გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე.
ცოტა ხნის წინ შემუშავდა ქიმიური ნივთიერებებისგან თავისუფალი ანტიმიკრობული პლატფორმა, რომელიც დაფუძნებულია ნანოტექნოლოგიაზე, რომელიც იყენებს ხელოვნურ წყლის ნანოსტრუქტურებს (EWNS). EWNS-ებს აქვთ მაღალი ზედაპირული მუხტი და მდიდარია რეაქტიული ჟანგბადის სახეობებით (ROS), რომლებსაც შეუძლიათ ურთიერთქმედება და ინაქტივაცია მოახდინონ რიგ მიკროორგანიზმებთან, მათ შორის საკვებით გადამდები პათოგენებთან. აქ ნაჩვენებია, რომ სინთეზის დროს მათი თვისებების დახვეწა და ოპტიმიზაცია შესაძლებელია მათი ანტიბაქტერიული პოტენციალის შემდგომი გაძლიერების მიზნით. EWNS ლაბორატორიული პლატფორმა შექმნილია EWNS-ის თვისებების დახვეწისთვის სინთეზის პარამეტრების შეცვლით. EWNS-ის თვისებების (მუხტი, ზომა და ROS შემცველობა) დახასიათება ჩატარდა თანამედროვე ანალიტიკური მეთოდების გამოყენებით. გარდა ამისა, საკვები მიკროორგანიზმები, როგორიცაა Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum და Saccharomyces cerevisiae, შეიყვანეს ორგანული ყურძნის პომიდვრის ზედაპირზე მათი მიკრობული ინაქტივაციის პოტენციალის შესაფასებლად. აქ წარმოდგენილი შედეგები აჩვენებს, რომ EWNS-ის თვისებების დახვეწა შესაძლებელია სინთეზის დროს, რაც იწვევს ინაქტივაციის ეფექტურობის ექსპონენციალურ ზრდას. კერძოდ, ზედაპირული მუხტი ოთხჯერ გაიზარდა და ROS შემცველობაც გაიზარდა. მიკრობების მოცილების სიჩქარე მიკრობულად დამოკიდებული იყო და მერყეობდა 1.0-დან 3.8 log-მდე 40,000 #/სმ3 EWNS აეროზოლის დოზის 45 წუთის განმავლობაში ზემოქმედების შემდეგ.
მიკრობული დაბინძურება საკვებით გამოწვეული დაავადებების მთავარი მიზეზია, რომელიც გამოწვეულია პათოგენების ან მათი ტოქსინების მიღებით. საკვებით გამოწვეული დაავადებები ყოველწლიურად დაახლოებით 76 მილიონ დაავადებას, 325 000 ჰოსპიტალიზაციას და 5 000 სიკვდილს იწვევს მხოლოდ შეერთებულ შტატებში1. გარდა ამისა, შეერთებული შტატების სოფლის მეურნეობის დეპარტამენტი (USDA) ვარაუდობს, რომ ახალი პროდუქტების მოხმარების ზრდა პასუხისმგებელია შეერთებულ შტატებში დაფიქსირებული საკვებით გამოწვეული დაავადებების 48 პროცენტზე2. საკვებით გამოწვეული პათოგენებით გამოწვეული დაავადებებისა და სიკვდილიანობის ღირებულება შეერთებულ შტატებში ძალიან მაღალია, დაავადებათა კონტროლისა და პრევენციის ცენტრების (CDC) შეფასებით, წელიწადში 15.6 მილიარდ აშშ დოლარზე მეტია3.
ამჟამად, საკვების უვნებლობის უზრუნველსაყოფად ქიმიური4, რადიაციული5 და თერმული6 ანტიმიკრობული ჩარევები ძირითადად ხორციელდება წარმოების ჯაჭვის შეზღუდულ კრიტიკულ საკონტროლო წერტილებში (CCP) (ჩვეულებრივ, მოსავლის აღების შემდეგ და/ან შეფუთვის დროს) და არა უწყვეტად ისე, რომ ახალი პროდუქტი ჯვარედინი დაბინძურების ობიექტი გახდეს. 7 ანტიმიკრობული ჩარევები საჭიროა საკვებით გამოწვეული დაავადებებისა და საკვების გაფუჭების უკეთ კონტროლისთვის და მათ აქვთ პოტენციალი, რომ მათი გამოყენება ფერმიდან სუფრამდე მთელი პროცესის განმავლობაში მოხდეს. ნაკლები ზემოქმედება და ხარჯები.
