Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз қолданып жатқан шолғыш нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Әзірге қолдауды жалғастыру үшін сайтты мәнерлерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Адамның ішек морфогенезі 3D эпителий микроархитектурасының және кеңістіктік ұйымының крипт-виллус ерекшеліктерін белгілейді. Бұл бірегей құрылым базальды крипттегі дің жасушаларының ұясын экзогендік микробтық антигендер мен олардың метаболиттерінен қорғау арқылы ішек гомеостазын сақтау үшін қажет. Сонымен қатар, ішектің әр түрлі жасушалары бар эпителийдің кілегейлі қабығы мен кілегей қабығын қорғайтын функциялары бар. ішектің шырышты қабатындағы тосқауыл. Сондықтан 3D эпителий құрылымдарын қалпына келтіру in vitro ішек модельдерін құру үшін өте маңызды. Атап айтқанда, органикалық миметикалық ішектің чиптегі ішек эпителийінің өздігінен 3D морфогенезін индукциялауы мүмкін, біз жақсартылған биофизиканы қамтамасыз етеміз. микрофлюидтік чипте, сондай-ақ Transwell ендірілген гибридті чипте ішекте ішек морфогенезін сенімді түрде индукциялауға арналған қайталанатын протокол. Біз құрылғыны жасаудың егжей-тегжейлі әдістерін сипаттаймыз, Caco-2 немесе ішектің органоидты эпителий жасушаларын кәдімгі параметрлерде, сондай-ақ микроплатформада, сондай-ақ 3D платформасында өсіреміз. морфогенез, және көптеген бейнелеу әдістерін пайдалана отырып, белгіленген 3D эпителий сипаттамасы. Бұл хаттама 5 күн бойы базотерапевтік сұйықтық ағынын бақылау арқылы функционалдық ішек микроархитектурасының регенерациясына қол жеткізеді. Біздің in vitro морфогенез әдісіміз физиологиялық маңызды ығысу кернеуін және механикалық қозғалысты пайдаланады және бізде күрделі жасушалық өңдеуді немесе басқа механизмдерді жасауды қажет етпейтін. Біздің ұсынылған хаттама биомедициналық, клиникалық және фармацевтикалық қолданбалар үшін in vitro 3D ішек эпителий қабаттарын қалпына келтіру әдісін қамтамасыз ететін биомедициналық зерттеу қауымдастығы үшін кең әсер етуі мүмкін деп болжаңыз.
Тәжірибе көрсеткендей, чиптегі ішекте өсірілген ішек эпителийі Caco-2 жасушалары 1,2,3,4,5 немесе екі қабатты микрофлюидтік құрылғылар6,7 негізгі механизмді нақты түсінбей in vitro стихиялық 3D морфогенезінен өтуі мүмкін. Біздің жақында жүргізген зерттеуімізде біз бастолатеральды культурадан тазартылған семорогенді құрылғыларды анықтадық. Caco-2 және емделушіден алынған ішек органоидтары көрсеткен in vitro 3D эпителий морфогенезін индукциялау үшін қажетті және жеткілікті. Эпителий жасушалары валидацияланды. Бұл зерттеуде біз күшті Wnt антагонисті Диккопф-1 (DKK-1) микросхемадағы ішекте және құрамында «Гибридті чип» деп аталатын Трансвелл кірістірулері бар модификацияланған микрофлюидтік құрылғыларда жасуша өндірісі мен концентрациясының таралуына ерекше назар аудардық. Чиптегі ішекке 1-репрессор, 1-бүйірленген протеин немесе Soggy-1) бөлінуі морфогенезді тежейді немесе алдын ала құрылымдалған 3D эпителий қабатын бұзады, бұл дақыл кезінде антагонистік стресс ішек морфогенезіне in vitro жауап береді деп болжайды. белсенді шаю (мысалы, чиптегі ішек немесе гибридті-чип платформаларында) немесе диффузиялық .Базолатеральды ортада (мысалы, Трансвелл кірістірулерінен ұңғымалардағы үлкен базолатеральды резервуарларға) базолатеральді бөлімдегі Wnt антагонистерінің деңгейін жою немесе ең аз деңгейде сақтау болып табылады.
Бұл хаттамада біз полидиметилсилоксан (PDMS) негізіндегі кеуекті мембраналардағы (6А, 7А, 8, 9-ші полиэстерлі мембраналар немесе полиэстер 6-қадамдары) ішек эпителий жасушаларын өсіру үшін Трансвелл енгізілетін гибридті чиптерді (1-5-қадамдар) микроқұрылғылар мен Трансвелл арқылы енгізудің егжей-тегжейлі әдісін береміз. 7B, 8, 9) және in vitro индукцияланған 3D морфогенезі (10-қадам). Біз сондай-ақ көптеген бейнелеу әдістерін (11-24-қадамдар) қолдану арқылы тінге тән гистогенезді және ұрпаққа тәуелді жасушалық саралауды көрсететін жасушалық және молекулалық ерекшеліктерді анықтадық. немесе ішек органоидтары, техникалық мәліметтері бар екі культура пішімінде, оның ішінде кеуекті мембраналардың бетінің модификациясы, 2D моноқабаттарын құру және ішектің биохимиялық және биомеханикалық микроортаның көбеюі.in vitro. 2D эпителий моноқабаттарынан 3D морфогенезін индукциялау үшін, біз морфогенді және бүйірлік культура ортасына екі бүйірлік культураны қалыптастыру арқылы базистерді алып тастадық. культура бөлімі.Соңында, біз морфогенге тәуелді эпителий өсуін, бойлық хост-микробиома ко-культураларын, патогенді инфекцияны, қабыну жарақатын, эпителий тосқауылының дисфункциясын және exrap.inf.inf.infunksiya негізіндегі пробиотиктерді модельдеу үшін пайдаланылуы мүмкін регенерацияланатын 3D эпителий қабатының утилитасын ұсынамыз.
