გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვიყვანთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
თხევადი ბიოფსია (LB) არის კონცეფცია, რომელიც სწრაფად იძენს პოპულარობას ბიოსამედიცინო სფეროში.კონცეფცია ძირითადად ეფუძნება მოცირკულირე უჯრედგარე დნმ-ის (ccfDNA) ფრაგმენტების აღმოჩენას, რომლებიც ძირითადად გამოიყოფა მცირე ფრაგმენტების სახით სხვადასხვა ქსოვილებში უჯრედის სიკვდილის შემდეგ.ამ ფრაგმენტების მცირე ნაწილი წარმოიქმნება უცხო (უცხო) ქსოვილებიდან ან ორგანიზმებიდან.მიმდინარე სამუშაოებში, ჩვენ გამოვიყენეთ ეს კონცეფცია მიდიებზე, სენტინელ სახეობებზე, რომლებიც ცნობილია ზღვის წყლის მაღალი ფილტრაციის უნარით.ჩვენ ვიყენებთ მიდიების უნარს, იმოქმედონ როგორც ბუნებრივი ფილტრები, რათა მივიღოთ გარემოს დნმ-ის ფრაგმენტები სხვადასხვა წყაროდან, რათა მივაწოდოთ ინფორმაცია ზღვის სანაპირო ეკოსისტემების ბიომრავალფეროვნების შესახებ.ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ მიდიის ჰემოლიმფა შეიცავს დნმ-ის ფრაგმენტებს, რომლებიც ძალიან განსხვავდება ზომით, 1-დან 5 კბ-მდე.თოფის თანმიმდევრობამ აჩვენა, რომ დნმ-ის ფრაგმენტების დიდი რაოდენობა უცხო მიკრობული წარმოშობისაა.მათ შორის, ჩვენ აღმოვაჩინეთ დნმ-ის ფრაგმენტები ბაქტერიებიდან, არქეებიდან და ვირუსებიდან, მათ შორის ვირუსების ჩათვლით, რომლებიც ცნობილია, რომ აინფიცირებს სხვადასხვა მასპინძლებს, რომლებიც ჩვეულებრივ გვხვდება სანაპირო საზღვაო ეკოსისტემებში.დასასრულს, ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ მიდიებზე გამოყენებული LB კონცეფცია წარმოადგენს ცოდნის მდიდარ, მაგრამ ჯერ კიდევ შეუსწავლელ წყაროს ზღვის სანაპირო ეკოსისტემებში მიკრობული მრავალფეროვნების შესახებ.
კლიმატის ცვლილების (CC) გავლენა ზღვის ეკოსისტემების ბიომრავალფეროვნებაზე არის კვლევის სწრაფად მზარდი სფერო.გლობალური დათბობა არა მხოლოდ იწვევს მნიშვნელოვან ფიზიოლოგიურ სტრესს, არამედ უბიძგებს ზღვის ორგანიზმების თერმული სტაბილურობის ევოლუციურ საზღვრებს, გავლენას ახდენს რიგი სახეობების ჰაბიტატზე, უბიძგებს მათ მოძებნონ უფრო ხელსაყრელი პირობები [1, 2].გარდა იმისა, რომ გავლენას ახდენს მეტაზოანების ბიომრავალფეროვნებაზე, CC არღვევს მასპინძელ-მიკრობული ურთიერთქმედების დელიკატურ ბალანსს.ეს მიკრობული დისბაქტერიოზი სერიოზულ საფრთხეს უქმნის ზღვის ეკოსისტემებს, რადგან ის საზღვაო ორგანიზმებს უფრო მგრძნობიარეს ხდის ინფექციური პათოგენების მიმართ [3, 4].ითვლება, რომ SS თამაშობს მნიშვნელოვან როლს მასობრივ სიკვდილში, რაც სერიოზულ პრობლემას წარმოადგენს გლობალური საზღვაო ეკოსისტემების მართვისთვის [5, 6].ეს მნიშვნელოვანი საკითხია მრავალი ზღვის სახეობის ეკონომიკური, ეკოლოგიური და კვების ზემოქმედების გათვალისწინებით.ეს განსაკუთრებით ეხება ორსარქველებს, რომლებიც ცხოვრობენ პოლარულ რეგიონებში, სადაც CK-ის ეფექტი უფრო მყისიერი და მძიმეა [6, 7].ფაქტობრივად, ორსარქველი, როგორიცაა Mytilus spp.ფართოდ გამოიყენება საზღვაო ეკოსისტემებზე CC-ის ზემოქმედების მონიტორინგისთვის.გასაკვირი არ არის, რომ ბიომარკერების შედარებით დიდი რაოდენობა შემუშავებულია მათი ჯანმრთელობის მონიტორინგისთვის, ხშირად იყენებენ ორ დონის მიდგომას, რომელიც მოიცავს ფუნქციურ ბიომარკერებს, რომლებიც დაფუძნებულია ფერმენტულ აქტივობაზე ან უჯრედულ ფუნქციებზე, როგორიცაა უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა და ფაგოციტური აქტივობა [8].ეს მეთოდები ასევე მოიცავს სპეციფიკური წნევის მაჩვენებლების კონცენტრაციის გაზომვას, რომლებიც გროვდება რბილ ქსოვილებში დიდი რაოდენობით ზღვის წყლის შეწოვის შემდეგ.თუმცა, მაღალი ფილტრაციის უნარი და ორსარქვლოვანთა ნახევრად ღია ცირკულაციური სისტემა იძლევა შესაძლებლობას განავითაროს ახალი ჰემოლიმფის ბიომარკერები თხევადი ბიოფსიის (LB) კონცეფციის გამოყენებით, პაციენტის მართვის მარტივი და მინიმალური ინვაზიური მიდგომის გამოყენებით.სისხლის ნიმუშები [9, 10].მიუხედავად იმისა, რომ მოცირკულირე მოლეკულების რამდენიმე ტიპი გვხვდება ადამიანის LB-ში, ეს კონცეფცია ძირითადად ეფუძნება პლაზმაში მოცირკულირე უჯრედგარე დნმ-ის (ccfDNA) ფრაგმენტების დნმ-ის თანმიმდევრობის ანალიზს.ფაქტობრივად, ადამიანის პლაზმაში მოცირკულირე დნმ-ის არსებობა ცნობილი იყო მე-20 საუკუნის შუა ხანებიდან [11], მაგრამ მხოლოდ ბოლო წლებში იყო, რომ მაღალი გამტარუნარიანობის თანმიმდევრობის მეთოდების გამოჩენამ განაპირობა კლინიკური დიაგნოზი ccfDNA-ზე დაფუძნებული.ამ მოცირკულირე დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა ნაწილობრივ განპირობებულია გენომიური დნმ-ის (ბირთვული და მიტოქონდრიული) პასიური გამოთავისუფლებით უჯრედის სიკვდილის შემდეგ. ჯანმრთელ ადამიანებში ccfDNA-ს კონცენტრაცია ჩვეულებრივ დაბალია (<10 ნგ/მლ), მაგრამ შეიძლება გაიზარდოს 5-10-ჯერ პაციენტებში, რომლებსაც აქვთ სხვადასხვა პათოლოგიები ან ექვემდებარებიან სტრესს, რაც იწვევს ქსოვილის დაზიანებას. ჯანმრთელ ადამიანებში ccfDNA-ს კონცენტრაცია ჩვეულებრივ დაბალია (<10 ნგ/მლ), მაგრამ შეიძლება გაიზარდოს 5-10-ჯერ პაციენტებში, რომლებსაც აქვთ სხვადასხვა პათოლოგიები ან ექვემდებარებიან სტრესს, რაც იწვევს ქსოვილის დაზიანებას. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ნგ/მლ), მაგრამ შეიძლება 5–10 განზავდეს ზედმეტად სტრესი, приводяврщенему. ჯანმრთელ ადამიანებში cccDNA კონცენტრაცია ჩვეულებრივ დაბალია (<10 ნგ/მლ), მაგრამ ის შეიძლება გაიზარდოს 5-10-ჯერ სხვადასხვა პათოლოგიის მქონე პაციენტებში ან სტრესის ქვეშ, რაც იწვევს ქსოვილის დაზიანებას.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ნგ/მლ），但在患有各种病理或承各种病理或承可加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ნგ/მლ） 但 在 各 种 病理 或可 增加 5-10 倍 从而 组织。。。ccfDNA კონცენტრაცია დაბალია (<10 ნგ/მლ) ძლიერ ადამიანებში, მაგრამ არ შეიძლება იყოს 5-10-ზე მეტი პაციენტთან ერთად სხვადასხვა პათოლოგიის ან სტრესის დროს. ccfDNA კონცენტრაცია ჩვეულებრივ დაბალია (<10 ნგ/მლ) ჯანმრთელ ადამიანებში, მაგრამ შეიძლება გაიზარდოს 5-10-ჯერ სხვადასხვა პათოლოგიის ან სტრესის მქონე პაციენტებში, რაც იწვევს ქსოვილის დაზიანებას.ccfDNA ფრაგმენტების ზომა ფართოდ განსხვავდება, მაგრამ ჩვეულებრივ მერყეობს 150-დან 200 bp-მდე.[12].თვითგანვითარებული ccfDNA, ანუ ccfDNA ნორმალური ან ტრანსფორმირებული მასპინძელი უჯრედების ანალიზი, შეიძლება გამოყენებულ იქნას ბირთვულ და/ან მიტოქონდრიულ გენომში არსებული გენეტიკური და ეპიგენეტიკური ცვლილებების გამოსავლენად, რითაც ეხმარება კლინიცისტებს კონკრეტული მოლეკულური მიზნობრივი თერაპიის შერჩევაში [13].თუმცა, ccfDNA შეიძლება მიღებულ იქნას უცხო წყაროებიდან, როგორიცაა ccfDNA ორსულობის დროს ნაყოფის უჯრედებიდან ან გადანერგილი ორგანოებიდან [14,15,16,17].ccfDNA ასევე ინფორმაციის მნიშვნელოვანი წყაროა ინფექციური აგენტის (უცხო) ნუკლეინის მჟავების არსებობის დასადგენად, რაც საშუალებას იძლევა არაინვაზიური გამოვლენის ფართოდ გავრცელებული ინფექციები, რომლებიც არ არის გამოვლენილი სისხლის კულტურებით, თავიდან აიცილებს ინფიცირებული ქსოვილის ინვაზიურ ბიოფსიას [18].ბოლო კვლევებმა მართლაც აჩვენა, რომ ადამიანის სისხლი შეიცავს ინფორმაციის მდიდარ წყაროს, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას ვირუსული და ბაქტერიული პათოგენების იდენტიფიცირებისთვის და რომ ადამიანის პლაზმაში ნაპოვნი ccfDNA-ს დაახლოებით 1% უცხო წარმოშობისაა [19].ეს კვლევები აჩვენებს, რომ ორგანიზმის მოცირკულირე მიკრობიომის ბიომრავალფეროვნება შეიძლება შეფასდეს ccfDNA ანალიზის გამოყენებით.თუმცა, ბოლო დრომდე, ეს კონცეფცია გამოიყენებოდა ექსკლუზიურად ადამიანებში და, ნაკლებად, სხვა ხერხემლიანებში [20, 21].
