Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз қолданып жатқан шолғыш нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Әзірге қолдауды жалғастыру үшін сайтты мәнерлерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Адамның ішек морфогенезі 3D эпителий микроархитектурасының және кеңістіктік ұйымының крипт-виллус ерекшеліктерін белгілейді. Бұл бірегей құрылым базальды крипттегі дің жасушаларының ұясын экзогендік микробтық антигендерден және олардың метаболиттерінен қорғау арқылы ішек гомеостазын сақтау үшін қажет. Сонымен қатар, ішек шырышты қабықшалары бар әртүрлі эпикреиальды жасушалар мен қабықшаларды қорғайды. ішектің шырышты қабатының беті. Сондықтан 3D эпителий құрылымдарын қайта құру in vitro ішек модельдерін құру үшін өте маңызды. Атап айтқанда, органикалық миметикалық ішектің чиптегі ішек эпителийінің өздігінен 3D морфогенезін тудыруы мүмкін, ол биомеханикалық және биомеханикалық функцияны жақсартады. микрофлюидтік чипте, сондай-ақ Transwell ендірілген гибридті чипте ішекте ішек морфогенезін бақылайды. Біз құрылғыны жасаудың егжей-тегжейлі әдістерін сипаттаймыз, Caco-2 немесе ішек органоидты эпителий жасушаларын кәдімгі параметрлерде, сондай-ақ микрофлюидтік платформада, белгіленген эпиморогенезді индукциялау және эпиморогенезді 3D қолдану арқылы культивациялау. Бұл хаттама 5 күн бойы базотерапалды сұйықтық ағынын бақылау арқылы ішектің функционалды микроархитектурасының регенерациясына қол жеткізеді. Біздің in vitro морфогенез әдісіміз физиологиялық маңызды ығысу кернеуін және механикалық қозғалысты пайдаланады және күрделі жасушалық инженерияны немесе манипуляцияны қажет етпейді, бұл басқа қолданыстағы әдістерден асып түсуі мүмкін. биомедициналық, клиникалық және фармацевтикалық қолданбалар үшін in vitro 3D ішек эпителий қабаттарын жеді.
Тәжірибе көрсеткендей, чиптегі ішекте өсірілген ішек эпителийі Caco-2 жасушалары 1,2,3,4,5 немесе екі қабатты микрофлюидтік құрылғылар6,7 негізгі механизмді нақты түсінбестен in vitro стихиялық 3D морфогенезінен өтуі мүмкін. Caco-2 және емделушіден алынған ішек органоидтары көрсеткен in vitro 3D эпителий морфогенезін индукциялайды.Эпителий жасушалары валидацияланды. Бұл зерттеуде біз күшті Wnt антагонисті Диккопф-1 (DKK-1) микросхемадағы ішекте және құрамында «Гибридті чип» деп аталатын Трансвелл кірістірулері бар модификацияланған микрофлюидтік құрылғыларда жасуша өндірісі мен концентрациясының таралуына ерекше назар аудардық. 1, бөртпелермен байланысты протеин 1 немесе Soggy-1) микросхемадағы ішекке бөлінетін морфогенезді тежейді немесе алдын ала құрылымдалған 3D эпителий қабатын бұзады , культура кезінде антагонистік стресс ішек морфогенезіне in vitro жауап береді деген болжам жасайды. Сондықтан, рогенді микроорганизмдердің минималды деңгейіне жетудің практикалық тәсілі робусты жоюға мүмкіндік береді. nt антагонистері базолатеральды бөлімде белсенді жуу арқылы (мысалы, чиптегі ішек немесе гибридті-чип платформаларында) немесе диффузиялық .Базолатеральды ортада (мысалы, Transwell кірістерінен ұңғымалардағы үлкен базолатеральды резервуарларға).
Бұл хаттамада біз полидиметилсилоксан (PDMS) негізіндегі кеуекті мембраналарда (6А, 7А, 8, В мембраналарында, полиэстер 68, полиэстерлерде) ішек эпителий жасушаларын өсіру үшін чиптегі ішек микроқұрылғыларын және Трансвелл енгізілетін гибридті чиптерді (1-5-қадамдар) жасаудың егжей-тегжейлі әдісін береміз. , 9) және индукцияланған 3D морфогенезі in vitro (10-қадам). Біз сондай-ақ көптеген бейнелеу әдістерін (11-24-қадамдарды) қолдану арқылы тінге тән гистогенезді және ұрпаққа тәуелді жасушалық дифференциацияны көрсететін жасушалық және молекулалық ерекшеліктерді анықтадық. Кеуекті мембраналардың бетінің модификациясы, 2D моноқабаттарын құру және ішек биохимиясы және биомеханикалық микроортаның көбеюі. in vitro. 2D эпителий моноқабаттарынан 3D морфогенезін индукциялау үшін біз морфоген антагонистерін алып тастадық, оның ішінде кеуекті мембраналардың бетінің модификациясы, 2D моноқабаттарын жасау, техникалық мәліметтері бар мәдениет пішімдері. Морфогенге тәуелді эпителий өсімін, бойлық хост-микробиома ко-культураларын, патогенді инфекцияны, қабыну жарақатын, эпителий тосқауылының дисфункциясын және пробиотиктерге негізделген терапияларды модельдеу үшін пайдаланылуы мүмкін регенерацияланатын 3D эпителий қабатының утилитасы. Example.fluences.
Біздің хаттамамыз негізгі (мысалы, ішектің шырышты қабығының биологиясы, дің жасушаларының биологиясы және даму биологиясы) және қолданбалы зерттеулер (мысалы, клиникаға дейінгі препараттарды сынау, ауруларды модельдеу, тіндік инженерия және гастроэнтерология) кең ауқымды ғалымдарға пайдалы болуы мүмкін. Біздің протогенездегі протогенездегі эпидемияға төзімділігінің арқасында. vitro, біз техникалық стратегиямызды ішек дамуы, регенерация немесе гомеостаз кезінде жасуша сигнализациясының динамикасын зерттейтін аудиторияға таратуға болады деп ойлаймыз .Сонымен қатар, біздің хаттама Norovirus 8, Ауыр жедел респираторлық синдром Coronavirus 2 (SARSella-CophimurdiV), T-2 (SARSella-CophiliciV) сияқты әртүрлі жұқпалы агенттер кезінде инфекцияны анықтау үшін пайдалы. тырысқақ вибрионы.Аурудың патологиясы мен патогенезін зерттейтін аудитория да пайдалы. Чиптегі ішек микрофизиологиялық жүйесін пайдалану бойлық кокультураға 10 және ас қорыту жолындағы (АІЖ) патогенге байланысты зақымдануды қалпына келтіруге 10 және кейіннен хост қорғанысын бағалауға мүмкіндік береді. колит, поучит немесе тітіркенген ішек синдромын 3D ішек эпителий қабаттары емделушінің 3D ішек эпителий қабаттары арқылы дайындалған кезде модельдеуге болады, бұл ауруларға виллозды атрофия, крипттің қысқаруы, шырышты қабықтың зақымдануы немесе эпителий тосқауылының бұзылуы жатады. ауру ортасының күрделілігін ескере отырып, оқырмандар 3D ішек виллусы-крипт микроархитектуралары бар үлгілерге пациенттің перифериялық қан мононуклеарлы жасушалары (PBMCs) сияқты ауруға қатысты жасуша түрлерін қосуды қарастыруы мүмкін.тінге тән иммундық жасушалар, 5.
