გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული მხარდაჭერა CSS-ისთვის. საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვაჩენთ საიტს სტილისა და JavaScript-ის გარეშე.
ფოროვანი სილიციუმის ნაწილაკები მომზადდა სოლ-გელის მეთოდით გარკვეული ცვლილებებით მაკროფოროვანი ნაწილაკების მისაღებად. ეს ნაწილაკები წარმოებული იქნა შექცევადი დამატების ფრაგმენტაციის ჯაჭვის გადაცემის (RAFT) პოლიმერიზაციით N-ფენილმალეიმიდ-მეთილვინილილიზოციანატით (PMI) და სტირონით N-ფენილმალეიმიდ-მეთილვინილისოციანატით (PMI) და სტირონით N-ფენილმალეიმიდ-მეთილვინილისოციანატით (PMI) და სტირონით მოსამზადებლად. ნაკლები ფოლადის სვეტები (100 × 1.8 მმ id) შეფუთული იყო შლამიანი შეფუთვით. შეფასებული PMP სვეტის გამოყოფა პეპტიდური ნარევისგან, რომელიც შედგება ხუთი პეპტიდისგან (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Serphalin) და ადამიანის დიფერენცირებადი ცერცოგრაფიული ეფექტურობა. ალბუმინი (HAS). გამორეცხვის ოპტიმალურ პირობებში, პეპტიდური ნარევის თეორიული ფირფიტების რაოდენობა არის 280,000 ფირფიტა/მ². განვითარებული სვეტის განცალკევების ეფექტურობის შედარება კომერციულ Ascentis Express RP-Amide სვეტთან, დაფიქსირდა, რომ PMP-ის განცალკევების შესრულება აღემატებოდა კომერციულ გარჩევადობის სვეტს.
ბოლო წლების განმავლობაში, ბიოფარმაცევტული ინდუსტრია გახდა გაფართოებული გლობალური ბაზარი ბაზრის წილის მნიშვნელოვანი ზრდით. ბიოფარმაცევტული ინდუსტრიის ფეთქებადი ზრდის გამო, პეპტიდებისა და ცილების ანალიზი ძალიან სასურველია. სამიზნე პეპტიდის გარდა, რამდენიმე მინარევები წარმოიქმნება პეპტიდების სინთეზისა და ანალიზების სასურველი მატროპტიფიკაციისთვის. ცილები სხეულის სითხეებში, ქსოვილებში და უჯრედებში ძალიან რთული ამოცანაა ერთ ნიმუშში პოტენციურად შესამჩნევი სახეობების დიდი რაოდენობის გამო. მიუხედავად იმისა, რომ მასის სპექტრომეტრია ეფექტური ინსტრუმენტია პეპტიდებისა და ცილების თანმიმდევრობისთვის, თუ ასეთი ნიმუშები მასსპექტრომეტრში შეჰყავთ ერთჯერადად, გამოყოფა იდეალური არ იქნება. ანალიზები, რომლებიც შედიან მასის სპექტრომეტრში მოცემულ დროს4,5,6. გარდა ამისა, თხევადი ფაზის გამოყოფის დროს ანალიზები შეიძლება ფოკუსირებული იყოს ვიწრო რეგიონებში, რითაც ხდება ამ ანალიზების კონცენტრირება და აუმჯობესებს MS გამოვლენის მგრძნობელობას.