ნანოტექნოლოგიაზე დაფუძნებული, ქიმიურად თავისუფალი ანტიმიკრობული პლატფორმა ცოტა ხნის წინ შემუშავდა ხელოვნური წყლის ნანოსტრუქტურების (EWNS) გამოყენებით ზედაპირებსა და ჰაერში არსებული ბაქტერიების ინაქტივაციისთვის. EVNS-ის სინთეზისთვის გამოყენებული იქნა ორი პარალელური პროცესი: ელექტროშესხურება და წყლის იონიზაცია (სურ. 1ა). ადრე დადასტურდა, რომ EWNS-ს გააჩნია ფიზიკური და ბიოლოგიური თვისებების უნიკალური ნაკრები8,9,10. EWNS-ს საშუალოდ 10 ელექტრონი აქვს თითო სტრუქტურაზე და საშუალოდ 25 ნმ ნანომეტრის ზომა (სურ. 1ბ,გ)8,9,10. გარდა ამისა, ელექტრონული სპინური რეზონანსის (ESR) მიხედვით, EWNS შეიცავს დიდი რაოდენობით რეაქტიული ჟანგბადის სახეობებს (ROS), ძირითადად ჰიდროქსილის (OH•) და სუპეროქსიდის (O2-) რადიკალებს (სურ. 1გ)8. EWNS დიდი ხნის განმავლობაში რჩებოდა ჰაერში და შეეძლო შეჯახებოდა ჰაერში და ზედაპირებზე არსებულ მიკრობებს, გამოეყენებინა მათი ROS დატვირთვა და გამოეწვია მიკრობული ინაქტივაცია (სურ. 1დ). ამ ადრეულმა კვლევებმა ასევე აჩვენა, რომ EWNS-ს შეუძლია ურთიერთქმედება და ინაქტივაცია მოახდინოს საზოგადოებრივი ჯანმრთელობისთვის მნიშვნელობის მქონე სხვადასხვა გრამუარყოფით და გრამდადებით ბაქტერიასთან, მათ შორის მიკობაქტერიებთან, ზედაპირებსა და ჰაერში8,9. ტრანსმისიულ ელექტრონულ მიკროსკოპიამ აჩვენა, რომ ინაქტივაცია გამოწვეული იყო უჯრედის მემბრანის დაზიანებით. გარდა ამისა, მწვავე ინჰალაციის კვლევებმა აჩვენა, რომ EWNS-ის მაღალი დოზები არ იწვევს ფილტვების დაზიანებას ან ანთებას8.
(ა) ელექტროშესხურება ხდება მაშინ, როდესაც მაღალი ძაბვა გამოიყენება სითხის შემცველ კაპილარსა და საპირისპირო ელექტროდს შორის. (ბ) მაღალი ძაბვის გამოყენება იწვევს ორ განსხვავებულ ფენომენს: (i) წყლის ელექტროშესხურებას და (ii) რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების (იონების) წარმოქმნას, რომლებიც ხაფანგში ხვდებიან ელექტრონულ-ელექტროდში. (გ) ელექტრონულ-ელექტროდული სისტემის უნიკალური სტრუქტურა. (დ) ელექტრონულ-ელექტროდული სისტემები ნანომასშტაბიანი ბუნების გამო ძალიან მობილურია და შეუძლიათ ურთიერთქმედება ჰაერწვეთოვან პათოგენებთან.
ასევე ცოტა ხნის წინ დადასტურდა EWNS ანტიმიკრობული პლატფორმის უნარი, ინაქტივირება გაუკეთოს საკვებით გამოწვეულ მიკროორგანიზმებს ახალი საკვების ზედაპირზე. ასევე ნაჩვენებია, რომ EWNS-ის ზედაპირული მუხტის გამოყენება შესაძლებელია ელექტრულ ველთან ერთად მიზნობრივი მიწოდებისთვის. უფრო მნიშვნელოვანია ის, რომ EWNS-ის დაახლოებით 50,000#/სმ311 კონცენტრაციით EWNS-ის ზემოქმედებით 90 წუთის განმავლობაში დაფიქსირდა ორგანული პომიდვრის აქტივობის დაახლოებით 1.4 ლოგარითმით შემცირების პერსპექტიული საწყისი შედეგი, რომელიც დაახლოებით 50,000#/სმ311 კონცენტრაციით შემცირდა, დაფიქსირდა. გარდა ამისა, წინასწარი ორგანოლეპტიკური შეფასების ტესტებმა არ აჩვენა ორგანოლეპტიკური ეფექტი საკონტროლო პომიდორთან შედარებით. მიუხედავად იმისა, რომ ინაქტივაციის ეს საწყისი შედეგები გვპირდება საკვების უსაფრთხოებას EWNS-ის ძალიან დაბალი დოზების, 50,000#/სმ3, გამოყენების შემთხვევაშიც კი, ცხადია, რომ ინაქტივაციის უფრო მაღალი პოტენციალი უფრო სასარგებლო იქნებოდა ინფექციისა და გაფუჭების რისკის შემდგომი შემცირებისთვის.
აქ ჩვენი კვლევა ფოკუსირებული იქნება EWNS გენერაციის პლატფორმის შემუშავებაზე, რათა დახვეწოს სინთეზის პარამეტრები და ოპტიმიზაცია გაუკეთოს EWNS-ის ფიზიკურ-ქიმიურ თვისებებს მათი ანტიბაქტერიული პოტენციალის გასაძლიერებლად. კერძოდ, ოპტიმიზაცია ფოკუსირებულია მათი ზედაპირული მუხტის გაზრდაზე (მიზნობრივი მიწოდების გასაუმჯობესებლად) და ROS შემცველობის გაზრდაზე (ინაქტივაციის ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად). ოპტიმიზებული ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების (ზომა, მუხტი და ROS შემცველობა) დახასიათება თანამედროვე ანალიტიკური მეთოდების გამოყენებით და ისეთი გავრცელებული საკვები მიკროორგანიზმების გამოყენებით, როგორიცაა E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae და M. parafortuitum.
EVNS სინთეზირებული იქნა მაღალი სისუფთავის წყლის (18 MΩ სმ–1) ერთდროული ელექტროშესხურებითა და იონიზაციით. ელექტრო ატომიზატორი 12, როგორც წესი, გამოიყენება სითხეების, სინთეზური პოლიმერის და კერამიკული ნაწილაკების 13 და კონტროლირებადი ზომის ბოჭკოების 14 ატომიზაციისთვის.