Біздің хаттамамыз негізгі (мысалы, ішектің шырышты қабығының биологиясы, дің жасушаларының биологиясы және даму биологиясы) және қолданбалы зерттеулер (мысалы, клиникаға дейінгі дәрілік сынақтар, ауруларды модельдеу, тіндік инженерия және гастроэнтерология) кең ауқымды ғалымдарға пайдалы болуы мүмкін. Біздің протогенездегі морфологиялық тестілердің қайталануы мен беріктігіне байланысты. эпителий in vitro жағдайында біз техникалық стратегиямызды ішек дамуы, регенерация немесе гомеостаз кезінде жасуша сигналының динамикасын зерттейтін аудиторияға таратуға болады деп ойлаймыз .Сонымен қатар, біздің хаттама Norovirus 8, Ауыр жедел респираторлық синдром (CRS-SAfflosV2triicium, CRSSAfflostriicium-2) сияқты әртүрлі жұқпалы агенттер кезінде инфекцияны сұрау үшін пайдалы. Salmonella Typhimurium 9 немесе тырысқақ вибрионы. Аурудың патологиясы мен патогенезін зерттейтін аудитория да пайдалы. Чиптегі ішек микрофизиологиялық жүйесін пайдалану бойлық бірлескен мәдениетке 10 және ас қорыту жолындағы (ГІ) патогенге байланысты зақымдануды қалпына келтіруге 10 және кейіннен хост қорғанысын бағалауға мүмкіндік береді. ойық жаралы колит, поучит немесе тітіркенген ішек синдромын 3D ішек эпителий қабаттары емделушінің 3D ішек эпителий қабаттары арқылы дайындалған кезде имитациялауға болады, бұл ауруларға вилл атрофиясы, крипттің қысқаруы, шырышты қабықтың зақымдалуы немесе эпителий немесе жасушалық тосқауылдың бұзылуы жатады. органоидтер12,13. Ауру ортасының жоғары күрделілігін жақсырақ модельдеу үшін оқырмандар 3D ішек виллусы-крипт микроархитектуралары бар үлгілерге пациенттің перифериялық қан мононуклеарлы жасушалары (PBMCs) сияқты ауруға қатысты жасуша түрлерін қосуды қарастыруы мүмкін. тінге тән иммундық жасушалар, 5.
3D эпителий микроқұрылымын секциялау процесінсіз бекітуге және визуализациялауға болатындықтан, кеңістіктік транскриптомия және жоғары ажыратымдылықтағы немесе өте жоғары ажыратымдылықтағы бейнелеумен жұмыс істейтін көрермендер эпителий тауашаларындағы гендер мен ақуыздардың кеңістік-уақыттық динамикасын картаға түсіруге қызығушылық танытуы мүмкін. Технологияға қызығушылық. Микробтық немесе иммундық тітіркендіргіштерге жауап. Сонымен қатар, ішек гомеостазын үйлестіретін бойлық хост-микробиома 10, 14 айқаспасын әртүрлі микроб түрлерін, микробтық қауымдастықтарды немесе әсіресе фекальді микробиот- г-де-г-де бірге өсіру арқылы 3D ішектің шырышты қабатында орнатуға болады. платформада. Бұл тәсіл шырышты қабықтың иммунологиясын, гастроэнтерологиясын, адам микробиомасын, культуромиканы және клиникалық микробиологияны зерттейтін аудитория үшін ерекше тартымды болып табылады. Бұрын дақылданбаған ішек микробиоталарын зертханада өсіруге ұмтылады. Егер біздің in vitro морфогенез хаттамамыз масштабталатын культура сияқты көп форматтарға бейімделуі мүмкін болса,292, Базолатеральды бөліктерді үздіксіз толтыратын 384 ұңғыма пластиналары, хаттаманы тамақ өнеркәсібіне арналған фармацевтикалық, биомедициналық немесе жоғары өнімді скрининг немесе валидация платформаларын әзірлеушілерге де таратуға болады. Принциптің дәлелі ретінде біз жақында мультиплексті жоғары өткізу қабілетті пластинкалық пішімге морфогендік пішім24 қосу мүмкіндігін көрсеттік. чипте органның көптеген өнімдері коммерцияланды16,17,18.Сондықтан, біздің in vitro морфогенез әдісіміздің валидациясы жеделдетіліп, көптеген зерттеу зертханалары, өнеркәсіп немесе үкіметтік және реттеуші органдар арқылы in vitro ішек морфогенезінің жасушалық қайта бағдарламалануын түсіну үшін қабылдауы мүмкін. үміткерлер ішек морфогенезі процесінің қайталану мүмкіндігін бағалау үшін 3D ішек суррогаттарын немесе тапсырыс немесе коммерциялық орган-а-чип үлгілерін пайдалану арқылы бағаланды.
Ішек эпителий морфогенезін зерттеу үшін адамға қатысты эксперименттік үлгілердің шектеулі саны пайдаланылды, бұл негізінен in vitro 3D морфогенезін индукциялау үшін іске асырылатын хаттамалардың болмауына байланысты. Шындығында, ішек морфогенезі туралы қазіргі білімнің көп бөлігі жануарларды зерттеуге негізделген (мысалы, тауық балығы немесе тышқан, тышқан, тышқан20). шығынды көп қажет етеді, этикалық тұрғыдан күмәнді болуы мүмкін және ең бастысы, адамның даму процестерін дәл анықтамайды. Бұл модельдердің көп жақты масштабталатын әдіспен сыналу мүмкіндігі де өте шектеулі. Сондықтан in vitro 3D ұлпа құрылымдарын қалпына келтіруге арналған хаттамамыз in vivo жануарлар үлгілерінен, сондай-ақ басқа да дәстүрлі түрде сипатталған u2D жасуша культурасынан жоғары нәтиже береді. 3D эпителий құрылымдары әртүрлі шырышты немесе иммундық тітіркендіргіштерге жауап ретінде крипт-виллус осіндегі сараланған жасушалардың кеңістіктік локализациясын зерттеуге мүмкіндік берді. 3D эпителий қабаттары микробтық жасушалардың кеңістіктік қуыстарды қалыптастыру үшін қалай бәсекелесетінін және хост факторларына жауап ретінде экологиялық эволюцияны (мысалы, ішкі шырышты қабықшалар мен кілегей қабықшаларға қарсы, микробқа қарсы және іріңді қабықшаларға қарсы) зерттеуге мүмкіндік береді. пептидтер).Сонымен қатар, 3D эпителий морфологиясы ішек микробиотасының өз қауымдастығын қалай түзетінін және жасушалық ұйымды қалыптастыратын микробтық метаболиттерді (мысалы, қысқа тізбекті май қышқылдары) синергетикалық түрде өндіретінін түсінуге мүмкіндік береді және базальды крипттердегі дің жасушаларының ұяшықтарын қалыптастырады. Бұл ерекшеліктерді тек эпителистік қабатта анықтауға болады3D.
Біздің 3D ішек эпителий құрылымдарын жасау әдістемемізден басқа, бірнеше in vitro әдістері бар. Ішек органоидты культурасы - арнайы морфогендік жағдайларда ішектің дің жасушаларын өсіруге негізделген заманауи тіндік инженерия әдісі23,24,25. Дегенмен, 3D органоидты жасушаларды пайдалану немесе микробикулезді талдау үшін көбінесе органоидты модельдерді тасымалдау болып табылады. өйткені ішек люмені органоидтың ішінде қоршалған, сондықтан микробтық жасушалар немесе экзогендік антигендер сияқты люминальды компоненттерді енгізу шектелген. Органоидты люмендерге қол жеткізуді микроинжектор арқылы жақсартуға болады,26,27, бірақ бұл әдіс инвазивті және еңбекті көп қажет етеді және орындау үшін арнайы білімді қажет етеді.Сонымен қатар, статикалық жағдайда гидрогельдік тіректерде сақталған дәстүрлі органоидты мәдениеттер белсенді in vivo биомеханикасын дәл көрсетпейді.
