლემების მოგვარებისთვის, აუცილებელია, მიუხედავად იმ სისტემის ასაკისა, რომელსაც ვიყენებთ. ამ სერიის ძირითადი თემა ძალიან აქტუალურია LCGC-ის ცნობილი „LC პრობლემების მოგვარების სახელმძღვანელოსთვის“. დიაგრამა (4) ბევრ ლაბორატორიაში ჰკიდია. ამ სერიის მესამე ნაწილისთვის, მე გადავწყვიტე, ყურადღება გამემახვილებინა პიკის ფორმასთან ან პიკის მახასიათებლებთან დაკავშირებულ საკითხებზე. წარმოუდგენელია, მაგრამ კედლის დიაგრამაზე ჩამოთვლილია პიკის ცუდი ფორმის 44 სხვადასხვა პოტენციური მიზეზი! ჩვენ არ შეგვიძლია ყველა ამ საკითხის დეტალურად განხილვა ერთ სტატიაში, ამიტომ ამ თემაზე ამ პირველ ნაწილში, მე ყურადღებას გავამახვილებ ზოგიერთ მათგანზე, რომლებსაც ყველაზე ხშირად ვხედავ. იმედი მაქვს, რომ LC-ის ახალგაზრდა და უფროსი მომხმარებლები იპოვიან სასარგებლო რჩევებსა და შეხსენებებს ამ მნიშვნელოვან თემაზე.
პრობლემების მოგვარების კითხვებს სულ უფრო ხშირად ვპასუხობ ფრაზით „ყველაფერი შესაძლებელია“. ეს პასუხი შეიძლება მარტივი ჩანდეს, როდესაც განვიხილავთ ძნელად ინტერპრეტირებად დაკვირვებებს, მაგრამ ხშირად მიმაჩნია, რომ ეს მიზანშეწონილია. ცუდი პიკის ფორმის მრავალი შესაძლო მიზეზის გათვალისწინებით, მნიშვნელოვანია, რომ პრობლემის განხილვისას ღია გონება შევინარჩუნოთ და შევძლოთ პოტენციური მიზეზების პრიორიტეტულობის განსაზღვრა პრობლემების მოგვარების მცდელობების დასაწყებად, ფოკუსირებით ყველაზე გავრცელებულ შესაძლებლობებზე, ეს საკითხი ძალიან მნიშვნელოვანია.
ნებისმიერი პრობლემის გადაჭრის სავარჯიშოს მთავარი ნაბიჯი — თუმცა, ვფიქრობ, რომ არასაკმარისად შეფასებული — არის იმის აღიარება, რომ არსებობს პრობლემა, რომლის გადაჭრაც აუცილებელია. პრობლემის აღიარება ხშირად ნიშნავს იმის აღიარებას, რომ ხელსაწყოსთან დაკავშირებული მოვლენები განსხვავდება ჩვენი მოლოდინებისგან, რომლებიც ჩამოყალიბებულია თეორიით, ემპირიული ცოდნითა და გამოცდილებით (5). აქ მოხსენიებული „პიკის ფორმა“ სინამდვილეში არა მხოლოდ პიკის ფორმას (სიმეტრიული, ასიმეტრიული, გლუვი, ფუმფულა, წინა კიდე, კუდისებური და ა.შ.) ეხება, არამედ სიგანესაც. პიკის რეალური ფორმის ჩვენი მოლოდინები მარტივია. თეორია (6) კარგად ადასტურებს სახელმძღვანელოს მოლოდინს, რომ უმეტეს შემთხვევაში, ქრომატოგრაფიული პიკები უნდა იყოს სიმეტრიული და შეესაბამებოდეს გაუსის განაწილების ფორმას, როგორც ეს ნაჩვენებია ნახაზ 1ა-ში. ის, რასაც პიკის სიგანისგან ველოდებით, უფრო რთული საკითხია და ამ თემას მომავალ სტატიაში განვიხილავთ. ნახაზ 1-ში მოცემული სხვა პიკის ფორმები აჩვენებს ზოგიერთ სხვა შესაძლებლობას, რომელთა დაკვირვებაც შესაძლებელია — სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, ზოგიერთ გზას, თუ როგორ შეიძლება რაღაც არასწორად წავიდეს. ამ ნაწილის დარჩენილ ნაწილში დროს დავუთმობთ იმ სიტუაციების კონკრეტული მაგალითების განხილვას, რომლებმაც შეიძლება გამოიწვიოს ამ ფორმის ტიპები.
