გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვიყვანთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
საჭიროა საიმედო ინ ვიტრო სისტემა, რომელსაც შეუძლია ზუსტად განაახლოს გულის ფიზიოლოგიური გარემო ნარკოლოგიური ტესტირებისთვის.ადამიანის გულის ქსოვილის კულტურის სისტემების შეზღუდულმა ხელმისაწვდომობამ გამოიწვია გულის წამლის ეფექტების არაზუსტი ინტერპრეტაციები.აქ ჩვენ შევიმუშავეთ გულის ქსოვილის კულტურის მოდელი (CTCM), რომელიც ელექტრომექანიკურად ასტიმულირებს გულის ნაჭრებს და განიცდის ფიზიოლოგიურ დაჭიმვას გულის ციკლის სისტოლური და დიასტოლური ფაზების დროს.კულტურის 12 დღის შემდეგ, ამ მიდგომამ ნაწილობრივ გააუმჯობესა გულის განყოფილებების სიცოცხლისუნარიანობა, მაგრამ სრულად არ შეინარჩუნა მათი სტრუქტურული მთლიანობა.ამიტომ, მცირე მოლეკულების სკრინინგის შემდეგ, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 100 ნმ ტრიიოდთირონინის (T3) და 1 μM დექსამეტაზონის (Dex) დამატება ჩვენს გარემოში ინარჩუნებდა განყოფილებების მიკროსტრუქტურას 12 დღის განმავლობაში.T3/Dex მკურნალობასთან ერთად, CTCM სისტემა ინარჩუნებდა ტრანსკრიპციულ პროფილებს, სიცოცხლისუნარიანობას, მეტაბოლურ აქტივობას და სტრუქტურულ მთლიანობას იმავე დონეზე, როგორც სუფთა გულის ქსოვილი 12 დღის განმავლობაში.გარდა ამისა, კულტურაში გულის ქსოვილის გადაჭარბებული გაჭიმვა იწვევს ჰიპერტროფიულ გულის სიგნალიზაციას, რაც ადასტურებს CTCM-ის უნარს მიბაძოს ჰიპერტროფიულ მდგომარეობას, რომელიც გამოწვეულია გულის დაჭიმვით.დასასრულს, CTCM-ს შეუძლია მოახდინოს გულის ფიზიოლოგიისა და პათოფიზიოლოგიის მოდელირება კულტურაში ხანგრძლივი დროის განმავლობაში, რაც საშუალებას მისცემს წამლების საიმედო სკრინინგს.
კლინიკურ კვლევებამდე საჭიროა სანდო ინ ვიტრო სისტემები, რომლებსაც შეუძლიათ ადამიანის გულის ფიზიოლოგიური გარემოს ზუსტად რეპროდუცირება.ასეთი სისტემები უნდა მიბაძონ შეცვლილ მექანიკურ გაჭიმვას, გულისცემას და ელექტროფიზიოლოგიურ თვისებებს.ცხოველური მოდელები ჩვეულებრივ გამოიყენება, როგორც გულის ფიზიოლოგიის სკრინინგის პლატფორმა, შეზღუდული სანდოობით ადამიანის გულზე წამლების ზემოქმედების ასახვისას1,2.საბოლოო ჯამში, იდეალური გულის ქსოვილის კულტურის ექსპერიმენტული მოდელი (CTCM) არის მოდელი, რომელიც არის უაღრესად მგრძნობიარე და სპეციფიკური სხვადასხვა თერაპიული და ფარმაკოლოგიური ჩარევისთვის, რომელიც ზუსტად ასახავს ადამიანის გულის ფიზიოლოგიასა და პათოფიზიოლოგიას3.ასეთი სისტემის არარსებობა ზღუდავს გულის უკმარისობის მკურნალობის ახალი მეთოდების აღმოჩენას4,5 და იწვევს წამლების კარდიოტოქსიკურობას, როგორც ბაზრიდან გამოსვლის ძირითად მიზეზს6.
გასული ათწლეულის განმავლობაში რვა არაკარდიოვასკულური პრეპარატი გამოირიცხა კლინიკური გამოყენებისგან, რადგან ისინი იწვევენ QT ინტერვალის გახანგრძლივებას, რაც იწვევს პარკუჭოვანი არითმიას და უეცარ სიკვდილს7.ამრიგად, იზრდება საიმედო პრეკლინიკური სკრინინგის სტრატეგიების საჭიროება გულ-სისხლძარღვთა ეფექტურობისა და ტოქსიკურობის შესაფასებლად.ადამიანის მიერ გამოწვეული პლურიპოტენტური ღეროვანი უჯრედებიდან მიღებული კარდიომიოციტების (hiPS-CM) ბოლოდროინდელი გამოყენება წამლების სკრინინგსა და ტოქსიკურობის ტესტირებაში უზრუნველყოფს ამ პრობლემის ნაწილობრივ გადაწყვეტას.თუმცა, hiPS-CM-ების გაუაზრებელი ბუნება და გულის ქსოვილის მრავალუჯრედული სირთულის ნაკლებობა ამ მეთოდის ძირითადი შეზღუდვებია.ბოლო კვლევებმა აჩვენა, რომ ეს შეზღუდვა ნაწილობრივ შეიძლება დაიძლიოს ადრეული hiPS-CM-ის გამოყენებით გულის ქსოვილის ჰიდროგელების ფორმირებისთვის სპონტანური შეკუმშვის დაწყებიდან მალევე და დროთა განმავლობაში თანდათან გაზრდის ელექტრო სტიმულაციას.თუმცა, ამ hiPS-CM მიკროქსოვილებს არ გააჩნიათ ზრდასრული მიოკარდიუმის მომწიფებული ელექტროფიზიოლოგიური და კონტრაქტურული თვისებები.გარდა ამისა, ადამიანის გულის ქსოვილს აქვს უფრო რთული სტრუქტურა, რომელიც შედგება სხვადასხვა ტიპის უჯრედების ჰეტეროგენული ნარევისგან, მათ შორის ენდოთელური უჯრედები, ნეირონები და სტრომული ფიბრობლასტები, რომლებიც ერთმანეთთან არის დაკავშირებული უჯრედგარე მატრიქსის ცილების სპეციფიკური ნაკრებით.არაკარდიომიოციტური პოპულაციების ეს ჰეტეროგენულობა11,12,13 ზრდასრული ძუძუმწოვრების გულში არის ძირითადი ბარიერი გულის ქსოვილის მოდელირებისთვის ცალკეული უჯრედების ტიპების გამოყენებით.ეს ძირითადი შეზღუდვები ხაზს უსვამს ფიზიოლოგიურ და პათოლოგიურ პირობებში უცვლელი მიოკარდიუმის ქსოვილის კულტივირების მეთოდების შემუშავების მნიშვნელობას.
ადამიანის გულის კულტივირებული თხელი (300 μm) მონაკვეთები დადასტურდა, რომ პერსპექტიული მოდელია ხელუხლებელი ადამიანის მიოკარდიუმის.ეს მეთოდი უზრუნველყოფს ადამიანის გულის ქსოვილის მსგავს სრულ 3D მრავალუჯრედულ სისტემაზე წვდომას.თუმცა, 2019 წლამდე, კულტივირებული გულის სექციების გამოყენება შეზღუდული იყო კულტურის ხანმოკლე (24 სთ) გადარჩენით.ეს გამოწვეულია მთელი რიგი ფაქტორებით, მათ შორის ფიზიკურ-მექანიკური გაჭიმვის ნაკლებობით, ჰაერ-თხევადი ინტერფეისით და მარტივი მედიის გამოყენებით, რომელიც არ აკმაყოფილებს გულის ქსოვილის საჭიროებებს.2019 წელს, რამდენიმე კვლევითმა ჯგუფმა აჩვენა, რომ გულის ქსოვილის კულტურის სისტემებში მექანიკური ფაქტორების ჩართვამ შეიძლება გაახანგრძლივოს კულტურის სიცოცხლე, გააუმჯობესოს გულის ექსპრესია და მიბაძოს გულის პათოლოგიას.ორი ელეგანტური კვლევა 17 და 18 აჩვენებს, რომ ცალღეროვანი მექანიკური დატვირთვა დადებითად მოქმედებს გულის ფენოტიპზე კულტურის დროს.თუმცა, ამ კვლევებში არ იყო გამოყენებული გულის ციკლის დინამიური სამგანზომილებიანი ფიზიკურ-მექანიკური დატვირთვა, ვინაიდან გულის განყოფილებები დატვირთული იყო ან იზომეტრიული დაჭიმვის ძალებით 17 ან ხაზოვანი აუქსოტონური დატვირთვით 18 .ქსოვილის გაჭიმვის ამ მეთოდებმა გამოიწვია გულის მრავალი გენის ჩახშობა ან გენების გადაჭარბებული გამოხატვა, რომლებიც დაკავშირებულია არანორმალურ გაჭიმვის პასუხებთან.აღსანიშნავია, რომ Pitoulis et al.19 შეიმუშავა დინამიური გულის ნაჭრის კულტურის აბაზანა გულის ციკლის რეკონსტრუქციისთვის ძალის გადამყვანის უკუკავშირის და დაძაბულობის დრაივების გამოყენებით.მიუხედავად იმისა, რომ ეს სისტემა საშუალებას იძლევა უფრო ზუსტი ინ ვიტრო გულის ციკლის მოდელირება, მეთოდის სირთულე და დაბალი გამტარუნარიანობა ზღუდავს ამ სისტემის გამოყენებას.ჩვენმა ლაბორატორიამ ახლახან შეიმუშავა კულტურის გამარტივებული სისტემა ელექტრო სტიმულაციისა და ოპტიმიზებული საშუალების გამოყენებით ღორისა და ადამიანის გულის ქსოვილის სიცოცხლისუნარიანობის შესანარჩუნებლად 6 დღემდე20,21.
ამჟამინდელ ხელნაწერში ჩვენ აღვწერთ გულის ქსოვილის კულტურის მოდელს (CTCM) ღორის გულის მონაკვეთების გამოყენებით, რომელიც აერთიანებს ჰუმორულ მინიშნებებს გულის სამგანზომილებიანი ფიზიოლოგიისა და პათოფიზიოლოგიური დისტენციის აღწერისთვის გულის ციკლის განმავლობაში.ამ CTCM-ს შეუძლია გაზარდოს პრეკლინიკური წამლების პროგნოზირების სიზუსტე იმ დონემდე, რაც აქამდე არასდროს ყოფილა მიღწეული, ხარჯთეფექტური, საშუალო გამტარუნარიანობის გულის სისტემის მიწოდებით, რომელიც მიბაძავს ძუძუმწოვართა გულის ფიზიოლოგიას/პათოფიზიოლოგიას პრეკლინიკური წამლის ტესტირებისთვის.
ჰემოდინამიკური მექანიკური სიგნალები გადამწყვეტ როლს თამაშობენ კარდიომიოციტების ფუნქციის შენარჩუნებაში in vitro 22,23,24.მიმდინარე ხელნაწერში ჩვენ შევიმუშავეთ CTCM (სურათი 1a), რომელსაც შეუძლია მიბაძოს ზრდასრულთა გულის გარემოს როგორც ელექტრული, ასევე მექანიკური სტიმულაციის გამოწვევით ფიზიოლოგიურ სიხშირეებზე (1.2 ჰც, 72 დარტყმა წუთში).დიასტოლის დროს ქსოვილის გადაჭარბებული დაჭიმვის თავიდან ასაცილებლად, 3D ბეჭდვის მოწყობილობა გამოიყენეს ქსოვილის ზომის 25%-ით გაზრდის მიზნით (ნახ. 1ბ).C-PACE სისტემით ინდუცირებული ელექტრული პეისინგი დაწყებული იყო სისტოლამდე 100 ms-ით ადრე, მონაცემთა შეგროვების სისტემის გამოყენებით გულის ციკლის სრულად რეპროდუცირებისთვის.ქსოვილის კულტურის სისტემა იყენებს პროგრამირებად პნევმატურ აქტივატორს (LB Engineering, გერმანია), რათა ციკლურად გააფართოვოს მოქნილი სილიკონის მემბრანა, რათა გამოიწვიოს გულის ნაჭრების გაფართოება ზედა პალატაში.სისტემა უერთდებოდა გარე ჰაერის ხაზს წნევის გადამყვანის საშუალებით, რამაც შესაძლებელი გახადა წნევის (± 1 მმ Hg) და დროის (± 1 ms) ზუსტად დარეგულირება (ნახ. 1c).