Бірнеше зерттеу топтары қолданатын басқа тәсілдер гель бетіндегі оқшауланған адам ішек жасушаларын өсіру арқылы ішек эпителий құрылымына еліктеу үшін алдын ала құрылымдалған 3D гидрогельді тіректерді пайдаланады. 3D басып шығарылған, микро фрезерленген немесе литографиялық жолмен жасалған қалыптарды пайдаланып гидрогельді тіректерді жасайды. физиологиялық маңызды морфогендік градиенттер, жоғары арақатынасты эпителий құрылымын және строма-эпителиалды айқастырмаларды тірекке стромалық жасушаларды қосу арқылы белгілейді. Дегенмен, алдын ала құрылымдалған тіректердің табиғаты өздігінен морфогенетикалық процестің өзін көрсетуге кедергі келтіруі мүмкін. Бұл модельдер сонымен қатар сұйықтық ағынының динамикалық, динамикалық жетіспеушілігін қамтамасыз етпейді. ішек жасушалары морфогенезден өтіп, физиологиялық функцияға ие болуы керек. Жақында жүргізілген тағы бір зерттеуде микрофлюидтік платформада гидрогельді тіректер және лазерлік өрнектеу әдістерін қолданатын ішек эпителий құрылымдары қолданылды. Тышқанның ішек органоидтары ішек түтікшелі құрылымдарын және ішілік микрофлюминальды сұйықтықты қолдану арқылы оюланған үлгілерді сақтайды. модуль.Алайда, бұл модель өздігінен жүретін морфогенетикалық процестерді көрсетпейді және ішектің механобиологиялық қозғалысын қамтымайды. Бір топтағы 3D басып шығару әдістері өздігінен морфогенетикалық процестері бар миниатюралық ішек түтіктерін жасай алды. Түтік ішінде әртүрлі ішек сегменттерінің күрделі жасалуына қарамастан, бұл модельде сұйықтықтың ағынының механикалық деформациялану қабілеті де жоқ. шектелген, әсіресе биобасып шығару процесі аяқталғаннан кейін, эксперименттік жағдайларды немесе жасуша-жасушаның өзара әрекеттесуін бұзады. Оның орнына, біздің ұсынылған хаттама ішектің стихиялық морфогенезін, физиологиялық маңызды ығысу кернеуін, ішек моторикасын имитациялайтын биомеханиканы, тәуелсіз апикальды және базолатеральды бөлімдердің қолжетімділігін, комплекстердің биологиялық ревизиялары үшін қол жетімділікті қамтамасыз етеді. біздің in vitro 3D морфогенез протоколымыз бар әдістердің қиындықтарын жеңу үшін қосымша тәсілді қамтамасыз етуі мүмкін.
Біздің хаттама толығымен 3D эпителий морфогенезіне бағытталған, культурада тек эпителий жасушалары және мезенхималық жасушалар, эндотелий жасушалары және иммундық жасушалар сияқты қоршаған жасушалардың басқа түрлері жоқ. Бұрын сипатталғандай, біздің хаттамамыздың өзегі - бүйірлік кресттің ингибиторларын жою арқылы эпителий морфогенезін индукциялау. Біздің чиптегі ішектің және чиптегі гибридтің сенімді модульділігі толқынды 3D эпителий қабатын қайта құруға мүмкіндік бергенімен, эпителий-мезенхималық өзара әрекеттесулер33,34, жасушадан тыс матрица (ECM) тұндыру 35, криптологиялық модельдер сияқты қосымша биологиялық күрделіліктер базальды крипттерде бұдан әрі қарастырылуы керек. Мезенхимадағы стромальды жасушалар (мысалы, фибробласттар) ECM ақуыздарын өндіруде және ішек морфогенезін реттеуде шешуші рөл атқарады in vivo35,37,38. Біздің модельге мезенхималық жасушалардың қосылуы морфогенетикалық процесті және жасуша капелла қабатының тиімділігін арттырды. ішек микроортасында молекулалық тасымалдауды реттеуде маңызды рөл39 және иммундық жасушаларды жинау40. Сонымен қатар, ұлпа үлгілері көп мүшелердің өзара әрекеттесуін көрсету үшін жасалған кезде, тіндердің үлгілері арасында қосылуы мүмкін қан тамырларының құрамдастары міндетті шарт болып табылады. Сондықтан орган-физиологиялық ерекшеліктері бар эндотелий жасушаларын модельдеу үшін дәлірек қосу қажет болуы мүмкін. resolution. Науқастан алынған иммундық жасушалар туа біткен иммундық жауаптарды, антигенді көрсетуді, туа біткен адаптивті иммундық айқастарды және ішек ауруын имитациялау аясында тінге тән иммунитетті көрсету үшін де маңызды.
Гибридті чиптерді пайдалану чиптегі ішекке қарағанда оңайырақ, себебі құрылғыны орнату оңайырақ және Transwell кірістірулерін пайдалану ішек эпителийін масштабтауға мүмкіндік береді. Дегенмен, полиэфирлі мембраналары бар сатылымдағы Transwell кірістірулері серпімді емес және перистальтика тәрізді қозғалыстарды имитациялай алмайды. Сонымен қатар, трансвеллдік кірістіруді априкальды бөлікке орналастырады. апикальды жағында ығысу кернеуі жоқ стационарлық күйде қалды. Апикальды бөліктегі статикалық қасиеттер гибридті чиптерде ұзақ мерзімді бактериялық кокультураны сирек қамтамасыз етеді. Гибридті чиптерді пайдаланған кезде біз Transwell кірістірулерінде 3D морфогенезін сенімді түрде индукциялай алатын болсақ, сұйықтықтың жетіспеушілігі физиологиялық және сәйкес сұйықтық ағынының биомеханикалық деңгейін шектеуі мүмкін. әлеуетті қолданбаларға арналған гибридті чип платформалары.
Чиптегі ішек және чиптегі гибридті дақылдардағы адамның крипт-виллус осін толық масштабты реконструкциялау толық анықталған жоқ. Морфогенез эпителийдің моноқабатынан басталатындықтан, 3D микроархитектуралары біздегі криптографиялық популяцияға жақын морфологиялық ұқсастықты қамтамасыз ете алмайды. микроинженерлік 3D эпителийіндегі базальды крипт домені, крипт және вилл аймақтары анық демаркацияланбаған. Чиптегі жоғары жоғарғы арналар микроинженерлік эпителий биіктігінің жоғарылауына әкелсе де, максималды биіктік әлі де ~300–400 мкм-мен шектеледі. Адамның ішек-қарыншасы мен ірі ішек-қарыншасының нақты тереңдігі ~3 мкм. және тиісінше ~400 мкм, ал жіңішке ішек бүршіктерінің биіктігі ~600 мкм41.