წინამდებარე ნაშრომში, ჩვენ ვიყენებთ LB პოტენციალს Aulacomya atra-ს ccfDNA-ს გასაანალიზებლად, სამხრეთი სახეობა, რომელიც ჩვეულებრივ გვხვდება სუბანტარქტიკულ კერგულენის კუნძულებზე, კუნძულების ჯგუფი დიდ პლატოზე, რომელიც ჩამოყალიბდა 35 მილიონი წლის წინ.ვულკანური ამოფრქვევა.ინ ვიტრო ექსპერიმენტული სისტემის გამოყენებით აღმოვაჩინეთ, რომ ზღვის წყალში დნმ-ის ფრაგმენტები სწრაფად ითვისება მიდიების მიერ და შედის ჰემოლიმფის განყოფილებაში.თოფის თანმიმდევრობამ აჩვენა, რომ მიდიის ჰემოლიმფის ccfDNA შეიცავს საკუთარი და არასაკუთარი წარმოშობის დნმ-ის ფრაგმენტებს, მათ შორის სიმბიოზურ ბაქტერიებს და დნმ-ის ფრაგმენტებს ცივი ვულკანური ზღვის სანაპირო ეკოსისტემებისთვის დამახასიათებელი ბიომებიდან.ჰემოლიმფის ccfDNA ასევე შეიცავს ვირუსულ თანმიმდევრობებს, რომლებიც მიიღება სხვადასხვა მასპინძლის დიაპაზონის მქონე ვირუსებისგან.ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ მრავალუჯრედიანი ცხოველების დნმ-ის ფრაგმენტები, როგორიცაა ძვლოვანი თევზი, ზღვის ანემონები, წყალმცენარეები და მწერები.დასასრულს, ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ LB კონცეფცია შეიძლება წარმატებით იქნას გამოყენებული ზღვის უხერხემლოებზე, რათა შეიქმნას მდიდარი გენომიური რეპერტუარი ზღვის ეკოსისტემებში.
მოზრდილები (55-70 მმ სიგრძით) Mytilus platensis (M. platensis) და Aulacomya atra (A. atra) შეგროვდა პორტ-ო-ფრანსის შუალედური კლდოვანი სანაპიროებიდან (049°21.235 S, 070°13.490 E .).კერგულენის კუნძულები 2018 წლის დეკემბერში. სხვა ზრდასრული ცისფერი მიდიები (Mytilus spp.) მიიღეს კომერციული მიმწოდებლისგან (PEI Mussel King Inc., პრინც ედუარდის კუნძული, კანადა) და მოთავსებული იქნა ტემპერატურის კონტროლირებად (4°C) გაზიან ავზში, რომელიც შეიცავს 10-20 ლ 32‰ ხელოვნურ მარილწყალს.(ხელოვნური ზღვის მარილი Reef Crystal, Instant Ocean, ვირჯინია, აშშ).თითოეული ექსპერიმენტისთვის იზომებოდა ცალკეული ჭურვების სიგრძე და წონა.
უფასო ღია წვდომის პროტოკოლი ამ პროგრამისთვის ხელმისაწვდომია ონლაინ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).მოკლედ, LB ჰემოლიმფა შეგროვდა გამტაცებელი კუნთებიდან, როგორც აღწერილია [22].ჰემოლიმფა გასუფთავდა ცენტრიფუგირებით 1200×გრ-ზე 3 წუთის განმავლობაში, სუპერნატანტი გაყინული იყო (-20°C) გამოყენებამდე.cfDNA-ს იზოლაციისა და გაწმენდისთვის, ნიმუშები (1.5-2.0 მლ) გალღვა და დამუშავდა NucleoSnap cfDNA ნაკრების გამოყენებით (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით.ccfDNA ინახებოდა -80°C-ზე შემდგომ ანალიზამდე.ზოგიერთ ექსპერიმენტში, ccfDNA იყო იზოლირებული და გაწმენდილი QIAamp დნმ-ის მკვლევარის ნაკრების გამოყენებით (QIAGEN, ტორონტო, ონტარიო, კანადა).გაწმენდილი დნმ რაოდენობრივად შეფასდა სტანდარტული PicoGreen ანალიზის გამოყენებით.იზოლირებული ccfDNA-ს ფრაგმენტების განაწილება გაანალიზდა კაპილარული ელექტროფორეზით Agilent 2100 ბიოანალიზატორის გამოყენებით (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) მაღალი მგრძნობელობის დნმ ნაკრების გამოყენებით.ანალიზი ჩატარდა ccfDNA ნიმუშის 1 μl გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით.
ჰემოლიმფის ccfDNA ფრაგმენტების თანმიმდევრობისთვის, Génome Québec-მა (მონრეალი, კვებეკი, კანადა) მოამზადა თოფის ბიბლიოთეკები Illumina MiSeq PE75 ნაკრების Illumina DNA Mix ნაკრების გამოყენებით.გამოყენებული იქნა სტანდარტული ადაპტერი (BioO).ნედლეული მონაცემთა ფაილები ხელმისაწვდომია NCBI Sequence Read Archive-დან (SRR8924808 და SRR8924809).კითხვის ძირითადი ხარისხი შეფასდა FastQC-ის გამოყენებით [23].Trimmomatic [24] გამოიყენებოდა გადამყვანების დასაჭერად და უხარისხო წაკითხვისთვის.თოფის წაკითხვები დაწყვილებული ბოლოებით იყო FLASH გაერთიანდა უფრო ხანგრძლივ ერთ კითხვად, მინიმალური გადახურვით 20 bp, რათა თავიდან ავიცილოთ შეუსაბამობები [25]. შერწყმული წაკითხვები ანოტირებული იყო BLASTN-ით ორსარქვლოვანი NCBI ტაქსონომიის მონაცემთა ბაზის გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e−3 და 90% ჰომოლოგია) და დაბალი სირთულის თანმიმდევრობების შენიღბვა განხორციელდა DUST-ის გამოყენებით [26]. შერწყმული წაკითხვები ანოტირებული იყო BLASTN-ით ორსარქვლოვანი NCBI ტაქსონომიის მონაცემთა ბაზის გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e−3 და 90% ჰომოლოგია) და დაბალი სირთულის თანმიმდევრობების შენიღბვა განხორციელდა DUST-ის გამოყენებით [26]. BLASTN BLASTN დვუსქმნილი NCBI (მნიშვნელობა e < 1e-3 და 90% სრულყოფილად გაერთიანებული NCBI) со использованием DUST [26]. გაერთიანებული წაკითხვები ანოტირებული იყო BLASTN-ით NCBI ორსარქვლოვანი ტაქსონომიის მონაცემთა ბაზის გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e-3 და 90% ჰომოლოგია) და დაბალი სირთულის თანმიმდევრობის ნიღაბი შესრულდა DUST-ის გამოყენებით [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 使用 合并 读数]复杂度 序列 的。。。.蔽 掩蔽 掩蔽ერთიანი ანოტიროვანები BLASTN-ის დახმარებით BLASTN-ის გამოყენებით ტაქსონომიჩესკის ბაზაზე დაფუძნებული NCBI (მნიშვნელობა e <1e-3 და 90% შეღავათიანობის შემდეგ), და полнено со использованием DUST [26]. გაერთიანებული წაკითხვები ანოტირებული იყო BLASTN-ით NCBI ორსარქვლოვანი ტაქსონომიური მონაცემთა ბაზის გამოყენებით (e მნიშვნელობა <1e-3 და 90% ჰომოლოგია) და დაბალი სირთულის თანმიმდევრობის ნიღაბი შესრულდა DUST-ის გამოყენებით [26].წაკითხული დაყოფილი იყო ორ ჯგუფად: დაკავშირებული ორსარქვლოვან თანმიმდევრობებთან (აქ უწოდებენ თვითკითხვებს) და შეუსაბამო (არასაკუთარი კითხვებს).ორი ჯგუფი ცალკე შეიკრიბა MEGAHIT-ის გამოყენებით კონტიგების გენერირებისთვის [27].იმავდროულად, უცხო მიკრობიომის წაკითხვის ტაქსონომიური განაწილება კლასიფიცირებული იყო Kraken2-ის გამოყენებით [28] და გრაფიკულად წარმოდგენილი იყო კრონას ტორტი დიაგრამით გალაქტიკაზე [29, 30].ჩვენი წინასწარი ექსპერიმენტებიდან ოპტიმალური კმერები დადგინდა კმერს-59. შემდეგ თვითმმართველობის კონტიგები იდენტიფიცირებული იყო BLASTN-თან (ორსარქვლოვანი NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია) გასწორებით საბოლოო ანოტაციისთვის. შემდეგ თვითმმართველობის კონტიგები იდენტიფიცირებული იყო BLASTN-თან (ორსარქვლოვანი NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია) გასწორებით საბოლოო ანოტაციისთვის. BLASTN-ის ფუნქციონირებადი დადასტურებული ფუნქციონირება (ბაზა დაწესებულებებში შექმნილია NCBI, მნიშვნელობა e <1e-10 და მეცნიერება 60%) ცნობილობისთვის. შემდეგ თვითმმართველობის კონტიგები იდენტიფიცირებული იყო BLASTN-თან (NCBI ორსარქვლოვანი მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია) შესატყვისით საბოლოო ანოტაციისთვის.