a მიამაგრეთ ქსოვილის განყოფილება 7 მმ-იან საყრდენ რგოლზე, რომელიც ნაჩვენებია ლურჯად, მოწყობილობის კულტურის კამერის შიგნით.კულტურის კამერა გამოყოფილია ჰაერის კამერისგან თხელი მოქნილი სილიკონის გარსით.მოათავსეთ შუასადებები თითოეულ კამერას შორის გაჟონვის თავიდან ასაცილებლად.მოწყობილობის სახურავი შეიცავს გრაფიტის ელექტროდებს, რომლებიც უზრუნველყოფენ ელექტრო სტიმულაციას.b დიდი ქსოვილის მოწყობილობის, სახელმძღვანელო რგოლისა და საყრდენი რგოლის სქემატური გამოსახულება.ქსოვილის სექციები (ყავისფერი) მოთავსებულია დიდი ზომის მოწყობილობაზე სახელმძღვანელო რგოლით, რომელიც მოთავსებულია მოწყობილობის გარე კიდეზე ღარში.სახელმძღვანელოს გამოყენებით, ფრთხილად მოათავსეთ საყრდენი რგოლი, რომელიც დაფარულია ქსოვილის აკრილის წებოთი გულის ქსოვილის მონაკვეთზე.c გრაფიკი, რომელიც გვიჩვენებს ელექტრული სტიმულაციის დროს, როგორც ჰაერის კამერის წნევის ფუნქცია, რომელსაც აკონტროლებს პროგრამირებადი პნევმატური აქტივატორი (PPD).მონაცემთა შეგროვების მოწყობილობა გამოიყენებოდა ელექტრული სტიმულაციის სინქრონიზაციისთვის წნევის სენსორების გამოყენებით.როდესაც კულტურის კამერაში წნევა მიაღწევს დადგენილ ზღურბლს, პულსის სიგნალი ეგზავნება C-PACE-EM-ს ელექტრო სტიმულაციის გასააქტიურებლად.d ინკუბატორის თაროზე განთავსებული ოთხი CTCM-ის სურათი.ოთხი მოწყობილობა უკავშირდება ერთ PPD-ს პნევმატური წრედის მეშვეობით და წნევის სენსორები ჩასმულია ჰემოსტატურ სარქველში პნევმატურ წრეში წნევის მონიტორინგისთვის.თითოეული მოწყობილობა შეიცავს ქსოვილის ექვს განყოფილებას.
ერთი პნევმატური აქტივატორის გამოყენებით ჩვენ შევძელით 4 CTCM მოწყობილობის კონტროლი, რომელთაგან თითოეულს შეეძლო ქსოვილის 6 მონაკვეთის მოთავსება (ნახ. 1დ).CTCM-ში ჰაერის წნევა ჰაერის პალატაში გარდაიქმნება სინქრონულ წნევად სითხის კამერაში და იწვევს გულის ნაჭრის ფიზიოლოგიურ გაფართოებას (სურათი 2a და დამატებითი ფილმი 1).ქსოვილის დაჭიმვის შეფასება 80 მმ Hg-ზე.Ხელოვნება.აჩვენა ქსოვილის მონაკვეთების დაჭიმვა 25%-ით (ნახ. 2ბ).ნაჩვენებია, რომ ეს პროცენტული გაჭიმვა შეესაბამება სარკომერის ფიზიოლოგიურ სიგრძეს 2.2–2.3 მკმ ნორმალური გულის მონაკვეთის შეკუმშვისთვის17,19,25.ქსოვილის მოძრაობა შეფასდა კამერის მორგებული პარამეტრების გამოყენებით (დამატებითი სურათი 1).ქსოვილის მოძრაობის ამპლიტუდა და სიჩქარე (ნახ. 2c, d) შეესაბამებოდა გაჭიმვას გულის ციკლის დროს და დროს სისტოლისა და დიასტოლის დროს (ნახ. 2b).გულის ქსოვილის გაჭიმვა და სიჩქარე შეკუმშვისა და რელაქსაციის დროს უცვლელი დარჩა 12 დღის განმავლობაში კულტურაში (ნახ. 2f).ელექტრული სტიმულაციის ეფექტის შესაფასებლად კონტრაქტურაზე კულტურის დროს, ჩვენ შევიმუშავეთ მეთოდი აქტიური დეფორმაციის დასადგენად დაჩრდილვის ალგორითმის გამოყენებით (დამატებითი ნახ. 2a,b) და შევძელით გარჩევა დეფორმაციები ელექტრული სტიმულაციის გარეშე.გულის იგივე მონაკვეთი (ნახ. 2f).ჭრის მოძრავ უბანში (R6-9) ელექტრული სტიმულაციის დროს ძაბვა 20%-ით მეტი იყო, ვიდრე ელექტროსტიმულაციის არარსებობის შემთხვევაში, რაც მიუთითებს ელექტრული სტიმულაციის წვლილზე შეკუმშვის ფუნქციაში.
ჰაერის კამერის წნევის, სითხის კამერის წნევის და ქსოვილის მოძრაობის გაზომვების წარმომადგენლობითი კვალი ადასტურებს, რომ პალატაში წნევა ცვლის სითხის კამერაში წნევას, რაც იწვევს ქსოვილის ნაჭრის შესაბამის მოძრაობას.b ქსოვილის მონაკვეთების პროცენტული დაჭიმვის (ლურჯი) წარმომადგენლობითი კვალი, რომელიც შეესაბამება პროცენტულ მონაკვეთს (ნარინჯისფერი).c გულის ნაჭრის გაზომილი მოძრაობა შეესაბამება მოძრაობის გაზომილ სიჩქარეს.(დ) ციკლური მოძრაობის (ლურჯი ხაზი) ​​და სიჩქარის (ნარინჯისფერი წერტილოვანი ხაზი) ​​წარმომადგენლობითი ტრაექტორიები გულის ნაჭერში.e ციკლის დროის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან), შეკუმშვის დრო (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში), დასვენების დრო (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან), ქსოვილის მოძრაობა (n = 25).ნაჭერი)/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან), პიკური სისტოლური სიჩქარე (n = 24(D0), 25(D12) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან) და პიკური რელაქსაციის სიჩქარე (n=24(D0), 25(D12) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან).ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტმა არ აჩვენა მნიშვნელოვანი განსხვავება არცერთ პარამეტრში.ვ წარმომადგენლობითი დაძაბულობის ანალიზი ქსოვილის მონაკვეთების კვალი (წითელი) და (ლურჯი) ელექტრული სტიმულაციის გარეშე, იმავე განყოფილების ქსოვილის სექციების ათი რეგიონალური უბანი.ქვედა პანელები აჩვენებს დაძაბულობის პროცენტული სხვაობის რაოდენობრივ რაოდენობას ქსოვილის მონაკვეთებში ელექტრული სტიმულაციის გარეშე და მის გარეშე ათ უბანში სხვადასხვა განყოფილებიდან. (n = 8 ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ტარდება ორკუდიანი სტუდენტური t-ტესტი; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ტარდება ორკუდიანი სტუდენტური t-ტესტი; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 სექცია/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტი; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 სექცია/ჯგუფი, სხვადასხვა ღორებიდან, ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტი; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
ჩვენს წინა სტატიკური ბიომიმეტური გულის ნაჭრების კულტურის სისტემაში [20, 21], ჩვენ შევინარჩუნეთ გულის ნაჭრების სიცოცხლისუნარიანობა, ფუნქცია და სტრუქტურული მთლიანობა 6 დღის განმავლობაში ელექტრული სტიმულაციის გამოყენებით და საშუალო შემადგენლობის ოპტიმიზაციის გზით.თუმცა, 10 დღის შემდეგ ეს მაჩვენებლები მკვეთრად დაეცა.ჩვენ მივმართავთ სექციებს კულტივირებულ ჩვენს წინა სტატიკური ბიომიმეტური კულტურის სისტემაში 20, 21 საკონტროლო პირობებში (Ctrl) და ჩვენ გამოვიყენებთ ჩვენს ადრე ოპტიმიზებულ გარემოს, როგორც MC პირობებში და კულტურას ერთდროული მექანიკური და ელექტრული სტიმულაციის პირობებში (CTCM).დაურეკა .პირველი, ჩვენ დავადგინეთ, რომ მექანიკური სტიმულაცია ელექტრო სტიმულაციის გარეშე არასაკმარისი იყო ქსოვილის სიცოცხლისუნარიანობის შესანარჩუნებლად 6 დღის განმავლობაში (დამატებითი სურ. 3a,b).საინტერესოა, რომ ფიზიო-მექანიკური და ელექტრო სტიმულაციის დანერგვით STCM-ის გამოყენებით, გულის 12-დღიანი სექციების სიცოცხლისუნარიანობა იგივე დარჩა, როგორც ახალი გულის განყოფილებებში MS პირობებში, მაგრამ არა Ctrl პირობებში, როგორც ნაჩვენებია MTT ანალიზით (ნახ. 1).3a).ეს ვარაუდობს, რომ გულის ციკლის მექანიკურ სტიმულაციას და სიმულაციას შეუძლია ქსოვილის მონაკვეთების სიცოცხლისუნარიანობა ორჯერ მეტი ხნით შეინარჩუნოს, ვიდრე ეს იყო მოხსენებული ჩვენს წინა სტატიკური კულტურის სისტემაში.თუმცა, ქსოვილის სექციების სტრუქტურული მთლიანობის შეფასება გულის ტროპონინის T და კონექსინის 43-ის იმუნური მარკირებით აჩვენა, რომ კონექსინის 43 გამოხატულება მნიშვნელოვნად მაღალი იყო MC ქსოვილებში მე-12 დღეს, ვიდრე კონტროლში იმავე დღეს.თუმცა, კონექსინის 43-ის ერთიანი გამოხატულება და Z-დისკის ფორმირება სრულად არ იყო შენარჩუნებული (ნახ. 3b).ჩვენ ვიყენებთ ხელოვნური ინტელექტის (AI) ჩარჩოს ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივად26, გამოსახულებაზე დაფუძნებული ღრმა სწავლის მილსადენს, რომელიც დაფუძნებულია ტროპონინ-T-ზე და კონექსინის შეღებვაზე43, რათა ავტომატურად განვსაზღვროთ გულის ნაჭრების სტრუქტურული მთლიანობა და ფლუორესცენცია ლოკალიზაციის სიძლიერის თვალსაზრისით.ეს მეთოდი იყენებს კონვოლუციურ ნერვულ ქსელს (CNN) და ღრმა სწავლის ჩარჩოს, რათა საიმედოდ განსაზღვროს გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობა ავტომატური და მიუკერძოებელი გზით, როგორც ეს აღწერილია მითითებაში.26. MC ქსოვილმა აჩვენა გაუმჯობესებული სტრუქტურული მსგავსება 0 დღესთან შედარებით სტატიკური კონტროლის სექციებთან შედარებით.გარდა ამისა, მასონის ტრიქრომის შეღებვამ გამოავლინა ფიბროზის მნიშვნელოვნად დაბალი პროცენტი MS პირობებში, ვიდრე საკონტროლო პირობებში კულტურის მე-12 დღეს (ნახ. 3c).მიუხედავად იმისა, რომ CTCM-მა გაზარდა გულის ქსოვილის სექციების სიცოცხლისუნარიანობა მე-12 დღეს ახალი გულის ქსოვილის მსგავს დონემდე, მან მნიშვნელოვნად არ გააუმჯობესა გულის სექციების სტრუქტურული მთლიანობა.