შებრუნებული ფაზის თხევადი ქრომატოგრაფია (RP-LC) ფართოდ გამოიყენება პეპტიდური ნარევების გასაწმენდად და გამოყოფისთვის ოქტადეცილით მოდიფიცირებული სილიციუმის დიოქსიდის (ODS) გამოყენებით, როგორც სტაციონარული ფაზა11,12,13. თუმცა, RP სტაციონარული ფაზები არ იძლევა დამაკმაყოფილებელ განცალკევებას მათი პეპტიდების, კომპლექსური სტრუქტურისა და ცილების კომპლექსური ბუნების4, კომპლექსური ბუნების5 და ცილების გამო. დაპროექტებული სტაციონარული ფაზები საჭიროა პეპტიდებისა და ცილების გასაანალიზებლად პოლარული და არაპოლარული ნაწილაკებით ამ ანალიზებთან ურთიერთქმედებისთვის და შესანარჩუნებლად16. შერეული რეჟიმის ქრომატოგრაფია, რომელიც უზრუნველყოფს მულტიმოდალურ ურთიერთქმედებებს, შეიძლება იყოს RP-LC-ის ალტერნატივა პეპტიდების, ცილების და სხვა რთული ნარევების გამოყოფისთვის. და ცილების განცალკევება17,18,19,20,21. შერეული რეჟიმის სტაციონარული ფაზები (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, პოლარული ინტერკალაცია/RPLC) შესაფერისია პეპტიდებისა და ცილების განცალკევებისთვის, როგორც პოლარული, ასევე არაპოლარული ჯგუფების არსებობის გამო22,23,24,25,25,26,27, პოლარული თანაბარი სადგურებით. ლარ ჯგუფები აჩვენებენ კარგ გამოყოფის ძალას და უნიკალურ სელექციურობას პოლარული და არაპოლარული ანალიზებისთვის, რადგან გამოყოფა დამოკიდებულია ანალიზსა და სტაციონარულ ფაზას შორის ურთიერთქმედებაზე.მულტიმოდალური ურთიერთქმედება 29, 30, 31, 32. ცოტა ხნის წინ, Zhang et al.30 მოამზადა დოდეცილით დასრულებული პოლიამინის სტაციონარული ფაზა და წარმატებით გამოყო ნახშირწყალბადები, ანტიდეპრესანტები, ფლავონოიდები, ნუკლეოზიდები, ესტროგენები და რამდენიმე სხვა ანალიზი. პოლარულ ინტერკალატორს აქვს როგორც პოლარული, ასევე არაპოლარული ჯგუფები, ამიტომ ის შეიძლება გამოყენებულ იქნას პეპტიდებისა და ცილების გამოსაყოფად, რომლებსაც აქვთ როგორც ჰიდროფობიური, ასევე ჰიდროფობიური სვეტები. ed C18 სვეტები) კომერციულად ხელმისაწვდომია სავაჭრო სახელწოდებით Ascentis Express RP-Amide სვეტები, მაგრამ ეს სვეტები გამოიყენება მხოლოდ ამინ 33-ის ანალიზისთვის.
მიმდინარე კვლევაში მომზადდა პოლარული ჩაშენებული სტაციონარული ფაზა (N-ფენილმალეიმიდი-ჩაშენებული პოლისტირონი) და შეფასდა HSA-ს პეპტიდების და ტრიპსინის დიჯესტების გამოყოფისთვის. სტაციონარული ფაზა მომზადდა შემდეგი სტრატეგიის გამოყენებით. ფოროვანი სილიციუმის ნაწილაკები მომზადდა პროცედურების მიხედვით, რომელიც მოცემულია ჩვენს წინა პუბლიკაციაში. G), TMOS, წყლის ძმარმჟავა მორგებული იყო სილიციუმის ნაწილაკების მოსამზადებლად დიდი ფორების ზომით. მეორე, ახალი ლიგანდი, ფენილმალეიმიდ-მეთილ ვინილის იზოციანატი, სინთეზირებული იყო და გამოიყენებოდა სილიციუმის ნაწილაკების წარმოებულებისთვის პოლარული ჩაშენებული სტაციონარული ფაზის მოსამზადებლად. შედეგად მიღებული სტაციონარული ფაზა (1 მმ 0 ×00 სტაციონარული ფოლადის ოპტიმიზებული) იყო. შეფუთვის სქემა. სვეტის შეფუთვას ეხმარება მექანიკური ვიბრაცია, რათა უზრუნველყოს სვეტის შიგნით ერთგვაროვანი ფსკერის ჩამოყალიბება. შეაფასეთ პეპტიდური ნარევების შეფუთული სვეტის გამოყოფა, რომელიც შედგება ხუთი პეპტიდისგან;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) და ადამიანის შრატის ალბუმინის ტრიპსინის დაიჯესტი (HAS). პეპტიდური ნარევი და ტრიფსინის დაიჯესტი HSA დაფიქსირდა, რომ გამოყოფილი იყო კარგი გარჩევადობით და RPA-ს ეფექტურობით. სვეტი. როგორც პეპტიდები, ასევე პროტეინები დაფიქსირდა, რომ კარგად იყო ამოღებული და ეფექტური PMP სვეტზე, რომელიც უფრო ეფექტური იყო ვიდრე Ascentis Express RP-Amide სვეტი.
PEG (პოლიეთილენ გლიკოლი), შარდოვანა, ძმარმჟავა, ტრიმეთოქსი ორთოსილიკატი (TMOS), ტრიმეთილ ქლოროსილანი (TMCS), ტრიფსინი, ადამიანის შრატის ალბუმინი (HSA), ამონიუმის ქლორიდი, შარდოვანა, ჰექსანი მეთილდისილაზანი (HMDS), მეთაკრილოილ-სტიროქსიდენ-ქლორიდი (MCS) BPO), HPLC ხარისხის აცეტონიტრილი (ACN), მეთანოლი, 2-პროპანოლი და აცეტონი შეძენილი Sigma-Aldrich-ისგან (სენტ-ლუისი, MO, აშშ).