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识襫别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN-ის შეზღუდვისთვის დამახასიათებელი ანოტაციების შესახებ ინფორმაცია BLASTN-ის შესახებ (ბაზა NCBI დვუსშემქმნელი моллюсков, მნიშვნელობა e <1e-10 და 6%). შემდეგ გამოვლინდა თვითკონტიგები საბოლოო ანოტაციისთვის BLASTN-თან (NCBI ორსარქვლოვანი მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია) შესატყვისით. პარალელურად, არასაკუთარი ჯგუფის კონტიგები ანოტირებული იყო BLASTN-ით (nt NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია). პარალელურად, არასაკუთარი ჯგუფის კონტიგები ანოტირებული იყო BLASTN-ით (nt NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია). პარალელურად чужеродные групповые контиги были аннотированы со помош BLASTN (ბაზა მონაცემები nt NCBI, მნიშვნელობა e <1e-10 და გონოლოგია 60%). პარალელურად, უცხოური ჯგუფის კონტიგები ანოტირებული იყო BLASTN-ით (NT NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 პარალელურად კონტიგი, არ არის относящиеся к општественный группе, были аннотированы со помош BLASTN (ძირითადად nt NCBI, მნიშვნელობა e <1e-10 და გომოლოგია 60%). პარალელურად, არასაკუთარი ჯგუფის კონტიგები ანოტირებული იყო BLASTN-ით (nt NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია). BLASTX ასევე ჩატარდა nonself contigs-ზე nr და RefSeq ცილის NCBI მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია). BLASTX ასევე ჩატარდა nonself contigs-ზე nr და RefSeq ცილის NCBI მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка nr და RefSeq NCBI (მნიშვნელობა e <1e-10 და გომოლოგია 60%). BLASTX ასევე შესრულდა არა თვითმმართველობის კონტიგებზე nr და RefSeq NCBI ცილების მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e-10 და 60% ჰომოლოგია).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка nr და RefSeq NCBI (მნიშვნელობა e <1e-10 და ზომიერება 60%). BLASTX ასევე შესრულდა არა-თვით კონტიგებზე nr და RefSeq NCBI ცილების მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია).BLASTN და BLASTX არა-თვით-კონტიგების აუზი წარმოადგენს საბოლოო კონტიგებს (იხ. დამატებითი ფაილი).
PCR-სთვის გამოყენებული პრაიმერები ჩამოთვლილია ცხრილში S1.Taq დნმ პოლიმერაზა (Bio Basic Canada, Markham, ON) გამოიყენებოდა ccfDNA სამიზნე გენების გასაძლიერებლად.გამოყენებული იქნა შემდეგი რეაქციის პირობები: დენატურაცია 95°C-ზე 3 წუთის განმავლობაში, 95°C 1 წუთის განმავლობაში, დაყენებული ანეილირების ტემპერატურა 1 წუთის განმავლობაში, დრეკადობა 72°C-ზე 1 წუთის განმავლობაში, 35 ციკლი და ბოლოს 72°C 10 წუთის განმავლობაში..PCR პროდუქტები გამოეყო ელექტროფორეზით აგაროზის გელებში (1.5%), რომელიც შეიცავს SYBRTM Safe DNA Gel Stain-ს (Invitrogen, Burlington, ON, კანადა) 95 ვ.
მიდიები (Mytilus spp.) აკლიმატიზებული იყო 500 მლ ჟანგბადით გაჯერებულ ზღვის წყალში (32 PSU) 24 საათის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე.პლაზმური დნმ, რომელიც შეიცავს ადამიანის გალექტინ-7 cDNA თანმიმდევრობის მაკოდირებელ ჩანართს (NCBI დაშვების ნომერი L07769) დაემატა ფლაკონს საბოლოო კონცენტრაციით 190 μg/μl.საკონტროლო იყო იმავე პირობებში ინკუბირებული მიდიები დნმ-ის დამატების გარეშე.მესამე საკონტროლო ავზი შეიცავდა დნმ-ს მიდიების გარეშე.ზღვის წყალში დნმ-ის ხარისხის მონიტორინგისთვის, აღებული იქნა ზღვის წყლის ნიმუშები (20 μl; სამი გამეორება) თითოეული ავზიდან მითითებულ დროს.პლაზმიდური დნმ-ის მიკვლევადობისთვის, LB მიდიები აღებული იქნა მითითებულ დროს და გაანალიზდა qPCR და ddPCR.ზღვის წყალში მარილის მაღალი შემცველობის გამო, ალიქვოტები განზავებული იყო PCR ხარისხის წყალში (1:10) ყველა PCR ანალიზამდე.
ციფრული წვეთოვანი PCR (ddPCR) შესრულდა BioRad QX200 პროტოკოლის გამოყენებით (მისსაუგა, ონტარიო, კანადა).გამოიყენეთ ტემპერატურის პროფილი ოპტიმალური ტემპერატურის დასადგენად (ცხრილი S1).წვეთები წარმოიქმნა QX200 წვეთების გენერატორის (BioRad) გამოყენებით.ddPCR ჩატარდა შემდეგნაირად: 95°C 5 წთ, 50 ციკლი 95°C 30 წმ და მოცემული ანეილის ტემპერატურა 1 წთ და 72°C 30 წმ, 4°C 5 წთ და 90°C 5 წუთის განმავლობაში.წვეთების რაოდენობა და დადებითი რეაქციები (ასლების რაოდენობა/μl) გაზომილი იყო QX200 წვეთების წამკითხველის (BioRad) გამოყენებით.10000-ზე ნაკლები წვეთით ნიმუშები უარყოფილია.შაბლონის კონტროლი არ ხდებოდა ყოველ ჯერზე ddPCR გაშვებისას.
qPCR ჩატარდა Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, ავსტრალია) და LGALS7 სპეციფიკური პრაიმერების გამოყენებით.ყველა რაოდენობრივი PCR ჩატარდა 20 μl-ში QuantiFast SYBR Green PCR ნაკრების (QIAGEN) გამოყენებით.qPCR დაიწყო 15 წუთის ინკუბაციით 95°C-ზე, რასაც მოჰყვა 40 ციკლი 95°C-ზე 10 წამის განმავლობაში და 60°C-ზე 60 წამის განმავლობაში ერთი მონაცემთა შეგროვებით.დნობის მრუდები წარმოიქმნა თანმიმდევრული გაზომვების გამოყენებით 95°C-ზე 5 წმ-ზე, 65°C-ზე 60 წამის განმავლობაში და 97°C-ზე qPCR-ის ბოლოს.თითოეული qPCR შესრულდა სამჯერ, გარდა საკონტროლო ნიმუშებისა.
ვინაიდან მიდიები ცნობილია მაღალი ფილტრაციის სიჩქარით, ჩვენ პირველად გამოვიკვლიეთ, შეეძლოთ თუ არა მათ გაფილტრონ და შეინარჩუნონ ზღვის წყალში არსებული დნმ-ის ფრაგმენტები.ჩვენ ასევე გვაინტერესებდა, გროვდება თუ არა ეს ფრაგმენტები მათ ნახევრად ღია ლიმფურ სისტემაში.ჩვენ გადავწყვიტეთ ეს საკითხი ექსპერიმენტულად, ცისფერი მიდიების ავზებში დამატებული ხსნადი დნმ-ის ფრაგმენტების ბედის კვალის გზით.დნმ-ის ფრაგმენტების თვალთვალის გასაადვილებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ უცხო (არა თვით) პლაზმიდური დნმ, რომელიც შეიცავს ადამიანის გალექტინ-7 გენს.ddPCR პლაზმური დნმ-ის ფრაგმენტებს ზღვის წყალში და მიდიებში აკვლევს.ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ თუ დნმ-ის ფრაგმენტების რაოდენობა ზღვის წყალში რჩებოდა შედარებით მუდმივი დროთა განმავლობაში (7 დღემდე) მიდიების არარსებობის შემთხვევაში, მაშინ მიდიების თანდასწრებით ეს დონე თითქმის მთლიანად გაქრა 8 საათის განმავლობაში (ნახ. 1a,b).ეგზოგენური დნმ-ის ფრაგმენტები ადვილად გამოვლინდა 15 წუთში ინტრავალვულ სითხეში და ჰემოლიმფაში ​​(ნახ. 1c).ამ ფრაგმენტების აღმოჩენა შესაძლებელია ექსპოზიციიდან 4 საათამდე.ეს ფილტრაციის აქტივობა დნმ-ის ფრაგმენტებთან მიმართებაში შედარებულია ბაქტერიებისა და წყალმცენარეების ფილტრაციის აქტივობასთან [31].ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ მიდიებს შეუძლიათ გაფილტრონ და დააგროვონ უცხო დნმ სითხის განყოფილებებში.