Бейнелеу тұрғысынан, 3D микроархитектураларының орнында өте жоғары ажыратымдылықтағы кескіні чиптегі ішекпен шектелуі мүмкін, өйткені объективті линзадан эпителий қабатына дейін қажетті жұмыс қашықтығы бірнеше миллиметрді құрайды. Бұл мәселені шешу үшін қашықтағы объекті қажет болуы мүмкін. Сонымен қатар, кескіннің жұқа кесінділерін дайындауға байланысты жоғары сапалы кескінді жасау болып табылады. PDMS.Сонымен қатар, чиптегі ішектің қабат-қабат микрофабрикациясы әр қабат арасындағы тұрақты адгезияны қамтитындықтан, эпителий қабатының беткі құрылымын зерттеу үшін жоғарғы қабатты ашу немесе алып тастау өте қиын. Мысалы, сканерлеуші ​​электронды микроскопты (SEM) пайдалану арқылы.
PDMS гидрофобтылығы гидрофобты шағын молекулалармен айналысатын микрофлюидке негізделген зерттеулерде шектеуші фактор болды, өйткені PDMS мұндай гидрофобты молекулаларды бейспецификалық түрде адсорбциялай алады. PDMS-тің баламаларын басқа полимерлік материалдармен бірге қарастыруға болады. Баламалы түрде, PDMS бетінің модификациясы (мысалы, полиэтиленді немесе полиэтиленді материалдармен (мысалы, гликоль) 43 ) гидрофобты молекулалардың адсорбциясын барынша азайту үшін қарастыруға болады.
Ақырында, біздің әдіс жоғары өнімді скринингті немесе «бір өлшемді» пайдаланушыға ыңғайлы эксперименттік платформаны қамтамасыз ету тұрғысынан жақсы сипатталған жоқ. Ағымдағы хаттама CO2 инкубаторында орын алып, ауқымды эксперименттерге жол бермейтін микроқұрылғыға шприцті сорғыны қажет етеді. Бұл шектеуді айтарлықтай жақсартуға болады. 96 ұңғыма немесе 384 шұңқырлы кеуекті кірістірулер үздіксіз толтыруға және базолатеральды ортаны жоюға мүмкіндік береді).
In vitro адам ішек эпителийінің 3D морфогенезін индукциялау үшін біз люмен-капиллярлық интерфейсті жасау үшін екі параллель микроарнадан және олардың арасында серпімді кеуекті мембранадан тұратын микрофлюидтік чипті ішек құрылғысын қолдандық. Сондай-ақ біз бір арналы микрофлюидтік құрылғыны (гиблярлы чиптер ағынын қамтамасыз ететін) пайдалануды көрсетеміз. Трансвелл кірістірулерінде өсірілген эпителий қабаттары. Екі платформада да адамның әртүрлі ішек эпителий жасушаларының морфогенезін базолатеральды бөлімнен морфоген антагонисттерін жою үшін ағынның бағытталған манипуляциясын қолдану арқылы көрсетуге болады. Бүкіл тәжірибелік процедура (1-сурет) бес бөліктен тұрады: (i) Трансвелл микросхемасындағы микросхемадағы чиптер. (1-5 қадамдар; 1 ұяшық), (ii) ішек эпителий жасушаларын (Caco-2 жасушалары) немесе адамның ішек органоидтарын дайындау; 2-5 қораптар), (iii) ішек микросхемаларындағы немесе гибридті чиптердегі ішек эпителий жасушаларының культурасы (6-9-қадамдар), (iv) in vitro 3D морфогенезінің индукциясы (10-қадам) және (v) ) 3D эпителий микроқұрылымын сипаттау үшін (қадамдар, әрі қарай 2-қадамдар, 11-қадамдар бойынша бақылау). төменде) эпителий морфогенезін кеңістіктік, уақыттық, шартты немесе процедуралық бақылаулармен салыстыру арқылы in vitro морфогенезінің тиімділігін тексеруге арналған.
Біз екі түрлі культура платформасын қолдандық: түзу арналары немесе сызықты емес бұралған арналары бар чиптегі ішек немесе микрофлюидтік құрылғыдағы Transwell (TW) кірістірулері бар гибридті чиптер, 1-қорапта сипатталғандай дайындалған және 1-5-қадам. «Құрылғыны жасау» бір микросхеманы немесе эпидемиялы микросхеманы жасаудың негізгі қадамдарын көрсетеді. Жасушалар» осы хаттамада қолданылатын жасуша көзін (Caco-2 немесе адам ішек органоидтары) және культура процедурасын түсіндіреді. «In vitro морфогенез» Како-2 немесе органоидтан алынған эпителий жасушаларын ішек чипінде немесе Трансвелл кірістірулерінде гибридтік чипта және одан әрі гибридтік чипта түзілу сипатында өсіретін жалпы қадамдарды көрсетеді3D. эпителий құрылымы. Бағдарлама қадамының нөмірі немесе қорап нөмірі әрбір көрсеткінің астында көрсетіледі. Қолданбада белгіленген ішек эпителий қабаттарын қалай пайдалануға болатынына мысалдар келтірілген, мысалы, жасуша дифференциациясында, ішек физиологиясын зерттеуде, микробиоманың микробиомасының экожүйесін құруда және ауруларды модельдеуде. ішек микросхемасында түзілген 3D Caco-2 эпителий қабатында көрсетілген.MUC2 сигналы бокал жасушаларында және шырышты қабаттардан бөлінетін шырышта болады. Ішек физиологиясындағы флуоресцентті кескіндер екі флуоресцентті кескіндерді пайдаланып сиал қышқылына және N-ацетилглюкозамин қалдықтарына бояу нәтижесінде пайда болған шырышты көрсетеді. "Хост-микроб бірлескен мәдениеттері" микросхемадағы микробиоманың микробиомасының микроинженерлік жасушалары бар жасыл флуоресцентті протеинді (GFP) экспрессиялайтын ішек таяқшасының ортақ мәдениетін көрсетеді. Оң жақ панельде GFP E. Caco-2 эпителий жасушалары бар GFP E-микробиомаларының локализациясы көрсетіледі. содан кейін F-актинмен (қызыл) және ядролармен (көк) иммунофлуоресценциямен бояу. Ауруды модельдеу бактериялық антигендермен (мысалы, липополисахарид, LPS) және иммундық жасушалармен (мысалы, PBMC-3-ге жасыл эпизодты культура түзген); қабат. Масштаб жолағы, 50 мкм. Төменгі қатардағы кескіндер: анықтаманың рұқсатымен бейімделген «Ұяшықтардың дифференциациясы».2. Оксфорд университетінің баспасы; Анықтама 5 рұқсатымен шығарылған. NAS; «Хост-микробтың бірлескен мәдениеті» сілтеме 3 рұқсатымен бейімделген. NAS; Анықтаманың рұқсатымен бейімделген «Ауруларды модельдеу».5. NAS.