შარდოვანას (8 გ), პოლიეთილენგლიკოლის (8 გ) და 8 მლ 0,01 N ძმარმჟავას ნარევს ურევენ 10 წუთის განმავლობაში და შემდეგ მას ყინულის პირობებში დაემატა 24 მლ TMOS. რეაქციის ნარევი თბება 40°C-ზე 6 საათის განმავლობაში, შემდეგ კი 120°C-ზე, მასალა ადუღდება 8 საათის განმავლობაში. გაშრეს 70°C-ზე 12 საათის განმავლობაში. გამხმარი რბილი მასა გლუვ დაფქულ ღუმელში და კალცინირებული 550°C-ზე 12 საათის განმავლობაში. მომზადდა სამი პარტია და დახასიათდა ნაწილაკების ზომის, ფორების ზომისა და ზედაპირის ფართობის გამრავლების შესამოწმებლად.
სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირის მოდიფიკაციით წინასწარ სინთეზირებული ლიგანდი ფენილმალეიმიდი-მეთილვინილილიზოციანატით (PCMP), რასაც მოჰყვა რადიალური პოლიმერიზაცია სტირონით, მომზადდა პოლარული ჯგუფის შემცველი ნაერთი.სტაციონარული ფაზა აგრეგატებისა და პოლისტიროლის ჯაჭვებისთვის. მომზადების პროცესი აღწერილია ქვემოთ.
N-ფენილმალეიმიდი (200 მგ) და მეთილის ვინილის იზოციანატი (100 მგ) იხსნება მშრალ ტოლუოლში და 0.1 მლ 2,2'-აზოიზობუტირონიტრილი (AIBN) დაემატა რეაქციულ კოლბას ფენილმალეიმიდ-მეთილვინილის ნარევის მოსამზადებლად (გაფილტრული PM30C-ზე და 30 საათის განმავლობაში გაფილტრული იზოციანატი 30 საათის განმავლობაში). გააშრეთ ღუმელში 40°C ტემპერატურაზე 3 საათის განმავლობაში.
გამხმარი სილიციუმის ნაწილაკები (2 გ) დაფანტეს მშრალ ტოლუოლში (100 მლ), აურიეს და გაჟღენთეს 500 მლ მრგვალ ფსკერის კოლბაში 10 წუთის განმავლობაში. PMCP (10 მგ) იხსნება ტოლუოლში და წვეთ-წვეთად დაემატება სარეაქციო კოლბას წვეთოვანი ძაბრის საშუალებით. ნარევი გაფილტრულია 100°C-ზე და ადუღდება 800 საათის განმავლობაში. 60°C 3 საათის განმავლობაში. შემდეგ, PMCP-ით შეკრული სილიციუმის ნაწილაკები (100 გ) იხსნება ტოლუოლში (200 მლ) და 4-ჰიდროქსი-TEMPO (2 მლ) დაემატა 100 μL დიბუტილ კალის დილაურატის თანდასწრებით, როგორც კატალიზატორი. ნარევი გაფილტრული იყო 8 მშრ50°C-ზე 5 საათის განმავლობაში. .
სტირონი (1 მლ), ბენზოილ პეროქსიდი BPO (0,5 მლ) და TEMPO-PMCP-ზე მიმაგრებული სილიციუმის ნაწილაკები (1,5 გ) დაფანტეს ტოლუოლში და გაწმინდეს აზოტით. სტიროლის პოლიმერიზაცია ჩატარდა 100°C-ზე 12 საათის განმავლობაში. მიღებული რეაქცია გარეცხილი იქნა მთელი ღამის განმავლობაში 60°C-ზე. me ნაჩვენებია სურათზე 1.
ნიმუშები გაზავებული იქნა 393 K ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში 10-3 Torr-ზე ნაკლები ნარჩენი წნევის მისაღებად. N2-ის რაოდენობა, რომელიც ადსორბირებულია P/P0 = 0.99 ფარდობით წნევაზე, გამოიყენებოდა ფორების მთლიანი მოცულობის დასადგენად. შიშველი და ლიგანდ შეკრული სილიციუმის ნაწილაკების მორფოლოგია. გამხმარი ნიმუშები (შიშველი სილიციუმის დიოქსიდი და ლიგანდთან შეკრული სილიციუმის ნაწილაკები) მოთავსებული იყო ალუმინის სვეტზე წებოვანი ელექტრული ლენტის გამოყენებით. ნიმუშებზე ოქრო მოოქროვილი იყო Q150T გამჭოლი საფარის გამოყენებით და ნიმუშებზე დატანილი იყო 5 ნმ Au ფენა. ham, MA, აშშ) Flash EA1112 ელემენტარული ანალიზატორი გამოიყენებოდა ელემენტარული ანალიზისთვის. Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 ნაწილაკების ზომის ანალიზატორი გამოყენებული იყო ნაწილაკების ზომის განაწილების მისაღებად. შიშველი სილიციუმის ნაწილაკები და ლიგანდთან შეკრული სილიციუმის ნაწილაკები (თითოეული 5 მგ) დაიშალა mL 1,5 მგ, 5 მგ 5-ში. წთ და მოთავსებულია Mastersizer-ის ოპტიკურ სკამზე. თერმოგრავიმეტრული ანალიზი ჩატარდა წუთში 5 °C სიჩქარით 30-დან 800 °C-მდე ტემპერატურის დიაპაზონში.