3D эпителий микроқұрылымын секциялау процесінсіз бекітуге және визуализациялауға болатындықтан, кеңістіктік транскриптомия және жоғары ажыратымдылықтағы немесе өте жоғары ажыратымдылықтағы бейнелеумен жұмыс істейтін көрермендер эпителий тауашаларындағы гендер мен ақуыздардың кеңістік-уақыттық динамикасын картаға түсіруге қызығушылық танытуы мүмкін.Технологияға қызығушылық. Микробтық немесе иммундық тітіркендіргіштерге жауап. Сонымен қатар, ішек гомеостазын үйлестіретін бойлық хост-микробиома 10, 14 айқаспасын әртүрлі микроб түрлерін, микробтық қауымдастықтарды немесе әсіресе фекальді микробиот- г-де-г-де бірге өсіру арқылы 3D ішектің шырышты қабатында орнатуға болады.платформада. Бұл тәсіл шырышты қабықтың иммунологиясын, гастроэнтерологиясын, адам микробиомасын, культуромиканы және клиникалық микробиологияны зерттейтін аудитория үшін ерекше тартымды болып табылады. Бұрын дақылданбаған ішек микробиоталарын зертханада өсіруге ұмтылады. Егер біздің in vitro морфогенез хаттамамыз масштабталатын культураларға, сондай-ақ көп ұяшықтар пішіміне бейімделуі мүмкін болса, Базолатеральды бөлімдерді үздіксіз толықтырып отыратындықтан, хаттама тамақ өнеркәсібіне арналған фармацевтикалық, биомедициналық немесе жоғары өнімді скрининг немесе валидация платформаларын әзірлеушілерге де таратылуы мүмкін. Принциптің дәлелі ретінде біз жақында мультиплексті жоғары өткізу қабілеттілігінің мүмкіндігін көрсеттік. коммерцияланған16,17,18.Сондықтан, біздің in vitro морфогенез әдісіміздің валидациясы дәрілік заттарды немесе биотерапевттерді пайдалана отырып сынау үшін транскриптомдық деңгейде in vitro ішек морфогенезінің жасушалық қайта бағдарламалануын түсіну үшін көптеген зерттеу зертханалары, өнеркәсіп немесе мемлекеттік және реттеуші агенттіктер арқылы жеделдетілуі және ықтимал қабылдауы мүмкін. ішек морфогенезі процесінің қайталану мүмкіндігін бағалау үшін тапсырыстық немесе коммерциялық орган-а-чип модельдері.
Ішек эпителий морфогенезін зерттеу үшін адамға қатысты эксперименттік үлгілердің шектеулі саны пайдаланылды, бұл негізінен in vitro 3D морфогенезін индукциялау үшін іске асырылатын хаттамалардың болмауына байланысты. Шындығында, ішек морфогенезі туралы қазіргі білімнің көп бөлігі жануарларды зерттеуге негізделген (мысалы, тауық балығы20, тауық балығы20,22,22,202,2020 тауық балықтары және еңбек құны). этикалық тұрғыдан күмәнді болуы және ең бастысы, адамның даму процестерін дәл анықтамайды. Бұл модельдердің көп жақты масштабталатын әдіспен сыналу мүмкіндігі де өте шектеулі. Сондықтан in vitro 3D ұлпа құрылымдарын регенерациялауға арналған протоколымыз in vivo жануарлар үлгілерінен, сондай-ақ бізге бұрынғы эпизодтық 2D үлгілерінен бұрын сипатталған басқа да дәстүрлі статикалық 2D жасушалық культуралардан жоғары нәтиже береді. әртүрлі шырышты немесе иммундық тітіркендіргіштерге жауап ретінде крипт-виллус осіндегі сараланған жасушалардың кеңістіктік локализациясын амин. 3D эпителий қабаттары микроб жасушаларының кеңістіктік тауашаларды және хост факторларына жауап ретінде экологиялық эволюцияны (мысалы, ішкі және сыртқы шырыш қабаттары, IgA3D петиморальды және антиморальды эпидемиялық секреция) қалыптастыру үшін қалай бәсекелесетінін зерттеу үшін кеңістікті қамтамасыз ете алады. ология ішек микробиотасының өз қауымдастықтарын қалай құратынын және жасушалық ұйымды қалыптастыратын (мысалы, қысқа тізбекті май қышқылдары) микробтық метаболиттерді (мысалы, қысқа тізбекті май қышқылдары) қалай шығаратынын түсінуге мүмкіндік береді. Бұл мүмкіндіктерді 3D эпителий қабаттары in vitro жағдайында ғана көрсетуге болады.
Біздің 3D ішек эпителий құрылымдарын жасау әдістемемізден басқа, бірнеше in vitro әдістері бар. Ішек органоидты культурасы - арнайы морфогендік жағдайларда ішектің дің жасушаларын өсіруге негізделген заманауи тіндік инженерия әдісі23,24,25. Дегенмен, 3D органоидты жасушаларды пайдалану көбінесе микробикулезді тасымалдауға арналған органоидты модельдерді немесе микроорганоидтарды талдау болып табылады. ал люмен органоид ішінде қоршалған, сондықтан микробтық жасушалар немесе экзогендік антигендер сияқты люминальды компоненттерді енгізу шектелген.Органоидты люмендерге қол жеткізуді микроинжектор арқылы жақсартуға болады,26,27, бірақ бұл әдіс инвазивті және еңбекті көп қажет етеді және орындау үшін арнайы білімді қажет етеді.Сонымен қатар, статикалық жағдайда гидрогельдік тіректерде сақталған дәстүрлі органоидты мәдениеттер белсенді in vivo биомеханикасын дәл көрсетпейді.