ზოგჯერ პიკები საერთოდ არ შეინიშნება ქრომატოგრამაში, სადაც მათი ელუირებაა მოსალოდნელი. ზემოთ მოცემული კედლის დიაგრამა მიუთითებს, რომ პიკის არარსებობა (თუ ნიმუში რეალურად შეიცავს სამიზნე ანალიტს ისეთი კონცენტრაციით, რომ დეტექტორის რეაქცია საკმარისი უნდა იყოს მისი ხმაურის ზემოთ დასანახად) ჩვეულებრივ დაკავშირებულია ინსტრუმენტის რაიმე პრობლემასთან ან არასწორ მოძრავ ფაზის პირობებთან (თუ საერთოდ შეინიშნება). პიკები, როგორც წესი, ძალიან „სუსტი“). ამ კატეგორიაში პოტენციური პრობლემებისა და გადაწყვეტილებების მოკლე სია შეგიძლიათ იხილოთ ცხრილში I.
როგორც ზემოთ აღვნიშნეთ, საკითხი, თუ რამდენად უნდა იყოს პიკის გაფართოება ასატანი ყურადღების მიქცევამდე და მის გამოსწორებამდე, რთული თემაა, რომელსაც მომავალ სტატიაში განვიხილავ. ჩემი გამოცდილებით, პიკის მნიშვნელოვან გაფართოებას ხშირად თან ახლავს პიკის ფორმის მნიშვნელოვანი ცვლილება და პიკის კუდისებრი ფორმა უფრო ხშირია, ვიდრე პიკისწინა ან გაყოფა. თუმცა, ნომინალურად სიმეტრიული პიკებიც ფართოვდება, რაც შეიძლება რამდენიმე განსხვავებული მიზეზით იყოს გამოწვეული:
თითოეული ეს საკითხი დეტალურად იყო განხილული ჟურნალ „LC პრობლემების მოგვარების“ წინა ნომრებში და ამ თემებით დაინტერესებულ მკითხველს შეუძლია გაეცნოს წინა სტატიებს ამ პრობლემების ძირითადი მიზეზებისა და პოტენციური გადაწყვეტილებების შესახებ ინფორმაციის მისაღებად. დამატებითი დეტალები.
პიკის კუდისებრი, პიკის წინა ნაწილისებრი და გაყოფილი შეიძლება გამოწვეული იყოს ქიმიური ან ფიზიკური მოვლენებით და ამ პრობლემების პოტენციური გადაწყვეტილებების სია მნიშვნელოვნად განსხვავდება იმისდა მიხედვით, ქიმიურ თუ ფიზიკურ პრობლემასთან გვაქვს საქმე. ხშირად, ქრომატოგრამაში სხვადასხვა პიკების შედარებით, შეგიძლიათ იპოვოთ მნიშვნელოვანი მინიშნებები იმის შესახებ, თუ რომელია დამნაშავე. თუ ქრომატოგრამაში ყველა პიკი მსგავს ფორმებს ავლენს, მიზეზი, სავარაუდოდ, ფიზიკური არ არის. თუ მხოლოდ ერთი ან რამდენიმე პიკია დაზარალებული, მაგრამ დანარჩენი კარგად გამოიყურება, მიზეზი, სავარაუდოდ, ქიმიურია.
პიკური კუდის ქიმიური მიზეზები ძალიან რთულია აქ მოკლედ განსახილველად. დაინტერესებულ მკითხველს უფრო სიღრმისეული განხილვისთვის ვურჩევთ „LC Troubleshooting“-ის ბოლო ნომერს (10). თუმცა, მარტივი გზაა ინექცირებული ანალიტის მასის შემცირება და იმის დანახვა, გაუმჯობესდება თუ არა პიკის ფორმა. თუ ასეა, მაშინ ეს კარგი მინიშნებაა იმისა, რომ პრობლემა „მასის გადატვირთვაა“. ამ შემთხვევაში, მეთოდი უნდა შემოიფარგლოს მცირე ანალიტური მასების ინექციით, ან ქრომატოგრაფიული პირობები უნდა შეიცვალოს ისე, რომ პიკის კარგი ფორმების მიღება შესაძლებელი იყოს ინექცირებული უფრო დიდი მასების შემთხვევაშიც კი.