როგორც წინა პუბლიკაციებში 8, 9, 10, 11 დეტალურად არის აღწერილი, ტიპურ ექსპერიმენტში, ლითონის კაპილარსა და დამიწებულ საპირისპირო ელექტროდს შორის მაღალი ძაბვა გამოიყენება. ამ პროცესის დროს ორი განსხვავებული ფენომენი ხდება: 1) ელექტროშესხურება და 2) წყლის იონიზაცია. ორ ელექტროდს შორის ძლიერი ელექტრული ველი იწვევს კონდენსირებული წყლის ზედაპირზე უარყოფითი მუხტების დაგროვებას, რაც იწვევს ტეილორის კონუსების წარმოქმნას. შედეგად, წარმოიქმნება მაღალმუხტიანი წყლის წვეთები, რომლებიც რელეის თეორიის თანახმად, აგრძელებენ დაშლას უფრო პატარა ნაწილაკებად16. ამავდროულად, ძლიერი ელექტრული ველი იწვევს წყლის ზოგიერთი მოლეკულის დაშლას და ელექტრონების მოცილებას (იონიზაცია), რითაც წარმოიქმნება დიდი რაოდენობით რეაქტიული ჟანგბადის სახეობები (ROS)17. ერთდროულად წარმოქმნილი ROS18 პაკეტები მოთავსდა EWNS-ში (სურ. 1გ).
ნახ. 2ა-ზე ნაჩვენებია EWNS გენერაციის სისტემა, რომელიც შემუშავებულია და გამოიყენება ამ კვლევაში EWNS სინთეზში. დახურულ ბოთლში შენახული გასუფთავებული წყალი მიეწოდებოდა ტეფლონის მილის (2 მმ შიდა დიამეტრი) მეშვეობით 30G უჟანგავი ფოლადის ნემსს (ლითონის კაპილარი). როგორც ნაჩვენებია ნახ. 2ბ-ზე, წყლის ნაკადი კონტროლდება ბოთლში ჰაერის წნევით. ნემსი მიმაგრებულია ტეფლონის კონსოლზე, რომლის ხელით რეგულირება შესაძლებელია საპირისპირო ელექტროდიდან გარკვეულ მანძილზე. საპირისპირო ელექტროდი არის გაპრიალებული ალუმინის დისკი შუაში ნახვრეტით ნიმუშების ასაღებად. საპირისპირო ელექტროდის ქვემოთ არის ალუმინის ნიმუშის ძაბრი, რომელიც დაკავშირებულია ექსპერიმენტული სისტემის დანარჩენ ნაწილთან ნიმუშის პორტის საშუალებით (ნახ. 2ბ). ნიმუშის აღების ყველა კომპონენტი ელექტრონულად არის დამიწებული, რათა თავიდან იქნას აცილებული მუხტის დაგროვება, რამაც შეიძლება დააზიანოს ნაწილაკების ნიმუშის აღება.
(ა) წყლის ნანოსტრუქტურის გენერირების ინჟინერიული სისტემა (EWNS). (ბ) სინჯის ამღების და ელექტროშესხურების ერთეულის განივი კვეთი, რომელიც აჩვენებს ყველაზე მნიშვნელოვან პარამეტრებს. (გ) ბაქტერიების ინაქტივაციის ექსპერიმენტული მოწყობა.
ზემოთ აღწერილი EWNS გენერაციის სისტემას შეუძლია შეცვალოს ძირითადი ოპერაციული პარამეტრები EWNS თვისებების ზუსტი რეგულირების გასაადვილებლად. EWNS მახასიათებლების ზუსტი რეგულირებისთვის დაარეგულირეთ გამოყენებული ძაბვა (V), ნემსსა და საპირისპირო ელექტროდს შორის მანძილი (L) და კაპილარში წყლის ნაკადი (φ). სიმბოლოები [V (kV), L (სმ)] გამოიყენება სხვადასხვა კომბინაციების აღსანიშნავად. დაარეგულირეთ წყლის ნაკადი გარკვეული ნაკრების სტაბილური ტეილორის კონუსის მისაღებად [V, L]. ამ კვლევის მიზნებისთვის, საპირისპირო ელექტროდის (D) აპერტურა დაყენებული იყო 0.5 ინჩზე (1.29 სმ).
შეზღუდული გეომეტრიისა და ასიმეტრიის გამო, ელექტრული ველის სიძლიერის გამოთვლა პირველი პრინციპებიდან შეუძლებელია. ამის ნაცვლად, ელექტრული ველის გამოსათვლელად გამოყენებული იქნა QuickField™ პროგრამული უზრუნველყოფა (სვენდბორგი, დანია)19. ელექტრული ველი ერთგვაროვანი არ არის, ამიტომ კაპილარის წვერზე ელექტრული ველის მნიშვნელობა სხვადასხვა კონფიგურაციისთვის საცნობარო მნიშვნელობად იქნა გამოყენებული.
კვლევის დროს შეფასდა ნემსსა და საპირისპირო ელექტროდს შორის ძაბვისა და მანძილის რამდენიმე კომბინაცია ტეილორის კონუსის ფორმირების, ტეილორის კონუსის სტაბილურობის, EWNS წარმოების სტაბილურობისა და რეპროდუცირებადობის თვალსაზრისით. სხვადასხვა კომბინაციები ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში S1.