Бірнеше зерттеу топтары қолданатын басқа тәсілдер гель бетінде оқшауланған адам ішек жасушаларын өсіру арқылы ішек эпителий құрылымына еліктеу үшін алдын ала құрылымдалған 3D гидрогельді тіректерді пайдаланады. 3D басып шығарылған, микро-фрезерленген немесе литографиялық жолмен жасалған қалыптарды пайдаланып гидрогельді тіректерді жасау. морфогендік градиенттер, жоғары пропорционалды эпителий құрылымын және строма-эпителиальды айқасты орнату стромалық жасушаларды тірекке қосу арқылы. Дегенмен, алдын ала құрылымдалған тіректердің табиғаты өздігінен морфогенетикалық процестің өзін көрсетуге кедергі келтіруі мүмкін. Бұл модельдер сонымен қатар жасушалардың динамикалық жарық ағынының немесе интерститильді щетканың сынама ағынының жетіспеушілігін қамтамасыз етпейді. генез және физиологиялық функцияға ие болады. Жақында жүргізілген тағы бір зерттеуде микрофлюидтік платформада гидрогельді тіректер және лазерлік сызу әдістерін пайдалана отырып, ішек эпителий құрылымдарының үлгілері пайдаланылды. Тышқанның ішек органоидтары ішек түтікшелі құрылымдарын қалыптастыру үшін оюланған үлгілерді ұстанады және интралюминальды сұйықтық ағыны микрофлюидтік платформада қолданылған. морфогенетикалық процестер мен ішектің механобиологиялық қозғалысын қамтымайды. Бір топтағы 3D басып шығару әдістері өздігінен морфогенетикалық процестері бар миниатюралық ішек түтіктерін жасай алды. Түтік ішінде әртүрлі ішек сегменттерінің күрделі жасалуына қарамастан, бұл модельде люминальды сұйықтық ағыны және механикалық деформация жоқ. Сонымен қатар, модельдің жұмыс істеуі, әсіресе, биожасушалық басып шығарудан кейін, модельдің толық жұмыс істеу жағдайлары шектелуі мүмкін. Оның орнына, біздің ұсынылған хаттама ішектің стихиялық морфогенезін, физиологиялық маңызды ығысу кернеуін, ішек моторикасын имитациялайтын биомеханиканы, тәуелсіз апикальды және базолатеральды бөлімдердің қол жетімділігін және модульдік күрделі биологиялық микроорталарды қайта құруды қамтамасыз етеді. бар әдістер.
Біздің хаттама толығымен 3D эпителий морфогенезіне бағытталған, культурада тек эпителий жасушалары және мезенхималық жасушалар, эндотелий жасушалары және иммундық жасушалар сияқты қоршаған жасушалардың басқа түрлері жоқ. Бұрын сипатталғандай, біздің хаттамамыздың өзегі робусты ингибиторлы робустың ингибиторлары арқылы робусты ингибиторлар арқылы эпителий морфогенезін индукциялау болып табылады. Біздің чиптегі ішектің және чиптегі гибридтің модульділігі толқынды 3D эпителий қабатын, эпителий-мезенхималық өзара әрекеттесулер33,34 сияқты қосымша биологиялық күрделіліктерді, жасушадан тыс матрицаны (ECM) тұндыру 35 және біздің моделімізде криптальды-конструкциялық жасушалардың крипт-виллдерінде қарастырылатын ерекшеліктерін сақтайды. мезенхимадағы тромальды жасушалар (мысалы, фибробласттар) ECM ақуыздарын өндіруде және in vivo35,37,38 ішек морфогенезін реттеуде шешуші рөл атқарады. Біздің модельге мезенхималық жасушалардың қосылуы морфогенетикалық процесті және жасушалардың қосылу тиімділігін арттырды. Эндотелий қабаты немесе иммундық капиллярларды тасымалдауда маңызды рөл атқарады. ішек микроортасында рекруитмент40.Сонымен қатар, ұлпа үлгілері көп мүшелердің өзара әрекеттесуін көрсетуге арналған кезде, ұлпа үлгілері арасында қосылуға болатын тамыр құрамдас бөліктері міндетті шарт болып табылады.Сондықтан, эндотелий жасушаларын орган деңгейіндегі физиологиялық ерекшеліктерді модельдеу үшін қосу қажет болуы мүмкін. туа біткен адаптивті иммундық айқас және ішек ауруын имитациялау аясында тінге тән иммунитет.
Гибридті чиптерді пайдалану чиптегі ішекке қарағанда оңайырақ, себебі құрылғыны орнату оңайырақ және Transwell кірістірулерін пайдалану ішек эпителийін масштабтауға мүмкіндік береді. Дегенмен, полиэфирлі мембраналары бар сатылымдағы Transwell кірістірулері серпімді емес және перистальтика тәрізді қозғалыстарды имитациялай алмайды. Бұдан басқа, трансвеллді қосымша стансада апробридтік қосымша орналаспайды. апикальды жағындағы ығысу кернеуі. Апикальды бөліктегі статикалық қасиеттер гибридті чиптерде ұзақ мерзімді бактериялық кокультураны сирек қамтамасыз етеді. Гибридті чиптерді пайдаланған кезде Transwell кірістірулерінде 3D морфогенезін сенімді түрде индукциялай алатынымызға қарамастан, физиологиялық тұрғыдан сәйкес келетін сұйықтық ағынының микросхемаларының жетіспеушілігі микросхемалар платформасының әлеуетті биомеханикасына шек қоюы мүмкін.
Чиптегі ішек және чиптегі гибридті дақылдардағы адамның крипт-виллус осінің толық масштабты реконструкциялары толық анықталған жоқ. Морфогенез эпителий моноқабатынан басталатындықтан, 3D микроархитектуралары міндетті түрде біз вивоферадағы криптификациялық домендегі криптографиялық популяцияға морфологиялық ұқсастықты қамтамасыз етпейді. микроинженерлік 3D эпителий, крипт және вилл аймақтары анық демаркацияланбаған. Чиптегі жоғары жоғарғы арналар микроинженерлік эпителий биіктігінің жоғарылауына әкелсе де, максималды биіктік әлі де ~300–400 мкм-мен шектеледі. Адамның ішек және үлкен крипттердің нақты тереңдігі ~ 30 мкм және кіші сынамалардағы ~30 мкм, ly, ал жіңішке ішек бүршіктерінің биіктігі ~600 мкм41.
