გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
ფოროვანი სილიციუმის ნაწილაკები მომზადდა სოლ-გელის მეთოდით, გარკვეული მოდიფიკაციებით, მაკროფოროვანი ნაწილაკების მისაღებად. ეს ნაწილაკები წარმოებული იქნა შექცევადი დამატებით-ფრაგმენტაციის ჯაჭვის გადაცემის (RAFT) პოლიმერიზაციით N-ფენილმალეიმიდ-მეთილვინილიზოციანატით (PMI) და სტიროლით, პოლისტიროლის (PMP) სტაციონარული ფაზის N-ფენილმალეიმიდის ინტერკალაციის მოსამზადებლად. ვიწრო კალიბრის უჟანგავი ფოლადის სვეტები (100 × 1.8 მმ იდგ.) შეფუთული იქნა სუსპენზიის შეფუთვით. შეფასდა ხუთი პეპტიდისგან (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ლეიცინის ენკეფალინი) შემდგარი პეპტიდური ნარევის PMP სვეტის გამოყოფა (ქრომატოგრაფიული შესრულება) და ადამიანის შრატის ალბუმინის (HAS) ტრიფსინით მონელება. ოპტიმალური ელუირების პირობებში, პეპტიდური ნარევის თეორიული ფირფიტების რაოდენობა 280,000 ფირფიტას/მ²-ს აღწევს. შემუშავებული სვეტის გამოყოფის შესრულების შედარება კომერციულ Ascentis-თან. Express RP-ამიდის სვეტში დაფიქსირდა, რომ PMP სვეტის გამოყოფის ეფექტურობა გამოყოფის ეფექტურობისა და გარჩევადობის თვალსაზრისით აღემატებოდა კომერციულ სვეტს.
ბოლო წლებში ბიოფარმაცევტული ინდუსტრია გლობალურ ბაზარზე გადაიზარდა, სადაც ბაზრის წილი მნიშვნელოვნად გაიზარდა. ბიოფარმაცევტული ინდუსტრიის სწრაფი ზრდის გამო1,2,3, პეპტიდებისა და ცილების ანალიზი ძალიან სასურველია. სამიზნე პეპტიდის გარდა, პეპტიდების სინთეზის დროს რამდენიმე მინარევი წარმოიქმნება, რაც სასურველი სისუფთავის პეპტიდების მისაღებად ქრომატოგრაფიულ გაწმენდას მოითხოვს. სხეულის სითხეებში, ქსოვილებსა და უჯრედებში ცილების ანალიზი და დახასიათება უკიდურესად რთული ამოცანაა ერთ ნიმუშში პოტენციურად აღმოსაჩენი სახეობების დიდი რაოდენობის გამო. მიუხედავად იმისა, რომ მას-სპექტრომეტრია პეპტიდებისა და ცილების სეკვენირების ეფექტური ინსტრუმენტია, თუ ასეთი ნიმუშები მას-სპექტრომეტრში ერთი გავლის შემდეგ შეჰყავთ, გამოყოფა იდეალური არ იქნება. ეს პრობლემა შეიძლება შემსუბუქდეს MS ანალიზამდე თხევადი ქრომატოგრაფიის (LC) გამოყოფის განხორციელებით, რაც შეამცირებს მას-სპექტრომეტრში მოცემულ დროს შემავალი ანალიზების რაოდენობას4,5,6. გარდა ამისა, თხევადი ფაზის გამოყოფის დროს, ანალიზები შეიძლება ფოკუსირებული იყოს ვიწრო რეგიონებში, რითაც კონცენტრირდება ეს ანალიზები და გაუმჯობესდება MS აღმოჩენის მგრძნობელობა. თხევადი ქრომატოგრაფია (LC) მნიშვნელოვნად განვითარდა. ბოლო ათწლეულის განმავლობაში და პროტეომიკურ ანალიზში პოპულარული ტექნიკა გახდა7,8,9,10.
შებრუნებული ფაზის თხევადი ქრომატოგრაფია (RP-LC) ფართოდ გამოიყენება პეპტიდური ნარევების გასაწმენდად და გამოყოფისთვის, ოქტადეცილ-მოდიფიცირებული სილიციუმის (ODS) გამოყენებით, როგორც სტაციონარული ფაზა11,12,13. თუმცა, RP სტაციონარული ფაზები არ უზრუნველყოფენ პეპტიდებისა და ცილების დამაკმაყოფილებელ გამოყოფას მათი რთული სტრუქტურისა და ამფიფილური ბუნების გამო14,15. ამიტომ, სპეციალურად შექმნილი სტაციონარული ფაზებია საჭირო პოლარული და არაპოლარული ფრაგმენტების მქონე პეპტიდებისა და ცილების გასაანალიზებლად, რათა ურთიერთქმედება მოახდინონ ამ ანალიზებთან და შეინარჩუნონ ისინი16. შერეული რეჟიმის ქრომატოგრაფია, რომელიც უზრუნველყოფს მულტიმოდალურ ურთიერთქმედებებს, შეიძლება იყოს RP-LC-ის ალტერნატივა პეპტიდების, ცილების და სხვა რთული ნარევების გამოყოფისთვის. მომზადდა რამდენიმე შერეული რეჟიმის სტაციონარული ფაზა და ამ ფაზებით შევსებული სვეტები გამოყენებული იქნა პეპტიდებისა და ცილების გამოყოფისთვის17,18,19,20,21. შერეული რეჟიმის სტაციონარული ფაზები (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, პოლარული ინტერკალაცია/RPLC) შესაფერისია პეპტიდებისა და ცილების გამოყოფისთვის, როგორც პოლარული, ასევე არაპოლარული ნაერთების არსებობის გამო. ჯგუფები22,23,24,25,26,27,28. ანალოგიურად, პოლარული ინტერკალაციური სტაციონარული ფაზები კოვალენტურად შეკავშირებული პოლარული ჯგუფებით ავლენენ კარგ გამოყოფის უნარს და უნიკალურ სელექციურობას პოლარული და არაპოლარული ანალიზებისთვის, რადგან გამოყოფა დამოკიდებულია ანალიზსა და სტაციონარულ ფაზას შორის ურთიერთქმედებაზე. მულტიმოდალური ურთიერთქმედებები29, 30, 31, 32. ცოტა ხნის წინ, ჟანგმა და სხვებმა30 მოამზადეს დოდეცილ-ტერმინირებული პოლიამინის სტაციონარული ფაზა და წარმატებით გამოყვეს ნახშირწყალბადები, ანტიდეპრესანტები, ფლავონოიდები, ნუკლეოზიდები, ესტროგენები და რამდენიმე სხვა ანალიზები. პოლარულ ინტერკალატორს აქვს როგორც პოლარული, ასევე არაპოლარული ჯგუფები, ამიტომ მისი გამოყენება შესაძლებელია პეპტიდების და ცილების გამოსაყოფად, რომლებსაც აქვთ როგორც ჰიდროფობიური, ასევე ჰიდროფილური ფრაგმენტები. პოლარულად ჩაშენებული სვეტები (მაგ., ამიდით ჩაშენებული C18 სვეტები) კომერციულად ხელმისაწვდომია სავაჭრო სახელწოდებით Ascentis Express RP-ამიდის სვეტები, მაგრამ ეს სვეტები გამოიყენება მხოლოდ ამინ 33-ის ანალიზისთვის.