ზოლიანი დიაგრამა გვიჩვენებს ახალი გულის ნაჭრების (D0) ან გულის ნაჭრების კულტურის MTT სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას 12 დღის განმავლობაში, სტატიკური კულტურაში (D12 Ctrl) ან CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) შესრულებულია სხვადასხვა ტესტებიდან. .0001 D0-თან შედარებით და **p <0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით). ზოლიანი დიაგრამა გვიჩვენებს ახალი გულის ნაჭრების (D0) ან გულის ნაჭრების კულტურის MTT სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას 12 დღის განმავლობაში სტატიკური კულტურაში (D12 Ctrl) ან CTCM-ში (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC, ერთი გზა შესრულებულია ტესტისგან, ##გრ. 0.0001 D0-თან შედარებით და **p <0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით).ჰისტოგრამა აჩვენებს MTT ახალი გულის მონაკვეთების სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას (D0) ან გულის სექციების კულტურას 12 დღის განმავლობაში სტატიკური კულტურაში (D12 კონტროლი) ან CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 კონტროლი).####p < 0,0001 по сравнению с D0 და **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0-თან შედარებით და **p <0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向向他 测0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相*)*ჰისტოგრამა, რომელიც გვიჩვენებს MTT სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას ახალი გულის სექციებში (D0) ან გულის სექციებში კულტივირებული 12 დღის განმავლობაში სტატიკურ კულტურაში (D12 კონტროლი) ან CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 კონტროლი)), 12 (D12 MC) სექციები/ცალმხრივი ANOVA ტესტის ჯგუფიდან;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0-თან შედარებით, **p <0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით).b Troponin-T (მწვანე), კონექსინი 43 (წითელი) და DAPI (ლურჯი) ახლად იზოლირებულ გულის განყოფილებებში (D0) ან გულის სექციებში, რომლებიც კულტივირებულია სტატიკური პირობებით (Ctrl) ან CTCM პირობებში (MC) 12 დღის განმავლობაში) წარმომადგენლობითი იმუნოფლუორესცენციის სურათებით (ცარიელი მასშტაბი = 100 μm). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის ხელოვნური ინტელექტის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი თითოეული სხვადასხვა ღორიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი შესრულებულია; გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის ხელოვნური ინტელექტის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი თითოეული სხვადასხვა ღორიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი შესრულებულია; ####p <0.0001 D0-თან შედარებით და ****p <0.02 Ctrl-თან შედარებით). Количественная оценка структурной целности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) резов/групп срезных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный D0 და ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ხელოვნური ინტელექტის საშუალებით (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) განყოფილება/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ჩატარებული ცალმხრივი ANOVA ტესტი;人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ნაჭერი / თითოეული სხვადასხვა ღორის ჯგუფი, ცალმხრივი ANOVA ტესტი.比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ნაჭერი/თითოეული სხვადასხვა ღორების ჯგუფი, ცალმხრივი ANOVA ტესტი.###00p; ，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, однос v#00000000. внения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ხელოვნური ინტელექტი გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივად გასაზომად (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) სექციები/ჯგუფი თითოეული სხვადასხვა ღორიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p<0.0001 vs. c წარმომადგენლობითი გამოსახულებები (მარცხნივ) და რაოდენობრივი (მარჯვნივ) გულის ნაჭრების შეღებვა მასონის ტრიქრომული ლაქით (Scale bare = 500 μm) (n = 10 ნაჭერი/ჯგუფი თითო სხვადასხვა ღორიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი შესრულებულია; ####p <0.0001 C შედარებით D1). c წარმომადგენლობითი გამოსახულებები (მარცხნივ) და რაოდენობრივი (მარჯვნივ) გულის ნაჭრების შეღებვა მასონის ტრიქრომული ლაქით (Scale bare = 500 μm) (n = 10 ნაჭერი/ჯგუფი თითო სხვადასხვა ღორებიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი შესრულებულია; #### p <0.0001 D1 შედარებით). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (მასშტაბ ურთიერთდამოკიდებულების გარეშე = 500 მკმ) (n = 10 განცალკევებული ტესტი, NOVA) ; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c მასონის ტრიქრომული ლაქით შეღებილი გულის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი სურათები (მარცხნივ) და რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (დაუფარავი მასშტაბი = 500 μm) (n = 10 სექციები/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, შესრულებული ცალმხრივი ANOVA ტესტი; #### p <0 .0001 შედარებით D0 და 1 ***p). c.切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比︎D0 相比Ｘ0***p . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣表性度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 绋比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (чистая шкала = 500 მკმ) (n = 10 срезов/групыфа, кажо протестно друго пожныйпа, кажо протестно друго пожныйпа, кажо протестно. кторного дисперсионного ანალიზი ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c მასონის ტრიქრომული ლაქით შეღებილი გულის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი სურათები (მარცხნივ) და რაოდენობრივი რაოდენობა (მარჯვნივ) (ცარიელი = 500 მკმ) (n = 10 განყოფილება/ჯგუფი, თითოეული განსხვავებული ღორიდან, ტესტირება ცალმხრივი დისპერსიის ანალიზით;### # p <0.0001 1 tr <D0, შედარებით).შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ მცირე მოლეკულების დამატებით კულტურულ გარემოში, კარდიომიოციტების მთლიანობა შეიძლება გაუმჯობესებულიყო და ფიბროზის განვითარება შემცირებულიყო CTCM კულტურის დროს.ამიტომ ჩვენ ვამოწმებდით მცირე მოლეკულებს ჩვენი სტატიკური კონტროლის კულტურების გამოყენებით20,21 დამაბნეველი ფაქტორების მცირე რაოდენობის გამო.ამ ეკრანისთვის არჩეული იყო დექსამეტაზონი (Dex), ტრიიოდთირონინი (T3) და SB431542 (SB).ეს მცირე მოლეკულები ადრე გამოიყენებოდა hiPSC-CM კულტურებში კარდიომიოციტების მომწიფების გამოსაწვევად სარკომერის სიგრძის, T-ტუბულების და გამტარობის სიჩქარის გაზრდით.გარდა ამისა, როგორც Dex (გლუკოკორტიკოიდი) და SB ცნობილია, რომ თრგუნავს ანთებას29,30.ამიტომ, ჩვენ გამოვცადეთ, ამ მცირე მოლეკულების ერთი ან მათი კომბინაცია გააუმჯობესებს გულის განყოფილებების სტრუქტურულ მთლიანობას.საწყისი სკრინინგისთვის, თითოეული ნაერთის დოზა შეირჩა უჯრედული კულტურის მოდელებში ჩვეულებრივ გამოყენებული კონცენტრაციების საფუძველზე (1 μM Dex27, 100 nM T327 და 2.5 μM SB31).კულტურის 12 დღის შემდეგ, T3-ისა და Dex-ის კომბინაციამ გამოიწვია კარდიომიოციტების სტრუქტურული მთლიანობა და მინიმალური ბოჭკოვანი რემოდელირება (დამატებითი ნახატები 4 და 5).გარდა ამისა, T3-ისა და Dex-ის ამ ორმაგი ან ორმაგი კონცენტრაციების გამოყენებამ გამოიწვია მავნე ეფექტები ნორმალურ კონცენტრაციებთან შედარებით (დამატებითი სურ. 6a,b).
თავდაპირველი სკრინინგის შემდეგ, ჩვენ შევასრულეთ 4 კულტურის პირობების თავდაპირველი შედარება (სურათი 4a): Ctrl: გულის სექციები კულტივირებული ჩვენს ადრე აღწერილ სტატიკურ კულტურაში ჩვენი ოპტიმიზებული საშუალების გამოყენებით;20.21 TD: T3 და Ctrl s დამატებულია Dex ოთხშაბათს;MC: გულის სექციები კულტივირებული CTCM-ში ჩვენი ადრე ოპტიმიზებული საშუალების გამოყენებით;და MT: CTCM ერთად T3 და Dex დამატებული საშუალო.კულტივებიდან 12 დღის შემდეგ, MS და MT ქსოვილების სიცოცხლისუნარიანობა იგივე დარჩა, რაც ახალ ქსოვილებში, შეფასებული MTT ანალიზით (ნახ. 4b).საინტერესოა, რომ T3-ისა და Dex-ის დამატება ტრანსველების კულტურებში (TD) არ მოჰყვა სიცოცხლისუნარიანობის მნიშვნელოვან გაუმჯობესებას Ctrl პირობებთან შედარებით, რაც მიუთითებს მექანიკური სტიმულაციის მნიშვნელოვან როლზე გულის მონაკვეთების სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნებაში.
ექსპერიმენტული დიზაინის დიაგრამა, რომელიც ასახავს კულტურის ოთხ მდგომარეობას, რომელიც გამოიყენება მექანიკური სტიმულაციის და T3/Dex დანამატის ეფექტების შესაფასებლად გარემოზე 12 დღის განმავლობაში. b ზოლიანი დიაგრამა გვიჩვენებს სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ ხარისხს კულტივებიდან 12 დღის შემდეგ 4 კულტურის პირობებში (Ctrl, TD, MC და MT) შედარებით ახალი გულის ნაჭრებთან შედარებით (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD და D12 MT), 12 (D12 MC, ერთი ჯგუფის ტესტი, შესრულებული ##p) განსხვავებულია; 0.0001, ###p <0.001 D0-თან შედარებით და **p <0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით). b ზოლიანი დიაგრამა გვიჩვენებს სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ ხარისხს კულტივებიდან 12 დღის შემდეგ 4 კულტურის პირობებში (Ctrl, TD, MC და MT) შედარებით ახალი გულის ნაჭრებთან შედარებით (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD და D12 MT), 12 (D12 MC, ერთი ჯგუფის ტესტი, შესრულებული ##p) განსხვავებულია; 0.0001, ###p <0.001 D0-თან შედარებით და **p <0.01 D12 ctrl-თან შედარებით). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях култивирования (კონტროლი, TD, MC და MT) ერთად სრავნენიიუ ერთად ცოდნის შეფასებისას (D10, 15) (D101, 1) (D10, 1) (D10,10) (D10,10) (D10,10) (D10,10) (D10,10) (D10,10) (D10,15) (D10,10D1) D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) резов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; b ზოლიანი დიაგრამა გვიჩვენებს სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივებიდან 12 დღის განმავლობაში 4 კულტურის პირობებში (საკონტროლო, TD, MC და MT) შედარებით ახალი გულის სექციებთან (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD და D12 MT), 12 (D12 ცალმხრივი MC) სხვადასხვა სექციებიდან.#0. 001, ###p <0.001 vs. D0 და **p <0.01 by D12 Ctrl-თან შედარებით). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 、11 (D5) D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001，#0##p 0.01 წ. D12 控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (კონტროლი, TD, MC და MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD2 და D12 MT2) группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению со D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). b ჰისტოგრამა, რომელიც გვიჩვენებს კულტურის ოთხივე მდგომარეობას (საკონტროლო, TD, MC და MT) შედარებით ახალი გულის სექციებთან (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD და D12 MT), სხვადასხვა ღორებიდან 12 (D12 MC) სექციები/ჯგუფი, ცალმხრივი ANOVA ტესტი.#0#0<0.#0<0. 0, **p<0.01 კონტროლის D12-ის წინააღმდეგ). c ზოლიანი დიაგრამა გვიჩვენებს გლუკოზის ნაკადის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივებიდან 12 დღის შემდეგ 4 კულტურის პირობებში (Ctrl, TD, MC და MT) შედარებით ახალი გულის ნაჭრებთან (D0) (n = 6 ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი შესრულებულია; ###p < 0.001-თან შედარებით). c ზოლიანი დიაგრამა გვიჩვენებს გლუკოზის ნაკადის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივებიდან 12 დღის შემდეგ 4 კულტურის პირობებში (Ctrl, TD, MC და MT) შედარებით ახალი გულის ნაჭრებთან (D0) (n = 6 ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი შესრულებულია; ###p < 0.001-თან შედარებით). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования всех 4 условиях культивирования (კონტროლი, TD, MC და MT) по скравнению со свежими срезами (6 резон) й, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c ჰისტოგრამა გვიჩვენებს გლუკოზის ნაკადის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივებიდან 12 დღის შემდეგ 4 კულტურის პირობებში (საკონტროლო, TD, MC და MT) შედარებით ახალი გულის სექციებთან (D0) (n = 6 სექცია/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, შესრულებული ცალმხრივი ANOVA ტესტი ; ###p <0.001 შედარებით <D0 და 1*** tr). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相楩詹2，糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，䛌10p 0 მე. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组试；###p < 0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая кольчественную оценку потока глюкозы через 12 დღის შემდეგ კულტივირებითი ჯგუფში ყველა 4 პირობებიй культивирования (კონტროლი, TD, MC და MT) ერთად ცრურწმენით (6 რეზმი) от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 (კონტროლი). c ჰისტოგრამა, რომელიც აჩვენებს გლუკოზის ნაკადის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივებიდან 12 დღის განმავლობაში 4 კულტურის პირობებისთვის (საკონტროლო, TD, MC და MT) შედარებით ახალი გულის სექციებთან (D0) (n = 6 სექცია/ჯგუფი, სხვადასხვა ღორებიდან, ცალმხრივი იყო ANOVA ტესტები ჩატარებული, ###p <0.001 შედარებით).d ახალი (ლურჯი), დღის 12 MC (მწვანე) და 12 MT (წითელი) ქსოვილების დაძაბულობის საანალიზო ნაკვეთები ათ რეგიონულ ქსოვილის მონაკვეთის წერტილში (n = 4 ნაჭერი/ჯგუფი, ცალმხრივი ANOVA ტესტი; არ იყო მნიშვნელოვანი განსხვავება ჯგუფებს შორის).ვულკანის დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს განსხვავებულად გამოხატულ გენებს ახალ გულის სექციებში (D0) სტატიკური პირობებში (Ctrl) ან MT პირობებში (MT) კულტივირებულ გულის მონაკვეთებთან შედარებით 10-12 დღის განმავლობაში.f სარკომერის გენების სითბოს რუკა გულის მონაკვეთებისთვის, რომლებიც კულტივირებულია თითოეული კულტურის პირობებში.შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
ცხიმოვანი მჟავების დაჟანგვიდან გლიკოლიზზე გადასვლაზე მეტაბოლური დამოკიდებულება კარდიომიოციტების დედიფერენციაციის დამახასიათებელი ნიშანია.გაუაზრებელი კარდიომიოციტები ძირითადად იყენებენ გლუკოზას ATP წარმოებისთვის და აქვთ ჰიპოპლასტიკური მიტოქონდრია რამდენიმე კრისტალით5,32.გლუკოზის უტილიზაციის ანალიზებმა აჩვენა, რომ MC და MT პირობებში, გლუკოზის უტილიზაცია მსგავსი იყო 0 დღის ქსოვილებში (სურათი 4c).თუმცა, Ctrl ნიმუშებმა აჩვენა გლუკოზის გამოყენების მნიშვნელოვანი ზრდა ახალ ქსოვილთან შედარებით.ეს მიუთითებს, რომ CTCM-ისა და T3/Dex-ის კომბინაცია აძლიერებს ქსოვილის სიცოცხლისუნარიანობას და ინარჩუნებს მეტაბოლურ ფენოტიპს 12-დღიანი კულტივირებული გულის მონაკვეთების.გარდა ამისა, დაძაბულობის ანალიზმა აჩვენა, რომ შტამის დონეები იგივე დარჩა, როგორც სუფთა გულის ქსოვილში 12 დღის განმავლობაში MT და MS პირობებში (ნახ. 4d).