Бейнелеу тұрғысынан алғанда, 3D микроархитектураларын in situ өте жоғары ажыратымдылықпен бейнелеу микросхемадағы ішекпен шектелуі мүмкін, өйткені объективті линзадан эпителий қабатына дейінгі қажетті жұмыс қашықтығы бірнеше миллиметрді құрайды. Бұл мәселені шешу үшін қашықтағы объекті қажет болуы мүмкін. Сонымен қатар, MSF үшін жұқа кесінділерді дайындау қажет. сонымен қатар микросхемадағы ішектің қабат-қабат микрофабрикациясы әр қабат арасындағы тұрақты адгезияны қамтитындықтан, эпителий қабатының беткі құрылымын зерттеу үшін жоғарғы қабатты ашу немесе алып тастау өте қиын. Мысалы, сканерлеуші ​​электронды микроскопты (SEM) пайдалану арқылы.
PDMS гидрофобтылығы гидрофобты шағын молекулалармен айналысатын микрофлюидке негізделген зерттеулерде шектеуші фактор болды, өйткені PDMS мұндай гидрофобты молекулаларды спецификалық емес адсорбциялай алады. PDMS-тің баламаларын басқа полимерлік материалдармен бірге қарастыруға болады. Баламалы түрде, PDMS бетінің модификациясы (мысалы, полиэтиленді (мысалы, g243) полиэтиленді материалдармен) ) гидрофобты молекулалардың адсорбциясын азайту үшін қарастырылуы мүмкін.
Ақырында, біздің әдіс жоғары өнімді скрининг немесе «бір өлшемді» пайдаланушыға ыңғайлы эксперименттік платформаны қамтамасыз ету тұрғысынан жақсы сипатталған жоқ. Ағымдағы хаттама CO2 инкубаторында орын алып, ауқымды эксперименттерге жол бермейтін микроқұрылғыға шприц сорғысын қажет етеді. Бұл шектеуді айтарлықтай жақсартуға болады. 384-ұңқырлы кеуекті кірістірулер, үздіксіз толтыруға және базотерапалды ортаны жоюға мүмкіндік береді).
In vitro адам ішек эпителийінің 3D морфогенезін индукциялау үшін біз люмен-капиллярлық интерфейсті жасау үшін екі параллель микроканалы және олардың арасында серпімді кеуекті мембранасы бар микрофлюидті чипті ішек құрылғысын қолдандық. Сондай-ақ біз бір арналы микрофлюидтік құрылғыны пайдалануды көрсетеміз. Transwell кірістірулерінде. Екі платформада да адамның әртүрлі ішек эпителий жасушаларының морфогенезін базолатеральді бөлімнен морфоген антагонисттерін жою үшін ағынның бағытталған манипуляциясын қолдану арқылы көрсетуге болады. Бүкіл эксперименттік процедура (1-сурет) бес бөліктен тұрады: (i) ішектің микрофабрикациясы (і) ішектің микрофабрикациясы (1-сурет) ) ішек эпителий жасушаларын (Caco-2 жасушалары) немесе адамның ішек органоидтарын дайындау;2-5 қораптар), (iii) ішек микросхемаларында немесе гибридті чиптерде ішек эпителий жасушаларын өсіру (6-9 қадамдар), (iv) in vitro 3D морфогенезін индукциялау (10-қадам) және (v) ) 3D эпителий микроқұрылымын сипаттау үшін (төменде жарамды бақылау тобына сәйкес 1-2-қадамдар). эпителий морфогенезін кеңістіктік, уақытша, шартты немесе процедуралық бақылаулармен салыстыру арқылы in vitro морфогенезінің тиімділігін анықтады.
Біз екі түрлі культура платформасын қолдандық: түзу арналары немесе сызықты емес бұралған арналары бар чиптегі ішек немесе микрофлюидтік құрылғыдағы Transwell (TW) кірістірулері бар гибридті чиптер, 1-қоспада сипатталғандай дайындалған және 1-5-қадам. «Құрылғыны жасау» эпизодтық микросхеманың бір микросхемасын немесе эпидемиялы микросхемалардың гибридтік чиптерін жасаудың негізгі қадамдарын көрсетеді. жасуша көзі (Caco-2 немесе адам ішек органоидтары) және осы хаттамада қолданылатын культура процедурасы. «In vitro морфогенез» Како-2 немесе органоидтан алынған эпителий жасушаларын ішек чипінде немесе гибридті чиптің Transwell кірістірулерінде өсіретін жалпы қадамдарды көрсетеді, содан кейін эпиморогендік құрылымның индукциясы немесе эпиморогендік құрылымның 3D санының индукциясы. Әрбір көрсеткінің астында көрсетіледі. Қолданбада белгіленген ішек эпителий қабаттарын қалай қолдануға болатыны мысалдары келтірілген, мысалы, жасуша дифференциациясында, ішек физиологиясын зерттеуде, хост-микробиоманың экожүйесін құруда және ауруларды модельдеуде. Иммунофлуоресценция кескіндері «Жасуша дифференциациясында» M2-D эпителий қабатын генерациялайтын және FUC-де эпителий қабатын білдіретін, ішек чипінде.MUC2 сигналы бокал жасушаларында және шырышты қабаттардан бөлінетін шырышта болады. Ішек физиологиясындағы флуоресцентті суреттер бидай ұрықтары агглютининінің флуоресцентті көмегімен сиал қышқылына және N-ацетилглюкозамин қалдықтарына бояу арқылы өндірілген шырышты көрсетеді. Екі қабаттасушы-қосушы-микробикулярлы бейнелер "H-C-H"-де бір-біріне сәйкес келетін микро- микроб-көп өкілдерін көрсетеді. чиптегі ішекте s. Сол жақ панель микроинженерлік 3D Caco-2 эпителий жасушаларымен жасыл флуоресцентті ақуызды (GFP) экспрессиялайтын E. coli бірлескен мәдениетін көрсетеді. Оң жақ панель 3D Caco-2 эпителий жасушаларымен және F-Bluease-қызыл иммундық жасушалармен (одан кейін нуклеозды нуклеозды модельдермен) бірге өсірілген GFP E. coli локализациясын көрсетеді. ing бактериялық антигендермен (мысалы, липополисахарид, LPS) және иммундық жасушалармен (мысалы, PBMC);жасыл).3D эпителий қабатын орнату үшін Caco-2 жасушалары өсірілді. Масштаб жолағы, 50 мкм. Төменгі қатардағы суреттер: анықтаманың рұқсатымен бейімделген «Жасушалардың дифференциациясы».2.Оксфорд университетінің баспасы;Анықтама 5 рұқсатымен шығарылған.NAS;«Хост-микробтың бірлескен мәдениеті» сілтеме 3 рұқсатымен бейімделген.NAS;Анықтаманың рұқсатымен бейімделген «Ауруларды модельдеу».5.NAS.