შუშით დაფარული უჟანგავი ფოლადის განზომილების ვიწრო ბურღული სვეტები (100 × 1.8 მმ id) შეფუთული იყო ნადუღის შეფუთვის მეთოდის გამოყენებით, იგივე პროცედურის გამოყენებით, რომელიც გამოიყენება Ref.31. უჟანგავი ფოლადის სვეტი (მინის ფენით, 100 × 1,8 მმ id) გამოსასვლელი ფიტინგით, რომელიც შეიცავს 1 μm ფრიტს, დაკავშირებული იყო ნალექის შეფუთვასთან (Alltech Deerfield, IL, აშშ). მოამზადეთ სტაციონარული ფაზის ნამცხვარი 150 მგ 1 მლ მეოლი სტაციონარულ ფაზაში და გაგზავნით. გამოიყენება როგორც ნაღების გამხსნელი და ასევე მამოძრავებელი გამხსნელი. შეავსეთ სვეტი თანმიმდევრულად 100 MP ზეწოლის გამოყენებით 10 წუთის განმავლობაში, 80 MP 15 წუთის განმავლობაში და 60 MP 30 წუთის განმავლობაში. შეფუთვისას მექანიკური ვიბრაცია გამოყენებული იყო ორი GC სვეტის შეკერით (Alltech, Device Los). შეფუთეთ და გაათავისუფლეთ წნევა ნელა, რათა თავიდან აიცილოთ რაიმე დაზიანება სვეტის შიგნით. გამორთეთ სვეტი ნალექის შესაფუთი განყოფილებიდან და შეაერთეთ სხვა ფიტინგი შესასვლელთან და LC სისტემასთან მისი მუშაობის შესამოწმებლად.
LC ტუმბო (10AD Shimadzu, იაპონია), ინჟექტორი (Valco (USA) C14 W.05) 50nL საინექციო მარყუჟით, მემბრანული დეგაზატორი (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS კაპილარული ფანჯარა აშენდა სპეციალური μLC მოწყობილობის დეტექტორი (UV-2075) და მინიმიზირებული მინის შუშის მინიმიზაციისა და მინის შუშის მინიმიზაციას. სვეტის დიაპაზონის გაფართოება.შეფუთვის შემდეგ, კაპილარები (50 μm id 365 და შემცირებული კავშირის კაპილარები (50 μm) დაინსტალირებული იყო შემცირების კავშირის 1/16" გამოსასვლელში. მონაცემთა შეგროვება და ქრომატოგრაფიული დამუშავება განხორციელდა Multichro 2000-ის გამოყენებით. მონიტორინგი განხორციელდა 254V-ზე ანალიზის მონაცემებით 254V. inPro8 (ნორტემპტონი, MA).
ალბუმინი ადამიანის შრატიდან, ლიოფილიზებული ფხვნილი, ≥ 96% (აგაროზის გელის ელექტროფორეზი) 3 მგ შერეული ტრიპსინთან (1,5 მგ), 4,0 მ შარდოვანა (1 მლ) და 0,2 მ ამონიუმის ბიკარბონატი (1 მლ). ხსნარი აურიეთ 10 წუთის განმავლობაში და შემდეგ გააჩერეს 6 ლ 3 სთ წყალში. 0.1% TFA. გაფილტრეთ ხსნარი და შეინახეთ 4 °C-ზე დაბალ ტემპერატურაზე.