CTCM და T3/Dex-ის საერთო ზემოქმედების გასაანალიზებლად გულის ნაჭრის ქსოვილის გლობალურ ტრანსკრიპციულ ლანდშაფტზე, ჩვენ შევასრულეთ RNAseq გულის ნაჭრებზე ოთხივე სხვადასხვა კულტურის პირობებიდან (დამატებითი მონაცემები 1).საინტერესოა, რომ MT სექციებმა აჩვენა მაღალი ტრანსკრიპციული მსგავსება ახალი გულის ქსოვილთან, 13642 გენიდან მხოლოდ 16 დიფერენციალურად გამოხატული.თუმცა, როგორც ადრე ვაჩვენეთ, Ctrl ნაჭრებმა აჩვენეს 1229 დიფერენციალურად გამოხატული გენი კულტურაში 10-12 დღის შემდეგ (ნახ. 4e).ეს მონაცემები დადასტურებული იყო გულის და ფიბრობლასტის გენების qRT-PCR-ით (დამატებითი სურ. 7a-c).საინტერესოა, რომ Ctrl სექციებმა აჩვენა გულის და უჯრედული ციკლის გენების დაქვეითება და ანთებითი გენის პროგრამების გააქტიურება.ეს მონაცემები ვარაუდობს, რომ დედიფერენციაცია, რომელიც ჩვეულებრივ ხდება გრძელვადიანი კულტივირების შემდეგ, მთლიანად შესუსტებულია MT პირობებში (დამატებითი სურ. 8a,b).სარკომერის გენების ფრთხილად შესწავლამ აჩვენა, რომ მხოლოდ MT პირობებში არის შენარჩუნებული გენები, რომლებიც აკოდირებენ სარკომერს (ნახ. 4f) და იონურ არხს (დამატებითი სურათი 9), რაც იცავს მათ დათრგუნვისგან Ctrl, TD და MC პირობებში.ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ მექანიკური და ჰუმორული სტიმულაციის კომბინაციით (T3/Dex), გულის ნაჭრის ტრანსკრიპტომი შეიძლება დარჩეს ახალი გულის ნაჭრების მსგავსი 12 დღის შემდეგ კულტურაში.
ეს ტრანსკრიპციული დასკვნები მხარს უჭერს იმ ფაქტს, რომ კარდიომიოციტების სტრუქტურული მთლიანობა გულის განყოფილებებში საუკეთესოდ არის შენარჩუნებული MT პირობებში 12 დღის განმავლობაში, როგორც ნაჩვენებია უცვლელი და ლოკალიზებული კონექსინით 43 (ნახ. 5a).გარდა ამისა, ფიბროზი გულის განყოფილებებში MT პირობებში მნიშვნელოვნად შემცირდა Ctrl-თან შედარებით და ახალი გულის სექციების მსგავსი (ნახ. 5b).ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ მექანიკური სტიმულაციისა და T3/Dex მკურნალობის კომბინაცია ეფექტურად ინარჩუნებს გულის სტრუქტურას კულტურაში გულის განყოფილებებში.
a ტროპონინ-T-ის (მწვანე), კონექსინის 43 (წითელი) და DAPI (ლურჯი) წარმომადგენლობითი იმუნოფლუორესცენციის გამოსახულებები ახლად იზოლირებულ გულის განყოფილებებში (D0) ან კულტივირებული 12 დღის განმავლობაში ოთხივე გულის განყოფილების კულტურის პირობებში (მასშტაბის ზოლი = 100 μm).). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის ხელოვნური ინტელექტის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 7 (D0 და D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ჩატარებულია ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ლ). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის ხელოვნური ინტელექტის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 7 (D0 და D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ჩატარებულია ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ლ). Количественная оценка структурной целости ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) резов/группу од разных свиней, 01 по сравнению с D0 и *p < 0,05 ან ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ხელოვნური ინტელექტის გამოყენებით (n = 7 (D0 და D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) სექციები/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, შესრულებული ცალმხრივი ANOVA ტესტი;对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 伈（D0工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 2tr1DC < 0,000对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 (d0 和 d12 ctrl) (5 （d12 td 、 d12 mＥ2 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 与D0 和*p < 0.05 缌0 tr相比).გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ხელოვნური ინტელექტის გამოყენებით სხვადასხვა ღორებში (n = 7 (D0 და D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) სექცია/ჯგუფი) ცალმხრივი ANOVA ტესტით;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 ან ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0-თან შედარებით და *p <0.05 ან ****p <0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). b მასონის ტრიქრომული ლაქით შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი სურათები და რაოდენობრივი მაჩვენებელი (მასონის ზოლი = 500 μm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD და D12 MC), 9 (D12 MT) ნაჭერი/ჯგუფი შესრულებულია სხვადასხვა ღორებთან შედარებით. და ***p <0.001, ან ****p <0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). b მასონის ტრიქრომული ლაქით შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი სურათები და რაოდენობრივი მაჩვენებელი (მასონის ზოლი = 500 μm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD და D12 MC), 9 (D12 MT) ნაჭერი/ჯგუფი შესრულებულია სხვადასხვა ღორებთან შედარებით. და ***p <0.001, ან ****p <0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 მკმ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 განზ2 MTD) ых свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 ან ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson-ის ტრიქრომული ლაქით შეღებილი გულის სექციების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები და რაოდენობრივი განსაზღვრა 001 ან ****p <0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）2）0（0D = 500 μm）10D1D10D =和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； <1####p0 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化l 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切燉 切燉 切燉 切燉片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析差分析01. ***p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Massona (масштабная линейка = 500 მკმ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD და D12 TD და D12 MC) , один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 ან ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson-ის ტრიქრომით შეღებილი გულის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები და რაოდენობრივი მაჩვენებელი ****p <0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით).შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
საბოლოოდ, CTCM-ის უნარი მიბაძოს გულის ჰიპერტროფიას შეფასდა გულის ქსოვილის დაჭიმვის გაზრდით.CTCM-ში ჰაერის კამერის მაქსიმალური წნევა გაიზარდა 80 მმ-დან 80 მმ-მდე.Ხელოვნება.(ნორმალური გაჭიმვა) 140 მმ-მდე არტ.(ნახ. 6ა).ეს შეესაბამება გაჭიმვის 32%-ით ზრდას (ნახ. 6b), რომელიც ადრე იყო ნაჩვენები, როგორც შესაბამისი პროცენტული გაჭიმვა, რომელიც საჭიროა გულის მონაკვეთებისთვის სარკომერის სიგრძის მიღწევის მსგავსი ჰიპერტროფიის დროს.გულის ქსოვილის გაჭიმვა და სიჩქარე შეკუმშვისა და რელაქსაციის დროს უცვლელი დარჩა კულტურის ექვსი დღის განმავლობაში (ნახ. 6c).MT პირობების გულის ქსოვილი ექვემდებარებოდა ნორმალურ გაჭიმვას (MT (ნორმალური)) ან გადაჭიმვის პირობებს (MT (OS)) ექვსი დღის განმავლობაში.უკვე ოთხი დღის შემდეგ კულტურაში, ჰიპერტროფიული ბიომარკერი NT-ProBNP მნიშვნელოვნად გაიზარდა გარემოში MT (OS) პირობებში MT (ნორმალური) პირობებში შედარებით (ნახ. 7a).გარდა ამისა, კულტივირების ექვსი დღის შემდეგ, უჯრედის ზომა MT (OS)-ში (ნახ. 7b) მნიშვნელოვნად გაიზარდა MT გულის სექციებთან შედარებით (ნორმალური).გარდა ამისა, NFATC4 ბირთვული ტრანსლოკაცია მნიშვნელოვნად გაიზარდა გადაჭიმულ ქსოვილებში (ნახ. 7c).ეს შედეგები აჩვენებს პათოლოგიური რემოდელირების პროგრესულ განვითარებას ჰიპერდისტენზიის შემდეგ და მხარს უჭერს კონცეფციას, რომ CTCM მოწყობილობა შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც პლატფორმა დაჭიმვით გამოწვეული გულის ჰიპერტროფიის სიგნალის შესასწავლად.