Chip-on-chip және гибридті чиптер жұмсақ литография1,44 арқылы кремний қалыптарынан құйылған және SU-8 үлгісімен өңделген PDMS көшірмелері арқылы дайындалған. Әрбір чиптегі микроарналардың дизайны ығысу кернеуі және гидродинамикалық қысым сияқты гидродинамиканы ескере отырып анықталады1,4,12. қатар орналасқан екі параллель түзу микроарнадан тұратын, күрделі ішекке (кеңейтілген деректер 1b-сурет) айналды, ол сұйықтықтың тұру уақытын ұлғайту, ағынның сызықты емес үлгілері және өсірілген жасушалардың көп осьті деформациясын индукциялау үшін жұп қисық микроарналарды қамтиды (212-суретте күрделі биоканалдарды қажет етеді). қайта жасалған, күрделі ішектің микросхемаларын таңдауға болады. Біз конвультацияланған Gut-Chip де 3D морфогенезін ұқсас уақыт аралығында қатты индукциялайтынын көрсеттік, бұл өсірілген жасуша түріне қарамастан бастапқы Gut-Chip-пен салыстырғанда ұқсас эпителий өсу дәрежесі. бір-бірін алмастыруға болады. SU-8 үлгілері бар кремний қалыптарында өңделген PDMS репликалары қалыптаудан кейін жағымсыз мүмкіндіктерді қамтамасыз етті (2а-сурет). Чиптегі ішекті жасау үшін дайындалған жоғарғы PDMS қабаты кеуекті PDMS пленкасымен дәйекті түрде байланыстырылды, содан кейін қайтымсыз матаны өңдеу арқылы төменгі PDMS қабатымен тураланды (Fig a2b). гибридті чиптер, өңделген PDMS көшірмелері Transwell кірістірулерін орналастыра алатын бір арналы микрофлюидтік құрылғыларды жасау үшін шыны слайдтарға байланыстырылды (сурет 2h және Кеңейтілген деректер 2-сурет). Байланыстыру процесі PDMS репликасының беттерін өңдеу арқылы орындалады және әйнек оттегімен стерильденген плазмаға стерильденген құрылғыға бекітіледі. силикон түтігі, құрылғы қондырғысы ішек эпителийінің 3D морфогенезін орындауға дайын болды (2g-сурет).
a, SU-8 үлгісіндегі кремний қалыптарынан PDMS бөлшектерін дайындаудың схемалық суреті. Кептірілмеген PDMS ерітіндісі кремний қалыпқа (сол жақта) құйылды, 60 °C температурада (ортаңғыда) өңделеді және құйылады (оң жақта). Қалыптан шығарылған PDMS бөліктерге кесіліп, әрі қарай пайдалану үшін тазартылды.b, PDMS қабатының фотосуреті, қолданылған кремний қабатын дайындау үшін Dc фотосуреті. PDMS кеуекті мембранасын жасау үшін қолданылатын кремний пішіні.d, Жоғарғы және төменгі PDMS компоненттерінің және жиналған чиптегі ішек құрылғысының фотосуреттерінің сериясы.e, Жоғарғы, мембраналық және төменгі PDMS компоненттерін теңестіру схемасы. Әрбір қабат плазмамен немесе коронаватикалық өңдеу құрылғысымен қайтымсыз байланыстырылған. қабаттасқан бұралған микроканалдар және вакуумдық камералар.g, Микрофлюидтік жасуша мәдениеті үшін микросхемадағы ішекті орнату. Силиконды түтік пен шприцпен жиналған чиптегі дайындалған ішек жапқышқа орналастырылған. Чип құрылғысы 150 мм қақпақтың қақпағына орналастырылған. гибридті чиптерді қолдану және гибридті чиптерді қолдану арқылы 3D морфогенездің суреттері. Трансвеллді кірістірулер культураға тәуелсіз дайындалған Ішек эпителий жасушаларының 2D моноқабаттары ішектің 3D морфогенезін индукциялау үшін гибридті чипке енгізілді. Қоршаған орта микроканал ішіне микроканал қабатында орнатылады. бар, 1 см.сағ Анықтаманың рұқсатымен қайта басылған.4. Elsevier.
Бұл хаттамада Caco-2 жасуша желісі мен ішек органоидтары эпителий көздері ретінде пайдаланылды (3a-сурет). Жасушалардың екі түрі де тәуелсіз түрде өсірілді (2-қорап және 5-қорап) және микросхемадағы ішектің немесе Transwell кірістірулерінің ECM-жабылған микроарналарын себу үшін пайдаланылды. Жасушалар бір-бірімен қосылған кезде (95% қабықша), Т-колбалардағы Caco-2 жасушалары (10 және 50-ші жолдар арасында) трипсинизация сұйықтығы арқылы диссоциацияланған жасуша суспензияларын дайындау үшін жиналады (2-қорап). Ішек биопсияларынан немесе хирургиялық резекциялардан алынған адам ішек органоидтары 24 шұңқырлы микроструктуралық пластиналарды ұстап тұру үшін Матригел тірек күмбездерінде өсірілді. морфогендер (Wnt, R-spondin және Noggin сияқты) және 3-қорапта сипатталғандай дайындалған өсу факторлары органоидтар диаметрі ~500 мкм-ге дейін өскенше күн сайын толықтырылып отырды. Толығымен өсірілген органоидтар жиналып, ішекке немесе Transwell кірістірулеріне себу үшін бір жасушаларға ыдырайды (бізде әртүрлі чиптерде хабарланған55). ауру түрі 12,13 (мысалы, ойық жаралы колит, Крон ауруы, колоректальды қатерлі ісік немесе қалыпты донор), зақымдану орны (мысалы, зақымданбаған аймаққа қарсы) және тракттағы асқазан-ішек жолдарының орналасуы (мысалы, он екі елі ішек, иеунум, шажырқай ішек, соқыр ішек, тоқ ішек немесе тік ішек). (колоидтар), олар әдетте жіңішке ішек органоидтеріне қарағанда морфогендердің жоғары концентрациясын қажет етеді.