მიმდინარე კვლევაში მომზადდა და შეფასდა პოლარულად ჩაშენებული სტაციონარული ფაზა (N-ფენილმალეიმიდში ჩაშენებული პოლისტიროლი) HSA-ს პეპტიდებისა და ტრიფსინის დიჯესტების გამოყოფისთვის. სტაციონარული ფაზა მომზადდა შემდეგი სტრატეგიის გამოყენებით. ფოროვანი სილიციუმის ნაწილაკები მომზადდა ჩვენს წინა პუბლიკაციაში მოცემული პროცედურის მიხედვით, მომზადების პროტოკოლში გარკვეული ცვლილებებით. შარდოვანას, პოლიეთილენგლიკოლის (PEG), TMOS-ის, წყლისა და ძმარმჟავას თანაფარდობა დარეგულირებული იქნა დიდი ფორების ზომის სილიციუმის ნაწილაკების მოსამზადებლად. მეორეც, სინთეზირებული იქნა ახალი ლიგანდი, ფენილმალეიმიდ-მეთილ ვინილ იზოციანატი, და გამოყენებული იქნა სილიციუმის ნაწილაკების წარმოებულად პოლარულად ჩაშენებული სტაციონარული ფაზის მოსამზადებლად. შედეგად მიღებული სტაციონარული ფაზა შეფუთული იქნა უჟანგავი ფოლადის სვეტში (100 × 1.8 მმ იდ. დიამეტრი) ოპტიმიზებული შეფუთვის სქემის გამოყენებით. სვეტის შეფუთვას ეხმარება მექანიკური ვიბრაცია, რათა უზრუნველყოფილი იყოს სვეტში ერთგვაროვანი ფენის ფორმირება. შეაფასეთ ხუთი პეპტიდისგან შემდგარი პეპტიდური ნარევების შეფუთული სვეტის გამოყოფა; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ლეიცინის ენკეფალინი) და ადამიანის შრატის ალბუმინის (HAS) ტრიფსინის დიჯესტი. დაფიქსირდა, რომ HSA-ს პეპტიდური ნარევი და ტრიფსინის დიჯესტი გამოიყოფა კარგი გარჩევადობითა და ეფექტურობით. PMP სვეტის გამოყოფის ეფექტურობა შედარებული იყო Ascentis Express RP-ამიდის სვეტის გამოყოფის ეფექტურობასთან. როგორც პეპტიდები, ასევე ცილები კარგად იხსნება და ეფექტურია PMP სვეტზე, რაც უფრო ეფექტურია Ascentis Express RP-ამიდის სვეტთან შედარებით.
PEG (პოლიეთილენგლიკოლი), შარდოვანა, ძმარმჟავა, ტრიმეტოქსი ორთოსილიკატი (TMOS), ტრიმეთილქლოროსილანი (TMCS), ტრიფსინი, ადამიანის შრატის ალბუმინი (HSA), ამონიუმის ქლორიდი, შარდოვანა, ჰექსან მეთილდისილაზანი (HMDS), მეტაკრილოლის ქლორიდი (MC), სტიროლი, 4-ჰიდროქსი-TEMPO, ბენზოილის პეროქსიდი (BPO), HPLC ხარისხის აცეტონიტრილი (ACN), მეთანოლი, 2-პროპანოლი და აცეტონი. შეძენილია Sigma-Aldrich-ისგან (სენტ-ლუისი, მისური, აშშ).
შარდოვანას (8 გ), პოლიეთილენგლიკოლის (8 გ) და 8 მლ 0.01 N ძმარმჟავას ნარევი 10 წუთის განმავლობაში მოურიეს, შემდეგ კი ყინულივით ცივ პირობებში დაუმატეს 24 მლ TMOS. რეაქციის ნარევი 6 საათის განმავლობაში 40°C-ზე გაცხელდა, შემდეგ კი 8 საათის განმავლობაში უჟანგავი ფოლადის ავტოკლავში 120°C-ზე. წყალი გადაასხეს და ნარჩენი მასალა 70°C-ზე 12 საათის განმავლობაში გააშრეს. გამხმარი რბილი მასა გლუვად დაფქვა ღუმელში და 12 საათის განმავლობაში 550°C-ზე დაამუშავეს. სამი პარტია მომზადდა და დახასიათდა ნაწილაკების ზომის, ფორების ზომისა და ზედაპირის ფართობის რეპროდუცირების შესასწავლად.
სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირული მოდიფიკაციით წინასწარ სინთეზირებული ლიგანდით ფენილმალეიმიდ-მეთილვინილიზოციანატით (PCMP), რასაც მოჰყვა რადიალური პოლიმერიზაცია სტიროლით, მომზადდა პოლარული ჯგუფის შემცველი ნაერთი. სტაციონარული ფაზა აგრეგატებისა და პოლისტიროლის ჯაჭვებისთვის. მომზადების პროცესი აღწერილია ქვემოთ.
N-ფენილმალეიმიდი (200 მგ) და მეთილვინილიზოციანატი (100 მგ) გახსნეს მშრალ ტოლუოლში და ფენილმალეიმიდ-მეთილვინილიზოციანატის კოპოლიმერის (PMCP) მოსამზადებლად რეაქციის კოლბაში დაემატა 0.1 მლ 2,2′-აზოიზობუტირონიტრილი (AIBN). ნარევი გაცხელდა 60°C-ზე 3 საათის განმავლობაში, გაფილტრეს და გააშრეს ღუმელში 40°C-ზე 3 საათის განმავლობაში.
გამხმარი სილიციუმის ნაწილაკები (2 გ) გაიფანტა მშრალ ტოლუოლში (100 მლ), მოურიეს და ჩაუტარდათ ულტრაბგერითი დამუშავება 500 მლ-იან მრგვალძირიან კოლბაში 10 წუთის განმავლობაში. PMCP (10 მგ) გახსნეს ტოლუოლში და წვეთ-წვეთობით დაუმატეს რეაქციის კოლბას საწვეთური ძაბრის მეშვეობით. ნარევი 8 საათის განმავლობაში ადუღეს 100°C ტემპერატურაზე, გაფილტრეს და გარეცხეს აცეტონით და 3 საათის განმავლობაში გააშრეს 60°C ტემპერატურაზე. შემდეგ, PMCP-თან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკები (100 გ) გახსნეს ტოლუოლში (200 მლ) და კატალიზატორის სახით დაემატა 4-ჰიდროქსი-TEMPO (2 მლ) 100 µლ დიბუტილტინ დილაურატის თანაობისას. ნარევი 8 საათის განმავლობაში მოურიეს 50°C ტემპერატურაზე, გაფილტრეს და 3 საათის განმავლობაში გააშრეს 50°C ტემპერატურაზე.
სტიროლი (1 მლ), ბენზოილ პეროქსიდი BPO (0.5 მლ) და TEMPO-PMCP-თან მიმაგრებული სილიციუმის ნაწილაკები (1.5 გ) გაიფანტა ტოლუოლში და გაიწმინდა აზოტით. სტიროლის პოლიმერიზაცია ჩატარდა 100°C ტემპერატურაზე 12 საათის განმავლობაში. მიღებული პროდუქტი გარეცხეს მეთანოლით და გააშრეს 60°C ტემპერატურაზე მთელი ღამის განმავლობაში. რეაქციის საერთო სქემა ნაჩვენებია ნახაზ 1-ში.
ნიმუშები დეგაზირებული იქნა 393 K ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში, რათა მიღებულ იქნას 10-3 Torr-ზე ნაკლები ნარჩენი წნევა. P/P0 = 0.99 ფარდობითი წნევით ადსორბირებული N2-ის რაოდენობა გამოყენებული იქნა ფორების საერთო მოცულობის დასადგენად. შიშველი და ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების მორფოლოგია შემოწმდა სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპით (Hitachi High Technologies, ტოკიო, იაპონია). გამხმარი ნიმუშები (შიშველი სილიციუმი და ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკები) მოათავსეს ალუმინის სვეტზე წებოვანი ნახშირბადის ლენტის გამოყენებით. ნიმუშებზე დაიფარა ოქრო Q150T გაფრქვევის საფარი და ნიმუშებზე დაიტანეს 5 ნმ Au ფენა. ეს აუმჯობესებს პროცესის ეფექტურობას დაბალი ძაბვების გამოყენებით და უზრუნველყოფს წვრილმარცვლოვან, ცივ გაფრქვევას. ელემენტარული ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა Thermo Electron (Waltham, MA, აშშ) Flash EA1112 ელემენტარული ანალიზატორი. ნაწილაკების ზომის განაწილების მისაღებად გამოყენებული იქნა Malvern (Worcestershire, დიდი ბრიტანეთი) Mastersizer 2000 ნაწილაკების ზომის ანალიზატორი. შიშველი სილიციუმის ნაწილაკები და ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმი ნაწილაკები (თითოეული 5 მგ) გაიფანტა 5 მლ იზოპროპანოლში, დამუშავდა ულტრაბგერით 10 წუთის განმავლობაში, მორევირდა 5 წუთის განმავლობაში და განთავსდა Mastersizer-ის ოპტიკურ სკამზე. თერმოგრავიმეტრიული ანალიზი ჩატარდა წუთში 5°C სიჩქარით, 30-დან 800°C-მდე ტემპერატურის დიაპაზონში.