პიკური ტალღის ვარდნის მრავალი პოტენციური ფიზიკური მიზეზი არსებობს. მკითხველებს, რომლებიც დაინტერესებულნი არიან შესაძლებლობების დეტალური განხილვით, შეუძლიათ ნახონ „LC Troubleshooting“-ის კიდევ ერთი ბოლო ნომერი (11). პიკური ტალღის ვარდნის ერთ-ერთი ყველაზე გავრცელებული ფიზიკური მიზეზია ინჟექტორსა და დეტექტორს შორის წერტილში ცუდი კავშირი (12). უკიდურესი მაგალითი ნაჩვენებია ნახაზ 1d-ზე, რომელიც რამდენიმე კვირის წინ ჩემს ლაბორატორიაში მივიღე. ამ შემთხვევაში, ჩვენ ავაშენეთ სისტემა ახალი ინექციური სარქველით, რომელიც აქამდე არ გამოგვიყენებია და დავაყენეთ მცირე მოცულობის ინექციური მარყუჟი ფერულით, რომელიც უჟანგავი ფოლადის კაპილარზე იყო ჩამოსხმული. პრობლემების მოგვარების რამდენიმე საწყისი ექსპერიმენტის შემდეგ, მივხვდით, რომ ინექციური სარქვლის სტატორში პორტის სიღრმე გაცილებით ღრმა იყო, ვიდრე შეჩვეულები ვიყავით, რაც პორტის ძირში დიდ მკვდარ მოცულობას იწვევდა. ეს პრობლემა ადვილად წყდება ინექციური მარყუჟის სხვა მილით ჩანაცვლებით, ჩვენ შეგვიძლია ფერულის სწორ პოზიციაზე დაყენება, რათა აღმოვფხვრათ მკვდარი მოცულობა პორტის ძირში.
პიკური ფრონტები, როგორიცაა ნაჩვენებია ნახაზ 1e-ზე, ასევე შეიძლება გამოწვეული იყოს ფიზიკური ან ქიმიური პრობლემებით. წამყვანი კიდის საერთო ფიზიკური მიზეზია ის, რომ სვეტის ნაწილაკების ფენა კარგად არ არის შეფუთული, ან რომ ნაწილაკები დროთა განმავლობაში რეორგანიზებულნი არიან. როგორც ამ ფიზიკური ფენომენით გამოწვეული პიკური კუდის შემთხვევაში, ამის გამოსწორების საუკეთესო გზაა სვეტის შეცვლა და მუშაობის გაგრძელება. ფუნდამენტურად, ქიმიური წარმოშობის წამყვანი კიდის პიკის ფორმები ხშირად წარმოიქმნება იმისგან, რასაც ჩვენ „არაწრფივ“ შეკავების პირობებს ვუწოდებთ. იდეალურ (წრფივ) პირობებში, სტაციონარული ფაზის მიერ შეკავებული ანალიტის რაოდენობა (შესაბამისად, შეკავების კოეფიციენტი) წრფივად არის დაკავშირებული სვეტში ანალიტის კონცენტრაციასთან. ქრომატოგრაფიულად, ეს ნიშნავს, რომ სვეტში შეყვანილი ანალიტის მასის ზრდასთან ერთად, პიკი უფრო მაღალი ხდება, მაგრამ არა უფრო ფართო. ეს ურთიერთობა ირღვევა, როდესაც შეკავების ქცევა არაწრფივია და პიკები არა მხოლოდ უფრო მაღალი ხდება, არამედ უფრო ფართოც ხდება, რადგან მეტი მასა შეჰყავთ. გარდა ამისა, არაწრფივი ფორმები განსაზღვრავს ქრომატოგრაფიული პიკების ფორმას, რაც იწვევს წამყვან ან უკანა კიდეებს. როგორც მასის გადატვირთვის შემთხვევაში, რაც იწვევს პიკური კუდის წარმოქმნას. (10), არაწრფივი შეკავებით გამოწვეული პიკური ლიდერობის დიაგნოზის დასმა ასევე შესაძლებელია ინექცირებული ანალიტის მასის შემცირებით. თუ პიკის ფორმა გაუმჯობესდება, მეთოდი უნდა შეიცვალოს ისე, რომ არ გადააჭარბოს ინექციის ხარისხს, რომელიც იწვევს წამყვან კიდეს, ან ქრომატოგრაფიული პირობები უნდა შეიცვალოს ამ ქცევის მინიმიზაციისთვის.