Chip-on-chip және гибридті чиптер жұмсақ литография1,44 арқылы кремний қалыптарынан құйылған және SU-8 үлгісімен өңделген PDMS көшірмелерін қолдану арқылы дайындалған. Әрбір чиптегі микроарналардың дизайны ығысу кернеуі және гидродинамикалық қысым сияқты гидродинамиканы ескере отырып анықталады1,4,12. Бұл екі бөліктен тұрады. параллель түзу микроканалдарды орналастырды, күрделі ішекке айналды (кеңейтілген деректер 1b-сурет), ол сұйықтықтың тұру уақытын ұлғайту, ағынның сызықты емес үлгілері және өсірілген жасушалардың көп осьті деформациясын (2a-f-сурет) индукциялау үшін қисық микроарналардың жұбын қамтиды (2а-f-сурет) күрделі биоканикалық күрделі қайта өңдеуді қажет етеді. таңдауға болады. Біз бұралған Gut-Chip сондай-ақ 3D морфогенезін ұқсас уақыт шеңберінде, өсірілген жасуша түріне қарамастан, эпителий өсімінің ұқсас дәрежесімен бастапқы Gut-Chip-мен күшті түрде индукциялайтынын көрсеттік. Сондықтан, 3D морфогенезін индукциялау үшін сызықтық және күрделі мольдік репродуктивті репродукциялар бар. SU-8 үлгілері бар ds қалыптаудан кейін жағымсыз қасиеттерді қамтамасыз етті (Cурет 1).2a). Ішекті чипте жасау үшін, дайындалған жоғарғы PDMS қабаты кеуекті PDMS пленкасымен дәйекті түрде байланыстырылды, содан кейін тәжді өңдеу құралының көмегімен қайтымсыз байланыстыру арқылы төменгі PDMS қабатымен теңестірілді (2б-f-сурет). Гибридті чиптерді жасау үшін, өңделген PDMS репликалары бір шыны микрокомодтық құрылғыларға қосылатын біртұтас микромодикалық құрылғыларды жасай алады. ұңғыма кірістірулері (Cурет 2h және Кеңейтілген деректер 2-сурет). Байланыстыру процесі PDMS репликасының және шынының беттерін оттегі плазмасымен немесе тәжді өңдеумен өңдеу арқылы орындалады. Силикон түтікке бекітілген микрофабрикалы құрылғыны зарарсыздандырудан кейін құрылғыны орнату 3D морфогенезінің тестілеуін орындауға дайын болды.
a, SU-8 үлгісіндегі кремний қалыптарынан PDMS бөлшектерін дайындаудың сызбалық суреті. Кептірілмеген PDMS ерітіндісі кремний қалыпқа (сол жақта) құйылды, 60 °C температурада (ортаңғыда) өңделеді және қалыптан шығарылды (оң жақта). Қалыптан шығарылған PDMS бөліктерге кесіліп, әрі қарай пайдалану үшін тазартылды.b, кремнийді дайындауға арналған PDMS фотосуреті. PDMS кеуекті мембранасын жасау үшін пайдаланылады.d, Жоғарғы және төменгі PDMS құрамдастарының және жиналған чиптегі ішек құрылғысының фотосуреттерінің сериясы.e, Жоғарғы, мембраналық және төменгі PDMS құрамдастарының туралану схемасы. Әрбір қабат плазмамен немесе тәжді өңдеумен қайтымсыз байланыстырылған. s және вакуумдық камералар.g, Микрофлюидтік жасуша культурасына арналған чипте ішекті орнату. Силиконды түтік пен шприцпен жиналған чиптегі дайындалған ішек қабықшаға орналастырылды. Чип құрылғысы өңдеуге арналған 150 мм Петри табақшасының қақпағына орналастырылды. Тұтқыр мата чиптерін және визуалды түтіктерді жабу үшін қолданылады. гибридті чиптерді қолдану арқылы морфогенез. Мәдениетке тәуелсіз дайындалған Трансвелл кірістірулері ішек эпителий жасушаларының 2D моноқабаттары ішектің 3D морфогенезін индукциялау үшін гибридті чипке енгізілді. Орта Transwell сілтемесінде орнатылған жасуша қабатының астындағы микроканалдар арқылы перфузияланады, см.Elsevier.
Бұл хаттамада Caco-2 жасуша желісі мен ішек органоидтары эпителий көздері ретінде пайдаланылды (3a-сурет). Жасушалардың екі түрі де тәуелсіз түрде өсірілді (2-қорап және 5-қорап) және микросхемадағы ішектің немесе Трансвелл кірістірулерінің ECM-жабылған микроарналарын себу үшін пайдаланылды. Жасушалар қосылған кезде (Cacouts% robets inserts), 10 және 50 үзінділер) трипсинизация сұйықтығы арқылы диссоциацияланған жасуша суспензияларын дайындау үшін T-колбалардағы (2-қорап) жиналады. Ішек биопсияларынан немесе хирургиялық резекциялардан алынған адам ішек органоидтары құрылымдық микроорганизмдерді (R-М) қамтамасыз ету үшін 24 шұңқырлы пластиналардағы Матригел тірек күмбездерінде өсірілді. спондин, және Ноггин) және өсу факторлары 3 қорапта сипатталғандай дайындалған органоидтар диаметрі ~500 мкм дейін өскенше күн сайын толықтырылды. Толығымен өсірілген органоидтар жиналып, ішекке немесе Трансвелл кірістірулеріне чипке себу үшін бір жасушаларға бөлінеді (5 қорап). n ауруы, колоректальды қатерлі ісік немесе қалыпты донор), зақымдану орны (мысалы, зақымданбаған аймаққа қарсы) және трактідегі асқазан-ішек жолдарының орналасуы (мысалы, он екі елі ішек, иежум, шажырқай ішек, соқыр ішек, тоқ ішек немесе тік ішек). Біз тоқ ішек органоидтарының кішігірім концентрациясын қажет ететін тоқ ішек органоидтарын өсіруге қарағанда 5-ші қорапта оңтайландырылған хаттаманы береміз. с.