ჰაერის კამერის წნევის, სითხის კამერის წნევის და ქსოვილის მოძრაობის გაზომვების წარმომადგენლობითი კვალი ადასტურებს, რომ პალატაში წნევა ცვლის სითხის კამერაში წნევას, რაც იწვევს ქსოვილის ნაჭრის შესაბამის მოძრაობას.b გაჭიმვის პროცენტული და დაჭიმვის სიჩქარის წარმომადგენლობითი მრუდები ნორმალურად დაჭიმული (ნარინჯისფერი) და ზედმეტად დაჭიმული (ლურჯი) ქსოვილის მონაკვეთებისთვის.c ზოლიანი დიაგრამა გვიჩვენებს ციკლის დროს (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან), შეკუმშვის დრო (n = 18-19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორიდან), დასვენების დრო (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან) ), ქსოვილის მოძრაობის ამპლიტუდა (n = 14 ნაჭერი/ღორები), 4 ცალი ღორები/ჯგუფი, სხვადასხვა. სხვადასხვა ღორებიდან) და პიკური რელაქსაციის სიჩქარე (n = 14 (D0), 15 (D6) ) სექციები/ჯგუფები) სხვადასხვა ღორებიდან), ორკუდიანი Student-ის t-ტესტი არ აჩვენა მნიშვნელოვანი განსხვავება არცერთ პარამეტრში, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ეს პარამეტრები უცვლელი დარჩა კულტურის 6 დღის განმავლობაში გადაჭარბებული ძაბვით.შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
NT-ProBNP კონცენტრაციის რაოდენობრივი განსაზღვრა კულტურის მედიაში გულის ნაჭრებიდან, რომლებიც კულტივირებულია MT ნორმალური გაჭიმვის (ნორმა) ან გადაჭიმვის (OS) პირობებში (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm და D4 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან. **1 შედარება ANOVA ნორმალურთან. NT-ProBNP კონცენტრაციის რაოდენობრივი განსაზღვრა კულტურულ მედიაში გულის ნაჭრებიდან, რომლებიც კულტივირებულია MT ნორმალური გაჭიმვის (ნორმა) ან გადაჭიმვის (OS) პირობებში (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm და D4 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან ** 1 ANOVA ნორმალურთან შედარებით.NT-ProBNP კონცენტრაციის რაოდენობრივი ჰისტოგრამა კულტურულ გარემოში გულის ნაჭრებიდან, კულტივირებული ნორმალური MT დაჭიმვის (ნორმა) ან გადაჭიმვის (OS) პირობებში (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm და D4). MTOS) ნაჭერი /ჯგუფი სხვადასხვა ღორების ვარიანტისგან, შესრულებული ცალ-ცალკე.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით). a 在MT 正常拉伸(ნორმა) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分向減行双向方差分分，p < 0.01）. NT-ProBNP კონცენტრაციის რაოდენობრივი განსაზღვრა გულის ნაჭრებში, რომლებიც კულტივირებულია MT ნორმალური გაჭიმვის (ნორმა) ან გადაჭიმვის (OS) პირობებში (n=4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) სხვადასხვა 猪的切片/组，动; ** ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით, p <0.01).ჰისტოგრამა NT-ProBNP კონცენტრაციების რაოდენობრივი განსაზღვრა გულის ნაჭრებში, რომლებიც კულტივირებულია ნორმალური MT გაჭიმვის (ნორმა) ან გადაჭიმვის პირობებში (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) და D4 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ვარიაციის ორმხრივი ანალიზი;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით). b ტროპონინ-T და WGA (მარცხნივ) შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი სურათები და უჯრედის ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) უჯრედები/ჯგუფი 10 სხვადასხვა ნაჭერიდან სხვადასხვა ღორებიდან, ორკუდიანი სტუდენტური t-ტესტი შესრულებულია <1 ნორმალურთან შედარებით; ****0p). b ტროპონინ-T და WGA (მარცხნივ) შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი სურათები და უჯრედის ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) უჯრედები/ჯგუფი 10 სხვადასხვა ნაჭერიდან სხვადასხვა ღორებიდან, ორკუდიანი სტუდენტური t-ტესტი შესრულებულია ნორმალურთან შედარებით; ****0. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и колчественного განსაზღვრული размер клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток разне - проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ტროპონინ-T და AZP (მარცხნივ) შეღებილი გულის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები და უჯრედის ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) უჯრედები/ჯგუფი 10 სხვადასხვა სექციიდან სხვადასხვა ღორებიდან, ორკუდიანი სტუდენტური t-ტესტი შესრულდა <0-00p-სთან შედარებით. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表惞3 ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甸t比，****p <0.0001）. b კალკარეინ-T და WGA (მარცხნივ) შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი სურათები და უჯრედის ზომა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 სხვადასხვა ნაჭრიდან (D6 MTNorm)) უჯრედები/组，两方柕， 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm раззных) из 10 , двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). b ტროპონინ-T-ით და AZP-ით შეღებილი გულის განყოფილებების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები და უჯრედის ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 სხვადასხვა განყოფილებიდან სხვადასხვა ღორიდან) უჯრედები/ჯგუფი, ორკუდიანი კრიტერიუმი სტუდენტის t;****p <0.0001 ნორმალურ შტამთან შედარებით). c წარმომადგენლობითი გამოსახულებები დღის 0 და 6 დღის MTOS გულის ნაჭრების იმუნური მარკირებული ტროპონინ-T და NFATC4-ისთვის და NFATC4-ის გადაადგილების რაოდენობრივი განსაზღვრა CM-ების ბირთვებში (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, შესრულებულია სტუდენტური tp *- <0 ტესტირება. c წარმომადგენლობითი გამოსახულებები დღის 0 და 6 დღის MTOS გულის ნაჭრების იმუნური მარკირებული ტროპონინ-T და NFATC4-ისთვის და NFATC4-ის გადაადგილების რაოდენობრივი განსაზღვრა CM-ების ბირთვებში (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, შესრულებულია სტუდენტური tp <0-ტესტირება. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных дней MTOS (D6 = MTOS) ных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c წარმომადგენლობითი გამოსახულებები გულის სექციებისთვის 0 და 6 დღის MTOS-ზე, იმუნური მარკირებული ტროპონინ-T და NFATC4-ზე და NFATC4 ტრანსლოკაციების რაოდენობრივი განსაზღვრა კავერნოზული უჯრედების ბირთვში (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან) ჩატარებული სტუდენტების ორკუდიანი ტესტირება;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性努天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性弛的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学甪t <0；生t 5. c კალკანინ-T და NFATC4 იმუნომარკეტირების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები 第0天和第6天MTOS გულის ნაჭრები და NFATC4 სხვადასხვა NFATC4 易位至CM უჯრედის ბირთვიდან 的 რაოდენობა化 (n = 4 (D6 MTOS),间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количниквенная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свипай (n = 4 (Drez-D0), х. -критерий Стьюдента; *p <0,05). c MTOS გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები 0 და მე-6 დღეს ტროპონინ-T და NFATC4 იმუნომარკეტირებისთვის და NFATC4 ტრანსლოკაციისთვის CM-ის ბირთვში სხვადასხვა ღორებიდან (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი, ორკუდიანი სტუდენტური <0' t -criter).შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
თარგმანის გულ-სისხლძარღვთა კვლევა მოითხოვს ფიჭურ მოდელებს, რომლებიც ზუსტად ახდენენ გულის გარემოს რეპროდუცირებას.ამ კვლევაში შემუშავდა და დახასიათდა CTCM მოწყობილობა, რომელსაც შეუძლია გულის ულტრა თხელი მონაკვეთების სტიმულირება.CTCM სისტემა მოიცავს ფიზიოლოგიურად სინქრონიზებულ ელექტრომექანიკურ სტიმულაციას და T3 და Dex სითხის გამდიდრებას.როდესაც ღორის გულის სექციები ექვემდებარებოდა ამ ფაქტორებს, მათი სიცოცხლისუნარიანობა, სტრუქტურული მთლიანობა, მეტაბოლური აქტივობა და ტრანსკრიპციული გამოხატულება იგივე დარჩა, როგორც სუფთა გულის ქსოვილში კულტურის 12 დღის შემდეგ.გარდა ამისა, გულის ქსოვილის გადაჭარბებულმა დაჭიმულობამ შეიძლება გამოიწვიოს გულის ჰიპერტროფია, რომელიც გამოწვეულია ჰიპერექსტენზიით.საერთო ჯამში, ეს შედეგები მხარს უჭერს ფიზიოლოგიური კულტურის პირობების კრიტიკულ როლს გულის ნორმალური ფენოტიპის შენარჩუნებაში და უზრუნველყოფს პლატფორმას წამლების სკრინინგისთვის.
მრავალი ფაქტორი ხელს უწყობს კარდიომიოციტების ფუნქციონირებისა და გადარჩენისთვის ოპტიმალური გარემოს შექმნას.ამ ფაქტორებიდან ყველაზე აშკარა დაკავშირებულია (1) უჯრედშორისი ურთიერთქმედებები, (2) ელექტრომექანიკური სტიმულაცია, (3) ჰუმორული ფაქტორები და (4) მეტაბოლური სუბსტრატები.ფიზიოლოგიური უჯრედი-უჯრედული ურთიერთქმედება მოითხოვს მრავალი ტიპის უჯრედის კომპლექსურ სამგანზომილებიან ქსელებს, რომლებსაც მხარს უჭერს უჯრედგარე მატრიქსი.ასეთი რთული უჯრედული ურთიერთქმედება რთულია ინ ვიტროს რეკონსტრუქცია ცალკეული უჯრედების ტიპების ერთობლივი კულტივირებით, მაგრამ ადვილად მიიღწევა გულის განყოფილებების ორგანოტიპური ბუნების გამოყენებით.
კარდიომიოციტების მექანიკური გაჭიმვა და ელექტრული სტიმულაცია გადამწყვეტია გულის ფენოტიპის შესანარჩუნებლად33,34,35.მიუხედავად იმისა, რომ მექანიკური სტიმულაცია ფართოდ გამოიყენება hiPSC-CM კონდიცირებისა და მომწიფებისთვის, რამდენიმე ელეგანტურმა კვლევამ ახლახან სცადა კულტურაში გულის ნაჭრების მექანიკური სტიმულაცია ცალმხრივი დატვირთვის გამოყენებით.ეს კვლევები აჩვენებს, რომ 2D ცალმხრივი მექანიკური დატვირთვა დადებითად მოქმედებს გულის ფენოტიპზე კულტურის დროს.ამ კვლევებში, გულის მონაკვეთები ან დატვირთული იყო იზომეტრიული დაჭიმვის ძალებით17, ხაზოვანი აუქსოტონური დატვირთვით18, ან გულის ციკლი ხელახლა შეიქმნა ძალის გადამყვანის უკუკავშირის და დაძაბულობის დრაივების გამოყენებით.თუმცა, ეს მეთოდები იყენებს ქსოვილის ცალღერძულ გაჭიმვას გარემოს ოპტიმიზაციის გარეშე, რაც იწვევს გულის მრავალი გენის ჩახშობას ან გენების გადაჭარბებულ გამოხატვას, რომლებიც დაკავშირებულია არანორმალურ დაჭიმულ რეაქციებთან.აქ აღწერილი CTCM უზრუნველყოფს 3D ელექტრომექანიკურ სტიმულს, რომელიც მიბაძავს ბუნებრივ გულის ციკლს ციკლის დროისა და ფიზიოლოგიური გაჭიმვის თვალსაზრისით (25% დაჭიმულობა, 40% სისტოლა, 60% დიასტოლა და 72 დარტყმა წუთში).მიუხედავად იმისა, რომ მხოლოდ ეს სამგანზომილებიანი მექანიკური სტიმულაცია არ არის საკმარისი ქსოვილის მთლიანობის შესანარჩუნებლად, საჭიროა ჰუმორული და მექანიკური სტიმულაციის კომბინაცია T3/Dex გამოყენებით ქსოვილის სიცოცხლისუნარიანობის, ფუნქციისა და მთლიანობის ადეკვატურად შესანარჩუნებლად.
ჰუმორული ფაქტორები მნიშვნელოვან როლს თამაშობენ ზრდასრულთა გულის ფენოტიპის მოდულაციაში.ეს ხაზგასმული იყო HiPS-CM კვლევებში, რომლებშიც T3 და Dex დაემატა კულტურის მედიას, რათა დააჩქაროს უჯრედების მომწიფება.T3 შეიძლება გავლენა იქონიოს ამინომჟავების, შაქრისა და კალციუმის ტრანსპორტირებაზე უჯრედის მემბრანებში36.გარდა ამისა, T3 ხელს უწყობს MHC-α ექსპრესიას და MHC-β-ს დაქვეითებას, ხელს უწყობს სწრაფი გადახრის მიოფიბრილების ფორმირებას მომწიფებულ კარდიომიოციტებში, ნაყოფის CM-ში ნელი წევის მიოფიბრილებთან შედარებით.T3 დეფიციტი ჰიპოთირეოიდულ პაციენტებში იწვევს მიოფიბრილარული ზოლების დაკარგვას და ტონის განვითარების შემცირებულ სიჩქარეს37.დექსი მოქმედებს გლუკოკორტიკოიდულ რეცეპტორებზე და ნაჩვენებია, რომ ზრდის მიოკარდიუმის კონტრაქტურას იზოლირებულ პერფუზიულ გულებში;38 ითვლება, რომ ეს გაუმჯობესება დაკავშირებულია ეფექტთან კალციუმის დეპოზიტზე ორიენტირებულ შესვლაზე (SOCE) 39,40.გარდა ამისა, Dex უკავშირდება მის რეცეპტორებს, რაც იწვევს ფართო უჯრედშიდა რეაქციას, რომელიც თრგუნავს იმუნურ ფუნქციას და ანთებას30.
ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ ფიზიკურმა მექანიკურმა სტიმულაციამ (MS) გააუმჯობესა კულტურის მთლიანი შესრულება Ctrl-თან შედარებით, მაგრამ ვერ შეინარჩუნა სიცოცხლისუნარიანობა, სტრუქტურული მთლიანობა და გულის ექსპრესია კულტურაში 12 დღის განმავლობაში.Ctrl-თან შედარებით, T3 და Dex-ის დამატება CTCM (MT) კულტურებში გააუმჯობესა სიცოცხლისუნარიანობა და შეინარჩუნა მსგავსი ტრანსკრიფციის პროფილები, სტრუქტურული მთლიანობა და მეტაბოლური აქტივობა ახალი გულის ქსოვილით 12 დღის განმავლობაში.გარდა ამისა, ქსოვილის დაჭიმვის ხარისხის კონტროლით, ჰიპერექსტენზიით გამოწვეული გულის ჰიპერტროფიის მოდელი შეიქმნა STCM-ის გამოყენებით, რაც ასახავს STCM სისტემის მრავალმხრივობას.უნდა აღინიშნოს, რომ მიუხედავად იმისა, რომ გულის რემოდელირება და ფიბროზი ჩვეულებრივ მოიცავს უცვლელ ორგანოებს, რომელთა მოცირკულირე უჯრედებს შეუძლიათ უზრუნველყონ შესაბამისი ციტოკინები, ასევე ფაგოციტოზი და სხვა რემოდელირების ფაქტორები, გულის ნაწილებს მაინც შეუძლიათ ფიბროზული პროცესის მიბაძვა სტრესისა და ტრავმის საპასუხოდ.მიოფიბრობლასტებში.ეს ადრე იყო შეფასებული გულის ამ მოდელში.უნდა აღინიშნოს, რომ CTCM პარამეტრების მოდულირება შესაძლებელია წნევის/ელექტრული ამპლიტუდის და სიხშირის შეცვლით მრავალი მდგომარეობის სიმულაციისთვის, როგორიცაა ტაქიკარდია, ბრადიკარდია და მექანიკური სისხლის მიმოქცევის მხარდაჭერა (მექანიკური დატვირთული გული).ეს სისტემას აქცევს საშუალო გამტარუნარიანობას ნარკოტიკების ტესტირებისთვის.CTCM-ის უნარი გადაჭარბებული დატვირთვით გამოწვეული გულის ჰიპერტროფიის მოდელირებისთვის გზას უხსნის ამ სისტემის ტესტირებას პერსონალიზებული თერაპიისთვის.დასასრულს, წინამდებარე კვლევა აჩვენებს, რომ მექანიკური გაჭიმვა და ჰუმორული სტიმულაცია გადამწყვეტია გულის ქსოვილის სექციების კულტურის შესანარჩუნებლად.