ზოგჯერ ჩვენ ვხედავთ იმას, რაც „გაყოფილი“ პიკის მსგავსია, როგორც ეს ნაჩვენებია ნახაზ 1f-ზე. ამ პრობლემის გადაჭრის პირველი ნაბიჯი არის იმის დადგენა, გამოწვეულია თუ არა პიკის ფორმა ნაწილობრივი თანა-ელუციით (ანუ ორი განსხვავებული, მაგრამ მჭიდროდ ელუირებული ნაერთის არსებობით). თუ სინამდვილეში ორი განსხვავებული ანალიტი ელუირდება ერთმანეთთან ახლოს, მაშინ საქმე მათი გარჩევადობის გაუმჯობესებას ეხება (მაგალითად, სელექციურობის, შეკავების ან ფირფიტების რაოდენობის გაზრდით) და აშკარა „გაყოფილი“ პიკები დაკავშირებულია ფიზიკურ მახასიათებლებთან. შესრულებას არაფერი აქვს საერთო თავად სვეტთან. ხშირად, ამ გადაწყვეტილების ყველაზე მნიშვნელოვანი მინიშნება არის ის, ავლენს თუ არა ქრომატოგრამაში ყველა პიკი გაყოფილი ფორმებს, თუ მხოლოდ ერთს ან ორს. თუ ეს მხოლოდ ერთი ან ორია, ეს ალბათ თანა-ელუციის საკითხია; თუ ყველა პიკი გაყოფილია, ეს ალბათ ფიზიკური პრობლემაა, რომელიც, სავარაუდოდ, თავად სვეტს უკავშირდება.
სვეტის ფიზიკურ თვისებებთან დაკავშირებული გაყოფილი პიკები, როგორც წესი, გამოწვეულია ნაწილობრივ დაბლოკილი შესასვლელი ან გამოსასვლელი ფრიტებით, ან სვეტში ნაწილაკების რეორგანიზაციით, რაც საშუალებას აძლევს მობილურ ფაზას სვეტის არხის ფორმირების გარკვეულ ადგილებში უფრო სწრაფად იმოძრაოს, ვიდრე მობილურ ფაზას, სხვა რეგიონებში (11). ნაწილობრივ დაბლოკილი ფრიტის გაწმენდა ზოგჯერ შესაძლებელია სვეტში ნაკადის შებრუნებით; თუმცა, ჩემი გამოცდილებით, ეს, როგორც წესი, უფრო მოკლევადიანია, ვიდრე გრძელვადიანი გამოსავალი. ეს ხშირად ფატალურია თანამედროვე სვეტებისთვის, თუ ნაწილაკები სვეტში ხელახლა შეერთდება. ამ ეტაპზე საუკეთესოა სვეტის შეცვლა და გაგრძელება.
ნახაზ 1g-ზე მოცემული პიკი, რომელიც ასევე ჩემს ლაბორატორიაში ცოტა ხნის წინ მომხდარი შემთხვევაა, როგორც წესი, მიუთითებს, რომ სიგნალი იმდენად მაღალია, რომ მან რეაქციის დიაპაზონის მაღალ ზღვარს მიაღწია. ოპტიკური შთანთქმის დეტექტორებისთვის (ამ შემთხვევაში UV-vis), როდესაც ანალიტის კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, ანალიტი შთანთქავს დეტექტორის ნაკადის უჯრედში გამავალი სინათლის უმეტეს ნაწილს, რის გამოც ძალიან მცირე სინათლე რჩება აღმოსაჩენად. ამ პირობებში, ფოტოდეტექტორიდან წამოსულ ელექტრულ სიგნალზე ძლიერ გავლენას ახდენს ხმაურის სხვადასხვა წყარო, როგორიცაა გაფანტული სინათლე და „ბნელი დენი“, რაც სიგნალს ძალიან „ბუნდოვან“ იერს აძლევს და ანალიტის კონცენტრაციისგან დამოუკიდებელს ხდის. როდესაც ეს ხდება, პრობლემის გადაჭრა ხშირად ადვილად შეიძლება ანალიტის ინექციის მოცულობის შემცირებით - ინექციის მოცულობის შემცირებით, ნიმუშის განზავებით ან ორივეთი.
ქრომატოგრაფიის სკოლაში, ნიმუშში ანალიტის კონცენტრაციის ინდიკატორად დეტექტორის სიგნალს (ანუ ქრომატოგრამაზე y ღერძს) ვიყენებთ. ამიტომ, უცნაურად გამოიყურება ქრომატოგრამაზე ნულზე დაბალი სიგნალის შემცველობით, რადგან მარტივი ინტერპრეტაცია ის არის, რომ ეს ანალიტის უარყოფით კონცენტრაციაზე მიუთითებს - რაც, რა თქმა უნდა, ფიზიკურად შეუძლებელია. ჩემი გამოცდილებით, უარყოფითი პიკები ყველაზე ხშირად ოპტიკური შთანთქმის დეტექტორების (მაგ., UV-vis) გამოყენებისას შეინიშნება.