a, Ішек чипіндегі ішек морфогенезін индукциялауға арналған жұмыс ағыны. Бұл хаттамада 3D морфогенезін көрсету үшін Caco-2 адам ішек эпителийі және ішек органоидтары пайдаланылады. Оқшауланған эпителий жасушалары дайындалған чиптегі ішекке егілді (жасушалар микросхемаға бекітіледі) (О-дайындалған) D). MS кеуекті мембранасы 0 (D0) күні, апикальды (AP) ағыны басталады және алғашқы 2 күнде сақталады (ағын, AP, D0-D2). Базолатеральды (BL) ағыны да циклдік созылу қозғалыстарымен (созылу, ағын, AP және BL) бірге басталады. идик культурасы (морфогенез, D5). Фазалық контрастты кескіндер әрбір эксперименттік қадамда немесе уақыт нүктесінде Caco-2 жасушаларының репрезентативті морфологиясын көрсетеді (бағаналық график, 100 мкм). Ішек морфогенезінің сәйкес каскадтарын суреттейтін төрт схемалық диаграмма (жоғарғы оң жақта). Үзік сызылған көрсеткілер S сұйықтық ағынының жоғарғы бағытын көрсетеді. -2 эпителий (сол жақта).Үлкейтілген аймақты бөлектейтін кірістірме (ақ сызықша) 3D Caco-2 қабатындағы қалпына келтірілген микробүрінділерді көрсетеді (оң жақта).c, орнатылған Caco-2 3D көлденең маңдайдан көрінісі, клаудин (ZO-1, қызыл) және F-актин (жасыл) жасушалардың эпителийі (жасыл) және көрнекі жасушалардың эпителиализациясы таңбаланған үздіксіз щеткалы шекаралық мембраналар. ішек микросхемаларында. Ортаңғы схемаға бағытталған көрсеткілер әрбір конфокальды көрініс үшін ошақтық жазықтықтың орналасуын көрсетеді.d, 3, 7, 9, 11 және 13-ші күндері фазалық контрастты микроскопия арқылы алынған чипте өсірілген органоидтардағы морфологиялық өзгерістердің уақыт барысы. Кірістіру (жоғарғы оң жақта) D органының эпикрограммасының белгіленген жоғары ұлғайтылған суретін көрсетеді. 7.f күні алынған кесіндідегі ішек, Дің жасушаларына арналған маркерлерді көрсететін қабаттастырылған иммунофлуоресценция суреттері (LGR5;эпителий қабатында сәйкесінше (сол жақта) және 13 күндік (ортаңғы) органоидтарда 3 күн бойы ішек чиптерінде өсірілген қызыл қызыл), бокал жасушалары (MUC2; жасыл), F-актин (сұр) және ядролар (көгілдір). Культураның 13-ші күні CellMask бояуымен (оң жақта) плазмалық мембрананы бояу арқылы чипте ішекте орнатылған 3D органоидты эпителий. Егер басқаша көрсетілмесе, масштаб жолағы 50 мкм құрайды.b Анықтаманың рұқсатымен қайта басылған.2.Оксфорд университетінің баспасы;c Анықтаманың рұқсатымен бейімделген.2.Оксфорд университетінің баспасы;e және f сілтеме бойынша рұқсатпен бейімделген.12 Creative Commons лицензиясы бойынша CC BY 4.0.
Чиптегі ішекте сәтті ECM жабыны үшін PDMS кеуекті мембранасының гидрофобты бетін өзгерту қажет. Бұл хаттамада біз PDMS мембраналарының гидрофобтылығын өзгертудің екі түрлі әдісін қолданамыз. Caco-2 жасушаларын өсіру үшін тек ультракүлгін/озонмен өңдеу арқылы бетті белсендіру жеткілікті болды, PCMMS2 мембранасының гидрофобтылығын және PCM2 мембранасының мембранасының гидрофобтылығын төмендету үшін PDMS2 жасушаларын бекіту. .Алайда, органоидты эпителийдің микрофлюидтік культурасы полиэтиленейминді (PEI) және глутаральдегидті PDMS микроарналарына дәйекті қолдану арқылы ECM ақуыздарының тиімді тұндырылуына қол жеткізу үшін химиялық негізделген бетті функционализациялауды талап етеді. Беттік модификациядан кейін ECM ақуыздары функционалдық PDMS жасушаларын жабу үшін тұндырылды, содан кейін функционалдық PDMS органикалық жасушалардың беткі қабатына бекітіледі. сұйық жасуша культурасы жасушалар толық моноқабатты қалыптастырғанша ортаны тек жоғарғы микроарнаға перфузиялау арқылы басталады, ал төменгі микроарна статикалық жағдайларды сақтайды. Бұл бетті белсендіру және ECM жабу үшін оңтайландырылған әдіс PDMS бетінде 3D морфогенезін индукциялау үшін органоидты эпителийді бекітуге мүмкіндік береді.
Трансвелл дақылдары сонымен қатар жасуша себу алдында ECM жабынын қажет етеді;дегенмен, Transwell культуралары кеуекті кірістірулердің бетін белсендіру үшін күрделі алдын ала өңдеу қадамдарын қажет етпейді. Transwell кірістірулеріндегі Caco-2 жасушаларын өсіру үшін, кеуекті кірістірулердегі ECM жабыны диссоциацияланған Caco-2 жасушаларының бекітілуін (<1 сағат) және тығыз түйісу тосқауылының түзілуін (<1-2 күн) жылдамдатады). мембрана бетіне дейін (<3 сағ) түзіледі және органоидтар тосқауыл тұтастығы бар толық моноқабатты түзгенше сақталады. Трансвелл дақылдары гибридті чиптерді қолданбай 24 шұңқырлы пластиналарда орындалады.
In vitro 3D морфогенезін белгіленген эпителий қабатының базотерапиялық жағына сұйықтық ағынын қолдану арқылы бастауға болады. Чиптегі ішекте эпителий морфогенезі орта жоғарғы және төменгі микроарналарға перфузияланған кезде басталды (3a-сурет). Бұрын сипатталғандай, сұйықтық ағынының үздіксіз бағытын енгізу үшін маңызды болып табылады. морфоген ингибиторлары. Кеуекті мембраналармен байланысқан жасушаларды жеткілікті қоректік заттармен және сарысумен қамтамасыз ету және люминальды ығысу кернеуін генерациялау үшін біз әдетте чипте ішекте қос ағынды қолданамыз. Гибридті чиптерде эпителий моноқабаттары бар Transwell кірістірулері гибридті чиптерге енгізілді. Содан кейін трансвелдік кірістіру гибридті чиптерге енгізілді. Содан кейін трансвелдік кірістіру гибридті чиптерге енгізілді. екі культура платформасында базолатеральды ағын басталғаннан кейін 3-5 күннен кейін пайда болды.