პეპტიდური ნარევებისა და HSA ტრიფსინის დიჯესტების გამოყოფა შეფასდა ცალ-ცალკე PMP სვეტებზე. შეამოწმეთ პეპტიდური ნარევის და HSA-ს ტრიპსინის დაშლის გამოყოფა PMP სვეტით და შეადარეთ შედეგები Ascentis Express RP-Amide სვეტთან. თეორიული ფირფიტის ნომერი გამოითვლება შემდეგნაირად:
შიშველი სილიციუმის ნაწილაკებისა და ლიგანდებთან დაკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების SEM გამოსახულებები ნაჩვენებია ნახ.2. შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების SEM გამოსახულებები (A, B) აჩვენებს, რომ ჩვენი წინა კვლევებისგან განსხვავებით, ეს ნაწილაკები სფერულია, რომლებშიც ნაწილაკები წაგრძელებულია ან აქვთ არარეგულარული სიმეტრია. ლიგანდთან შეკრული სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირი (C, D) უფრო გლუვია, ვიდრე შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირი ნაწილაკები.
შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების (A, B) და ლიგანდთან დაკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების (C, D) ელექტრონული მიკროსკოპის სკანირება.
სილიციუმის შიშველი ნაწილაკების ნაწილაკების ზომის განაწილება და ლიგანდთან დაკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკები ნაჩვენებია სურათზე 3(A). მოცულობით დაფუძნებული ნაწილაკების ზომის განაწილების მრუდები აჩვენა, რომ სილიციუმის ნაწილაკების ზომა გაიზარდა ქიმიური მოდიფიკაციის შემდეგ (ნახ. 3A). (0.5), PMP არის 3.36 μm, ჩვენს წინა კვლევასთან შედარებით, ad(0.5) მნიშვნელობით 3.05 μm (პოლისტირონით შეკრული სილიციუმის ნაწილაკები)34. ამ პარტიას ჰქონდა ნაწილაკების ზომის უფრო ვიწრო განაწილება ჩვენს წინა კვლევასთან შედარებით PEG, შარდოვანა, MP მჟავა, რომელიც ოდნავ უფრო დიდია, ვიდრე რეაქცია TMOS ზომით და ac. ჩვენ ადრე შესწავლილი სილიციუმის ნაწილაკების ფაზა არ არის შეკრული. ეს ნიშნავს, რომ სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირული ფუნქციონალიზაცია სტირონით მხოლოდ პოლისტიროლის ფენას (0,97 μm) დეპონირებს სილიციუმის ზედაპირზე, მაშინ როცა PMP ფაზაში ფენის სისქე იყო 1,38 მკმ.
შიშველი სილიციუმის ნაწილაკებისა და ლიგანდთან დაკავშირებული სილიციუმის ნაწილაკების ნაწილაკების ზომის განაწილება (A) და ფორების ზომის განაწილება (B).
მიმდინარე კვლევის სილიციუმის ნაწილაკების ფორების ზომა, ფორების მოცულობა და ზედაპირის ფართობი მოცემულია ცხრილში 1(B). შიშველი სილიციუმის ნაწილაკების და ლიგანდთან შეკრული სილიციუმის ნაწილაკების PSD პროფილები ნაჩვენებია სურათზე 3(B). შედეგები შედარებულია ჩვენს წინა კვლევასთან. მიუთითებს, რომ ფორების ზომა მცირდება 69-ით ქიმიური მოდიფიკაციის შემდეგ, როგორც ნაჩვენებია ცხრილში 1(B), და მრუდის ცვლილება ნაჩვენებია ნახ. 3(B). ანალოგიურად, სილიციუმის ნაწილაკების ფორების მოცულობა შემცირდა 0,67-დან 0,58 სმ3/გ-მდე ქიმიური მოდიფიკაციის შემდეგ. კვლევა (124 მ2/გ). როგორც ცხრილში 1(B) ნაჩვენებია, სილიციუმის დიოქსიდის ნაწილაკების ზედაპირის ფართობი (მ2/გ) ასევე შემცირდა 116 მ2/გ-დან 105 მ2/გ-მდე ქიმიური მოდიფიკაციის შემდეგ.
სტაციონარული ფაზის ელემენტარული ანალიზის შედეგები ნაჩვენებია ცხრილში 2. მიმდინარე სტაციონარული ფაზის ნახშირბადის დატვირთვა არის 6.35%, რაც უფრო დაბალია, ვიდრე ჩვენი წინა კვლევის ნახშირბადის დატვირთვა (პოლისტიროლის შეკრული სილიციუმის ნაწილაკები, 7.93%35 და 10.21%, შესაბამისად) გამოყენებული იქნა ზოგიერთი პოლარული ლიგანდი, როგორიცაა ფენილმალეიმიდი-მეთილვინილილიზოციანატი (PCMP) და 4-ჰიდროქსი-TEMPO. მიმდინარე სტაციონარული ფაზის აზოტის მასის პროცენტი არის 2.21%, წინა კვლევებში აზოტის წონით 0.1735 და 0.85% წონით, შესაბამისად. ანალოგიურად, პროდუქტების (4) და (5) ნახშირბადის დატვირთვა იყო 2.7% და 2.9%, შესაბამისად, ხოლო საბოლოო პროდუქტის (6) ნახშირბადის დატვირთვა იყო 6.35%, როგორც ნაჩვენებია ცხრილში 2. წონის დაკლება შემოწმდა PMP სტაციონარული ფაზაში, და TGA მრუდი ნაჩვენებია სურათზე 4.6 TGA მრუდი გვიჩვენებს 6-ის კარგ მრუდს. 35%), რადგან ლიგანდები შეიცავს არა მხოლოდ C, არამედ N, O და H.
