Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Бірден үш слайдтан тұратын карусельді көрсетеді.Бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін «Алдыңғы» және «Келесі» түймелерін пайдаланыңыз немесе бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін соңында сырғытпа түймелерін пайдаланыңыз.
Гематоэнцефалдық бөгет және гематоэнцефалдық бөгет биотерапевтикалық агенттердің орталық жүйке жүйесінде өз мақсатына жетуіне жол бермейді, осылайша неврологиялық ауруларды тиімді емдеуге кедергі келтіреді.Мидың жаңа тасымалдаушыларын in vivo ашу үшін біз T7 фаг пептидтік кітапханасын және егеуқұйрықтардың кануляцияланған саналы үлкен бассейн үлгісін пайдалана отырып, сериялық жиналған қан мен цереброспинальды сұйықтықты (CSF) енгіздік.Арнайы фаг клондары іріктеудің төрт раундынан кейін CSF-те жоғары дәрежеде байытылды.Жеке кандидат пептидтерін сынау CSF 1000 еседен астам байытуды анықтады.Миға пептидті жеткізудің биоактивтілігі анықталған жаңа транзиттік пептидке байланысты BACE1 пептидті тежегішін қолдану арқылы ми-жұлын сұйықтығындағы амилоид-β деңгейінің 40%-ға төмендеуімен расталды.Бұл нәтижелер in vivo фагтарды таңдау әдістерімен анықталған пептидтер терапевтік әсері бар макромолекулаларды миға жүйелі жеткізу үшін пайдалы құралдар болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Орталық жүйке жүйесіне (ОЖЖ) бағытталған терапиялық зерттеулер негізінен миға белсенді дәрі-дәрмек жеткізу механизмдерін ашуға аз күш жұмсай отырып, ОЖЖ мақсатты қасиеттерін көрсететін оңтайландырылған препараттар мен агенттерді анықтауға бағытталған.Бұл қазір өзгере бастады, өйткені дәрі-дәрмек жеткізу, әсіресе үлкен молекулалар, қазіргі заманғы неврологияның дәрілік дамуының ажырамас бөлігі болып табылады.Орталық жүйке жүйесінің ортасы қан-ми тосқауылынан (BBB) ​​және гематоэнцефалдық бөгеттен (BCBB) 1 тұратын цереброваскулярлық кедергі жүйесімен жақсы қорғалған, бұл оны миға препараттарды жеткізуді қиындатады1,2.Үлкен молекулалы препараттардың барлығы дерлік және кіші молекулалы препараттардың 98%-дан астамы мидан шығарылады3.Сондықтан ОЖЖ 4,5 терапевтік препараттарды тиімді және нақты жеткізуді қамтамасыз ететін жаңа миды тасымалдау жүйелерін анықтау өте маңызды.Дегенмен, BBB және BCSFB есірткі жеткізуге тамаша мүмкіндік береді, өйткені олар мидың барлық құрылымдарына оның кең тамыр жүйесі арқылы еніп, енеді.Осылайша, миға жеткізудің инвазивті емес әдістерін қолдану бойынша қазіргі күш-жігер негізінен эндогендік BBB6 рецепторын қолданатын рецепторлық тасымалдау (PMT) механизміне негізделген.Трансферриндік рецепторлар жолын7,8 пайдаланатын соңғы негізгі жетістіктерге қарамастан, жақсартылған қасиеттері бар жаңа жеткізу жүйелерін одан әрі дамыту қажет.Осы мақсатта біздің мақсатымыз CSF тасымалдауына делдалдық жасауға қабілетті пептидтерді анықтау болды, өйткені олар негізінен макромолекулаларды орталық жүйке жүйесіне жеткізу немесе жаңа рецепторлық жолдарды ашу үшін пайдаланылуы мүмкін.Атап айтқанда, цереброваскулярлық жүйенің спецификалық рецепторлары мен тасымалдаушылары (BBB және BSCFB) биотерапевтік препараттарды белсенді және спецификалық жеткізу үшін әлеуетті нысандар ретінде қызмет ете алады.Ми-жұлын сұйықтығы (МС) хореоидты өрімінің (КС) секреторлық өнімі болып табылады және субарахноидальды және қарыншалық кеңістік арқылы мидың интерстициальды сұйықтығымен тікелей байланыста болады4.Жақында субарахноидальды ликвордың ми аралықтарына шамадан тыс диффузияланатыны анықталды9.Біз паренхималық кеңістікке осы субарахноидты ағын жолын пайдаланып немесе тікелей BBB арқылы қол жеткіземіз деп үміттенеміз.Бұған жету үшін біз осы екі түрлі жолдың кез келгені арқылы тасымалданатын пептидтерді идеалды түрде анықтайтын in vivo фагтарды таңдаудың сенімді стратегиясын жүзеге асырдық.