მიუხედავად იმისა, რომ აქ წარმოდგენილი მონაცემები ვარაუდობს, რომ CTCM არის ძალიან პერსპექტიული პლატფორმა ხელუხლებელი მიოკარდიუმის მოდელირებისთვის, კულტურის ამ მეთოდს აქვს გარკვეული შეზღუდვები.CTCM კულტურის მთავარი შეზღუდვა არის ის, რომ ის აწესებს უწყვეტ დინამიურ მექანიკურ სტრესებს ნაჭრებზე, რაც გამორიცხავს ყოველი ციკლის განმავლობაში გულის ნაჭრების შეკუმშვის აქტიური მონიტორინგის შესაძლებლობას.გარდა ამისა, გულის განყოფილებების მცირე ზომის გამო (7 მმ), შეზღუდულია სისტოლური ფუნქციის შეფასების უნარი კულტურის სისტემების გარეთ ტრადიციული ძალის სენსორების გამოყენებით.ამჟამინდელ ხელნაწერში ჩვენ ნაწილობრივ გადავლახავთ ამ შეზღუდვას ოპტიკური ძაბვის, როგორც შეკუმშვის ფუნქციის ინდიკატორის შეფასებით.თუმცა, ეს შეზღუდვა საჭიროებს შემდგომ მუშაობას და შეიძლება მოგვარდეს მომავალში კულტურაში გულის ნაჭრების ფუნქციის ოპტიკური მონიტორინგის მეთოდების დანერგვით, როგორიცაა ოპტიკური რუქა კალციუმის და ძაბვისადმი მგრძნობიარე საღებავების გამოყენებით.CTCM-ის კიდევ ერთი შეზღუდვა არის ის, რომ სამუშაო მოდელი არ მანიპულირებს ფიზიოლოგიურ სტრესს (წინასწარი და შემდგომი დატვირთვა).CTCM-ში, წნევა გამოწვეული იყო საპირისპირო მიმართულებით, რათა რეპროდუცირდეს 25% ფიზიოლოგიური გაჭიმვა დიასტოლში (სრული გაჭიმვა) და სისტოლაში (ელექტრული სტიმულაციის დროს შეკუმშვის ხანგრძლივობა) ძალიან დიდ ქსოვილებში.ეს შეზღუდვა უნდა მოიხსნას მომავალ CTCM დიზაინებში გულის ქსოვილზე ადექვატური ზეწოლით ორივე მხრიდან და ზუსტი წნევა-მოცულობის მიმართების გამოყენებით, რომელიც ხდება გულის კამერებში.
ამ ხელნაწერში მოხსენებული გადაჭიმვის შედეგად გამოწვეული რემოდელირება შემოიფარგლება ჰიპერტროფიული ჰიპერსტრეჩის სიგნალების მიბაძვით.ამრიგად, ამ მოდელს შეუძლია დაეხმაროს დაჭიმვით გამოწვეული ჰიპერტროფიული სიგნალიზაციის შესწავლაში ჰუმორული ან ნერვული ფაქტორების (რაც არ არსებობს ამ სისტემაში) საჭიროების გარეშე.საჭიროა შემდგომი კვლევები CTCM-ის სიმრავლის გასაზრდელად, მაგალითად, იმუნურ უჯრედებთან ერთობლივი კულტივირება, პლაზმის მოცირკულირე ჰუმორული ფაქტორები და ინერვაცია ნეირონულ უჯრედებთან ერთობლივი კულტივირებისას გააუმჯობესებს CTCM-ით დაავადების მოდელირების შესაძლებლობებს.
ამ კვლევაში გამოყენებული იყო ცამეტი ღორი.ცხოველების ყველა პროცედურა ჩატარდა ინსტიტუციური გაიდლაინების შესაბამისად და დამტკიცებული იყო ლუისვილის უნივერსიტეტის ინსტიტუციური ცხოველთა მოვლისა და გამოყენების კომიტეტის მიერ.აორტის თაღი დაიჭირეს და გულში პერფუზია 1 ლ სტერილური კარდიოპლეგიით (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL ჰეპარინი, pH 7-მდე); გულები ინახებოდა ყინულივით ცივ კარდიოპლეგიურ ხსნარში, სანამ არ გადაიყვანდნენ ლაბორატორიაში ყინულზე, რომელიც ჩვეულებრივ <10 წთ. გულები ინახებოდა ყინულივით ცივ კარდიოპლეგიურ ხსნარში, სანამ არ გადაიყვანდნენ ლაბორატორიაში ყინულზე, რომელიც ჩვეულებრივ <10 წთ. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 წთ. გულები ინახებოდა ყინულივით ცივ კარდიოპლეგიურ ხსნარში ლაბორატორიაში ყინულზე ტრანსპორტირებამდე, რასაც ჩვეულებრივ <10 წუთი სჭირდება.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 წთ. გულები შეინახეთ ყინულოვან კარდიოპლეგიაზე ლაბორატორიაში ყინულზე ტრანსპორტირებამდე, ჩვეულებრივ <10 წთ.
CTCM მოწყობილობა შეიქმნა SolidWorks კომპიუტერული დამხმარე დიზაინის პროგრამულ უზრუნველყოფაში (CAD).კულტურის კამერები, გამყოფები და საჰაერო კამერები დამზადებულია CNC გამჭვირვალე აკრილის პლასტმასისგან.7 მმ დიამეტრის სარეზერვო რგოლი დამზადებულია მაღალი სიმკვრივის პოლიეთილენისგან (HDPE) ცენტრში და აქვს ო-რგოლის ღარი, რათა მოთავსდეს სილიკონის ო-რგოლი, რომელიც გამოიყენება ქვემოდან მედიის დალუქვისთვის.თხელი სილიციუმის მემბრანა გამოყოფს კულტურის კამერას გამყოფი ფირფიტისგან.სილიკონის მემბრანა არის ლაზერული მოჭრილი 0.02" სისქის სილიკონის ფურცლიდან და აქვს 35A სიმტკიცე.ქვედა და ზედა სილიკონის შუასადებები ლაზერულია 1/16" სისქის სილიკონის ფურცლისგან და აქვს 50A სიმტკიცე.316L უჟანგავი ფოლადის ხრახნები და ფრთის თხილი გამოიყენება ბლოკის დასამაგრებლად და ჰერმეტული დალუქვის შესაქმნელად.
გამოყოფილი ბეჭდური მიკროსქემის დაფა (PCB) შექმნილია C-PACE-EM სისტემასთან ინტეგრირებისთვის.შვეიცარიული მანქანის დამაკავშირებელი სოკეტები PCB-ზე დაკავშირებულია გრაფიტის ელექტროდებთან ვერცხლის მოოქროვილი სპილენძის მავთულით და ბრინჯაოს 0-60 ხრახნებით, რომლებიც ხრახნიან ელექტროდებში.ბეჭდური მიკროსქემის დაფა მოთავსებულია 3D პრინტერის ყდაში.
CTCM მოწყობილობა კონტროლდება პროგრამირებადი პნევმატური აქტივატორით (PPD), რომელიც ქმნის კონტროლირებად სისხლის მიმოქცევის წნევას გულის ციკლის მსგავსი.ჰაერის კამერის შიგნით წნევის მატებასთან ერთად, მოქნილი სილიკონის მემბრანა ფართოვდება ზემოთ, რაც აიძულებს გარემოს ქსოვილის უბნის ქვეშ.შემდეგ ქსოვილის არე დაიჭიმება სითხის ამ გამოდევნით, დიასტოლის დროს გულის ფიზიოლოგიური გაფართოების მიბაძვით.რელაქსაციის პიკში ელექტრული სტიმულაცია ხდებოდა გრაფიტის ელექტროდების საშუალებით, რაც ამცირებს წნევას ჰაერის პალატაში და იწვევდა ქსოვილის მონაკვეთების შეკუმშვას.მილის შიგნით არის ჰემოსტატიკური სარქველი წნევის სენსორით ჰაერის სისტემაში წნევის დასადგენად.წნევის სენსორის მიერ აღქმული წნევა ვრცელდება ლეპტოპთან დაკავშირებულ მონაცემთა შემგროვებელზე.ეს საშუალებას იძლევა გაზის პალატაში წნევის მუდმივი მონიტორინგი.როდესაც პალატაში მაქსიმალური წნევა იქნა მიღწეული (სტანდარტული 80 მმ Hg, 140 მმ Hg OS), მონაცემთა შეგროვების მოწყობილობას დაევალა გაეგზავნა სიგნალი C-PACE-EM სისტემაში ორფაზიანი ძაბვის სიგნალის გენერირებისთვის 2 ms, დაყენებული 4 ვ.
მიიღეს გულის განყოფილებები და 6 ჭაბურღილში ჩატარდა კულტურის პირობები შემდეგნაირად: გადასატანი ჭურჭლიდან მიღებული გულები გადაიტანეთ ცივ (4°C) კარდიოპლეგიის შემცველ უჯრაში.მარცხენა პარკუჭის იზოლირებული იყო სტერილური დანა და დაჭრილი ცალი 1-2 სმ3.ქსოვილის ეს ბლოკები მიმაგრებული იყო ქსოვილის საყრდენებზე ქსოვილის ადჰეზივით და მოთავსებული იყო ვიბრაციული მიკროტომის ქსოვილის აბაზანაში, რომელიც შეიცავს ტიროდის ხსნარს და განუწყვეტლივ ჟანგბადს (3 გ/ლ 2,3-ბუტანედიონის მონოქსიმი (BDM), 140 მმ NaCl (8,18 გ), 6 მმ K471-გ. mM HEPES (2.38 გ), 1 mM MgCl2 (1 მლ 1 M ხსნარი), 1.8 mM CaCl2 (1.8 მლ 1 M ხსნარი), 1 ლ-მდე ddH2O).ვიბრაციული მიკროტომი დაყენებული იყო 300 მკმ სისქის ნაჭრების დასაჭრელად 80 ჰც სიხშირით, ჰორიზონტალური ვიბრაციის ამპლიტუდა 2 მმ და წინსვლის სიჩქარე 0.03 მმ/წმ.ქსოვილის აბაზანა გარშემორტყმული იყო ყინულით, რათა ხსნარი გაგრილებულიყო და ტემპერატურა შენარჩუნებული იყო 4°C-ზე.ქსოვილის სექციები მიკროტომის აბანოდან გადაიტანეთ ინკუბაციურ აბაზანაში, რომელიც შეიცავს ყინულზე მუდმივად ჟანგბადის შემცველ ტიროდის ხსნარს, სანამ არ მიიღება საკმარისი მონაკვეთები ერთი კულტურის ფირფიტისთვის.ტრანსუელების კულტურებისთვის ქსოვილის სექციები მიმაგრებული იყო სტერილურ 6 მმ სიგანის პოლიურეთანის საყრდენებზე და მოთავსებული იყო 6 მლ ოპტიმიზებულ გარემოში (199 საშუალო, 1x ITS დანამატი, 10% FBS, 5 ნგ/მლ VEGF, 10 ნგ/მლ FGF-ტუტე და 2X ანტიბიოტიკი-ანტიფუნგალური).ელექტრული სტიმულაცია (10 ვ, სიხშირე 1.2 ჰც) გამოყენებული იყო ქსოვილის სექციებზე C-Pace-ის მეშვეობით.TD პირობებისთვის, ახალი T3 და Dex დაემატა 100 ნმ და 1 μM ყოველ საშუალო ცვლილებაზე.ჩანაცვლებამდე გარემო გაჯერებულია ჟანგბადით 3-ჯერ დღეში.ქსოვილის სექციები კულტივირებული იყო ინკუბატორში 37°C-ზე და 5% CO2-ზე.