a, Ішек чипіндегі ішек морфогенезін индукциялауға арналған жұмыс ағыны. Бұл хаттамада 3D морфогенезін көрсету үшін Caco-2 адам ішек эпителийі және ішек органоидтары пайдаланылады. Оқшауланған эпителий жасушалары дайындалған ішектің чиптік құрылғысына егілді (жасушалар микросхемадағы микросхемаларға егілді) және қондырылған. (тіркелген) PDMS кеуекті мембранасына 0 (D0) күні апикальды (AP) ағыны басталады және алғашқы 2 күнде сақталады (ағын, AP, D0-D2). Базолатеральды (BL) ағыны да циклдік созылу қозғалыстарымен (созылу, ағын, AP және BL) бірге басталады. 5 күндік микрофлюидтік культурадан кейін (морфогенез, D5) өздігінен пайда болды. Фазалық контрастты кескіндер әрбір тәжірибелік қадамда немесе уақыт нүктесінде Caco-2 жасушаларының репрезентативті морфологиясын көрсетеді (бағаналық график, 100 мкм). Ішек морфогенезінің сәйкес келетін каскадтарын бейнелейтін төрт сызбалық диаграмма сұйықтықтың оңға қарай бағытын көрсетеді. flow.b, белгіленген 3D Caco-2 эпителийінің беткі топологиясын көрсететін SEM кескіні (сол жақта). Үлкейтілген аумақты бөлектейтін кірістірме (ақ сызықша) 3D Caco-2 қабатындағы қалпына келтірілген микробүршіктерді көрсетеді (оң жақта).c, Орнатылған Caco-2 3D көлденең маңдайдан көрінісі, қызыл (ZO- жиек) мембраналық щеткамен үздіксіз 1, қызыл (ZO- жапсырмасы бар щетка) және ядролар (көк) ішек микросхемаларындағы эпителий жасушаларының иммунофлуоресценция конфокальды визуализациясы. Ортаңғы схемаға бағытталған көрсеткілер әрбір конфокальды көрініс үшін ошақтық жазықтықтың орнын көрсетеді.d, фазалық контрастты микроскопия арқылы алынған чипте өсірілген органоидтардағы морфологиялық өзгерістердің уақыт барысы, 3, 11-ші күндерде және оң жақтағы топтамада. берілген кескіннің жоғары үлкейтуін көрсетеді.e, 7.f күні түсірілген кесіндіде ішекте орнатылған органоидты 3D эпителийдің DIC фотомикрографы, дің жасушалары (LGR5; қызыл қызыл), бокал жасушалары (MUC2; жасыл), F-актин (сұр) және 3 күн бойы өсетін чиптер үшін маркерлерді көрсететін қабаттастырылған иммунофлуоресцентті суреттер Эпителий қабатындағы (сол жақта) және 13 күндік (ортаңғы) органоидтар. Сондай-ақ MUC2 сигналынсыз LGR5 сигнализациясын көрсететін кеңейтілген деректерді 3-суретті қараңыз. Ішекте орнатылған 3D органоидты эпителийдің эпителий микроқұрылымын (оң жақта) көрсететін флуоресцентті кескіндер (оң жақтағы C) пластинка қабығын чиппен бояу арқылы ішекте (оң жақта) C3 мембранасын бояу арқылы Мәдениет. Масштаб жолағы 50 мкм, егер басқаша көрсетілмесе.b Анықтаманың рұқсатымен қайта басылған.2. Оксфорд университетінің баспасы; c Анықтаманың рұқсатымен бейімделген.2. Оксфорд университетінің баспасы; e және f сілтеме бойынша рұқсатпен бейімделген.12 Creative Commons лицензиясы бойынша CC BY 4.0.
Чиптегі ішекте сәтті ECM жабыны үшін PDMS кеуекті мембранасының гидрофобты бетін өзгерту қажет. Бұл хаттамада біз PDMS мембраналарының гидрофобтылығын өзгертудің екі түрлі әдісін қолданамыз. Caco-2 жасушаларын өсіру үшін тек ультракүлгін/озонмен өңдеу арқылы бетті белсендіру ғана жеткілікті болды, Ca-DCMco жасушаларының гидрофобтылығын және ECM2 қабатын бекіту үшін. PDMS мембранасы. Дегенмен, органоидты эпителийдің микрофлюидтік культурасы полиэтилениминді (PEI) және глутаральдегидті PDMS микроарналарына дәйекті түрде қолдану арқылы ECM ақуыздарының тиімді тұндырылуына қол жеткізу үшін химиялық негізде бетті функционализациялауды қажет етеді. Беттік модификациядан кейін ECM протеиндері PDMS беткі қабатын жабу үшін тұндырылды және функционалдық органоидталған беттік органоидты енгізеді. эпителий. Жасушалар бекітілгеннен кейін микрофлюидтік жасуша мәдениеті жасушалар толық моноқабатты түзгенше тек ортаны жоғарғы микроарнаға перфузиялау арқылы басталады, ал төменгі микроарна статикалық жағдайларды сақтайды. Бұл бетті белсендіру және ECM жабу үшін оңтайландырылған әдіс PMSD бетінде 3D морфогенезін индукциялау үшін органоидты эпителийді бекітуге мүмкіндік береді.
Трансвелл дақылдары сонымен қатар жасуша себу алдында ECM жабынын қажет етеді; дегенмен, Transwell культуралары кеуекті кірістірулердің бетін белсендіру үшін күрделі алдын ала өңдеу қадамдарын қажет етпейді. Transwell кірістірулеріндегі Caco-2 жасушаларын өсіру үшін кеуекті кірістірулердегі ECM жабыны диссоциацияланған Caco-2 жасушаларының бекітілуін (<1 сағат) және тығыз түйісу тосқауылының түзілуін (<1-2 күн) жылдамдатады). кірістірулер, мембрана бетіне бекітілген (<3 сағ) және органоидтар тосқауыл тұтастығы бар толық моноқабатты қалыптастырғанша сақталады .Трансвелл культуралары гибридті чиптерді қолданбай 24 шұңқырлы пластиналарда орындалады.
In vitro 3D морфогенезін белгіленген эпителий қабатының базолатеральды аспектісіне сұйықтық ағынын қолдану арқылы бастауға болады. Чиптегі ішекте эпителий морфогенезі орта жоғарғы және төменгі микроарналарға перфузияланған кезде басталды (сурет 3a). Бұрын сипатталғандай, сұйықтық ағынын (қосалқы қабаттың) ішіне үздіксіз енгізу өте маңызды. бағытталған бөлінетін морфоген ингибиторлары. Кеуекті мембраналармен байланысқан жасушаларды жеткілікті қоректік заттар мен сарысумен қамтамасыз ету және люминальды ығысу кернеуін тудыру үшін біз әдетте чипте ішекке қосарлы ағынды қолданамыз. Гибридті чиптерде эпителий моноқабаттары бар Transwell кірістірулері гибридті чиптерге енгізілген. Содан кейін порлатеральды жағының астына қоректік орта қолданылады. микроканал. Ішек морфогенезі екі дақылдық платформада да базотерапиялық ағын басталғаннан кейін 3-5 күннен кейін орын алды.