მინით დაფარული უჟანგავი ფოლადის ვიწრო კალიბრის სვეტები (100 × 1.8 მმ შიდა დიამეტრით) შეფუთული იქნა სუსპენზიური შეფუთვის მეთოდით, იმავე პროცედურის გამოყენებით, რაც გამოყენებულია მითითებაში. 31. უჟანგავი ფოლადის სვეტი (მინის საფარით, 100 × 1.8 მმ შიდა დიამეტრით) 1 µm ფრიტის შემცველი გამოსასვლელი ფიტინგით დაკავშირებული იყო სუსპენზიის შემფუთავთან (Alltech Deerfield, IL, აშშ). მოამზადეთ სტაციონარული ფაზის სუსპენზია 150 მგ სტაციონარული ფაზის 1.2 მლ მეთანოლში შეყვანით და გაგზავნეთ შესანახ სვეტში. მეთანოლი გამოყენებული იყო როგორც სუსპენზიის გამხსნელი, ასევე გამხსნელი. სვეტი თანმიმდევრულად შეავსეთ 100 MP წნევის გამოყენებით 10 წუთის განმავლობაში, 80 MP - 15 წუთის განმავლობაში და 60 MP - 30 წუთის განმავლობაში. შეფუთვის დროს, სვეტის ერთგვაროვანი შეფუთვის უზრუნველსაყოფად გამოყენებული იყო მექანიკური ვიბრაცია ორი GC სვეტის შემრევით (Alltech, Deerfield, IL, აშშ). დახურეთ სუსპენზიის შემფუთავი და ნელა მოხსენით წნევა სვეტში დაზიანების თავიდან ასაცილებლად. გამორთეთ სვეტი სუსპენზიის შემფუთვის ბლოკიდან და შეაერთეთ სხვა ფიტინგები შესასვლელთან და LC სისტემასთან მისი მუშაობის შესამოწმებლად.
აწყობილი იყო LC ტუმბო (10AD Shimadzu, იაპონია), ინჟექტორი (Valco (აშშ) C14 W.05) 50 ნლ ინექციური მარყუჟით, მემბრანული დეგაზატორი (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS კაპილარული ფანჯარა. სპეციალური µLC მოწყობილობა დეტექტორით (UV-2075) და მინით დაფარული მიკროსვეტები. სვეტის დამატებითი ზოლის გაფართოების ეფექტის მინიმიზაციისთვის გამოყენებული იყო ძალიან ვიწრო და მოკლე შემაერთებელი მილი. შეფუთვის შემდეგ, კაპილარები (50 μm id 365) და აღმდგენი შემაერთებელი კაპილარები (50 μm) დამონტაჟდა აღმდგენი შემაერთებელი შემაერთებელი კაპილარების 1/16″ გამოსასვლელში. მონაცემების შეგროვება და ქრომატოგრაფიული დამუშავება განხორციელდა Multichro 2000 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით. მონიტორინგი 254 ნმ-ზე. ანალიზები შემოწმდა ულტრაიისფერი შთანთქმისთვის. ქრომატოგრაფიული მონაცემები გაანალიზდა OriginPro8-ით (ნორთჰემპტონი, მასაჩუსეტსი).
ადამიანის შრატის ალბუმინი, ლიოფილიზებული ფხვნილი, ≥ 96% (აგაროზის გელის ელექტროფორეზი) 3 მგ, შერეული ტრიპსინთან (1.5 მგ), 4.0 M შარდოვანასთან (1 მლ) და 0.2 M ამონიუმის ბიკარბონატთან (1 მლ). ხსნარი მოურიეს 10 წუთის განმავლობაში და გააჩერეს წყლის აბაზანაში 37°C ტემპერატურაზე 6 საათის განმავლობაში, შემდეგ ჩააქრეს 1 მლ 0.1%-იანი TFA-თი. ხსნარი გაფილტრეთ და შეინახეთ 4°C-ზე დაბალ ტემპერატურაზე.
პეპტიდური ნარევებისა და HSA-ს ტრიფსინის დიგესტების გამოყოფა ცალ-ცალკე შეფასდა PMP სვეტებზე. შეამოწმეთ HSA-ს პეპტიდური ნარევისა და ტრიფსინის დიგესტის გამოყოფა PMP სვეტით და შეადარეთ შედეგები Ascentis Express RP-ამიდის სვეტს. თეორიული ფირფიტის ნომერი გამოითვლება შემდეგნაირად:
შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების და ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების SEM გამოსახულებები ნაჩვენებია ნახ. 2-ში. შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების (A, B) SEM გამოსახულებები აჩვენებს, რომ ჩვენი წინა კვლევებისგან განსხვავებით, ეს ნაწილაკები სფერულია, სადაც ნაწილაკები წაგრძელებულია ან აქვთ არარეგულარული სიმეტრია. ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების (C, D) ზედაპირი უფრო გლუვია, ვიდრე შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების, რაც შეიძლება გამოწვეული იყოს სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირზე პოლისტიროლის ჯაჭვების საფარით.
შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების (A, B) და ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების (C, D) სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპის გამოსახულებები.
შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების და ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების ნაწილაკების ზომის განაწილება ნაჩვენებია ნახაზ 3(A)-ში. მოცულობაზე დაფუძნებული ნაწილაკების ზომის განაწილების მრუდებმა აჩვენა, რომ სილიციუმის ნაწილაკების ზომა გაიზარდა ქიმიური მოდიფიკაციის შემდეგ (ნახ. 3A). მიმდინარე და წინა კვლევებიდან მიღებული სილიციუმის ნაწილაკების ნაწილაკების ზომის განაწილების მონაცემები შედარებულია ცხრილ 1(A)-ში. PMP-ის მოცულობაზე დაფუძნებული ნაწილაკების ზომა, d(0.5), არის 3.36 μm, ჩვენს წინა კვლევასთან შედარებით, რომლის ad(0.5) მნიშვნელობა იყო 3.05 μm (პოლისტიროლთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკები)34. ამ პარტიას ჰქონდა უფრო ვიწრო ნაწილაკების ზომის განაწილება ჩვენს წინა კვლევასთან შედარებით, რეაქციის ნარევში PEG-ის, შარდოვანას, TMOS-ის და ძმარმჟავას ცვალებადი თანაფარდობის გამო. PMP ფაზის ნაწილაკების ზომა ოდნავ აღემატება ჩვენს მიერ ადრე შესწავლილი პოლისტიროლთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების ფაზის ზომას. ეს ნიშნავს, რომ სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირული ფუნქციონალიზაცია სტიროლით მხოლოდ პოლისტიროლის ფენას (0.97 μm) ათავსებდა სილიციუმის ზედაპირზე, მაშინ როცა PMP ფაზაში ფენის სისქე იყო 1.38. მიკრომეტრი.
შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების და ლიგანდთან დაკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების ნაწილაკების ზომის განაწილება (A) და ფორების ზომის განაწილება (B).
მიმდინარე კვლევის ფარგლებში სილიციუმის ნაწილაკების ფორების ზომა, ფორების მოცულობა და ზედაპირის ფართობი მოცემულია ცხრილში 1(B). შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების და ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების PSD პროფილები ნაჩვენებია ნახაზზე 3(B). შედეგები შედარებადია ჩვენს წინა კვლევასთან. შიშველი და ლიგანდთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების ფორების ზომები შესაბამისად 310 და 241-ია, რაც მიუთითებს, რომ ქიმიური მოდიფიკაციის შემდეგ ფორების ზომა მცირდება 69-ით, როგორც ეს ნაჩვენებია ცხრილში 1(B), ხოლო მრუდის ცვლილება ნაჩვენებია ნახაზზე 3(B). ანალოგიურად, ქიმიური მოდიფიკაციის შემდეგ სილიციუმის ნაწილაკების ფორების მოცულობა შემცირდა 0.67-დან 0.58 სმ3/გ-მდე. ამჟამად შესწავლილი სილიციუმის ნაწილაკების სპეციფიკური ზედაპირის ფართობია 116 მ2/გ, რაც შედარებადია ჩვენს წინა კვლევასთან (124 მ2/გ). როგორც ნაჩვენებია ცხრილში 1(B), სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირის ფართობი (მ2/გ) ასევე შემცირდა 116 მ2/გ-დან 105 მ2/გ-მდე. ქიმიური მოდიფიკაცია.
სტაციონარული ფაზის ელემენტარული ანალიზის შედეგები ნაჩვენებია ცხრილში 2. მიმდინარე სტაციონარული ფაზის ნახშირბადის დატვირთვა 6.35%-ია, რაც უფრო დაბალია, ვიდრე ჩვენი წინა კვლევის ნახშირბადის დატვირთვა (პოლისტიროლთან შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკები, შესაბამისად 7.93%35 და 10.21%)42. მიმდინარე სტაციონარული ფაზის ნახშირბადის დატვირთვა დაბალია, რადგან მიმდინარე SP-ის მომზადებისას, სტიროლის გარდა, გამოყენებული იქნა რამდენიმე პოლარული ლიგანდი, როგორიცაა ფენილმალეიმიდი-მეთილვინილიზოციანატი (PCMP) და 4-ჰიდროქსი-TEMPO. მიმდინარე სტაციონარული ფაზის აზოტის წონითი პროცენტული მაჩვენებელია 2.21%, წინა კვლევებში აზოტის წონით 0.1735 და 0.85%-თან შედარებით, შესაბამისად. ეს ნიშნავს, რომ აზოტის წონითი პროცენტული მაჩვენებელი მიმდინარე სტაციონარული ფაზაში უფრო მაღალია ფენილმალეიმიდის გამო. ანალოგიურად, (4) და (5) პროდუქტების ნახშირბადის დატვირთვა იყო შესაბამისად 2.7% და 2.9%, ხოლო საბოლოო პროდუქტის ნახშირბადის დატვირთვა (6) იყო 6.35%, როგორც ეს ნაჩვენებია ცხრილ 2-ში. წონის კლება შემოწმდა PMP სტაციონარული ფაზით და TGA მრუდი ნაჩვენებია ნახაზ 4-ში. TGA მრუდი აჩვენებს წონის 8.6%-იან კლებას, რაც კარგად შეესაბამება ნახშირბადის დატვირთვას (6.35%), რადგან ლიგანდები შეიცავს არა მხოლოდ C-ს, არამედ N-ს, O-ს და H-ს.