პლაზმიდური დნმ-ის შედარებითი კონცენტრაციები ზღვის წყალში მიდიების (A) ან არარსებობის (B) თანდასწრებით, გაზომილი ddPCR-ით.A-ში შედეგები გამოხატულია პროცენტების სახით, უჯრების საზღვრები წარმოადგენს 75-ე და 25-ე პროცენტებს.მორგებული ლოგარითმული მრუდი ნაჩვენებია წითლად, ხოლო ნაცრისფერში დაჩრდილული უბანი წარმოადგენს 95% ნდობის ინტერვალს.B-ში წითელი ხაზი წარმოადგენს საშუალოს, ხოლო ლურჯი ხაზი წარმოადგენს კონცენტრაციის 95% ნდობის ინტერვალს.C პლაზმური დნმ-ის დაგროვება მიდიების ჰემოლიმფაში ​​და სარქვლოვან სითხეში პლაზმური დნმ-ის დამატების შემდეგ სხვადასხვა დროს.შედეგები წარმოდგენილია როგორც აღმოჩენილი აბსოლუტური ასლები/მლ (±SE).
შემდეგ, ჩვენ გამოვიკვლიეთ ccfDNA-ს წარმოშობა მიდიებში, რომლებიც შეგროვდა კერგულენის კუნძულებზე, კუნძულების შორეულ ჯგუფში, შეზღუდული ანთროპოგენური გავლენით.ამ მიზნით, cccDNA მიდიის ჰემოლიმფებიდან იყო გამოყოფილი და გაწმენდილი მეთოდებით, რომლებიც ჩვეულებრივ გამოიყენება ადამიანის cccDNA-ს გასაწმენდად [32, 33].ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ საშუალო ჰემოლიმფის ccfDNA კონცენტრაცია მიდიებში არის დაბალი მიკროგრამების ერთ მლ ჰემოლიმფის დიაპაზონში (იხ. ცხრილი S2, დამატებითი ინფორმაცია).კონცენტრაციების ეს დიაპაზონი გაცილებით დიდია, ვიდრე ჯანმრთელ ადამიანებში (დაბალი ნანოგრამები მილილიტრში), მაგრამ იშვიათ შემთხვევებში, კიბოს პაციენტებში, ccfDNA-ს დონემ შეიძლება მიაღწიოს რამდენიმე მიკროგრამს მილილიტრში [34, 35].ჰემოლიმფის ccfDNA-ს ზომის განაწილების ანალიზმა აჩვენა, რომ ეს ფრაგმენტები მნიშვნელოვნად განსხვავდება ზომით, 1000 bp-დან 1000 bp-მდე.5000 bp-მდე (ნახ. 2).მსგავსი შედეგები იქნა მიღებული სილიციუმზე დაფუძნებული QIAamp Investigator Kit-ის გამოყენებით, მეთოდი, რომელიც ჩვეულებრივ გამოიყენება სასამართლო მეცნიერებაში გენომიური დნმ-ის სწრაფი იზოლირებისთვის და გასაწმენდად დაბალი კონცენტრაციის დნმ-ის ნიმუშებიდან, მათ შორის ccfDNA [36].
მიდიის ჰემოლიმფის წარმომადგენლობითი ccfDNA ელექტროფორეგრამა.ექსტრაქტულია NucleoSnap Plasma Kit-ით (ზედა) და QIAamp დნმ-ის მკვლევარის ნაკრებით.B ვიოლინოს დიაგრამა, რომელიც გვიჩვენებს ჰემოლიმფის ccfDNA კონცენტრაციების (± SE) განაწილებას მიდიებში.შავი და წითელი ხაზები წარმოადგენს მედიანურ და პირველ და მესამე მეოთხედს, შესაბამისად.
ადამიანებში და პრიმატებში ccfDNA-ს დაახლოებით 1%-ს აქვს უცხო წყარო [21, 37].ორსარქვლოვანთა ნახევრად ღია ცირკულაციური სისტემის, მიკრობიებით მდიდარი ზღვის წყლისა და მიდიის ccfDNA-ს ზომის განაწილების გათვალისწინებით, ჩვენ გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ მიდიის ჰემოლიმფის ccfDNA შეიძლება შეიცავდეს მიკრობული დნმ-ის მდიდარ და მრავალფეროვან აუზს.ამ ჰიპოთეზის შესამოწმებლად, ჩვენ დავადგინეთ ჰემოლიმფის ccfDNA-ს თანმიმდევრობა Aulacomya atra-ს ნიმუშებიდან, რომლებიც შეგროვდა კერგულენის კუნძულებიდან, 10 მილიონზე მეტი წაკითხვის შედეგად, რომელთა 97.6%-მა გაიარა ხარისხის კონტროლი.წაკითხვები შემდეგ იყო კლასიფიცირებული თვით და არა-საკუთარი წყაროების მიხედვით BLASTN და NCBI ორსარქვლოვანი მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (ნახ. S1, დამატებითი ინფორმაცია).
ადამიანებში, როგორც ბირთვული, ასევე მიტოქონდრიული დნმ შეიძლება გამოიყოფა სისხლში [38].თუმცა, წინამდებარე კვლევაში შეუძლებელი იყო მიდიების ბირთვული გენომის დნმ-ის დეტალური აღწერა, იმის გათვალისწინებით, რომ A. atra გენომის თანმიმდევრობა და აღწერილი არ არის.თუმცა, ჩვენ შევძელით ჩვენივე წარმოშობის ccfDNA ფრაგმენტების იდენტიფიცირება ორსარქვლოვანი ბიბლიოთეკის გამოყენებით (ნახ. S2, დამატებითი ინფორმაცია).ჩვენ ასევე დავადასტურეთ ჩვენი წარმოშობის დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა A. atra გენების მიმართული PCR ამპლიფიკაციით, რომლებიც დახარისხებული იყო (ნახ. 3).ანალოგიურად, იმის გათვალისწინებით, რომ A. atra-ს მიტოქონდრიული გენომი ხელმისაწვდომია საჯარო მონაცემთა ბაზებში, შეგიძლიათ იპოვოთ მტკიცებულება მიტოქონდრიული ccfDNA ფრაგმენტების არსებობის შესახებ A. atra-ს ჰემოლიმფაში.მიტოქონდრიული დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა დადასტურდა PCR გაძლიერებით (ნახ. 3).
A. atra-ს (წითელი წერტილები - მარაგის ნომერი: SRX5705969) და M. platensis (ლურჯი წერტილები - მარაგის ნომერი: SRX5705968) ჰემოლიმფაში ​​იყო წარმოდგენილი სხვადასხვა მიტოქონდრიული გენი, რომელიც გაძლიერებულია PCR-ით.ფიგურა ადაპტირებული Breton et al., 2011 B ჰემოლიმფის სუპერნატანტის გაძლიერება A. atra-დან, ინახება FTA ქაღალდზე.გამოიყენეთ 3 მმ პუნჩი, რომ დაუმატოთ პირდაპირ PCR მილს, რომელიც შეიცავს PCR მიქსს.