ამ შემთხვევაში, უარყოფითი პიკი უბრალოდ ნიშნავს, რომ სვეტიდან გამომავალი მოლეკულები ნაკლებ სინათლეს შთანთქავენ, ვიდრე თავად მოძრავი ფაზა პიკის წინ და მის შემდეგ. ეს შეიძლება მოხდეს, მაგალითად, შედარებით დაბალი დეტექციის ტალღის სიგრძეების (<230 ნმ) და მოძრავი ფაზის დანამატების გამოყენებისას, რომლებიც შთანთქავენ სინათლის უმეტეს ნაწილს ამ ტალღის სიგრძეებზე. ასეთი დანამატები შეიძლება იყოს მოძრავი ფაზის გამხსნელის კომპონენტები, როგორიცაა მეთანოლი ან ბუფერული კომპონენტები, როგორიცაა აცეტატი ან ფორმატი. სინამდვილეში, შესაძლებელია უარყოფითი პიკების გამოყენება კალიბრაციის მრუდის მოსამზადებლად და ზუსტი რაოდენობრივი ინფორმაციის მისაღებად, ამიტომ არ არსებობს ფუნდამენტური მიზეზი, რომ თავი აარიდოთ მათ (ამ მეთოდს ზოგჯერ „არაპირდაპირ ულტრაიისფერ დეტექციას“ უწოდებენ) (13). თუმცა, თუ ნამდვილად გვინდა თავიდან ავიცილოთ უარყოფითი პიკები, შთანთქმის დეტექციის შემთხვევაში, საუკეთესო გამოსავალია გამოვიყენოთ დეტექციის განსხვავებული ტალღის სიგრძე ისე, რომ ანალიტმა უფრო მეტი შთანთქოს, ვიდრე მოძრავმა ფაზამ, ან შევცვალოთ მოძრავი ფაზის შემადგენლობა ისე, რომ ისინი უფრო ნაკლებ სინათლეს შთანთქავენ, ვიდრე ანალიზებს.
უარყოფითი პიკები ასევე შეიძლება გამოჩნდეს რეფრაქციული ინდექსის (RI) დეტექციის გამოყენებისას, როდესაც ნიმუშში ანალიტის გარდა სხვა კომპონენტების, მაგალითად, გამხსნელის მატრიცის, რეფრაქციული ინდექსი განსხვავდება მობილური ფაზის რეფრაქციული ინდექსისგან. ეს ასევე ხდება ულტრაიისფერი-ხილული დეტექციის დროს, მაგრამ ეს ეფექტი, როგორც წესი, სუსტდება RI დეტექციასთან შედარებით. ორივე შემთხვევაში, უარყოფითი პიკების მინიმიზაცია შესაძლებელია ნიმუშის მატრიცის შემადგენლობის მობილური ფაზის შემადგენლობის უფრო ზუსტად შესაბამისობაში მოყვანით.
მესამე ნაწილში, რომელიც LC პრობლემების მოგვარების ძირითად თემას ეძღვნება, განვიხილე სიტუაციები, როდესაც დაკვირვებული პიკის ფორმა განსხვავდება მოსალოდნელი ან ნორმალური პიკის ფორმისგან. ასეთი პრობლემების ეფექტური მოგვარება იწყება მოსალოდნელი პიკის ფორმების ცოდნით (თეორიის ან არსებული მეთოდების წინა გამოცდილების საფუძველზე), ამიტომ ამ მოლოდინებიდან გადახრები აშკარაა. პიკის ფორმის პრობლემებს მრავალი განსხვავებული პოტენციური მიზეზი აქვს (ძალიან ფართო, კუდისებური, წამყვანი კიდე და ა.შ.). ამ ნაწილში დეტალურად განვიხილავ ზოგიერთ მიზეზს, რომლებსაც ყველაზე ხშირად ვხედავ. ამ დეტალების ცოდნა კარგ საფუძველს იძლევა პრობლემების მოგვარების დასაწყებად, მაგრამ არ მოიცავს ყველა შესაძლებლობას. მკითხველს, რომელიც დაინტერესებულია მიზეზებისა და გადაწყვეტილებების უფრო სიღრმისეული სიით, შეუძლია იხილოს LCGC-ის „LC პრობლემების მოგვარების სახელმძღვანელო“ კედლის დიაგრამა.
(4) LCGC-ის „LC პრობლემების მოგვარების სახელმძღვანელო“ კედლის დიაგრამა. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) ა. ფელინგერი, მონაცემთა ანალიზი და სიგნალის დამუშავება ქრომატოგრაფიაში (ელსევიერი, ნიუ-იორკი, ნიუ-იორკი, 1998), გვ. 43-96.
(8) ვაჰაბ მ.ფ., დასგუპტა პ.კ., კაჯო აფ. და არმსტრონგ დ.ვ., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.