ფენილმალეიმიდ-მეთილვინილიზოციანატის ლიგანდი შეირჩა სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირული მოდიფიკაციისთვის, რადგან მას აქვს პოლარული ფენილმალეიმიდის ჯგუფები და ვინილიზოციანატის ჯგუფები. ვინილის იზოციანატის ჯგუფებს შეუძლიათ სტირენთან რეაქციაში შევიდნენ ცოცხალი რადიკალური პოლიმერიზაციით. მეორე მიზეზი არის ისეთი ჯგუფის ჩასმა, რომელსაც აქვს ზომიერი ურთიერთქმედება ანალიზატთან და არ აქვს ძლიერი ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედება ანალიზატსა და სტაციონარულ ფაზას შორის, რადგან ფენილმალეიმიდის ნაწილს არ აქვს ვირტუალური მუხტი ნორმალურ pH-ზე. სტაციონარული ფაზის პოლარობის კონტროლი შესაძლებელია სტიროლის ოპტიმალური რაოდენობით და თავისუფალი რადიკალური პოლიმერიზაციის რეაქციის დროით. რეაქციის ბოლო ეტაპი (თავისუფალი რადიკალური პოლიმერიზაცია) კრიტიკულია და შეიძლება შეცვალოს სტაციონარული ფაზის პოლარობა. ელემენტარული ანალიზი ჩატარდა ამ სტაციონარული ფაზების ნახშირბადის დატვირთვის შესამოწმებლად. დაფიქსირდა, რომ სტიროლის რაოდენობის და რეაქციის დროის გაზრდა ზრდიდა სტაციონარული ფაზის ნახშირბადის დატვირთვას და პირიქით. სტიროლის სხვადასხვა კონცენტრაციით მომზადებულ SP-ებს აქვთ სხვადასხვა ნახშირბადის დატვირთვა. კვლავ ჩატვირთეთ ეს სტაციონარული ფაზები უჟანგავი ფოლადის სვეტებში და შეამოწმეთ მათი ქრომატოგრაფიული მონაცემები. შესრულება (სელექციურობა, გარჩევადობა, N მნიშვნელობა და ა.შ.). ამ ექსპერიმენტების საფუძველზე, კონტროლირებადი პოლარობისა და ანალიტის კარგი შეკავების უზრუნველსაყოფად, PMP სტაციონარული ფაზის მოსამზადებლად შეირჩა ოპტიმიზირებული ფორმულა.
მობილური ფაზის გამოყენებით PMP სვეტის გამოყენებით ასევე შეფასდა ხუთი პეპტიდური ნარევი (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ლეიცინის ენკეფალინი); 60/40 (v/v) აცეტონიტრილი/წყალი (0.1% TFA) 80 μL/წთ ნაკადის სიჩქარით. ოპტიმალური ელუირების პირობებში, თეორიული ფირფიტების რაოდენობა (N) სვეტზე (100 × 1.8 მმ id) არის 20,000 ± 100 (200,000 ფირფიტა/მ²). ცხრილი 3 იძლევა N მნიშვნელობებს სამი PMP სვეტისთვის და ქრომატოგრამები ნაჩვენებია ნახაზ 5A-ზე. სწრაფი ანალიზი PMP სვეტზე მაღალი ნაკადის სიჩქარით (700 μL/წთ), ხუთი პეპტიდი გამოიყო ერთ წუთში, N მნიშვნელობები ძალიან კარგი იყო, 13,500 ± 330 სვეტზე (100 × 1.8 მმ id), რაც შეესაბამება 135,000 ფირფიტას/მ² (სურათი 5B). სამი იდენტური ზომის სვეტი (100 × 1.8 მმ id) შეფუთული იყო PMP სტაციონარული ფაზის სამი განსხვავებული პარტიით რეპროდუცირებადობის შესამოწმებლად. თითოეული სვეტისთვის ანალიტის კონცენტრაცია დაფიქსირდა ოპტიმალური ელუირების პირობების და თეორიული ფირფიტების რაოდენობის (N) და შეკავების დროის გამოყენებით თითოეულ სვეტზე ერთი და იგივე სატესტო ნარევის გამოსაყოფად. PMP სვეტების რეპროდუცირების მონაცემები ნაჩვენებია ცხრილში 4. PMP სვეტის რეპროდუცირება კარგად კორელირებს ძალიან დაბალ %RSD მნიშვნელობებთან, როგორც ეს ნაჩვენებია ცხრილში 3.
პეპტიდური ნარევის გამოყოფა PMP სვეტზე (B) და Ascentis Express RP-ამიდის სვეტზე (A); მობილური ფაზა 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP სვეტის ზომები (100 × 1.8 მმ იდგ. დიამეტრი); ანალიტიკური ნაერთების ელუირების თანმიმდევრობა: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) და 5 (ლეიცინის) მჟავა ენკეფალინი).
ადამიანის შრატის ალბუმინის ტრიპსული დიგესტების გამოყოფისთვის შეფასდა PMP სვეტი (100 × 1.8 მმ შიდა დიამეტრით) მაღალი ხარისხის თხევად ქრომატოგრაფიაში. ნახაზი 6-ზე მოცემული ქრომატოგრამა აჩვენებს, რომ ნიმუში კარგად არის გამოყოფილი და გარჩევადობა ძალიან კარგია. HSA დიგესტები გაანალიზდა 100 µლ/წთ ნაკადის სიჩქარის, მობილური ფაზის 70/30 აცეტონიტრილი/წყლის და 0.1% TFA-ს გამოყენებით. როგორც ქრომატოგრამაზეა ნაჩვენები (ნახაზი 6), HSA-ს დაშლა დაიყო 17 პიკად, რომლებიც შეესაბამება 17 პეპტიდს. HSA-ს დაშლაში თითოეული პიკის გამოყოფის ეფექტურობა გამოითვალა და მნიშვნელობები მოცემულია ცხრილში 5.
HSA-ს ტრიპსული დაიჯესტი (100 × 1.8 მმ შიდა დიამეტრით) გამოიყო PMP სვეტზე; ნაკადის სიჩქარე (100 µლ/წთ), მობილური ფაზა 60/40 აცეტონიტრილი/წყალი 0.1% TFA-თი.