ზღვის წყალში უხვი მიკრობული შემცველობის გათვალისწინებით, ჩვენ თავდაპირველად ყურადღება გავამახვილეთ ჰემოლიმფში მიკრობული დნმ-ის თანმიმდევრობების დახასიათებაზე.ამისათვის ჩვენ ვიყენებთ ორ განსხვავებულ სტრატეგიას.პირველმა სტრატეგიამ გამოიყენა Kraken2, ალგორითმზე დაფუძნებული თანმიმდევრობის კლასიფიკაციის პროგრამა, რომელსაც შეუძლია მიკრობული თანმიმდევრობების იდენტიფიცირება BLAST-თან და სხვა ინსტრუმენტებთან შედარებით სიზუსტით [28].6719-ზე მეტი კითხვა დადგინდა, რომ ბაქტერიული წარმოშობისა იყო, ხოლო 124 და 64 იყო არქეებიდან და ვირუსებიდან, შესაბამისად (ნახ. 4).ყველაზე უხვი ბაქტერიული დნმ-ის ფრაგმენტები იყო Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) და Bacteroidetes (17%) (ნახ. 4a).ეს განაწილება შეესაბამება ზღვის ლურჯი მიდიის მიკრობიომის წინა კვლევებს [39, 40].გამაპროტეობაქტერიები წარმოადგენდნენ პროტეობაქტერიების ძირითად კლასს (44%), მათ შორის მრავალი ვიბრიონალური (ნახ. 4b).ddPCR მეთოდმა დაადასტურა Vibrio დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა A. atra hemolymph-ის ccfDNA-ში (ნახ. 4c) [41].ccfDNA-ს ბაქტერიული წარმოშობის შესახებ მეტი ინფორმაციის მისაღებად გამოყენებული იქნა დამატებითი მიდგომა (ნახ. S2, დამატებითი ინფორმაცია). ამ შემთხვევაში, წაკითხვები, რომლებიც გადახურულია, აწყობილი იყო როგორც დაწყვილებული ბოლო წაკითხვები და კლასიფიცირებული იყო როგორც თვით (ორსარქვლოვანი) ან არასაკუთარი წარმოშობის, BLASTN-ის გამოყენებით და e მნიშვნელობის 1e−3 და წყვეტის >90% ჰომოლოგიით. ამ შემთხვევაში, წაკითხვები, რომლებიც გადახურულია, აწყობილი იყო როგორც დაწყვილებული ბოლო წაკითხვები და კლასიფიცირებული იყო როგორც თვით (ორსარქვლოვანი) ან არასაკუთარი წარმოშობის, BLASTN-ის გამოყენებით და e მნიშვნელობის 1e−3 და წყვეტის >90% ჰომოლოგიით. ამ კითხვის ნიშნის ქვეშ მყოფი კლასები და კლასსიფიციროვანები, როგორც სარგებლობა (დამხმარე моллюски) ან ბმულები, რომლებიც დაკავშირებულია 3-3 AST-ში. отсечения со гомологией> 90%. ამ შემთხვევაში, გადახურული წაკითხვები შეგროვდა, როგორც დაწყვილებული წაკითხვები და კლასიფიცირებული იყო, როგორც მშობლიური (ორსარქვლოვანი) ან არაორიგინალური, BLASTN-ის გამოყენებით და e მნიშვნელობის 1e-3 და ათვლის 90% ჰომოლოგიით.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和歄怺怺怐皌e >90%债值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 1-e bla和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。…. In этом скручае перекрывающиеся чтения были собраны како чтения со парными концами и классифицированы, როგორც საბსტვენნые (შექმნილი моллюски) ან несобственные по происхольждени. როга ცნობები> 90%. ამ შემთხვევაში, გადახურული წაკითხვები შეგროვდა, როგორც დაწყვილებული წაკითხვები და კლასიფიცირებული იყო როგორც საკუთარი (ორსარქვლიანი) ან არაორიგინალური e BLASTN და 1e-3 მნიშვნელობების გამოყენებით და ჰომოლოგიური ზღურბლი >90%.ვინაიდან A. atra გენომი ჯერ არ არის დახარისხებული, ჩვენ გამოვიყენეთ MEGAHIT შემდეგი თაობის თანმიმდევრობის (NGS) ასამბლერის de novo ასამბლეის სტრატეგია.სულ 147,188 კონტიგი იდენტიფიცირებულია, როგორც წარმოშობის დამოკიდებული (ორსარქველი).ეს კონტიგები შემდეგ აფეთქდა 1e-10 e-მნიშვნელობებით BLASTN და BLASTX გამოყენებით.ეს სტრატეგია საშუალებას გვაძლევს განვსაზღვროთ 482 არაბივალვური ფრაგმენტი, რომელიც იმყოფება A. atra ccfDNA-ში.ამ დნმ-ის ფრაგმენტების ნახევარზე მეტი (57%) მიღებული იყო ბაქტერიებისგან, ძირითადად ღრძილების სიმბიონებისგან, მათ შორის სულფოტროფული სიმბიონებისგან და ღრძილების სიმბიონებისგან Solemya velum (ნახ. 5).
შედარებითი სიმრავლე ტიპის დონეზე.B მიკრობული მრავალფეროვნება ორი ძირითადი ფილას (Firmicutes და Proteobacteria).ddPCR C Vibrio spp-ის წარმომადგენლობითი გაძლიერება.ა. 16S rRNA გენის ფრაგმენტები (ლურჯი) სამ ატრა ჰემოლიმფში.
სულ გაანალიზდა 482 შეგროვებული კონტიგი.მეტაგენომიური კონტიგური ანოტაციების (პროკარიოტები და ევკარიოტები) ტაქსონომიური განაწილების ზოგადი პროფილი.B BLASTN-ით და BLASTX-ით იდენტიფიცირებული ბაქტერიული დნმ-ის ფრაგმენტების დეტალური განაწილება.
Kraken2 ანალიზმა ასევე აჩვენა, რომ მიდიის ccfDNA შეიცავდა არქეულ დნმ-ის ფრაგმენტებს, მათ შორის Euryarchaeota-ს (65%), Crenarchaeota-ს (24%) და Thaurmarcheota-ს (11%) დნმ-ის ფრაგმენტებს (ნახ. 6a).Euryarchaeota-დან და Crenarchaeota-დან მიღებული დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა, რომლებიც ადრე აღმოჩენილი იყო კალიფორნიის მიდიების მიკრობულ საზოგადოებაში, გასაკვირი არ უნდა იყოს [42].მიუხედავად იმისა, რომ Euryarchaeota ხშირად ასოცირდება ექსტრემალურ პირობებთან, ახლა უკვე აღიარებულია, რომ ორივე Euryarchaeota და Crenarcheota არის ყველაზე გავრცელებულ პროკარიოტებს შორის საზღვაო კრიოგენულ გარემოში [43, 44].მიდიებში მეთანოგენური მიკროორგანიზმების არსებობა გასაკვირი არ არის, თუ გავითვალისწინებთ ბოლოდროინდელ ცნობებს მეთანის ფართო გაჟონვის შესახებ კერგულენის პლატოზე [45] და მეთანის შესაძლო მიკრობული წარმოების შესახებ, რომელიც დაფიქსირდა კერგულენის კუნძულების სანაპიროზე [46].
შემდეგ ჩვენი ყურადღება დნმ ვირუსების კითხვებზე გადავიდა.ჩვენი ცოდნით, ეს არის მიდიების ვირუსის შემცველობის პირველი მიზანმიმართული კვლევა.როგორც მოსალოდნელი იყო, ჩვენ აღმოვაჩინეთ ბაქტერიოფაგების (Caudovirales) დნმ-ის ფრაგმენტები (ნახ. 6b).თუმცა, ყველაზე გავრცელებული ვირუსული დნმ მოდის ნუკლეოციტოვირუსების ჯგუფიდან, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც ბირთვული ციტოპლაზმური დიდი დნმ ვირუსი (NCLDV), რომელსაც აქვს ნებისმიერი ვირუსის ყველაზე დიდი გენომი.ამ ჯგუფში, დნმ-ის მიმდევრობების უმეტესობა მიეკუთვნება Mimimidoviridae (58%) და Poxviridae (21%) ოჯახებს, რომელთა ბუნებრივ მასპინძლებში შედის ხერხემლიანები და ფეხსახსრიანები, ხოლო ამ დნმ-ის თანმიმდევრობების მცირე ნაწილი ეკუთვნის ცნობილ ვირუსოლოგიურ წყალმცენარეებს.აინფიცირებს ზღვის ევკარიოტულ წყალმცენარეებს.თანმიმდევრობები ასევე მიღებული იქნა პანდორას ვირუსისგან, გიგანტური ვირუსისგან, რომელსაც აქვს გენომის უდიდესი ზომა ნებისმიერი ცნობილი ვირუსული გვარისგან.საინტერესოა, რომ მასპინძლების დიაპაზონი, რომლებიც ცნობილია ვირუსით ინფიცირებულად, როგორც ჰემოლიმფის ccfDNA თანმიმდევრობით განსაზღვრული იყო, შედარებით დიდი იყო (სურათი S3, დამატებითი ინფორმაცია).მასში შედის ვირუსები, რომლებიც აზიანებენ მწერებს, როგორიცაა Baculoviridae და Iridoviridae, ასევე ვირუსები, რომლებიც აინფიცირებენ ამებაებს, წყალმცენარეებსა და ხერხემლიანებს.ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ მიმდევრობები, რომლებიც შეესაბამება Pithovirus sibericum გენომს.პიტოვირუსები (ასევე ცნობილი როგორც "ზომბი ვირუსები") პირველად იზოლირებული იქნა ციმბირში 30000 წლის მუდმივი ყინვისგან [47].ამრიგად, ჩვენი შედეგები შეესაბამება წინა ანგარიშებს, რომლებიც აჩვენებდნენ, რომ ამ ვირუსების ყველა თანამედროვე სახეობა არ არის გადაშენებული [48] და რომ ეს ვირუსები შეიძლება იყოს შორეულ სუბარქტიკულ საზღვაო ეკოსისტემებში.
საბოლოოდ, ჩვენ გამოვცადეთ, რომ გვეპოვა თუ არა სხვა მრავალუჯრედიანი ცხოველების დნმ-ის ფრაგმენტები.სულ 482 უცხო კონტიგი იდენტიფიცირებული იყო BLASTN-ისა და BLASTX-ის მიერ nt, nr და RefSeq ბიბლიოთეკებით (გენომიური და ცილა).ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ მრავალუჯრედიანი ცხოველების ccfDNA-ს უცხო ფრაგმენტებს შორის ჭარბობს ძვლის ძვლების დნმ (ნახ. 5).ასევე ნაპოვნია მწერების და სხვა სახეობების დნმ-ის ფრაგმენტები.დნმ-ის ფრაგმენტების შედარებით დიდი ნაწილი იდენტიფიცირებული არ არის, შესაძლოა გენომიურ მონაცემთა ბაზაში საზღვაო სახეობების დიდი რაოდენობით არასაკმარისი წარმოდგენის გამო ხმელეთის სახეობებთან შედარებით [49].