Микроинженерлік 3D эпителий қабаттарының морфологиялық ерекшеліктерін әртүрлі бейнелеу әдістерін қолдану арқылы талдауға болады, соның ішінде фазалық контрастты микроскопия, дифференциалды интерференциялық контраст (DIC) микроскопия, SEM немесе иммунофлуоресцентті конфокальды микроскопия (3 және 4-суреттер). Кез келген уақытта фазалық контрастты бақылау немесе DIC пішінін культурациялау кезінде оңай орындауға болады. телиальды қабаттар. PDMS және полиэфирлі пленкалардың оптикалық мөлдірлігіне байланысты чиптегі ішек те, гибридті чип платформалары да құрылғыны кесуді немесе бөлшектеуді қажет етпей-ақ нақты уақыт режимінде in situ кескінін қамтамасыз ете алады. Иммунофлуоресценциялық бейнелеуді орындаған кезде (1, 4б-суреттер, әдетте, ұяшықтармен бекітілген) альдегид (PFA), содан кейін Triton X-100 және 2% (масса/көлем)) ірі қара сарысуы альбумині (BSA) ретімен. Жасуша түріне байланысты әр түрлі бекіткіштер, өткізгіштер және блоктаушы агенттер қолданылуы мүмкін. Тіпке тәуелді жасушаны немесе аймақты нысанаға алатын біріншілік антиденелер екінші реттік антиденелер, жоғары мобильді микросхемаларда, қарсы жасушалармен бірге қолданылады. ядроға (мысалы, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индолға, DAPI) немесе F-актинге (мысалы, флуоресценттік таңбаланған фаллоидинге) бағытталған дақ бояуы. Сондай-ақ, флуоресценция негізіндегі тірі бейнелеу шырыш түзілуін анықтау үшін in situ жүргізілуі мүмкін (Cурет ).1, «Жасуша дифференциациясы» және «Ішек физиологиясы»), микробтық жасушалардың кездейсоқ колонизациясы (1-сурет, «Хост-микробтың бірлескен мәдениеті»), иммундық жасушалардың тартылуы (1-сурет, «Ауруды модельдеу») немесе 3D эпителий морфологиясының контурлары (Fig. жоғарғы қабатын төменгі микроарна қабатынан бөлу үшін, 2-суретте көрсетілгендей, 3D эпителий морфологиясын, сондай-ақ апикальды қылшық шекарасындағы микробүрінділерді SEM арқылы көруге болады (3б-сурет). Саралау маркерлерінің экспрессиясын сандық PCR5 орындау арқылы бағалауға болады. s немесе гибридті чиптер трипсинация арқылы жиналады, содан кейін молекулалық немесе генетикалық талдау үшін пайдаланылады.
a, Гибридті чипте ішек морфогенезін индукциялауға арналған жұмыс процесі. Бұл хаттамада гибридті чип платформасында 3D морфогенезін көрсету үшін Caco-2 және ішек органоидтары пайдаланылады. Бөлінген эпителий жасушалары дайындалған Transwell кірістірулеріне егілді (төменде полиэфирге бекітілген жасушалар) және полиэфирді қараңыз). ұңғыма кірістірулері, барлық жасушалар статикалық жағдайда өсірілді (TW мәдениеті). 7 күннен кейін эпителий жасушаларының 2D моноқабатын қамтитын жалғыз Transwell кірістіру гибридті чипке біріктіріліп, базотерапевтік ағынды (Flow, BL) енгізді, бұл сайып келгенде, 3D эпителий қабатының генерациясына әкелді (Flow, BL), бұл адам эпителийінің микроорганизмінің микроорганизмдерінің сыртқы ерекшеліктерін көрсетеді. әрбір эксперименттік қадамда немесе уақыт нүктесінде қалыпты донордан (C103 сызығы) жоғары көтерілетін қос нүктеден алынған lial жасушалар. Жоғарғы қабаттардағы схемалар әрбір қадам үшін эксперименттік конфигурацияны суреттейді.b, Гибридті чиптер (сол жақта схема) органоидты эпителий жасушаларының 3D морфогенезіне әкелуі мүмкін (жоғарыдан төменге қарай әртүрлі микроскопиялық және орташа конфигурациялар алынған, Z ортасы әртүрлі конфигурациялар);оң жақ схемалық және сәйкес нүктелі сызықтарды қараңыз).айқын морфологиялық сипаттамаларды көрсетті. F-актин (көгілдір), ядро ​​(сұр).c, 2D салыстырмалы гибридті чипке (ең үлкен толық түсірілім) қарсы статикалық Трансвеллде өсірілген органоидты эпителий жасушаларының (3D бұрыштық көрінісі) флуоресцентті конфокальды микрографтар (3D бұрышты көрініс). тік қиылған көріністер (жоғарғы оң жақ бұрышта кірістірілген; «XZ») сонымен қатар 2D және 3D мүмкіндіктерін көрсетеді. Масштаб жолағы, 100 мкм.c Анықтаманың рұқсатымен қайта басылған.4.Elsevier.
Бақылау элементтерін бірдей жасушаларды (Како-2 немесе ішек органоидты эпителий жасушалары) кәдімгі статикалық культура жағдайында екі өлшемді моноқабаттарға өсіру арқылы дайындауға болады. Атап айтқанда, қоректік заттардың сарқылуы микроарналардың шектеулі көлемдік сыйымдылығына байланысты болуы мүмкін (яғни, бастапқы ішек ағынының жоғарғы арнасында ~ 4 мкЛ, ішек чипінің дизайнына дейін және эпителиальды ағынды қолданудан кейін де болуы мүмкін). салыстырылды.
Жұмсақ литография процесі таза бөлмеде орындалуы керек. Чиптегі (жоғарғы және төменгі қабаттар мен мембраналар) және гибридті чиптердегі әрбір қабат үшін әртүрлі фотомаскалар қолданылды және бөлек кремний пластинкаларында дайындалды, себебі микроканалдардың биіктіктері әртүрлі болды. Чиптегі ішектің жоғарғы және төменгі микроканалдарының мақсатты биіктіктері 500 мкм арна биіктігіне сәйкес және 500 мкм гибридті құрайды. чип 200 мкм.
3 дюймдік кремний пластинасын ацетон қосылған ыдысқа салыңыз. Пластинаны 30 секундқа ақырын айналдырыңыз, содан кейін вафлиді ауада құрғатыңыз. Вафлиді IPA бар табаққа ауыстырыңыз, содан кейін тазалау үшін пластинаны 30 секунд айналдырыңыз.
Пиранья ерітіндісін (сутегі асқын тотығы мен концентрлі күкірт қышқылының қоспасы, 1:3 (көлем/көлем)) кремний пластинкасының бетінен органикалық қалдықтарды барынша жою үшін қосымша пайдалануға болады.