EWNS გენერირების სისტემის გამომავალი სიგნალი პირდაპირ იყო დაკავშირებული სკანირების მობილობის ნაწილაკების ზომის მოწყობილობასთან (SMPS, მოდელი 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) ნაწილაკების რაოდენობის კონცენტრაციის გასაზომად და გამოყენებული იყო ფარადეის აეროზოლის ელექტრომეტრთან (TSI, მოდელი 3068B, Shoreview, USA). MN) აეროზოლის ნაკადების გასაზომად, როგორც ეს აღწერილია ჩვენს წინა პუბლიკაციაში9. როგორც SMPS-დან, ასევე აეროზოლის ელექტრომეტრიდან აღებული ნიმუშები 0.5 ლ/წთ ნაკადის სიჩქარით (ნიმუშის საერთო ნაკადი 1 ლ/წთ). ნაწილაკების კონცენტრაციები და აეროზოლის ნაკადები გაიზომა 120 წამის განმავლობაში. გაიმეორეთ გაზომვა 30-ჯერ. აეროზოლის მთლიანი მუხტი გამოითვლება მიმდინარე გაზომვებიდან, ხოლო EWNS-ის საშუალო მუხტი შეფასებულია EWNS-ის ნიმუშის აღებული ნაწილაკების მთლიანი რაოდენობიდან. EWNS-ის საშუალო ღირებულება შეიძლება გამოითვალოს განტოლების (1) გამოყენებით:
სადაც IEl არის გაზომილი დენი, NSMPS არის SMPS-ით გაზომილი რიცხვითი კონცენტრაცია, ხოლო φEl არის ელექტრომეტრამდე ნაკადის სიჩქარე.
რადგან ფარდობითი ტენიანობა (RH) გავლენას ახდენს ზედაპირის მუხტზე, ექსპერიმენტის დროს ტემპერატურა და (RH) მუდმივი იყო, შესაბამისად, 21°C და 45%-ზე.
EWNS-ის ზომისა და სიცოცხლის ხანგრძლივობის გასაზომად გამოყენებული იქნა ატომური ძალის მიკროსკოპია (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, სანტა ბარბარა, კალიფორნია) და AC260T ზონდი (Olympus, ტოკიო, იაპონია). AFM სკანირების სიხშირეა 1 ჰც, ხოლო სკანირების არეალი 5 µm×5 µm 256 სკანირების ხაზით. ყველა სურათი დაექვემდებარა პირველი რიგის გამოსახულების გასწორებას Asylum-ის პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (ნიღაბი 100 ნმ დიაპაზონით და 100 pm ზღურბლით).
ამოიღეთ სინჯის აღების ძაბრი და მოათავსეთ ქარსის ზედაპირი საპირისპირო ელექტროდიდან 2.0 სმ დაშორებით საშუალოდ 120 წამის განმავლობაში, რათა თავიდან აიცილოთ ნაწილაკების შერწყმა და ქარსის ზედაპირზე არარეგულარული წვეთების წარმოქმნა. EWNS პირდაპირ დაიტანეს ახლად მოჭრილ ქარსის ზედაპირებზე (ტედ პელა, რედინგი, კალიფორნია). გაფრქვევისთანავე, ქარსის ზედაპირი ვიზუალიზებული იქნა AFM-ის გამოყენებით. ახლად მოჭრილი, არამოდიფიცირებული ქარსის ზედაპირის კონტაქტის კუთხე ახლოსაა 0°-თან, ამიტომ EWNS ქარსის ზედაპირზე გუმბათოვანი ფორმით ვრცელდება20. დიფუზიური წვეთების დიამეტრი (a) და სიმაღლე (h) გაიზომა უშუალოდ AFM ტოპოგრაფიიდან და გამოყენებული იქნა EWNS-ის გუმბათოვანი დიფუზიური მოცულობის გამოსათვლელად ჩვენი ადრე დადასტურებული მეთოდის8 გამოყენებით. იმის გათვალისწინებით, რომ ჩაშენებულ EVNS-ს აქვს იგივე მოცულობა, ეკვივალენტური დიამეტრის გამოთვლა შესაძლებელია განტოლებიდან (2):
ჩვენს მიერ ადრე შემუშავებული მეთოდის შესაბამისად, EWNS-ში ხანმოკლე სიცოცხლის ხანგრძლივობის რადიკალური შუალედური პროდუქტების არსებობის დასადგენად გამოყენებული იქნა ელექტრონული სპინური რეზონანსის (ESR) სპინური ხაფანგი. აეროზოლები გატარდა 235 mM DEPMPO-ს (5-(დიეთოქსიფოსფორილ)-5-მეთილ-1-პიროლინ-N-ოქსიდი) შემცველ ხსნარში (Oxis International Inc., პორტლენდი, ორეგონი). ყველა EPR გაზომვა ჩატარდა Bruker EMX სპექტრომეტრის (Bruker Instruments Inc. Billerica, მასაჩუსეტსი, აშშ) და ბრტყელი უჯრედების მასივების გამოყენებით. მონაცემების შეგროვებისა და ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა Acquisit პროგრამული უზრუნველყოფა (Bruker Instruments Inc. Billerica, მასაჩუსეტსი, აშშ). ROS დახასიათება ჩატარდა მხოლოდ ოპერაციული პირობების ნაკრებისთვის [-6.5 კვ, 4.0 სმ]. EWNS კონცენტრაციები გაიზომა SMPS-ის გამოყენებით, იმპაქტორში EWNS-ის დაკარგვის გათვალისწინებით.