წინამდებარე ნაშრომში, ჩვენ გამოვიყენებთ LB კონცეფციას მიდიებზე, ამტკიცებთ, რომ ჰემოლიმფის ccfDNA გასროლების თანმიმდევრობამ შეიძლება უზრუნველყოს ზღვის სანაპირო ეკოსისტემების შემადგენლობა.კერძოდ, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 1) მიდიის ჰემოლიმფა შეიცავს შედარებით მაღალ კონცენტრაციებს (მიკროგრამების დონეს) შედარებით დიდი (~1-5 კბ) მოცირკულირე დნმ-ის ფრაგმენტები;2) ეს დნმ-ის ფრაგმენტები არის როგორც დამოუკიდებელი, ასევე არა დამოუკიდებელი 3) ამ დნმ-ის ფრაგმენტების უცხო წყაროებს შორის აღმოვაჩინეთ ბაქტერიული, არქეალური და ვირუსული დნმ, ისევე როგორც სხვა მრავალუჯრედიანი ცხოველების დნმ;4) ამ უცხო ccfDNA ფრაგმენტების დაგროვება ჰემოლიმფაში ​​სწრაფად ხდება და ხელს უწყობს მიდიების შიდა ფილტრაციის აქტივობას.დასასრულს, ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ LB-ის კონცეფცია, რომელიც აქამდე ძირითადად გამოიყენება ბიომედიცინის სფეროში, შიფრავს ცოდნის მდიდარ, მაგრამ შეუსწავლელ წყაროს, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას სენტინელ სახეობებსა და მათ გარემოს შორის ურთიერთქმედების უკეთ გასაგებად.
პრიმატების გარდა, ccfDNA იზოლაცია დაფიქსირდა ძუძუმწოვრებში, მათ შორის თაგვებში, ძაღლებში, კატებში და ცხენებში [50, 51, 52].თუმცა, ჩვენი ცოდნით, ჩვენი კვლევა პირველია, რომელმაც შეატყობინა ccfDNA-ს გამოვლენისა და თანმიმდევრობის შესახებ საზღვაო სახეობებში ღია ცირკულაციის სისტემით.მიდიების ეს ანატომიური მახასიათებელი და ფილტრაციის უნარი ნაწილობრივ მაინც შეიძლება ახსნას მოცირკულირე დნმ-ის ფრაგმენტების განსხვავებული ზომის მახასიათებლები სხვა სახეობებთან შედარებით.ადამიანებში, სისხლში მოცირკულირე დნმ-ის ფრაგმენტების უმეტესობა არის პატარა ფრაგმენტები, რომელთა ზომებია 150-დან 200 bp-მდე.მაქსიმალური პიკით 167 bp [34, 53].დნმ-ის ფრაგმენტების მცირე, მაგრამ მნიშვნელოვანი ნაწილი ზომით 300-დან 500 bp-მდეა და დაახლოებით 5% 900 bp-ზე გრძელია.[54].ამ ზომის განაწილების მიზეზი არის ის, რომ ccfDNA-ს ძირითადი წყარო პლაზმაში ხდება უჯრედის სიკვდილის შედეგად, ან უჯრედის სიკვდილის გამო, ან ჯანმრთელ ადამიანებში მოცირკულირე ჰემატოპოეზური უჯრედების ნეკროზის გამო, ან სიმსივნური უჯრედების აპოპტოზის გამო კიბოს პაციენტებში (ცნობილია როგორც მოცირკულირე სიმსივნის დნმ).ctDNA).ჰემოლიმფის ccfDNA-ს ზომების განაწილება, რომელიც ჩვენ აღმოვაჩინეთ მიდიებში, მერყეობდა 1000-დან 5000 bp-მდე, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ მიდიის ccfDNA-ს განსხვავებული წარმოშობა აქვს.ეს ლოგიკური ჰიპოთეზაა, ვინაიდან მიდიებს აქვთ ნახევრად ღია სისხლძარღვთა სისტემა და ცხოვრობენ ზღვის წყლის გარემოში, რომელიც შეიცავს მიკრობული გენომიური დნმ-ის მაღალ კონცენტრაციას.სინამდვილეში, ეგზოგენური დნმ-ის გამოყენებით ჩვენმა ლაბორატორიულმა ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ მიდიები აგროვებენ დნმ-ის ფრაგმენტებს ზღვის წყალში, სულ მცირე, რამდენიმე საათის შემდეგ ისინი იშლება უჯრედული ათვისების შემდეგ და/ან გათავისუფლდება და/ან ინახება სხვადასხვა ორგანიზაციაში.უჯრედების იშვიათობის გათვალისწინებით (როგორც პროკარიოტული, ასევე ეუკარიოტული), ინტრავალვულური განყოფილებების გამოყენება შეამცირებს ccfDNA-ს რაოდენობას როგორც თვით წყაროებიდან, ასევე უცხოური წყაროებიდან.ორსარქვლოვანი თანდაყოლილი იმუნიტეტის და მოცირკულირე ფაგოციტების დიდი რაოდენობის მნიშვნელობის გათვალისწინებით, ჩვენ შემდგომში გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ უცხო ccfDNAც კი გამდიდრებულია მოცირკულირე ფაგოციტებით, რომლებიც აგროვებენ უცხო დნმ-ს მიკროორგანიზმების და/ან უჯრედული ნარჩენების მიღებისას.ერთად აღებული, ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ ორსარქვლოვანი ჰემოლიმფის ccfDNA არის მოლეკულური ინფორმაციის უნიკალური საცავი და აძლიერებს მათ, როგორც სენტინელ სახეობას.
ჩვენი მონაცემები მიუთითებს, რომ ბაქტერიებიდან მიღებული ჰემოლიმფის ccfDNA ფრაგმენტების თანმიმდევრობამ და ანალიზმა შეიძლება უზრუნველყოს ძირითადი ინფორმაცია მასპინძელი ბაქტერიული ფლორისა და მიმდებარე საზღვაო ეკოსისტემაში არსებული ბაქტერიების შესახებ.კადრების თანმიმდევრობის ტექნიკებმა გამოავლინა A. atra gill ბაქტერიების თანამიმდევრობები, რომლებიც გამოტოვებული იქნებოდა 16S rRNA იდენტიფიკაციის ჩვეულებრივი მეთოდების გამოყენების შემთხვევაში, ნაწილობრივ საცნობარო ბიბლიოთეკის მიკერძოების გამო.ფაქტობრივად, M. platensis-დან შეგროვებული LB მონაცემების ჩვენმა გამოყენებამ კერგუელენში მიდიების იმავე ფენაში აჩვენა, რომ გლუვთან ასოცირებული ბაქტერიული სიმბიონტების შემადგენლობა იგივე იყო მიდიის ორივე სახეობისთვის (ნახ. S4, დამატებითი ინფორმაცია).ორი გენეტიკურად განსხვავებული მიდიის ეს მსგავსება შეიძლება ასახავდეს ბაქტერიული თემების შემადგენლობას კერგულენის ცივ, გოგირდოვან და ვულკანურ საბადოებში [55, 56, 57, 58].გოგირდის შემამცირებელი მიკროორგანიზმების უფრო მაღალი დონე კარგად არის აღწერილი მიდიების მოსავლისას ბიოტურბირებული სანაპირო ზონებიდან [59], როგორიცაა პორტ-ო-ფრანსის სანაპირო.კიდევ ერთი შესაძლებლობა არის ის, რომ კომენსალური მიდიის ფლორა შეიძლება დაზარალდეს ჰორიზონტალური გადაცემით [60, 61].საჭიროა მეტი კვლევა, რათა დადგინდეს კორელაცია საზღვაო გარემოს, ზღვის ფსკერის ზედაპირსა და მიდიებში სიმბიოზური ბაქტერიების შემადგენლობას შორის.ეს კვლევები ამჟამად მიმდინარეობს.