Пиранха ерітіндісі өте коррозиялық және жылу шығарады.Қосымша қауіпсіздік шаралары қажет.Қалдықтарды тастау үшін ерітіндіні суытып, таза, құрғақ қоқыс контейнеріне тасымалдауға рұқсат етіңіз.Қосымша контейнерлерді пайдаланыңыз және қоқыс контейнерлерін дұрыс таңбалаңыз. Толығырақ процедуралар үшін нысанның қауіпсіздік нұсқауларын орындаңыз.
Вафлиді 10 минут бойы 200 °C ыстық плитаға қою арқылы сусыздандырыңыз. Сусыздандырудан кейін вафли салқындату үшін ауада бес рет шайқалды.
Тазартылған кремний пластинасының ортасына ~10 г фоторезист SU-8 2100 құйыңыз. Фоторезисттті вафлиге біркелкі тарату үшін пинцет қолданыңыз. Фоторезисттің жабысқақтығы аз және оңай жайылуы үшін вафлиді кейде 65°C ыстық плитаға қойыңыз. Вафлиді тікелей ыстық плитаға қоймаңыз.
SU-8 айналдыру жабыны арқылы вафлиге біркелкі таратылды. SU-8 кіріс айналымын 5-10 секундқа 100 айн/мин жылдамдықпен 500 айн/мин таралу үшін бағдарламалаңыз. Негізгі айналдыруды 200 мкм қалыңдықтағы үлгілеу үшін 1,500 мкм немесе қалыңдығы 500 мкм 500 мкм жету үшін орнатыңыз. микросхемадағы ішектің үстіңгі қабаты үшін м биіктігі; төмендегі «Критикалық қадамдар» бөлімін қараңыз) 300 айн/мин жылдамдықпен 30 секунд 1200 айн/мин жылдамдықпен орнатылады.
Негізгі айналдыру жылдамдығын кремний пластинасында SU-8 үлгісінің мақсатты қалыңдығына сәйкес реттеуге болады.
Чиптегі ішектің үстіңгі қабаты үшін биіктігі 500 мкм SU-8 үлгілерін жасау үшін 250 мкм екі қабатты шығару үшін осы қораптың айналдыру жабыны және жұмсақ пісіру қадамдары (7 және 8-қадамдар) дәйекті түрде қайталанды (9-қадамды қараңыз). SU-8 қалың қабаты 250 мкм жоғары қабатта қабатталып, 10 мкм қабатпен біріктірілуі мүмкін. .
Вафлиді 65 °C температурада 5 минут ыстық пластинаға абайлап қою арқылы SU-8 қапталған вафлиді жұмсақ пісіріңіз, содан кейін параметрді 95 °C-қа ауыстырыңыз және қосымша 40 минут инкубациялаңыз.
Жоғарғы микроарнадағы SU-8 үлгісінің 500 мкм биіктігіне жету үшін қалыңдығы 250 мкм екі SU-8 қабатын жасау үшін 7 және 8 қадамдарды қайталаңыз.
Ультракүлгін масканы туралау құралын пайдаланып, пластинаның экспозиция уақытын есептеу үшін өндірушінің нұсқауларына сәйкес лампа сынамасын орындаңыз.(экспозиция уақыты, мс) = (экспозициялық доза, мДж/см2)/(шам қуаты, мВт/см2).
Экспозиция уақытын анықтағаннан кейін фотомасканы ультракүлгін масканы туралау құралының маска ұстағышына қойыңыз және фотомасканы SU-8 қапталған вафлиге қойыңыз.
УК дисперсиясын азайту үшін фотомасканың басып шығарылған бетін кремний пластинаның SU-8 қапталған жағына тікелей қойыңыз.
SU-8 қапталған пластинаны және фотомасканы алдын ала белгіленген экспозиция уақыты үшін тігінен 260 мДж/см2 УК сәулесіне шығарыңыз (осы қораптың 10-қадамын қараңыз).
Ультракүлгін сәулесінің әсерінен кейін SU-8 қапталған кремний пластиналары биіктігі 200 мкм болатын үлгілерді дайындау үшін әрбір ыстық плитада 65°C температурада 5 минут және 95°C температурада 15 минут пісірілді. Биіктігі 50 мкм болатын үлгілерді жасау үшін пісіруден кейінгі уақытты 95 °C температурада 30 минутқа ұзартыңыз.
Әзірлеуші ​​шыны ыдысқа құйылады, ал пісірілген вафли ыдысқа орналастырылады. SU-8 әзірлеушісінің көлемі шыны пластинаның өлшеміне байланысты өзгеруі мүмкін. Ашық емес SU-8-ді толығымен алып тастау үшін жеткілікті SU-8 әзірлеушісін пайдаланғаныңызға көз жеткізіңіз. Мысалы, 150 мм диаметрі 1 литр сыйымдылығы бар шыны ыдысты пайдаланған кезде, ~30L 200 мл-ге дейін пайдаланыңыз. мезгіл-мезгіл жұмсақ айналумен.
Дайындалған пішінді ~10 мл жаңа әзірлеушімен шайыңыз, содан кейін тамшуыр арқылы ерітіндіні бүрку арқылы IPA қосыңыз.
Вафлиді плазмалық тазартқышқа салып, 1,5 минут бойы оттегі плазмасына (атмосфералық газ, мақсатты қысым 1 × 10−5 Торр, қуат 125 Вт) әсер етіңіз.
Вафлиді ішінде шыны слайды бар вакуумды эксикаторға салыңыз. Вафли мен сырғытпаларды қатар қоюға болады. Вакуумды эксикатор пластина арқылы бірнеше қабаттарға бөлінген болса, слайдтарды төменгі камераға, ал пластиналарды жоғарғы камераға салыңыз. e ерітіндісін шыны слайдқа салып, силанизация үшін вакуумды қолданыңыз.
Мұздатылған Caco-2 жасушаларының құтысын 37°C су моншасында ерітіңіз, содан кейін еріген жасушаларды 15 мл 37°C алдын ала жылытылған Caco-2 ортасы бар T75 колбасына ауыстырыңыз.
~90% қосылу кезінде Caco-2 жасушаларын өткізу үшін алдымен жылы Caco-2 ортасы, PBS және 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА 37°C су моншасында.
Вакуумды аспирация арқылы ортаны сорыңыз. Вакуумды аспирацияны қайталау және жаңа PBS қосу арқылы ұяшықтарды 5 мл жылы PBS арқылы екі рет жуыңыз.