ფენილმალეიმიდი-მეთილვინილისოციანატის ლიგანდი შეირჩა სილიციუმის ნაწილაკების ზედაპირული მოდიფიკაციისთვის, რადგან მას აქვს პოლარული ფენილმალეიმიდის ჯგუფები და ვინილისოციანატის ჯგუფები. ვინილის იზოციანატის ჯგუფებს შეუძლიათ შემდგომი რეაგირება სტირონთან ცოცხალი რადიკალური პოლიმერიზაციით. მეორე მიზეზი არის ჯგუფის ჩასმა, რომელსაც აქვს ზომიერი ანალიზური და ანალიზური ფაზის გარეშე ფაზა. , რადგან ფენილმალეიმიდის ნაწილს არ აქვს ვირტუალური მუხტი ნორმალურ pH-ზე. სტაციონარული ფაზის პოლარობა შეიძლება კონტროლდებოდეს სტიროლის ოპტიმალური რაოდენობით და თავისუფალი რადიკალების პოლიმერიზაციის რეაქციის დროით. რეაქციის ბოლო ეტაპი (თავისუფალი რადიკალური პოლიმერიზაცია) კრიტიკულია და შეუძლია შეცვალოს სტაციონარული ფაზის პოლარობა. ne და რეაქციის დრომ გაზარდა სტაციონარული ფაზის ნახშირბადის დატვირთვა და პირიქით. სტირონის სხვადასხვა კონცენტრაციით მომზადებულ SP-ებს აქვთ სხვადასხვა ნახშირბადის დატვირთვა. ისევ ჩატვირთეთ ეს სტაციონარული ფაზები უჟანგავი ფოლადის სვეტებში და შეამოწმეთ მათი ქრომატოგრაფიული მოქმედება (შერჩევითობა, გარჩევადობა, N მნიშვნელობა და ა.შ.).
ხუთი პეპტიდური ნარევი (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ლეიცინის ენკეფალინი) ასევე შეფასდა PMP სვეტის გამოყენებით მობილური ფაზის გამოყენებით;60/40 (ვ/ვ) აცეტონიტრილი/წყალი (0,1% TFA) 80 μL/წთ ნაკადის სიჩქარით. ოპტიმალური გამორეცხვის პირობებში, ფირის თეორიული ნომერი (N) თითო სვეტზე (100 × 1,8 მმ id) არის 20,000 ± 100 (200,3 მეგაპიქსელი/მ² სვეტისთვის 200,000 ტ. სვეტისთვის). ქრომატოგრამები ნაჩვენებია სურათზე 5A. სწრაფი ანალიზი PMP სვეტზე მაღალი დინების სიჩქარით (700 μL/წთ), ხუთი პეპტიდი გამოირეცხა ერთ წუთში, N მნიშვნელობები იყო ძალიან კარგი, 13,500 ± 330 თითო სვეტზე (100 × 1,8 მმ იდენტიფიცირებული), შეესაბამება 00 00 სთ55 სვეტის ზომას. (100 × 1.8 მმ id) შეფუთული იყო PMP სტაციონარული ფაზის სამი განსხვავებული პარტიით, რეპროდუცირებადობის შესამოწმებლად. ანალიზის კონცენტრაცია თითოეული სვეტისთვის დაფიქსირდა ოპტიმალური გამორეცხვის პირობების და თეორიული ფირფიტების რაოდენობის N და შეკავების დროის გამოყენებით, რათა გამოეყოთ ერთი და იგივე ტესტი ნარევი თითოეულ სვეტზე. ცხრილში 3.
პეპტიდური ნარევის გამოყოფა PMP სვეტზე (B) და Ascentis Express RP-Amide სვეტზე (A);მობილური ფაზა 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP სვეტის ზომები (100 × 1.8 მმ id);ანალიტიკური ნაერთების გამორეცხვის თანმიმდევრობა: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) და 5 (ლეიცინის) მჟავა ენკეფალინი)).