ოზონის დონის მონიტორინგი განხორციელდა 205 Dual Beam Ozone Monitor™-ის (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10 გამოყენებით.
ყველა EWNS თვისებისთვის, გაზომვის მნიშვნელობა არის გაზომვების საშუალო, ხოლო გაზომვის შეცდომა არის სტანდარტული გადახრა. ოპტიმიზებული EWNS ატრიბუტის მნიშვნელობის საბაზო EWNS-ის შესაბამის მნიშვნელობასთან შესადარებლად ჩატარდა t-ტესტი.
სურათი 2c გვიჩვენებს ადრე შემუშავებულ და დახასიათებულ ელექტროსტატიკური ნალექის გავლის სისტემას (EPES), რომლის გამოყენებაც შესაძლებელია EWNS11-ის ზედაპირებზე დასამიზნებლად. EPES იყენებს EWNS მუხტს ძლიერ ელექტრულ ველთან კომბინაციაში, რათა პირდაპირ „მიმართოს“ სამიზნის ზედაპირზე. EPES სისტემის დეტალები წარმოდგენილია პირიოტაკისის და სხვების მიერ გამოქვეყნებულ ბოლო პუბლიკაციაში. ამრიგად, EPES შედგება 3D პრინტერით დაბეჭდილი PVC კამერისგან კონუსური ბოლოებით, რომელიც შეიცავს ორ პარალელურ უჟანგავი ფოლადის (304 უჟანგავი ფოლადი, სარკისებურად გაპრიალებული) ლითონის ფირფიტას შუაში, ერთმანეთისგან 15.24 სმ დაშორებით. დაფები დაკავშირებული იყო გარე მაღალი ძაბვის წყაროსთან (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), ქვედა დაფა ყოველთვის დადებითი იყო, ხოლო ზედა დაფა ყოველთვის დამიწებული (მცურავი). კამერის კედლები დაფარულია ალუმინის ფოლგით, რომელიც ელექტრონულად არის დამიწებული ნაწილაკების დაკარგვის თავიდან ასაცილებლად. კამერას აქვს დალუქული წინა ჩატვირთვის კარი, რომელიც საშუალებას იძლევა სატესტო ზედაპირები განთავსდეს პლასტმასის თაროებზე, მათი აწევით ქვედა ლითონის ფირფიტიდან, რათა თავიდან იქნას აცილებული მაღალი ძაბვის ჩარევა.
EWNS-ის დეპონირების ეფექტურობა EPES-ში გამოითვალა დამატებით ნახაზ S111-ში დეტალურად აღწერილი ადრე შემუშავებული პროტოკოლის მიხედვით.
საკონტროლო კამერის სახით, ცილინდრული კამერის გავლით მეორე ნაკადი მიმდევრობით უკავშირდება EPES სისტემას შუალედური HEPA ფილტრის გამოყენებით EWNS-ის მოსაშორებლად. როგორც ნაჩვენებია ნახ. 2გ-ზე, EWNS აეროზოლი იტუმბებოდა მიმდევრობით დაკავშირებულ ორ კამერაში. საკონტროლო ოთახსა და EPES-ს შორის არსებული ფილტრი აშორებს დარჩენილ EWNS-ს, რის შედეგადაც ტემპერატურა (T), ფარდობითი ტენიანობა (RH) და ოზონის დონე იგივეა.
ახალი პროდუქტების დაბინძურება შესაძლებელია საკვებით გამოწვეული მნიშვნელოვანი მიკროორგანიზმებით, როგორიცაა Escherichia coli (ATCC #27325), ფეკალური ინდიკატორი, Salmonella enterica (ATCC #53647), საკვებით გამოწვეული პათოგენი, Listeria innocua (ATCC #33090), პათოგენური Listeria monocytogenes-ის ალტერნატივა, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), როგორც გაფუჭების საფუარის ალტერნატივა, და Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686), როგორც უფრო მდგრადი ცოცხალი ბაქტერია, რომლებიც შეძენილია ATCC-სგან (მანასასი, ვირჯინია).
შემთხვევითობის პრინციპით შეიძინეთ ორგანული ყურძნის პომიდვრის ყუთები თქვენს ადგილობრივ ბაზარზე და გამოყენებამდე შეინახეთ მაცივარში 4°C ტემპერატურაზე (3 დღემდე). აირჩიეთ პომიდორი და ექსპერიმენტი ჩაატარეთ ერთი ზომის, დაახლოებით 1/2 ინჩი დიამეტრის პომიდვრებით.
ინკუბაციის, ინოკულაციის, ექსპოზიციისა და კოლონიების დათვლის პროტოკოლები დეტალურად არის აღწერილი ჩვენს წინა პუბლიკაციებში და დეტალურად არის ახსნილი დამატებით მონაცემებში 11. EWNS-ის მუშაობა შეფასდა ინოკულირებული პომიდვრის 40,000 #/სმ3-ზე 45 წუთის განმავლობაში ზემოქმედებით. მოკლედ, t = 0 წთ დროში, გადარჩენილი მიკროორგანიზმების შესაფასებლად გამოყენებული იქნა სამი პომიდორი. სამი პომიდორი მოათავსეს EPES-ში და დაექვემდებარა EWNS-ს 40,000 #/cc (EWNS-ის ზემოქმედების ქვეშ მყოფი პომიდვრები), ხოლო სამი სხვა მოათავსეს საკონტროლო კამერაში (საკონტროლო პომიდვრები). პომიდვრის არცერთი ჯგუფი არ დაექვემდებარა დამატებით დამუშავებას. EWNS-ის ზემოქმედების შესაფასებლად EWNS-ის ზემოქმედების ქვეშ მყოფი პომიდვრები და საკონტროლო ჯგუფები ამოიღეს 45 წუთის შემდეგ.