Микроинженерлік 3D эпителий қабаттарының морфологиялық ерекшеліктерін әртүрлі бейнелеу әдістерін қолдану арқылы талдауға болады, соның ішінде фазалық контрастты микроскопия, дифференциалды интерференциялық контраст (DIC) микроскопия, SEM немесе иммунофлуоресценциялық конфокальды микроскопия (3 және 4-суреттер). 3D эпителий қабаттарының. PDMS және полиэфир қабықшаларының оптикалық мөлдірлігіне байланысты чиптегі ішек те, гибридті чип платформалары да құрылғыны кесуді немесе бөлшектеуді қажет етпей-ақ нақты уақыт режимінде in situ кескінді қамтамасыз ете алады. Иммунофлуоресцентті бейнелеуді орындаған кезде (3c, f4-суреттер және ұяшықтармен бекітілген), 4% (масса/көлем) параформальдегид (PFA), одан кейін Triton X-100 және 2% (масса/көлем) ) сиыр сарысуы альбумині (BSA) ретімен. Жасуша түріне байланысты әртүрлі фиксаторлар, өткізгіштер және блоктаушы агенттер қолданылуы мүмкін. Бастапқы антиденелер жасушаның жоғары сатысына тәуелді жасушаларға бағытталған немесе қозғалмалы аймаққа тәуелді маркерлер қолданылады. чип, одан кейін қайталама антиденелер және ядроға (мысалы, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индолға, DAPI) немесе F-актинге (мысалы, флуоресцентті таңбаланған фаллоидинге) бағытталған қарсы бояумен бірге қайталама антиденелер. Флуоресценция негізіндегі тірі бейнелеуді де орындалады. физиологиясы»), микробтық жасушалардың кездейсоқ колонизациясы (1-сурет, «Хост-микробтың бірлескен мәдениеті»), иммундық жасушаларды тарту (1-сурет, «Ауруды модельдеу») немесе 3D эпителий морфологиясының контурлары (3c,f және 4b,c-суреттер) төменгі қабаттың жоғарғы қабатын модификациялау үшін W). 2-суретте көрсетілгендей, 3D эпителий морфологиясын, сондай-ақ апикальды қылшық шекарасындағы микробүрінділерді SEM арқылы көрсетуге болады (3b-сурет). Дифференциалдау маркерлерінің экспрессиясын сандық PCR5 немесе бір жасушалы РНҚ секвенциясын орындау арқылы бағалауға болады. Бұл жағдайда эпителийдің 3D қабаты өседі. гибридті чиптер трипсинация арқылы жиналады, содан кейін молекулалық немесе генетикалық талдау үшін пайдаланылады.
a, Гибридті чипте ішек морфогенезін индукциялауға арналған жұмыс процесі. Гибридті чип платформасында 3D морфогенезін көрсету үшін осы хаттамада Caco-2 және ішек органоидтары пайдаланылады. Бөлінген эпителий жасушалары дайындалған Transwell кірістірулеріне егілді (ТВ алдын ала берілген ұяшықтарды қараңыз және суретте көрсетілген). Transwell кірістірулеріндегі полиэфирлік мембраналар, барлық жасушалар статикалық жағдайда өсірілді (TW культурасы). 7 күннен кейін эпителий жасушаларының 2D моноқабатын қамтитын жалғыз Transwell кірістіру гибридті чипке біріктіріліп, базолатеральды ағынды (Flow, BL) енгізді, бұл ақырында 3D микроэплиталық қабаттың (3D microesis epiphases conta) генерациясына әкелді. әрбір эксперименттік қадамда немесе уақыт нүктесінде қалыпты донордан (C103 сызығы) жоғары көтерілетін тоқ ішектен алынған адам органының эпителий жасушаларының морфологиялық ерекшеліктерін көрсетеді. Жоғарғы қабаттардағы схемалар әрбір қадам үшін эксперименттік конфигурацияны көрсетеді.b, Гибридті чиптер (сол жақта схема) Z органоидты-төменгі эпителиалдық көріністері бар органоидты эпителиальды жасушалардың әртүрлі эпифогенезінде алынған 3D-ге әкелуі мүмкін. позициялар (жоғарғы, ортаңғы және төменгі; оң жақ схемалық және сәйкес нүктелі сызықтарды қараңыз). айқын морфологиялық сипаттамаларды көрсетті. F-актин (көгілдір), ядро ​​(сұр).c, A3D, салыстырмалы гибридті чипке (ең үлкен толық түсірілім) қарсы статикалық Трансвеллде өсірілген органоидты эпителий жасушаларының (3D бұрыштық көрінісі) флуоресцентті конфокальды микросуреттері (3D бұрышты көрініс). 2D тік көлденең қиылған көріністердің (жоғарғы оң жақ бұрышқа енгізілген; «XZ») сонымен қатар 2D және 3D мүмкіндіктерін көрсетеді. Масштаб жолағы, 100 мкм.c Анықтаманың рұқсатымен қайта басылған.4. Elsevier.
Басқару элементтерін бірдей жасушаларды (Caco-2 немесе ішек органоидты эпителий жасушалары) кәдімгі статикалық культура жағдайында екі өлшемді моноқабаттарға өсіру арқылы дайындауға болады. Атап айтқанда, қоректік заттардың сарқылуы микроарналардың шектеулі көлемдік сыйымдылығына байланысты болуы мүмкін (яғни, бастапқы ішек-чиптің жоғарғы арнасында ~ 4 мкл, эпителиальды және эпителиальды дизайнның бастапқы дизайны бойынша). ағынын да салыстыруға болады.
Жұмсақ литография процесі таза бөлмеде орындалуы керек. Чиптегі (жоғарғы және төменгі қабаттар мен мембраналар) және гибридті чиптердегі әр қабат үшін әртүрлі фотомаскалар қолданылды және бөлек кремний пластинкаларында дайындалды, себебі микроканалдардың биіктіктері әртүрлі болды. Чиптегі ішектің жоғарғы және төменгі микроканалдарының мақсатты биіктіктері 500 μм, мақсатты арна биіктігі 500 μм құрайды. гибридті чип 200 мкм.
3 дюймдік кремний пластинасын ацетон қосылған ыдысқа салыңыз. Пластинаны 30 секундқа ақырын айналдырыңыз, содан кейін вафлиді ауада құрғатыңыз. Вафлиді IPA бар табаққа ауыстырыңыз, содан кейін тазалау үшін пластинаны 30 секунд айналдырыңыз.