სადაც L არის სვეტის სიგრძე, η არის მობილური ფაზის სიბლანტე, ΔP არის სვეტის უკუწნევა და u არის მობილური ფაზის წრფივი სიჩქარე. PMP სვეტის გამტარიანობა იყო 2.5 × 10-14 მ2, ნაკადის სიჩქარე იყო 25 μL/წთ და გამოყენებული იყო 60/40 v/v ACN/წყალი. PMP სვეტის გამტარიანობა (100 × 1.8 მმ id) მსგავსი იყო ჩვენი წინა კვლევის Ref.34-ის. ზედაპირულად ფოროვანი ნაწილაკებით შევსებული სვეტის გამტარიანობაა: 1.3 μm ნაწილაკებისთვის 1.7 × 10-15, 1.7 μm ნაწილაკებისთვის 3.1 × 10-15, 5.2 × 10-15 და 2.5 × 10-14 მ2 2.6 μm ნაწილაკებისთვის 5 μm ნაწილაკებისთვის 43. შესაბამისად, PMP ფაზის გამტარიანობა მსგავსია 5 μm ბირთვ-გარსიანი ნაწილაკების.
სადაც Wx არის ქლოროფორმით შევსებული სვეტის წონა, Wy არის მეთანოლით შევსებული სვეტის წონა და ρ არის გამხსნელის სიმკვრივე. მეთანოლის (ρ = 0.7866) და ქლოროფორმის (ρ = 1.484) სიმკვრივეები. SILICA PARTICLES-C18 სვეტების (100 × 1.8 მმ id) 34 და C18-შარდოვანას სვეტების 31 სრული ფორიანობა, რომლებიც ადრე შევისწავლეთ, შესაბამისად, 0.63 და 0.55 იყო. ეს ნიშნავს, რომ შარდოვანას ლიგანდების არსებობა ამცირებს სტაციონარული ფაზის გამტარიანობას. მეორეს მხრივ, PMP სვეტის სრული ფორიანობა (100 × 1.8 მმ id) არის 0.60. PMP სვეტების გამტარიანობა უფრო დაბალია, ვიდრე C18-შეკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკებით შევსებული სვეტების, რადგან C18 ტიპის სტაციონარულ ფაზებში C18 ლიგანდები მიმაგრებულია სილიციუმის ნაწილაკებზე წრფივი ჯაჭვების სახით, ხოლო პოლისტიროლის ტიპის სტაციონარულ ფაზებში წარმოიქმნება შედარებით სქელი პოლიმერული ფენა. მის გარშემო. ტიპურ ექსპერიმენტში, სვეტის ფორიანობა გამოითვლება შემდეგნაირად:
ნახაზი 7A,B გვიჩვენებს PMP სვეტს (100 × 1.8 მმ შიდა დიამეტრი) და Ascentis Express RP-ამიდის სვეტს (100 × 1.8 მმ შიდა დიამეტრი), ვან დეემტერის დიაგრამის იგივე ელუირების პირობების გამოყენებით (ანუ 60/40 ACN/H2O და 0.1% TFA). შერჩეული პეპტიდური ნარევები (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ლეიცინის ენკეფალინი) მომზადდა 20 µლ-ში. ორივე სვეტისთვის მინიმალური ნაკადის სიჩქარეა 800 µლ/წთ. ოპტიმალური ნაკადის სიჩქარის (80 µლ/წთ) დროს PMP სვეტისა და Ascentis Express RP-ამიდის სვეტისთვის მინიმალური HETP მნიშვნელობები შესაბამისად 2.6 µm და 3.9 µm იყო. HETP მნიშვნელობები მიუთითებს, რომ PMP სვეტის გამოყოფის ეფექტურობა (100 × 1.8 მმ id) გაცილებით უკეთესია, ვიდრე კომერციულად ხელმისაწვდომი Ascentis Express RP-ამიდის სვეტი (100 × 1.8 მმ id). ნახ. 7(A)-ზე ვან დეემტერის დიაგრამა აჩვენებს, რომ N მნიშვნელობის შემცირება ნაკადის ზრდასთან ერთად არ არის მნიშვნელოვანი ჩვენს წინა კვლევასთან შედარებით. PMP სვეტის უფრო მაღალი გამოყოფის ეფექტურობა (100 × 1.8 მმ id) Ascentis Express RP-ამიდის სვეტთან შედარებით, მიმდინარე ნაშრომში გამოყენებული ნაწილაკების ფორმის, ზომისა და სვეტის შეფუთვის რთული პროცედურების გაუმჯობესებაზეა დაფუძნებული34.
(A) ვან დემტერის დიაგრამა (HETP მოძრავი ფაზის ხაზოვანი სიჩქარის წინააღმდეგ) მიღებულია PMP სვეტის გამოყენებით (100 × 1.8 მმ იდგ. დიამეტრი) 60/40 ACN/H2O-ში 0.1% TFA-თი. (B) ვან დემტერის დიაგრამა (HETP მოძრავი ფაზის ხაზოვანი სიჩქარის წინააღმდეგ) მიღებულია Ascentis Express RP-ამიდის სვეტის გამოყენებით (100 × 1.8 მმ იდგ. დიამეტრი) 60/40 ACN/H2O-ში 0.1% TFA-თი.
პოლარულად ჩაშენებული პოლისტიროლის სტაციონარული ფაზა მომზადდა და შეფასდა ადამიანის შრატის ალბუმინის (HAS) სინთეზური პეპტიდური ნარევებისა და ტრიპსინის დიჯესტების გამოყოფისთვის მაღალი ხარისხის თხევად ქრომატოგრაფიაში. პეპტიდური ნარევებისთვის PMP სვეტების ქრომატოგრაფიული მახასიათებლები შესანიშნავია გამოყოფის ეფექტურობისა და გარჩევადობის თვალსაზრისით. PMP სვეტების გაუმჯობესებული გამოყოფის მახასიათებლები განპირობებულია სხვადასხვა მიზეზით, როგორიცაა სილიციუმის ნაწილაკების ნაწილაკების ზომა და ფორების ზომა, სტაციონარული ფაზის კონტროლირებადი სინთეზი და სვეტის კომპლექსური შეფუთვა. მაღალი გამოყოფის ეფექტურობის გარდა, ამ სტაციონარული ფაზის კიდევ ერთი უპირატესობაა სვეტის დაბალი უკუწნევა მაღალი ნაკადის სიჩქარეზე. PMP სვეტები ავლენენ კარგ რეპროდუცირებადობას და შეიძლება გამოყენებულ იქნას პეპტიდური ნარევების და სხვადასხვა ცილების ტრიპსინის დაშლის ანალიზისთვის. ჩვენ ვაპირებთ ამ სვეტის გამოყენებას ბუნებრივი პროდუქტების, სამკურნალო მცენარეებიდან ბიოაქტიური ნაერთების და სოკოვანი ექსტრაქტების გამოყოფისთვის თხევად ქრომატოგრაფიაში. მომავალში, PMP სვეტები ასევე შეფასდება ცილებისა და მონოკლონური ანტისხეულების გამოყოფისთვის.