თითოეული ექსპერიმენტი სამ ეგზემპლარად ჩატარდა. მონაცემთა ანალიზი ჩატარდა დამატებით მონაცემებში აღწერილი პროტოკოლის მიხედვით.
E. coli, Enterobacter და L. innocua ბაქტერიული ნიმუშები, რომლებიც ექსპოზიციის გარეშე იყვნენ დამუშავებული EWNS-ის (45 წთ, EWNS აეროზოლის კონცენტრაცია 40,000 #/სმ3) ზემოქმედების ქვეშ, ინაქტივაციის მექანიზმების შესაფასებლად დაქუცმაცდნენ. ნალექი ფიქსირდებოდა 2 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე 0.1 M ნატრიუმის კაკოდილატის ხსნარში (pH 7.4) 2.5% გლუტარალდეჰიდის, 1.25% პარაფორმალდეჰიდის და 0.03% პიკრინის მჟავას ფიქსატორით. გარეცხვის შემდეგ, ისინი ფიქსირდებოდა 1% ოსმიუმის ტეტროქსიდით (OsO4)/1.5% კალიუმის ფეროციანიდით (KFeCN6) 2 საათის განმავლობაში, 3-ჯერ ირეცხებოდა წყლით და ინკუბირებული იყო 1% ურანილის აცეტატში 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ ორჯერ ირეცხებოდა წყლით. შემდგომი დეჰიდრატაცია 10 წუთის განმავლობაში 50%, 70%, 90%, 100% სპირტით. შემდეგ ნიმუშები 1 საათის განმავლობაში მოათავსეს პროპილენოქსიდში და გაჟღენთეს პროპილენოქსიდისა და TAAP Epon-ის (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) 1:1 ნარევით. ნიმუშები ჩასვეს TAAB Epon-ში და პოლიმერიზდნენ 60°C-ზე 48 საათის განმავლობაში. გამაგრებული გრანულირებული ფისი დაიჭრა და ვიზუალიზაცია მოახდინეს TEM-ის გამოყენებით JEOL 1200EX (JEOL, ტოკიო, იაპონია), რომელიც წარმოადგენს AMT 2k CCD კამერით აღჭურვილ ტრადიციულ გამტარ ელექტრონულ მიკროსკოპიას (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, აშშ).
ყველა ექსპერიმენტი სამჯერ ჩატარდა. თითოეული დროის წერტილისთვის ბაქტერიული გამორეცხვები სამჯერ განთავსდა, რის შედეგადაც თითოეულ წერტილში სულ ცხრა მონაცემი იქნა მიღებული, რომელთა საშუალო მაჩვენებელი გამოყენებული იქნა კონკრეტული ორგანიზმის ბაქტერიული კონცენტრაციის მაჩვენებლად. სტანდარტული გადახრა გამოყენებული იქნა გაზომვის შეცდომად. ყველა ქულა ითვლება.
ბაქტერიების კონცენტრაციის შემცირების ლოგარითმი t = 0 წთ-თან შედარებით გამოითვალა შემდეგი ფორმულის გამოყენებით:
სადაც C0 არის ბაქტერიების კონცენტრაცია საკონტროლო ნიმუშში 0 დროს (ანუ ზედაპირის გაშრობის შემდეგ, მაგრამ კამერაში მოთავსებამდე) და Cn არის ბაქტერიების კონცენტრაცია ზედაპირზე n წუთიანი ზემოქმედების შემდეგ.
45-წუთიანი ექსპოზიციის პერიოდში ბაქტერიების ბუნებრივი დეგრადაციის გათვალისწინებით, ლოგ-რედუქცია ასევე გამოითვალა კონტროლთან შედარებით 45 წუთში შემდეგნაირად:
სადაც Cn არის ბაქტერიების კონცენტრაცია საკონტროლო ნიმუშში n დროს, ხოლო Cn-კონტროლი არის საკონტროლო ბაქტერიების კონცენტრაცია n დროს. მონაცემები წარმოდგენილია ლოგარითმული შემცირებით საკონტროლო ნიმუშთან შედარებით (EWNS ზემოქმედების გარეშე).