Пиранья ерітіндісін (сутегі асқын тотығы мен концентрлі күкірт қышқылының қоспасы, 1:3 (көлем/көлем)) кремний пластинкасының бетінен органикалық қалдықтарды барынша жою үшін қосымша пайдалануға болады.
Пиранха ерітіндісі өте коррозиялық және жылу шығарады.Қосымша қауіпсіздік шаралары қажет.Қалдықтарды тастау үшін ерітіндіні суытып, таза, құрғақ қоқыс контейнеріне тасымалдауға рұқсат етіңіз.Қосымша контейнерлерді пайдаланыңыз және қоқыс контейнерлерін дұрыс таңбалаңыз. Толығырақ процедуралар үшін нысанның қауіпсіздік нұсқауларын орындаңыз.
Вафлиді 10 минут бойы 200 °C ыстық плитаға қою арқылы сусыздандырыңыз. Сусыздандырудан кейін вафли салқындату үшін ауада бес рет шайқалды.
Тазартылған кремний пластинкасының ортасына ~10 г фоторезист SU-8 2100 құйыңыз. Фоторезисттті вафлиге біркелкі тарату үшін пинцет қолданыңыз. Фоторезисттің жабысқақтығы аз және оңай таралуы үшін вафлиді кейде 65°C ыстық плитаға қойыңыз. Вафлиді тікелей ыстық плитаға қоймаңыз.
SU-8 айналдыру жабыны арқылы вафлиге біркелкі таратылды. SU-8 кіріс айналуын 100 айн/мин жылдамдықпен 500 айн/мин таралу үшін 5–10 секундқа бағдарламалаңыз. Негізгі айналдыруды 200 мкм қалыңдықтағы үлгілеу үшін 1,500 мкм немесе 500 мкм2 қалыңдығына жету үшін орнатыңыз. Чиптегі ішектің жоғарғы қабаты үшін 500 мкм биіктік; төмендегі «Критикалық қадамдар» бөлімін қараңыз) 300 айн/с 30 секунд 1200 айн/мин жылдамдықпен орнатылады.
Негізгі айналдыру жылдамдығын кремний пластинасында SU-8 үлгісінің мақсатты қалыңдығына сәйкес реттеуге болады.
Чиптегі ішектің үстіңгі қабаты үшін биіктігі 500 мкм болатын SU-8 үлгілерін жасау үшін 250 мкм екі қабатты шығару үшін осы қораптың айналдыру жабыны және жұмсақ пісіру қадамдары (7 және 8-қадамдар) дәйекті түрде қайталанды (9-қадамды қараңыз). 500 мкм биіктікте.
Вафлиді 65 °C температурада 5 минут ыстық пластинаға абайлап қою арқылы SU-8 қапталған вафлиді жұмсақ пісіріңіз, содан кейін параметрді 95 °C-қа ауыстырыңыз және қосымша 40 минут инкубациялаңыз.
Жоғарғы микроарнадағы SU-8 үлгісінің 500 мкм биіктігіне жету үшін қалыңдығы 250 мкм екі SU-8 қабатын жасау үшін 7 және 8 қадамдарды қайталаңыз.
Ультракүлгін масканы туралау құралын пайдаланып, пластинаның экспозиция уақытын есептеу үшін өндірушінің нұсқауларына сәйкес лампа сынамасын орындаңыз.(экспозиция уақыты, мс) = (экспозициялық доза, мДж/см2)/(шам қуаты, мВт/см2).
Экспозиция уақытын анықтағаннан кейін фотомасканы ультракүлгін масканы туралау құралының маска ұстағышына қойыңыз және фотомасканы SU-8 қапталған вафлиге қойыңыз.
УК дисперсиясын азайту үшін фотомасканың басып шығарылған бетін кремний пластинаның SU-8 қапталған жағына тікелей қойыңыз.
SU-8 қапталған пластинаны және фотомасканы алдын ала белгіленген экспозиция уақыты үшін тігінен 260 мДж/см2 УК сәулесіне шығарыңыз (осы қораптың 10-қадамын қараңыз).
Ультракүлгін сәулесінің әсерінен кейін SU-8 қапталған кремний пластиналары биіктігі 200 мкм болатын үлгілерді дайындау үшін әрбір ыстық плитада 65°C температурада 5 минут және 95°C температурада 15 минут пісірілді. Биіктігі 50 мкм болатын үлгілерді жасау үшін пісіруден кейінгі уақытты 95 °C температурада 30 минутқа ұзартыңыз.
Әзірлеуші ​​шыны ыдысқа құйылады, ал пісірілген вафли ыдысқа салынады. SU-8 әзірлеушісінің көлемі шыны пластинаның өлшеміне байланысты әр түрлі болуы мүмкін. Ашық емес SU-8-ді толығымен алып тастау үшін жеткілікті SU-8 әзірлеушісін пайдаланғаныңызға көз жеткізіңіз. Мысалы, 150 мм диаметрі 1 литр сыйымдылығы бар шыны ыдысты пайдаланған кезде, ~L30De molop. мезгіл-мезгіл жұмсақ айналдырумен 25 минут бойы.
Дайындалған пішінді ~10 мл жаңа әзірлеушімен шайыңыз, содан кейін тамшуыр арқылы ерітіндіні бүрку арқылы IPA қосыңыз.
Вафлиді плазмалық тазартқышқа салып, 1,5 минут бойы оттегі плазмасына (атмосфералық газ, мақсатты қысым 1 × 10−5 Торр, қуат 125 Вт) әсер етіңіз.
Вафлиді ішінде шыны слайды бар вакуумды эксикаторға салыңыз. Вафлилер мен сырғытпаларды қатар қоюға болады. Вакуум эксикаторы табақша арқылы бірнеше қабаттарға бөлінген болса, слайдтарды төменгі камераға, ал пластиналарды жоғарғы камераға салыңыз. 100 мкл трихлоро (H,H1H,H2) тамшылатыңыз. 2Н-перфтороктил)силан ерітіндісін шыны слайдқа салып, силанизация үшін вакуумды жағыңыз.
Мұздатылған Caco-2 жасушаларының құтысын 37°C су моншасында ерітіңіз, содан кейін еріген жасушаларды 15 мл 37°C алдын ала жылытылған Caco-2 ортасы бар T75 колбасына ауыстырыңыз.
~90% қосылу кезінде Caco-2 жасушаларын өткізу үшін алдымен жылы Caco-2 ортасы, PBS және 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА 37°C су моншасында.
Вакуумды аспирация арқылы ортаны сорыңыз. Вакуумды аспирацияны қайталау және жаңа PBS қосу арқылы ұяшықтарды 5 мл жылы PBS арқылы екі рет жуыңыз.