CTCM კულტურებისთვის ქსოვილის სექციები მოთავსებული იყო სპეციალურად დამზადებულ 3D პრინტერზე პეტრის ჭურჭელში, რომელიც შეიცავდა ტიროდის მოდიფიცირებულ ხსნარს.მოწყობილობა შექმნილია იმისთვის, რომ გაზარდოს გულის ნაჭრის ზომა საყრდენი ბეჭდის ფართობის 25%-ით.ეს კეთდება იმისთვის, რომ ტიროდის ხსნარიდან საშუალოზე გადატანის შემდეგ და დიასტოლის დროს გულის მონაკვეთები არ დაიჭიმოს.ჰისტოაკრილის წებოს გამოყენებით, 300 მკმ სისქის მონაკვეთები დამაგრდა 7 მმ დიამეტრის საყრდენ რგოლზე.ქსოვილის სექციების საყრდენ რგოლზე მიმაგრების შემდეგ, შეწყვიტეთ ქსოვილის ჭარბი მონაკვეთები და მოათავსეთ მიმაგრებული ქსოვილის სექციები ყინულზე (4°C) ტიროდის ხსნარის აბაზანაში, სანამ არ მომზადდება საკმარისი სექციები ერთი მოწყობილობისთვის.ყველა მოწყობილობის დამუშავების საერთო დრო არ უნდა აღემატებოდეს 2 საათს.მას შემდეგ, რაც ქსოვილის 6 განყოფილება მიამაგრეს მათ საყრდენ რგოლებზე, CTCM მოწყობილობა შეიკრიბა.CTCM კულტურის კამერა წინასწარ ივსება 21 მლ წინასწარ ჟანგბადიანი საშუალებით.ქსოვილის სექციები გადაიტანეთ კულტურის კამერაში და ფრთხილად ამოიღეთ ჰაერის ბუშტები პიპეტით.შემდეგ ქსოვილის განყოფილება მიდის ხვრელში და ნაზად დაჭერით თავის ადგილზე.ბოლოს მოათავსეთ ელექტროდის თავსახური მოწყობილობაზე და გადაიტანეთ მოწყობილობა ინკუბატორში.შემდეგ შეაერთეთ CTCM საჰაერო მილსა და C-PACE-EM სისტემას.პნევმატური ამძრავი იხსნება და ჰაერის სარქველი ხსნის CTCM-ს.C-PACE-EM სისტემა კონფიგურირებული იყო იმისთვის, რომ მიეწოდოს 4 ვ 1.2 ჰც სიხშირეზე ორფაზიანი ტემპის დროს 2 ms.საშუალო იცვლებოდა დღეში ორჯერ და ელექტროდებს ცვლიდნენ დღეში ერთხელ, ელექტროდებზე გრაფიტის დაგროვების თავიდან ასაცილებლად.საჭიროების შემთხვევაში, ქსოვილის სექციები შეიძლება ამოღებულ იქნეს მათი კულტურის ჭაბურღილებიდან, რათა გამოდევნონ ჰაერის ბუშტები, რომლებიც შესაძლოა მათ ქვეშ მოხვდეს.MT მკურნალობის პირობებისთვის, T3/Dex დაემატა ახალი ყოველი საშუალო ცვლილება 100 nM T3 და 1 μM Dex.CTCM მოწყობილობები კულტივირებული იყო ინკუბატორში 37°C-ზე და 5% CO2-ზე.
გულის ნაჭრების დაჭიმული ტრაექტორიების მისაღებად შეიქმნა სპეციალური კამერის სისტემა.SLR კამერა (Canon Rebel T7i, Canon, ტოკიო, იაპონია) გამოყენებული იყო Navitar Zoom 7000 18-108 მმ მაკრო ლინზებით (Navitar, San Francisco, CA).ვიზუალიზაცია განხორციელდა ოთახის ტემპერატურაზე მას შემდეგ, რაც ჩანაცვლდა გარემო ახალი გარემოთი.კამერა განლაგებულია 51° კუთხით და ვიდეო იწერება 30 კადრი წამში.პირველი, ღია კოდის პროგრამული უზრუნველყოფა (MUSCLEMOTION43) გამოიყენებოდა Image-J-თან ერთად გულის ნაჭრების მოძრაობის რაოდენობრივად გასაზომად.ნიღაბი შეიქმნა MATLAB-ის (MathWorks, Natick, MA, აშშ) გამოყენებით, რათა განესაზღვრათ ინტერესის რეგიონები გულის ცემისთვის, რათა თავიდან აიცილოთ ხმაური.ხელით სეგმენტირებული ნიღბები გამოიყენება ყველა სურათზე კადრების თანმიმდევრობით და შემდეგ გადაეცემა MUSCLEMOTION დანამატს.Muscle Motion იყენებს პიქსელების საშუალო ინტენსივობას თითოეულ კადრში, რათა დაადგინოს მისი მოძრაობა საცნობარო ჩარჩოსთან შედარებით.მონაცემები ჩაიწერა, გაფილტრულიყო და გამოიყენეს ციკლის დროის რაოდენობრივი დასადგენად და გულის ციკლის განმავლობაში ქსოვილის გაჭიმვის შესაფასებლად.ჩაწერილი ვიდეოს შემდგომი დამუშავება მოხდა პირველი რიგის ნულოვანი ფაზის ციფრული ფილტრის გამოყენებით.ქსოვილის გაჭიმვის რაოდენობრივი დასადგენად (მწვერვალიდან მწვერვალამდე), ჩატარდა მწვერვალიდან მწვერვალამდე ანალიზი ჩაწერილ სიგნალში მწვერვალებისა და ღრმულების გასასხვავებლად.გარდა ამისა, დეტრენდინგი ხორციელდება მე-6 რიგის პოლინომის გამოყენებით სიგნალის დრიფტის აღმოსაფხვრელად.პროგრამის კოდი შეიქმნა MATLAB-ში ქსოვილის გლობალური მოძრაობის, ციკლის დროის, რელაქსაციის დროისა და შეკუმშვის დროის დასადგენად (დამატებითი პროგრამის კოდი 44).
დაძაბულობის ანალიზისთვის, იგივე ვიდეოების გამოყენებით, რომლებიც შექმნილია მექანიკური დაჭიმვის შეფასებისთვის, ჩვენ პირველად დავაკვირდით ორ სურათს, რომლებიც წარმოადგენენ მოძრაობის მწვერვალებს (მოძრაობის უმაღლესი (ზედა) და ყველაზე დაბალი (ქვედა) წერტილები) MUSCLEMOTION პროგრამული უზრუნველყოფის მიხედვით.შემდეგ ჩვენ დავყავით ქსოვილის რეგიონები და გამოვიყენეთ დაჩრდილვის ალგორითმის ფორმა სეგმენტირებული ქსოვილისთვის (დამატებითი სურ. 2a).შემდეგ სეგმენტირებული ქსოვილი დაიყო ათ ზედაპირად და თითოეულ ზედაპირზე დაძაბულობა გამოითვალა შემდეგი განტოლების გამოყენებით: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, სადაც Sup და Sdown არის ფორმის მანძილი ქსოვილის ზედა და ქვედა ჩრდილებიდან, შესაბამისად (Supplementary Fig. .2b).
გულის განყოფილებები ფიქსირდება 4% პარაფორმალდეჰიდში 48 საათის განმავლობაში.ფიქსირებული ქსოვილები დეჰიდრატირებული იყო 10% და 20% საქაროზაში 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ 30% საქაროზაში ღამით.შემდეგ სექციები ჩაშენებული იქნა ოპტიმალური ჭრის ტემპერატურის ნაერთში (OCT ნაერთი) და თანდათან გაყინული იყო იზოპენტანის/მშრალი ყინულის აბაზანაში.შეინახეთ OCT ჩამონტაჟებული ბლოკები -80 °C ტემპერატურაზე განცალკევებამდე.სლაიდები მომზადდა 8 მკმ სისქის სექციებად.
OCT გულის განყოფილებებიდან მოსაშორებლად, გააცხელეთ სლაიდები გამათბობელ ბლოკზე 95 °C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში.დაამატეთ 1 მლ PBS თითოეულ სლაიდს და ინკუბაცია 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, შემდეგ გაჟღენთეთ სექციები 0.1% Triton-X-ის დაყენებით PBS-ში 15 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.არასპეციფიკური ანტისხეულების ნიმუშთან შეკავშირების თავიდან ასაცილებლად, დაამატეთ 1 მლ 3% BSA ხსნარი სლაიდებზე და ინკუბაცია 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.შემდეგ BSA ამოიღეს და სლაიდები გარეცხეს PBS-ით.მონიშნეთ თითოეული ნიმუში ფანქრით.პირველადი ანტისხეულები (განზავებული 1:200 1% BSA-ში) (კონექსინი 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) და ტროპონინი-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) დაემატა 90 წუთში, შემდეგ მეორადი 0 ალექსი 1% ანტისხეულების მიმართ 488 (Thermo Scientific; #A16079), კურდღლის Alexa Fluor 594-ის წინააღმდეგ (Thermo Scientific; #T6391) დამატებითი 90 წუთის განმავლობაში გარეცხილი 3-ჯერ PBS-ით სამიზნე შეღებვის ფონისგან გასასხვავებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ მხოლოდ მეორადი ანტისხეული, როგორც კონტროლი. ბოლოს, დაემატა DAPI ატომური ლაქა და დაემატა ატომური ლაქა და აშლილი ლაქები. -x გადიდება) და Keyence მიკროსკოპი 40x გადიდებით.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 მკგ/მლ PBS-ში გამოყენებული იყო WGA შეღებვისთვის და დაიტანეს ფიქსირებულ მონაკვეთებზე 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.შემდეგ სლაიდები გარეცხეს PBS-ით და სუდანის შავი დაემატა თითოეულ სლაიდს და ინკუბირებული 30 წუთის განმავლობაში.შემდეგ სლაიდები გარეცხეს PBS-ით და დაემატა ვექტაშილის ჩაშენების საშუალება.სლაიდები ვიზუალიზებული იქნა Keyence მიკროსკოპზე 40x გადიდებით.
OCT ამოღებულ იქნა ნიმუშებიდან, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი.OCT-ის ამოღების შემდეგ, ჩაყარეთ სლაიდები ბუინის ხსნარში ღამით.შემდეგ სლაიდები გარეცხეს გამოხდილი წყლით 1 საათის განმავლობაში და შემდეგ მოათავსეს ბიბრიჩის ალოეს მჟავას ფუქსინის ხსნარში 10 წუთის განმავლობაში.შემდეგ სლაიდები გარეცხეს გამოხდილი წყლით და მოათავსეს 5% ფოსფომოლიბდენის/5% ფოსფოტონგსტინის მჟავას ხსნარში 10 წუთის განმავლობაში.ჩამობანის გარეშე გადაიტანეთ სლაიდები პირდაპირ ანილინის ცისფერ ხსნარში 15 წუთის განმავლობაში.შემდეგ სლაიდები გარეცხეს გამოხდილი წყლით და მოათავსეს 1% ძმარმჟავას ხსნარში 2 წუთის განმავლობაში.სლაიდები გაშრეს 200 N ეთანოლში და გადაიტანეს ქსილენში.შეღებილი სლაიდები ვიზუალიზებული იქნა Keyence მიკროსკოპის გამოყენებით 10x ობიექტივით.ფიბროზის ფართობის პროცენტი რაოდენობრივი იყო Keyence Analyzer პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
CyQUANT™ MTT უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობის ანალიზი (Invitrogen, Carlsbad, CA), კატალოგის ნომერი V13154, მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით გარკვეული ცვლილებებით.კერძოდ, MTT ანალიზის დროს ქსოვილის ერთიანი ზომის უზრუნველსაყოფად გამოყენებული იქნა ქირურგიული პუნჩი დიამეტრით 6 მმ.ქსოვილები ინდივიდუალურად იყო მოოქროვილი 12 ჭაბურღილიანი ფირფიტის ჭებში, რომელიც შეიცავს MTT სუბსტრატს მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით.სექციები ინკუბირებულია 37°C ტემპერატურაზე 3 საათის განმავლობაში და ცოცხალი ქსოვილი მეტაბოლიზებს MTT სუბსტრატს მეწამული ფორმაზანის ნაერთის წარმოქმნით.შეცვალეთ MTT ხსნარი 1 მლ DMSO-ით და ინკუბაცია 37 °C-ზე 15 წუთის განმავლობაში, რათა გამოიტანოთ მეწამული ფორმაზანი გულის ნაწილებიდან.ნიმუშები განზავებული იყო 1:10 DMSO-ში 96 კარგად გამჭვირვალე ქვედა ფირფიტებში და იასამნისფერი ფერის ინტენსივობა გაზომილი იყო 570 ნმ-ზე Cytation ფირფიტის წამკითხველის (BioTek) გამოყენებით.მაჩვენებლები ნორმალიზებული იყო გულის თითოეული ნაჭრის წონაზე.
გულის ნაჭრის მედია შეიცვალა მედიით, რომელიც შეიცავს 1 μCi/ml [5-3H]-გლუკოზას (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) გლუკოზის უტილიზაციის ანალიზისთვის, როგორც ადრე იყო აღწერილი.ინკუბაციიდან 4 საათის შემდეგ, დაამატეთ 100 μl საშუალო ღია მიკროცენტრიფუგა მილში, რომელიც შეიცავს 100 μl 0.2 N HCl-ს.შემდეგ მილი მოათავსეს სცინტილაციურ მილში, რომელიც შეიცავდა 500 μl dH2O-ს, რათა აორთქლდეს [3H]2O 72 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე.შემდეგ ამოიღეთ მიკროცენტრიფუგის მილი სცინტილაციის მილიდან და დაამატეთ 10 მლ სცინტილაციის სითხე.სცინტილაციის დათვლა ჩატარდა Tri-Carb 2900TR თხევადი ცინტილაციის ანალიზატორის გამოყენებით (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, აშშ).გლუკოზის უტილიზაცია შემდეგ გამოითვლებოდა [5-3H]-გლუკოზის სპეციფიკური აქტივობის, არასრული წონასწორობისა და ფონის, [5-3H]-ის განზავება არა მარკირებულ გლუკოზამდე და სცინტილაციის საწინააღმდეგო ეფექტურობის გათვალისწინებით.მონაცემები ნორმალიზდება გულის მონაკვეთების მასაზე.