PMP სვეტი (100 × 1.8 მმ id) შეფასებული იყო ადამიანის შრატის ალბუმინის ტრიპტიური დიჯესტების გამოყოფისთვის მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფიაში. ქრომატოგრამა 6-ზე ნაჩვენებია, რომ ნიმუში კარგად არის გამოყოფილი და გარჩევადობა ძალიან კარგია. როგორც ქრომატოგრამაზეა ნაჩვენები (სურათი 6), HSA მონელება დაყოფილია 17 პიკად, რომლებიც შეესაბამება 17 პეპტიდს. თითოეული პიკის გამოყოფის ეფექტურობა HSA დაიჯესტში იყო გამოთვლილი და მნიშვნელობები მოცემულია ცხრილში 5.
HSA-ს ტრიპტიკური დაიჯესტი (100 × 1.8 მმ id) გამოყოფილი იყო PMP სვეტზე;ნაკადის სიჩქარე (100 μL/წთ), მობილური ფაზა 60/40 აცეტონიტრილი/წყალი 0.1% TFA.
სადაც L არის სვეტის სიგრძე, η არის მობილური ფაზის სიბლანტე, ΔP არის სვეტის უკანა წნევა და u არის მობილური ფაზის წრფივი სიჩქარე. PMP სვეტის გამტარიანობა იყო 2,5 × 10-14 მ2, ნაკადის სიჩქარე იყო 25 μL/წთ, და 60/40 ვ/ვ. ACN × მემ. მსგავსი იყო ჩვენი წინა კვლევის Ref.34. ზედაპირულად ფოროვანი ნაწილაკებით შეფუთული სვეტის გამტარიანობაა: 1.7 × 10-15 1.3 მკმ ნაწილაკებისთვის, 3.1 × 10-15 1.7 μm ნაწილაკებისთვის, 5.2 × 10-5 × 15 მკმ ნაწილაკებისთვის, 5.2 × 10-5 × 15. m ნაწილაკები 43. აქედან გამომდინარე, PMP ფაზის გამტარიანობა მსგავსია 5 μm ბირთვის გარსის ნაწილაკების.
სადაც Wx არის ქლოროფორმით შეფუთული სვეტის წონა, Wy არის მეთანოლით შეფუთული სვეტის წონა და ρ არის გამხსნელის სიმკვრივე. მეთანოლის (ρ = 0,7866) და ქლოროფორმის (ρ = 1,484) სიმკვრივეები. C18-შარდოვანას 31 სვეტები, რომლებიც ადრე შევისწავლეთ, იყო 0.63 და 0.55, შესაბამისად. ეს ნიშნავს, რომ შარდოვანას ლიგანდების არსებობა ამცირებს სტაციონარული ფაზის გამტარიანობას. მეორეს მხრივ, PMP სვეტის მთლიანი ფორიანობა (100 × 1.8 მმ id) არის 0.60-ზე დაბალი, ვიდრე PMP 1 სვეტის შეფუთვაზე 8 სვეტის ბონუსით. ნაწილაკები, რადგან C18 ტიპის სტაციონარულ ფაზებში C18 ლიგანდები მიმაგრებულია სილიციუმის ნაწილაკებზე ხაზოვანი ჯაჭვების სახით, ხოლო პოლისტიროლის ტიპის სტაციონარულ ფაზებში მის გარშემო წარმოიქმნება შედარებით სქელი პოლიმერული ფენა. ტიპურ ექსპერიმენტში სვეტის ფორიანობა გამოითვლება შემდეგნაირად:
სურათი 7A,B გვიჩვენებს PMP სვეტს (100 × 1.8 მმ id) და Ascentis Express RP-Amide სვეტს (100 × 1.8 მმ id) იგივე გამორეცხვის პირობების გამოყენებით (ანუ 60/40 ACN/H2O და 0.1% TFA).) ვან დეიმტერის ნაკვეთი.შერჩეული პეპტიდური ნარევები (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ლეიცინის ენკეფალინი) მომზადდა 20 μL/-ში მინიმალური ნაკადის სიჩქარე ორივე სვეტისთვის არის 800 μL/წთ. მინიმალური HETPum მნიშვნელობები არის ოპტიმალური ნაკადი/წთ. RP-Amide სვეტი იყო 2.6 μm და 3.9 μm, შესაბამისად. HETP მნიშვნელობები მიუთითებს, რომ PMP სვეტის განცალკევების ეფექტურობა (100 × 1.8 მმ id) ბევრად უკეთესია, ვიდრე კომერციულად ხელმისაწვდომი Ascentis Express RP-Amide სვეტი (100 × 1.8 მმ-იანი ნაკადი ნაკადი მცირდება). არ არის მნიშვნელოვანი ჩვენს წინა კვლევასთან შედარებით. PMP სვეტის (100 × 1.8 მმ id) უფრო მაღალი გამიჯვნის ეფექტურობა Ascentis Express RP-Amide სვეტთან შედარებით ეფუძნება ნაწილაკების ფორმის, ზომისა და სვეტის შეფუთვის რთული პროცედურების გაუმჯობესებას, რომლებიც გამოიყენება მიმდინარე სამუშაოში34.