კვლევის დროს შეფასდა ნემსსა და საპირისპირო ელექტროდს შორის ძაბვისა და მანძილის რამდენიმე კომბინაცია ტეილორის კონუსის ფორმირების, ტეილორის კონუსის სტაბილურობის, EWNS წარმოების სტაბილურობისა და რეპროდუცირებადობის თვალსაზრისით. სხვადასხვა კომბინაცია ნაჩვენებია დამატებით ცხრილ S1-ში. სრული კვლევისთვის შეირჩა ორი შემთხვევა, რომელიც აჩვენებს სტაბილურ და რეპროდუცირებად თვისებებს (ტეილორის კონუსი, EWNS წარმოება და სტაბილურობა დროთა განმავლობაში). ნახ. 3-ზე ნაჩვენებია ROS-ის მუხტის, ზომისა და შემცველობის შედეგები ორი შემთხვევისთვის. შედეგები ასევე შეჯამებულია ცხრილ 1-ში. მითითებისთვის, ნახაზი 3 და ცხრილი 1 მოიცავს ადრე სინთეზირებული არაოპტიმიზებული EWNS8, 9, 10, 11 (საბაზისო EWNS) თვისებებს. ორმხრივი t-ტესტის გამოყენებით სტატისტიკური მნიშვნელობის გამოთვლები ხელახლა გამოქვეყნებულია დამატებით ცხრილ S2-ში. გარდა ამისა, დამატებითი მონაცემები მოიცავს კვლევებს საპირისპირო ელექტროდის ნიმუშის აღების ხვრელის დიამეტრის (D) და დამიწების ელექტროდსა და ნემსის წვერს შორის მანძილის (L) გავლენის შესახებ (დამატებითი ნახაზი S2 და S3).
(a–c) AFM ზომის განაწილება. (d – f) ზედაპირული მუხტის მახასიათებელი. (g) ROS-ისა და ESR-ის დახასიათება.
ასევე მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ ყველა ზემოთ ჩამოთვლილი პირობისთვის, გაზომილი იონიზაციის დენები იყო 2-6 µA დიაპაზონში, ხოლო ძაბვები - -3.8-დან -6.5 კვ-მდე დიაპაზონში, რაც ამ ერთტერმინალური EWNS გენერაციის მოდულის ენერგომოხმარებას 50 მვტ-ზე ნაკლებს იწვევდა. მიუხედავად იმისა, რომ EWNS სინთეზირებული იყო მაღალი წნევის ქვეშ, ოზონის დონე ძალიან დაბალი იყო და არასდროს აღემატებოდა 60 ppb-ს.
დამატებითი სურათი S4 გვიჩვენებს სიმულირებულ ელექტრულ ველებს [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენარებისთვის, შესაბამისად. სცენარების [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ] მიხედვით ველები გამოითვლება, შესაბამისად, 2 × 105 ვ/მ და 4.7 × 105 ვ/მ. ეს მოსალოდნელია, რადგან მეორე შემთხვევაში ძაბვისა და მანძილის თანაფარდობა გაცილებით მაღალია.
ნახ. 3a,b-ზე ნაჩვენებია AFM8-ით გაზომილი EWNS დიამეტრი. [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენარებისთვის EWNS-ის საშუალო დიამეტრები გამოითვალა, შესაბამისად, 27 ნმ და 19 ნმ-ის ტოლი. [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ] შემთხვევების განაწილების გეომეტრიული სტანდარტული გადახრები შესაბამისად 1.41 და 1.45-ია, რაც მიუთითებს ზომის ვიწრო განაწილებაზე. როგორც საშუალო ზომა, ასევე გეომეტრიული სტანდარტული გადახრა ძალიან ახლოსაა საბაზისო EWNS-თან და შეადგენს შესაბამისად 25 ნმ-ს და 1.41-ს. ნახ. 3c-ზე ნაჩვენებია საბაზისო EWNS-ის ზომის განაწილება, რომელიც გაზომილია იმავე მეთოდით იმავე პირობებში.
ნახ. 3d,e-ზე ნაჩვენებია მუხტის დახასიათების შედეგები. მონაცემები წარმოადგენს კონცენტრაციის (#/სმ3) და დენის (I) 30 ერთდროული გაზომვის საშუალო გაზომვებს. ანალიზი აჩვენებს, რომ EWNS-ზე საშუალო მუხტი შესაბამისად 22 ± 6 e- და 44 ± 6 e-ა [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ]-სთვის. საბაზისო EWNS-თან (10 ± 2 e-) შედარებით, მათი ზედაპირული მუხტი მნიშვნელოვნად მაღალია, ორჯერ მეტი ვიდრე [-6.5 კვ, 4.0 სმ] სცენარში და ოთხჯერ მეტი ვიდრე [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენარში. 3f გვიჩვენებს EWNS-ის გადახდის ძირითად მონაცემებს.
EWNS-ის რაოდენობის კონცენტრაციის რუკებიდან (დამატებითი სურათები S5 და S6) ჩანს, რომ [-6.5 კვ, 4.0 სმ] სცენაზე ნაწილაკების მნიშვნელოვნად მეტი რაოდენობაა, ვიდრე [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენაზე. ასევე უნდა აღინიშნოს, რომ EWNS-ის რაოდენობის კონცენტრაციები მონიტორინგი 4 საათამდე გრძელდებოდა (დამატებითი სურათები S5 და S6), სადაც EWNS-ის გენერაციის სტაბილურობამ ორივე შემთხვევაში ნაწილაკების რაოდენობის კონცენტრაციის იგივე დონე აჩვენა.
სურათი 3g გვიჩვენებს EPR სპექტრს კონტროლის (ფონის) გამოკლების შემდეგ ოპტიმიზებული EWNS-ისთვის [-6.5 კვ, 4.0 სმ]. ROS სპექტრი ასევე შედარებულია EWNS საბაზისო ხაზთან ადრე გამოქვეყნებულ ნაშრომში. სპინ-ხაფანგთან რეაქციის მქონე EWNS-ების გამოთვლილი რაოდენობაა 7.5 × 104 EWNS/წმ, რაც მსგავსია ადრე გამოქვეყნებული საბაზისო-EWNS8-ის. EPR სპექტრები ნათლად მიუთითებდნენ ROS-ის ორი ტიპის არსებობაზე, სადაც O2- ჭარბობდა, ხოლო OH• უფრო მცირე რაოდენობით იყო წარმოდგენილი. გარდა ამისა, პიკური ინტენსივობების პირდაპირმა შედარებამ აჩვენა, რომ ოპტიმიზებულ EWNS-ს ჰქონდა მნიშვნელოვნად მაღალი ROS შემცველობა საბაზისო EWNS-თან შედარებით.