ტრიზოლში ქსოვილის ჰომოგენიზაციის შემდეგ, რნმ იზოლირებული იქნა გულის სექციებიდან Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874-ის გამოყენებით მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით.RNAsec ბიბლიოთეკის მომზადება, თანმიმდევრობა და მონაცემთა ანალიზი ჩატარდა შემდეგნაირად:
რნმ-ის ბიბლიოთეკის მოსამზადებლად საწყის მასალად გამოიყენებოდა 1 მკგ რნმ თითო ნიმუშზე.თანმიმდევრობის ბიბლიოთეკები შეიქმნა NEBNext UltraTM RNA ბიბლიოთეკის მოსამზადებელი ნაკრების Illumina-სთვის (NEB, აშშ) მწარმოებლის რეკომენდაციების შესაბამისად და ინდექსის კოდები დაემატა ატრიბუტების თანმიმდევრობებს თითოეული ნიმუშისთვის.მოკლედ, mRNA გაიწმინდა მთლიანი რნმ-დან პოლი-T ოლიგონუკლეოტიდებით მიმაგრებული მაგნიტური მარცვლების გამოყენებით.ფრაგმენტაცია ხორციელდება ორვალენტიანი კათიონების გამოყენებით მაღალ ტემპერატურაზე NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზირებული იყო შემთხვევითი ჰექსამერის პრაიმერებისა და M-MuLV უკუ ტრანსკრიპტაზას (RNase H-) გამოყენებით.მეორე ჯაჭვის cDNA შემდეგ სინთეზირდება დნმ პოლიმერაზა I და RNase H გამოყენებით. დარჩენილი გადახურვები გარდაიქმნება ბლაგვ ბოლოებად ეგზონუკლეაზა/პოლიმერაზას აქტივობით.დნმ-ის ფრაგმენტის 3' ბოლო ადენილაციის შემდეგ, მასზე მიმაგრებულია NEBNext ადაპტერი თმის სამაგრის მარყუჟის სტრუქტურით, რათა მოამზადოს იგი ჰიბრიდიზაციისთვის.სასურველი სიგრძის cDNA ფრაგმენტების შერჩევისთვის 150-200 bp.ბიბლიოთეკის ფრაგმენტები გაიწმინდა AMPure XP სისტემის გამოყენებით (Beckman Coulter, ბევერლი, აშშ).შემდეგ, 3 μl USER ფერმენტი (NEB, აშშ) ზომით შერჩეული cDNA-ით, რომელიც ლიგირებული იყო ადაპტერით, გამოიყენებოდა 15 წუთის განმავლობაში 37°C-ზე და შემდეგ 5 წუთის განმავლობაში 95°C-ზე PCR-მდე.შემდეგ PCR ჩატარდა Phusion High-Fidelity დნმ პოლიმერაზას, უნივერსალური PCR პრაიმერებისა და ინდექსის (X) პრაიმერების გამოყენებით.საბოლოოდ, PCR პროდუქტები გაიწმინდა (AMPure XP სისტემა) და ბიბლიოთეკის ხარისხი შეფასდა Agilent Bioanalyzer 2100 სისტემაზე.შემდეგ cDNA ბიბლიოთეკის სეკვევენირება მოხდა Novaseq sequencer-ის გამოყენებით.Illumina-ს დაუმუშავებელი გამოსახულების ფაილები გადაკეთდა ნედლეულ კითხვად CASAVA Base Calling-ის გამოყენებით.ნედლეული მონაცემები ინახება FASTQ(fq) ფორმატის ფაილებში, რომლებიც შეიცავს წაკითხვის თანმიმდევრობას და შესაბამის საბაზისო ხარისხებს.აირჩიეთ HISAT2 გაფილტრული თანმიმდევრობის წაკითხვის შესატყვისად Sscrofa11.1 საცნობარო გენომთან.ზოგადად, HISAT2 მხარს უჭერს ნებისმიერი ზომის გენომს, მათ შორის 4 მილიარდ ფუძეზე მეტი გენომის ჩათვლით, და ნაგულისხმევი მნიშვნელობები დაყენებულია პარამეტრების უმეტესობისთვის.რნმ-ის Seq მონაცემებიდან წაკითხვის შერწყმა შეიძლება ეფექტურად გასწორდეს HISAT2-ის გამოყენებით, რომელიც ამჟამად ხელმისაწვდომია ყველაზე სწრაფი სისტემის გამოყენებით, იგივე ან უკეთესი სიზუსტით, ვიდრე ნებისმიერი სხვა მეთოდი.
ტრანსკრიპტების სიმრავლე პირდაპირ ასახავს გენის ექსპრესიის დონეს.გენის ექსპრესიის დონე ფასდება ტრანსკრიპტების სიმრავლით (თანმიმდევრობის რაოდენობა) დაკავშირებული გენომთან ან ეგზონებთან.წაკითხვის რაოდენობა პროპორციულია გენის გამოხატვის დონის, გენის სიგრძისა და თანმიმდევრობის სიღრმეზე.FPKM (ფრაგმენტები ათას საბაზისო წყვილზე გადაწერილი ტრანსკრიპტის მიმდევრობით მილიონ ბაზის წყვილზე) და განისაზღვრა დიფერენციალური გამოხატვის P-მნიშვნელობები DESeq2 პაკეტის გამოყენებით.შემდეგ ჩვენ გამოვთვალეთ ცრუ აღმოჩენის მაჩვენებელი (FDR) თითოეული P მნიშვნელობისთვის Benjamini-Hochberg მეთოდის9 გამოყენებით, ჩაშენებული R-ფუნქციის „p.adjust“ საფუძველზე.
გულის სექციებიდან გამოყოფილი რნმ გადაკეთდა cDNA-ში 200 ნგ/მკლ კონცენტრაციით SuperScript IV Vilo Master Mix-ის გამოყენებით Thermo-დან (თერმო, კატ. No. 11756050).რაოდენობრივი RT-PCR ჩატარდა Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 ჭაბურღილის გამჭვირვალე რეაქციის ფირფიტა (თერმო, კატ. No. 4483319) და მიკროამპერ ოპტიკური წებო (თერმო, კატ. No. 4311971).რეაქციის ნარევი შედგებოდა 5 მკლ Taqman Fast Advanced Master mix (თერმო, კატა # 4444557), 0.5 μl Taqman Primer და 3.5 μl H2O შერეული თითო ჭაბურღილში.ჩატარდა სტანდარტული qPCR ციკლები და CT მნიშვნელობები გაზომილი იყო Applied Biosystems Quantstudio 5 რეალურ დროში PCR ინსტრუმენტის გამოყენებით (384 ჭაბურღილის მოდული; პროდუქტი # A28135).Taqman პრაიმერები შეძენილია Thermo-დან (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL8m1 (Ss03375629_u1), RGL8m1 (Ss06908795_m1) 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss08_245-ის 8 CT მნიშვნელობები ნორმალიზებული იყო) GAPDH.
NT-ProBNP-ის მედია გამოშვება შეფასდა NT-ProBNP ნაკრების (ღორის) გამოყენებით (კატ. No. MBS2086979, MyBioSource) მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით.მოკლედ, 250 μl თითოეული ნიმუშისა და სტანდარტის დუბლიკატად დაემატა თითოეულ ჭაბურღილს.ნიმუშის დამატების შემდეგ დაუყოვნებლივ, დაამატეთ 50 მკლ საანალიზო რეაგენტი A თითოეულ ჭაბურღილს.ნაზად შეანჯღრიეთ ფირფიტა და დალუქეთ დალუქვა.შემდეგ ტაბლეტები ინკუბირებულია 37°C ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში.შემდეგ ამოიღეთ ხსნარი და გარეცხეთ ჭაბურღილები 4-ჯერ 350 μl 1X სარეცხი ხსნარით, სარეცხი ხსნარის ინკუბაციით ყოველ ჯერზე 1-2 წუთის განმავლობაში.შემდეგ დაამატეთ 100 μl საანალიზო რეაგენტი B თითო ჭაბურღილში და დალუქეთ ფირფიტის დალუქვით.ტაბლეტი ნაზად შეანჯღრიეთ და ინკუბირებული იყო 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში.შეიწოვეთ ხსნარი და გარეცხეთ ჭაბურღილები 5-ჯერ 350 μl 1X სარეცხი ხსნარით.თითოეულ ჭაბურღილს დაამატეთ 90 μl სუბსტრატის ხსნარი და დახურეთ ფირფიტა.თეფშს ინკუბაცია 37°C-ზე 10-20 წუთის განმავლობაში.თითოეულ ჭაბურღილს დაუმატეთ 50 μl Stop Solution.ფირფიტა მაშინვე გაიზომა Cytation (BioTek) ფირფიტის წამკითხველის გამოყენებით, დაყენებული 450 ნმ.
ჩატარდა სიმძლავრის ანალიზები ჯგუფის ზომების ასარჩევად, რომლებიც უზრუნველყოფენ >80% სიმძლავრეს პარამეტრის 10% აბსოლუტური ცვლილების გამოსავლენად 5% ტიპის I შეცდომის სიხშირით. ჩატარდა სიმძლავრის ანალიზები ჯგუფის ზომების ასარჩევად, რომლებიც უზრუნველყოფენ >80% სიმძლავრეს პარამეტრის 10% აბსოლუტური ცვლილების გამოსავლენად 5% ტიპის I შეცდომის სიხშირით. Analiz moщnosti был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечатување >80% moщnosti для обнаружения 10% აბსოლუტური გაცვლითი პარამეტრა 5% საათი ошибок ტიპის I. სიმძლავრის ანალიზი ჩატარდა ჯგუფის ზომების შესარჩევად, რომლებიც უზრუნველყოფენ >80% სიმძლავრეს 10% პარამეტრის აბსოლუტური ცვლილების გამოსავლენად 5% ტიპის I შეცდომის სიხშირით.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褯型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褯型 Bыl proveden analiz moщnosti для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% სასარგებლო თვისებები 10% აბსოლუტურად გაცვლითი პარამეტრი და 5% საათი ошибок ტიპის I. ჩატარდა სიმძლავრის ანალიზი ჯგუფის ზომის შესარჩევად, რომელიც უზრუნველყოფს >80% სიმძლავრეს 10% პარამეტრის აბსოლუტური ცვლილების და 5% ტიპის I შეცდომის სიხშირის გამოსავლენად.ექსპერიმენტამდე ქსოვილის სექციები შემთხვევით შეირჩა.ყველა ანალიზი იყო პირობითი ბრმა და ნიმუშები გაშიფრული იყო მხოლოდ ყველა მონაცემის გაანალიზების შემდეგ.ყველა სტატისტიკური ანალიზის შესასრულებლად გამოყენებული იქნა GraphPad Prism პროგრამული უზრუნველყოფა (San Diego, CA). ყველა სტატისტიკისთვის, p-მნიშვნელობები ჩაითვალა მნიშვნელოვნად <0.05 მნიშვნელობებზე. ყველა სტატისტიკისთვის, p-მნიშვნელობები ჩაითვალა მნიშვნელოვნად <0,05 მნიშვნელობებზე. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. ყველა სტატისტიკისთვის, p-მნიშვნელობები ჩაითვალა მნიშვნელოვნად <0,05 მნიშვნელობებზე.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. ყველა სტატისტიკისთვის, p-მნიშვნელობები ჩაითვალა მნიშვნელოვნად <0,05 მნიშვნელობებზე.ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი ჩატარდა მონაცემებზე მხოლოდ 2 შედარებით.ცალმხრივი ან ორმხრივი ANOVA იყო გამოყენებული მრავალ ჯგუფს შორის მნიშვნელობის დასადგენად.პოსტ-ჰოკ ტესტების ჩატარებისას, Tukey-ის კორექტირება იქნა გამოყენებული მრავალჯერადი შედარებისთვის.RNAsec მონაცემებს განსაკუთრებული სტატისტიკური მოსაზრებები აქვს FDR და p.adjust გაანგარიშებისას, როგორც აღწერილია მეთოდები სექციაში.
კვლევის დიზაინის შესახებ დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ ბუნების კვლევის ანგარიშის აბსტრაქტი, რომელიც დაკავშირებულია ამ სტატიასთან.