(A) ვან დეემტერის დიაგრამა (HETP მოძრავი ფაზის ხაზოვანი სიჩქარის მიმართ) მიღებული PMP სვეტის გამოყენებით (100 × 1.8 მმ id) 60/40 ACN/H2O-ში 0.1% TFA-ით. ACN/H2O 0.1% TFA-ით.
მომზადდა პოლარული ჩაშენებული პოლისტიროლის სტაციონარული ფაზა და შეფასდა ადამიანის შრატის ალბუმინის (HAS) სინთეზური პეპტიდური ნარევების გამოყოფისთვის და ტრიპსინის მონელებისთვის მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფიაში. სილიციუმის დიოქსიდის ნაწილაკების, სტაციონარული ფაზის კონტროლირებადი სინთეზი და სვეტის რთული შეფუთვა. გამოყოფის მაღალი ეფექტურობის გარდა, სვეტის დაბალი უკანა წნევა მაღალი ნაკადის სიჩქარით არის ამ სტაციონარული ფაზის კიდევ ერთი უპირატესობა. PMP სვეტები ავლენენ კარგ რეპროდუცირებას და შეიძლება გამოყენებულ იქნას პეპტიდური ნარევების ანალიზისთვის და ტრიპსინის მონელებისთვის. მცენარეები და სოკოების ექსტრაქტები თხევადი ქრომატოგრაფიაში. მომავალში, PMP სვეტები ასევე შეფასდება ცილების და მონოკლონური ანტისხეულების გამოყოფისთვის.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Peptide Separation Systems by Reversed Phase Chromatography Part I: Development of a Column Characterization Protocol.J.ქრომატოგრაფია.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. გაუმჯობესებული აქტიური პეპტიდები, რომლებიც შექმნილია ინფექციური დაავადებების სამკურნალოდ. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: Science and the market.drug discovery.15 (1-2) today, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009).2009).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.ქრომატოგრაფია.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. გაფართოებული თხევადი ქრომატოგრაფია-მასპექტრომეტრია საშუალებას იძლევა ფართოდ მიზანმიმართული მეტაბოლომიკისა და proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019) ჩართვას.
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC-ის როლი წამლების განვითარებაში.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM ულტრამაღალი წნევის თხევადი ქრომატოგრაფიის ფუნდამენტური და პრაქტიკული ასპექტები სწრაფი განცალკევებისთვის.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. ულტრა მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფიის გამოყენება წამლების შემუშავებაში. ჯ.ქრომატოგრაფია.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006 წ.).
Gu, H. et al.მონოლითური მაკროფოროვანი ჰიდროგელი, მომზადებული ზეთი-წყალში მაღალი შიდა ფაზის ემულსიებისგან ენტეროვირუსების ეფექტური გამწმენდისთვის. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA თხევადი ქრომატოგრაფიის როლი პროტეომიკაში. ჯ.ქრომატოგრაფია.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. თერაპიული პეპტიდების და ცილების შებრუნებული ფაზის თხევადი ქრომატოგრაფიის გამოყოფის განვითარებადი ტენდენციები: თეორია და აპლიკაციები. ჯ.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC.სექტ. მეცნიერება.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. გამოკვლეულია C18 sub-2 μm სრულად და ზედაპირულად ფოროვანი ნაწილაკებით შეფუთული მაღალი ეფექტურობის ქრომატოგრაფიული სვეტების მასის გადაცემის მახასიათებლები და კინეტიკური მოქმედება.Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. უახლესი ტენდენციები და ანალიტიკური გამოწვევები მცენარეთა ბიოაქტიური პეპტიდების იზოლაციაში, იდენტიფიკაციასა და ვალიდაციაში. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425-3444.https://doi.org/10.1007/s018-1016.
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the Kingdom of Life.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. თერაპიული პეპტიდების ქვემოთ დამუშავება მოსამზადებელი თხევადი ქრომატოგრაფიით. მოლეკულა (ბაზელი, შვეიცარია) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. შერეული რეჟიმის ქრომატოგრაფია და მისი გამოყენება ბიოპოლიმერებზე.J.ქრომატოგრაფია.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands შერეული რეჟიმის ცილის ქრომატოგრაფიისთვის: პრინციპი, დახასიათება და დიზაინი.ჯ.ბიოტექნოლოგია.144(1), 3-11 (2009).