ჰემოლიმფის ccfDNA-ს სიგრძე და კონცენტრაცია, მისი გაწმენდის სიმარტივე და მაღალი ხარისხი თოფის სწრაფი მიმდევრობის დასაშვებად არის მიდიის ccfDNA-ს გამოყენების მრავალი უპირატესობა ზღვის სანაპირო ეკოსისტემებში ბიომრავალფეროვნების შესაფასებლად.ეს მიდგომა განსაკუთრებით ეფექტურია მოცემულ ეკოსისტემაში ვირუსული თემების (ვირომების) დასახასიათებლად [62, 63].ბაქტერიებისგან, არქეებისა და ევკარიოტებისგან განსხვავებით, ვირუსული გენომები არ შეიცავს ფილოგენეტიკურად შენახულ გენებს, როგორიცაა 16S თანმიმდევრობა.ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ თხევადი ბიოფსიები ინდიკატორის სახეობებისგან, როგორიცაა მიდიები, შეიძლება გამოყენებულ იქნას შედარებით დიდი რაოდენობით ccfDNA ვირუსის ფრაგმენტების იდენტიფიცირებისთვის, რომლებიც აინფიცირებს მასპინძლებს, რომლებიც ჩვეულებრივ ბინადრობენ სანაპირო საზღვაო ეკოსისტემებში.ეს მოიცავს ვირუსებს, რომლებიც ცნობილია პროტოზოების, ართროპოდების, მწერების, მცენარეების და ბაქტერიული ვირუსების (მაგ., ბაქტერიოფაგების) დაინფიცირების მიზნით.მსგავსი განაწილება იქნა ნაპოვნი, როდესაც ჩვენ გამოვიკვლიეთ ცისფერი მიდიების (M. platensis) ჰემოლიმფის ccfDNA ვირუსი, შეგროვებული იმავე მიდიის ფენაში კერგუელენში (ცხრილი S2, დამატებითი ინფორმაცია).ccfDNA-ს თოფის თანმიმდევრობა მართლაც ახალი მიდგომაა, რომელიც იმპულსს იძენს ადამიანების ან სხვა სახეობების ვირუსის შესწავლაში [21, 37, 64].ეს მიდგომა განსაკუთრებით სასარგებლოა ორჯაჭვიანი დნმ ვირუსების შესასწავლად, რადგან არცერთი გენი არ არის დაცული ყველა ორჯაჭვიან დნმ ვირუსებს შორის, რაც წარმოადგენს ბალტიმორში ვირუსების ყველაზე მრავალფეროვან და ფართო კლასს [65].მიუხედავად იმისა, რომ ამ ვირუსების უმეტესობა რჩება არაკლასიფიცირებული და შეიძლება მოიცავდეს ვირუსებს ვირუსული სამყაროს სრულიად უცნობი ნაწილიდან [66], ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ A. atra და M. platensis მიდიების ვირომები და მასპინძელთა დიაპაზონი ორ სახეობას შორის ხვდება.ანალოგიურად (იხ. სურათი S3, დამატებითი ინფორმაცია).ეს მსგავსება გასაკვირი არ არის, რადგან ის შეიძლება ასახავდეს გარემოში არსებული დნმ-ის შეთვისების სელექტიურობის ნაკლებობას.გაწმენდილი რნმ-ის გამოყენებით მომავალი კვლევები ამჟამად საჭიროა რნმ-ის ვირომის დასახასიათებლად.
ჩვენს კვლევაში ჩვენ გამოვიყენეთ ძალიან მკაცრი მილსადენი, რომელიც ადაპტირებულია კოვარსკისა და კოლეგების ნამუშევრებიდან [37], რომლებმაც გამოიყენეს წაკითხვისა და კონტიგების ორეტაპიანი წაშლა მშობლიური ccfDNA-ს აწყობამდე და მის შემდეგ, რის შედეგადაც მიღწეული იქნა გაუმართავი წაკითხვის მაღალი წილი.აქედან გამომდინარე, ჩვენ არ შეგვიძლია გამოვრიცხოთ, რომ ზოგიერთ ამ დაუზუსტებელ წაკითხვას შეიძლება ჰქონდეს საკუთარი წარმომავლობა, უპირველეს ყოვლისა, იმიტომ, რომ ჩვენ არ გვაქვს მიდიების ამ სახეობის საცნობარო გენომი.ჩვენ ასევე გამოვიყენეთ ეს მილსადენი, რადგან შეშფოთებული ვიყავით ქიმერებით თვით და არა-თვით კითხვას შორის და წაკითხვის სიგრძეზე, რომელიც წარმოიქმნება Illumina MiSeq PE75-ის მიერ.ამოუცნობი წაკითხვის უმრავლესობის კიდევ ერთი მიზეზი არის ის, რომ საზღვაო მიკრობების დიდი ნაწილი, განსაკუთრებით შორეულ რაიონებში, როგორიცაა კერგულენი, არ არის ანოტირებული.ჩვენ გამოვიყენეთ Illumina MiSeq PE75, ვივარაუდოთ, რომ ccfDNA ფრაგმენტის სიგრძე ადამიანის ccfDNA-ს მსგავსია.მომავალი კვლევებისთვის, თუ გავითვალისწინებთ ჩვენს შედეგებს, რომლებიც აჩვენებენ, რომ ჰემოლიმფის ccfDNA-ს აქვს უფრო გრძელი წაკითხვა, ვიდრე ადამიანებს და/ან ძუძუმწოვრებს, ჩვენ გირჩევთ გამოიყენოთ თანმიმდევრობის პლატფორმა, რომელიც უფრო შესაფერისია ccfDNA უფრო გრძელი ფრაგმენტებისთვის.ეს პრაქტიკა გაადვილებს უფრო ღრმა ანალიზისთვის მეტი მითითებების იდენტიფიცირებას.ამჟამად მიუწვდომელი სრული A. atra ბირთვული გენომის თანმიმდევრობის მიღება ასევე მნიშვნელოვნად შეუწყობს ხელს ccfDNA-ს დისკრიმინაციას საკუთარი და არასაკუთარი წყაროებიდან.იმის გათვალისწინებით, რომ ჩვენი კვლევა ფოკუსირებულია მიდიებზე თხევადი ბიოფსიის კონცეფციის გამოყენების შესაძლებლობაზე, ვიმედოვნებთ, რომ ამ კონცეფციის შემდგომ კვლევებში გამოყენებული იქნება ახალი ხელსაწყოები და მილსადენები, რათა გაზარდოს ამ მეთოდის პოტენციალი მიდიების მიკრობული მრავალფეროვნების შესასწავლად.საზღვაო ეკოსისტემა.
როგორც არაინვაზიური კლინიკური ბიომარკერი, ccfDNA ადამიანის პლაზმაში ამაღლებული დონე ასოცირდება სხვადასხვა დაავადებებთან, ქსოვილების დაზიანებასთან და სტრესულ პირობებთან [67,68,69].ეს ზრდა დაკავშირებულია საკუთარი წარმოშობის დნმ-ის ფრაგმენტების გათავისუფლებასთან ქსოვილის დაზიანების შემდეგ.ჩვენ განვიხილეთ ეს საკითხი მწვავე სითბური სტრესის გამოყენებით, რომლის დროსაც მიდიები მოკლე დროში ექვემდებარებოდნენ 30 °C ტემპერატურას.ჩვენ ეს ანალიზი ჩავატარეთ სამ სხვადასხვა ტიპის მიდიაზე სამ დამოუკიდებელ ექსპერიმენტში.თუმცა, მწვავე სითბური სტრესის შემდეგ ccfDNA-ს დონის ცვლილება ვერ ვიპოვეთ (იხ. სურათი S5, დამატებითი ინფორმაცია).ამ აღმოჩენამ შესაძლოა ნაწილობრივ მაინც ახსნას ის ფაქტი, რომ მიდიებს აქვთ ნახევრად ღია სისხლის მიმოქცევის სისტემა და აგროვებენ დიდი რაოდენობით უცხო დნმ-ს მათი მაღალი ფილტრაციის აქტივობის გამო.მეორე მხრივ, მიდიები, ისევე როგორც მრავალი უხერხემლო, შეიძლება იყოს უფრო მდგრადი სტრესით გამოწვეული ქსოვილის დაზიანების მიმართ, რითაც ზღუდავს ccfDNA-ს გამოყოფას მათ ჰემოლიმფაში ​​[70, 71].