ნახ. 4-ზე ნაჩვენებია EWNS-ის დეპონირების ეფექტურობა EPES-ში. მონაცემები ასევე შეჯამებულია ცხრილში I და შედარებულია EWNS-ის ორიგინალურ მონაცემებთან. ორივე EUNS შემთხვევაში, დეპონირება თითქმის 100%-იანი იყო 3.0 კვ დაბალი ძაბვის დროსაც კი. როგორც წესი, 3.0 კვ საკმარისია 100%-იანი დეპონირების მისაღწევად ზედაპირის მუხტის ცვლილების მიუხედავად. იმავე პირობებში, Baseline-EWNS-ის დეპონირების ეფექტურობა მხოლოდ 56% იყო დაბალი მუხტის გამო (საშუალოდ 10 ელექტრონი თითო EWNS-ზე).
სურათი 5 და ცხრილი 2 აჯამებენ პომიდვრის ზედაპირზე ინოკულირებული მიკროორგანიზმების ინაქტივაციის ხარისხს დაახლოებით 40,000 #/სმ3 EWNS-ის 45 წუთის განმავლობაში ზემოქმედების შემდეგ ოპტიმალური სცენარის [-6.5 კვ, 4.0 სმ] პირობებში. ინოკულირებულმა E. coli-მ და L. innocua-მ 45 წუთიანი ზემოქმედების შემდეგ 3.8 ლოგარითმული ვარდნა აჩვენეს. იმავე პირობებში, S. enterica-მ 2.2 ლოგარითმული ვარდნა უფრო დაბალი, 2.2 ლოგარითმული ვარდნა აჩვენა, ხოლო S. cerevisiae-მ და M. parafortuitum-მა 1.0 ლოგარითმული ვარდნა.
ელექტრონული მიკროგრაფიები (სურათი 6), რომლებიც ასახავს EWNS-ის მიერ E. coli-ს, Salmonella enterica-ს და L. innocua-ს უჯრედებში ინაქტივაციის გამომწვევ ფიზიკურ ცვლილებებს. საკონტროლო ბაქტერიებს აჩვენეს უჯრედის მემბრანების ხელუხლებელი ხილვა, ხოლო ექსპოზიციის ქვეშ მყოფ ბაქტერიებს დაზიანებული ჰქონდათ გარეთა მემბრანები.
საკონტროლო და ექსპონირებული ბაქტერიების ელექტრონულ-მიკროსკოპიულმა გამოსახულებამ მემბრანის დაზიანება გამოავლინა.
ოპტიმიზებული EWNS-ის ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების შესახებ მონაცემები ერთობლივად აჩვენებს, რომ EWNS-ის თვისებები (ზედაპირული მუხტი და ROS შემცველობა) მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდა EWNS-ის ადრე გამოქვეყნებულ საბაზისო მონაცემებთან შედარებით8,9,10,11. მეორეს მხრივ, მათი ზომა ნანომეტრის დიაპაზონში დარჩა, რაც ძალიან ჰგავს ადრე გამოქვეყნებულ შედეგებს, რაც მათ საშუალებას აძლევს, ჰაერში დიდი ხნის განმავლობაში დარჩნენ. დაკვირვებული პოლიდისპერსიულობა შეიძლება აიხსნას ზედაპირული მუხტის ცვლილებებით, რომლებიც განსაზღვრავენ რელეის ეფექტის სიდიდეს, შემთხვევითობას და EWNS-ის პოტენციურ შერწყმას. თუმცა, როგორც ნილსენი და სხვები აღწერენ22, მაღალი ზედაპირული მუხტი ამცირებს აორთქლებას წყლის წვეთის ზედაპირული ენერგიის/დაჭიმულობის ეფექტურად გაზრდით. ეს თეორია ექსპერიმენტულად დადასტურდა მიკროწვეთებისთვის22 და EWNS-ისთვის ჩვენს წინა პუბლიკაციაში8. დროთა განმავლობაში დანაკარგმა ასევე შეიძლება გავლენა მოახდინოს ზომაზე და წვლილი შეიტანოს დაკვირვებული ზომის განაწილებაში.
გარდა ამისა, სტრუქტურის მუხტი, გარემოებებიდან გამომდინარე, დაახლოებით 22–44 e--ია, რაც მნიშვნელოვნად მაღალია ძირითად EWNS-თან შედარებით, რომელსაც სტრუქტურაზე საშუალოდ 10 ± 2 ელექტრონი აქვს. თუმცა, უნდა აღინიშნოს, რომ ეს არის EWNS-ის საშუალო მუხტი. სეტო და სხვ. ნაჩვენებია, რომ მუხტი არ არის ერთგვაროვანი და მიჰყვება ლოგ-ნორმალურ განაწილებას21. ჩვენს წინა ნაშრომთან შედარებით, ზედაპირული მუხტის გაორმაგება EPES სისტემაში დეპონირების ეფექტურობას თითქმის 100%-მდე11 აორმაგებს.