ფილდი, ჯ.კ., ეუერბი, მ.რ., ლაუ, ჯ., თოგერსენი, ჰ. და პეტერსონი, პ. პეპტიდების გამოყოფის სისტემების კვლევა შებრუნებული ფაზის ქრომატოგრაფიით, ნაწილი I: სვეტის დახასიათების პროტოკოლის შემუშავება. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
გომესი, ბ. და სხვ. ინფექციური დაავადებების სამკურნალოდ შექმნილი გაუმჯობესებული აქტიური პეპტიდები. ბიოტექნოლოგია.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
ვლიეგე, პ., ლისოვსკი, ვ., მარტინესი, ჯ. და ხრესტჩატისკი, მ. სინთეტიკური თერაპიული პეპტიდები: მეცნიერება და ბაზარი. წამლის აღმოჩენა. 15 (1-2) დღეს, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
სიე, ფ., სმიტი, რდ. და შენი, ი. მოწინავე პროტეომიკური თხევადი ქრომატოგრაფია. J. ქრომატოგრაფია. A 1261, 78–90 (2012).
ლიუ, ვ. და სხვ. მოწინავე თხევადი ქრომატოგრაფია-მას-სპექტრომეტრია საშუალებას იძლევა ფართოდ მიზნობრივი მეტაბოლომიკისა და პროტეომიკის ინტეგრირებისა. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
ჩესნატი, ს.მ. და სოლსბერი, ჯ.ჯ. UHPLC-ის როლი წამლების შემუშავებაში. ჯ. სექტ. მეცნიერება.30(8), 1183-1190 (2007).
ვუ, ნ. და კლაუზენი, ა.მ. სწრაფი გამოყოფისთვის ულტრამაღალი წნევის თხევადი ქრომატოგრაფიის ფუნდამენტური და პრაქტიკული ასპექტები. ჯ. სექტ. მეცნიერება.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
რენი, ს.ა. და ჩელიჩეფი, პ. ულტრამაღალი ეფექტურობის თხევადი ქრომატოგრაფიის გამოყენება წამლების შემუშავებაში. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
გუ, ჰ. და სხვ. მონოლითური მაკროფოროვანი ჰიდროგელები, რომლებიც მომზადებულია ზეთი-წყალში მაღალი შიდა ფაზის ემულსიებისგან ენტეროვირუსების ეფექტური გაწმენდისთვის. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
ში, ი., სიანგი, რ., ჰორვატი, ს. და უილკინსი, ჯ.ა. თხევადი ქრომატოგრაფიის როლი პროტეომიკაში. J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
ფეკეტე, ს., ვეუთეი, ჯ.-ლ. და გილარმე, დ. თერაპიული პეპტიდებისა და ცილების შებრუნებული ფაზის თხევადი ქრომატოგრაფიით გამოყოფის ახალი ტენდენციები: თეორია და გამოყენება. ჯ. ფარმაცია.ბიომედიცინური მეცნიერება.ანუსი.69, 9-27 (2012).
გილარი, მ., ოლივოვა, პ., დეილი, ა.ე. და გებლერი, ჯ.ს. პეპტიდების ორგანზომილებიანი გამოყოფა RP-RP-HPLC სისტემის გამოყენებით, პირველ და მეორე გამოყოფის განზომილებებში pH-ის სხვადასხვა მნიშვნელობების გამოყენებით. ჯ. სექტ. მეცნიერება.28(14), 1694-1703 (2005).
ფელეტი, ს. და სხვ. გამოკვლეული იქნა C18 სუბ-2 μm სრულად და ზედაპირულად ფოროვანი ნაწილაკებით შევსებული მაღალეფექტური ქრომატოგრაფიული სვეტების მასის გადაცემის მახასიათებლები და კინეტიკური მუშაობა. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
პიოვესანა, ს. და სხვ. მცენარეთა ბიოაქტიური პეპტიდების იზოლაციის, იდენტიფიკაციისა და ვალიდაციის ბოლოდროინდელი ტენდენციები და ანალიტიკური გამოწვევები. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
მიულერი, ჯ.ბ. და სხვ. სიცოცხლის სამეფოს პროტეომიკური ლანდშაფტი. ბუნება 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
დელუკა, ს. და სხვ. თერაპიული პეპტიდების შემდგომი დამუშავება პრეპარაციული თხევადი ქრომატოგრაფიით. Molecule (ბაზელი, შვეიცარია) 26(15), 4688(2021).
იანგი, ი. და გენგი, შ. შერეული რეჟიმის ქრომატოგრაფია და მისი გამოყენება ბიოპოლიმერებში. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
ჟაო, გ., დონგი, X.-Y. და სან, Y. ლიგანდები შერეული რეჟიმის ცილოვანი ქრომატოგრაფიისთვის: პრინციპი, დახასიათება და დიზაინი. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).