დღეისათვის, წყლის ეკოსისტემებში ბიომრავალფეროვნების დნმ-ის ანალიზი ძირითადად ფოკუსირებულია გარემოს დნმ-ის (eDNA) მეტაბარკოდირებაზე.თუმცა, ეს მეთოდი ჩვეულებრივ შეზღუდულია ბიომრავალფეროვნების ანალიზში პრაიმერების გამოყენებისას.თოფის თანმიმდევრობის გამოყენება აცილებს PCR-ის შეზღუდვებს და პრაიმერის კომპლექტების მიკერძოებულ შერჩევას.ამრიგად, გარკვეული გაგებით, ჩვენი მეთოდი უფრო ახლოსაა ახლახან გამოყენებულ მაღალი გამტარუნარიანობის eDNA თოფის თანმიმდევრობის მეთოდთან, რომელსაც შეუძლია უშუალოდ ფრაგმენტირებული დნმ-ის თანმიმდევრობა და თითქმის ყველა ორგანიზმის ანალიზი [72, 73].თუმცა, არსებობს მთელი რიგი ფუნდამენტური საკითხები, რომლებიც განასხვავებენ LB-ს სტანდარტული eDNA მეთოდებისგან.რა თქმა უნდა, მთავარი განსხვავება eDNA-სა და LB-ს შორის არის ბუნებრივი ფილტრის მასპინძლების გამოყენება.დაფიქსირდა საზღვაო სახეობების გამოყენება, როგორიცაა სპონგები და ორსარქველები (Dresseina spp.), როგორც ბუნებრივი ფილტრი eDNA-ს შესასწავლად [74, 75].თუმცა, დრეისენას კვლევამ გამოიყენა ქსოვილის ბიოფსია, საიდანაც დნმ იქნა ამოღებული.LB-დან ccfDNA-ს ანალიზი არ საჭიროებს ქსოვილის ბიოფსიას, სპეციალიზებულ და ზოგჯერ ძვირადღირებულ აღჭურვილობას და ლოგისტიკას, რომელიც დაკავშირებულია eDNA-სთან ან ქსოვილის ბიოფსიასთან.ფაქტობრივად, ჩვენ ახლახან შევატყობინეთ, რომ ccfDNA LB-დან შეიძლება შეინახოს და გაანალიზდეს FTA მხარდაჭერით ცივი ჯაჭვის შენარჩუნების გარეშე, რაც მთავარი გამოწვევაა შორეულ ადგილებში კვლევისთვის [76].ccfDNA-ს ამოღება თხევადი ბიოფსიიდან ასევე მარტივია და უზრუნველყოფს მაღალი ხარისხის დნმ-ს თოფის თანმიმდევრობის და PCR ანალიზისთვის.ეს არის დიდი უპირატესობა ზოგიერთი ტექნიკური შეზღუდვის გათვალისწინებით, რომელიც დაკავშირებულია eDNA ანალიზთან [77].შერჩევის მეთოდის სიმარტივე და დაბალი ღირებულება ასევე განსაკუთრებით შესაფერისია გრძელვადიანი მონიტორინგის პროგრამებისთვის.გარდა მათი მაღალი ფილტრაციის უნარისა, ორსარქვლოვანთა კიდევ ერთი ცნობილი თვისებაა მათი ლორწოს ქიმიური მუკოპოლისაქარიდული შემადგენლობა, რაც ხელს უწყობს ვირუსების შეწოვას [78, 79].ეს ქმნის ორსარქველებს იდეალურ ბუნებრივ ფილტრად ბიომრავალფეროვნებისა და კლიმატის ცვლილების ზემოქმედების დასახასიათებლად მოცემულ წყლის ეკოსისტემაში.მიუხედავად იმისა, რომ მასპინძელი დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა შეიძლება განიხილებოდეს, როგორც მეთოდის შეზღუდვა eDNA-სთან შედარებით, ასეთი ბუნებრივი ccfDNA eDNA-სთან შედარებით ქონასთან დაკავშირებული ღირებულება ერთდროულად გასაგებია ჯანმრთელობის კვლევებისთვის ხელმისაწვდომი ინფორმაციის დიდი რაოდენობით.ოფსეტური მასპინძელი.ეს მოიცავს მასპინძლის მასპინძლის გენომში ინტეგრირებული ვირუსული თანმიმდევრობების არსებობას.ეს განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია მიდიებისთვის, იმის გათვალისწინებით, რომ არსებობს ჰორიზონტალურად გადამდები ლეიკემიური რეტროვირუსები ორსაფეხურებში [80, 81].LB-ის კიდევ ერთი უპირატესობა eDNA-სთან შედარებით არის ის, რომ ის იყენებს ჰემოლიმფაში ​​მოცირკულირე სისხლის უჯრედების ფაგოციტურ აქტივობას, რომელიც შთანთქავს მიკროორგანიზმებს (და მათ გენომებს).ფაგოციტოზი არის სისხლის უჯრედების ძირითადი ფუნქცია ორსარქვლოვან უჯრედებში [82].და ბოლოს, მეთოდი სარგებლობს მიდიების მაღალი ფილტრაციის უნარით (საშუალოდ 1,5 ლ/სთ ზღვის წყალი) და ორდღიანი მიმოქცევით, რაც ზრდის ზღვის წყლის სხვადასხვა ფენების შერევას, რაც იძლევა ჰეტეროლოგიური eDNA-ს დაჭერის საშუალებას.[83, 84].ამრიგად, მიდიის ccfDNA ანალიზი საინტერესო გზაა მიდიების კვების, ეკონომიკური და გარემოზე ზემოქმედების გათვალისწინებით.ადამიანებისგან შეგროვებული LB-ის ანალიზის მსგავსად, ეს მეთოდი ასევე ხსნის გენეტიკური და ეპიგენეტიკური ცვლილებების გაზომვის შესაძლებლობას მასპინძლის დნმ-ში ეგზოგენური ნივთიერებების საპასუხოდ.მაგალითად, მესამე თაობის თანმიმდევრობის დადგენის ტექნოლოგიები შეიძლება გათვალისწინებული იყოს გენომის მასშტაბით მეთილაციის ანალიზის ჩასატარებლად მშობლიურ ccfDNA-ში ნანოფორების თანმიმდევრობის გამოყენებით.ამ პროცესს ხელი უნდა შეუწყოს იმ ფაქტმა, რომ მიდიის ccfDNA ფრაგმენტების სიგრძე იდეალურად შეესაბამება ხანგრძლივად წაკითხულ თანმიმდევრობის პლატფორმებს, რომლებიც იძლევა გენომის ფართო დნმ-ის მეთილაციის ანალიზს ერთი თანმიმდევრობით, ქიმიური გარდაქმნების გარეშე.მაშასადამე, მას შეუძლია უზრუნველყოს ღირებული ხედვა კლიმატის ცვლილების ან დამაბინძურებლების ზემოქმედების შემდგომ მექანიზმებზე, რომლებიც არეგულირებენ რეაგირებას [87].თუმცა, LB-ის გამოყენება არ არის შეზღუდვების გარეშე.ზედმეტია იმის თქმა, რომ ეს მოითხოვს ინდიკატორი სახეობების არსებობას ეკოსისტემაში.როგორც ზემოთ აღინიშნა, LB-ის გამოყენება მოცემული ეკოსისტემის ბიომრავალფეროვნების შესაფასებლად ასევე მოითხოვს მკაცრი ბიოინფორმატიკის მილსადენს, რომელიც ითვალისწინებს წყაროდან დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობას.კიდევ ერთი მთავარი პრობლემაა ზღვის სახეობებისთვის საცნობარო გენომის ხელმისაწვდომობა.იმედი გვაქვს, რომ ინიციატივები, როგორიცაა საზღვაო ძუძუმწოვრების გენომის პროექტი და ახლახან დაარსებული Fish10k პროექტი [88] ხელს შეუწყობს ასეთ ანალიზს მომავალში.LB კონცეფციის გამოყენება საზღვაო ფილტრებით მკვებავ ორგანიზმებზე ასევე თავსებადია უახლეს მიღწევებთან თანმიმდევრობის ტექნოლოგიის სფეროში, რაც შესანიშნავად აქცევს მას მრავალ ომ ბიომარკერების შემუშავებას, რათა უზრუნველყოს მნიშვნელოვანი ინფორმაცია საზღვაო ჰაბიტატების ჯანმრთელობის შესახებ გარემოსდაცვითი სტრესის საპასუხოდ.
გენომის თანმიმდევრობის მონაცემები დეპონირებულია NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 ქვეშ.
Brierley AS, Kingsford MJ კლიმატის ცვლილების გავლენა საზღვაო ცხოვრებასა და ეკოსისტემებზე.კოული ბიოლოგია.2009 წელი;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidu V, Bevilacqua S, და სხვ.განვიხილოთ კლიმატის ცვლილებისა და სხვა ადგილობრივი სტრესის ერთობლივი ზემოქმედება საზღვაო გარემოზე.ზოგადი სამეცნიერო გარემო.2021; 755: 142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, და სხვ.).პირველი მარტის მეცნიერება.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. შემცირებული სითბოს ტოლერანტობა განმეორებადი სითბური სტრესის პირობებში ხსნის ლურჯი მიდიების მაღალი ზაფხულის სიკვდილიანობას.სამეცნიერო ანგარიში 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, და სხვ.ბოლო ცვლილებები ცხოველთა სიკვდილის სიხშირეში, მიზეზებსა და მასშტაბებში.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.მრავალმა არასპეციფიკურმა პათოგენმა შეიძლება გამოიწვიოს Pinna nobilis-ის მასობრივი სიკვდილიანობა.ცხოვრება.2020; 10: 238.
ბრედლი M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.კლიმატის ცვლილების პოტენციური გავლენა არქტიკულ ზოონოზურ დაავადებებზე.Int J Circumpolar ჯანმრთელობა.2005 წელი;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. და სხვ.ლურჯი მიდიები (Mytilus edulis spp.) როგორც სასიგნალო ორგანიზმები სანაპირო დაბინძურების მონიტორინგში: მიმოხილვა.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. თხევადი ბიოფსიის ინტეგრაცია კიბოს მკურნალობაში.Nat Rev სუფთა Oncol.2017 წელი;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, და სხვ.თხევადი ბიოფსიის მომწიფება: სიმსივნის დნმ-ის ცირკულირების საშუალებას იძლევა.Nat Rev კიბო.2017; 17:223–38.
Mandel P., Metais P. ნუკლეინის მჟავები ადამიანის პლაზმაში.Soc Biol-ის შვილობილი კომპანიების შეხვედრის ოქმი.1948 წელი;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. ახალი როლი უჯრედებისგან თავისუფალი დნმ-ისთვის, როგორც მოლეკულური მარკერი კიბოს მკურნალობისთვის.ბიომოლარული ანალიზის რაოდენობრივი განსაზღვრა.2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS თხევადი ბიოფსია შემოდის კლინიკაში - განხორციელების საკითხები და სამომავლო გამოწვევები.ნატ რევ კლინ ონკოლ.2021 წელი;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW და სხვები.ნაყოფის დნმ იმყოფება დედის პლაზმასა და შრატში.ლანცეტი.1997 წელი;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR ორსულობის კურსის და მისი გართულებების შესწავლა ორსულობის დროს ქალების სისხლში მოცირკულირე უჯრედგარე რნმ-ის გამოყენებით.დოპედიატრია.2020; 8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.თხევადი ბიოფსია: დონორის უჯრედებისგან თავისუფალი დნმ გამოიყენება თირკმლის ტრანსპლანტატში ალოგენური დაზიანებების გამოსავლენად.ნატ რევ ნეფროლი.2021 წელი;17:591–603.
Juan FC, Lo YM ინოვაციები პრენატალურ დიაგნოსტიკაში: დედის პლაზმური გენომის თანმიმდევრობა.ანა მედიცინის დოქტორი.2016; 67: 419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D და სხვ.პათოგენის სწრაფი გამოვლენა ინფიცირებული სხეულის სითხეების შემდეგი თაობის მეტაგენომიური თანმიმდევრობით.ნატ მედიცინა.2021; 27: 115-24.