Енді біз кітапхананың ең жоғары әртүрлілігімен бастапқы іріктеу раундтарын бақылау үшін жоғары өткізу қабілеттілігінің реттілігімен (HTS) біріктірілген CSF сынамасы бар in vivo фагтарды көрсетудің дәйекті скрининг әдісін сипаттаймыз.Скрининг қанның ластануын болдырмау үшін тұрақты имплантацияланған үлкен цистерна (КМ) канюлясы бар саналы егеуқұйрықтарға жүргізілді.Маңыздысы, бұл әдіс миға бағытталған және цереброваскулярлық кедергі арқылы тасымалдау белсенділігі бар пептидтерді таңдайды.Біз T7 фагтарын шағын өлшемдерге (~60 нм)10 байланысты қолдандық және олардың эндотелий және/немесе эпителий-медулла тосқауылының жасушааралық өтуіне мүмкіндік беретін везикулаларды тасымалдау үшін қолайлы деп ұсындық.Төрт айналымнан кейін фаг популяциялары оқшауланды, олар in vivo CSF ​​байыту және церебральды микротамырлар байланысы күшті болды.Маңыздысы, біз таңдаулы және химиялық синтезделген ең жақсы кандидат пептидтер ақуыз жүктерін цереброспинальды сұйықтыққа тасымалдауға қабілетті екенін көрсету арқылы өз нәтижелерімізді растай алдық.Біріншіден, ОЖЖ фармакодинамикалық әсерлері жетекші транзиттік пептидті BACE1 пептидінің тежегішімен біріктіру арқылы анықталды.In vivo функционалдық скрининг стратегиялары мидың жаңа тасымалдау пептидтерін тиімді ақуыз жүк тасымалдаушылары ретінде анықтай алатынын көрсетумен қатар, біз ұқсас функционалды таңдау тәсілдері мидың жаңа тасымалдау жолдарын анықтауда маңызды болады деп күтеміз.
Фагты орау қадамынан кейін плак түзетін қондырғыларға (PFU) негізделген, әртүрлілігі шамамен 109 болатын кездейсоқ 12-мер сызықты T7 фаг пептидтерінің кітапханасы әзірленді және жасалды (Материалдар мен әдістерді қараңыз).Біз бұл кітапхананы in vivo панорамалау алдында мұқият талдағанымызды атап өту маңызды.Модификацияланған праймерлер көмегімен фаг кітапханасының үлгілерін ПТР күшейту HTS-ке тікелей қолданылатын ампликондарды жасады (қосымша 1а-сурет).a) HTS11 секвенирлеу қателеріне, б) праймерлердің сапасына әсер етуіне (NNK)1-12 және в) күту режиміндегі кітапханада жабайы типті (wt) фагтың (қаңқа кірістірулері) болуына байланысты тек тексерілген реттілік ақпаратын алу үшін ретті сүзу процедурасы жүзеге асырылды (Қосымша 1b сурет).Бұл сүзгі қадамдары барлық HTS реттілік кітапханаларына қолданылады.Стандартты кітапхана үшін барлығы 233 868 оқылым алынды, оның 39% сүзгі критерийлерінен өтті және келесі турлар үшін кітапхананы талдау және таңдау үшін пайдаланылды (қосымша 1c-e сурет).Оқылымдар негізінен 36 нуклеотидте шыңы бар ұзындығы 3 негізгі жұптың еселенген саны болды (Қосымша 1c-сурет), кітапхана дизайнын (NNK) 1-12 растайды.Атап айтқанда, кітапхана мүшелерінің шамамен 11% -ында 12 өлшемді жабайы типті (массалық) негізгі PAGISRELVDKL кірістіру және реттіліктердің жартысына жуығы (49%) кірістіру немесе жоюды қамтиды.Кітапхана кітапханасының HTS кітапханадағы пептидтердің әртүрлілігін растады: пептидтік тізбектердің 81% -дан астамы тек бір рет табылды және тек 1,5% ≥4 көшірмелерде болды (Қосымша сурет 2a).Репертуардағы барлық 12 позициядағы аминқышқылдарының жиілігі (aa) дегенерацияланған NKK репертуарында пайда болған кодондар саны үшін күтілетін жиіліктермен жақсы сәйкес келді (Қосымша 2б-сурет).Осы кірістірулер арқылы кодталған aa қалдықтарының байқалған жиілігі есептелген жиілікпен (r = 0,893) жақсы корреляцияланды (Қосымша 2c сурет).Фаг кітапханаларын инъекцияға дайындау эндотоксинді күшейту және жою қадамдарын қамтиды.Бұл бұрын фаг кітапханаларының әртүрлілігін азайтатыны көрсетілген12,13.Сондықтан, біз эндотоксинді жоюдан өткен пластинамен күшейтілген фаг кітапханасын тізбектеп, АА жиілігін бағалау үшін оны бастапқы кітапханамен салыстырдық.Бастапқы пул мен күшейтілген және тазартылған бассейн арасында күшті корреляция (r = 0,995) байқалды (Қосымша 2d сурет), бұл T7 фагының көмегімен пластиналарда күшейтілген клондар арасындағы бәсекелестік үлкен ауытқуды тудырмағанын көрсетеді.Бұл салыстыру әрбір кітапханадағы трипептид мотивтерінің жиілігіне негізделген, өйткені кітапханалардың әртүрлілігін (~109) тіпті HTS арқылы толық түсіру мүмкін емес.Әрбір позициядағы aa жиілігін талдау енгізілген репертуардың соңғы үш позициясында шағын позицияға тәуелді ауытқуды анықтады (Қосымша 2e сурет).Қорытындылай келе, біз кітапхананың сапасы мен әртүрлілігі қолайлы болды және таңдаудың бірнеше раундтары арасында фаг кітапханаларын күшейту мен дайындауға байланысты әртүрліліктегі шамалы өзгерістер ғана байқалды деген қорытындыға келдік.
Цереброспинальды сұйықтықты сериялық іріктеуді BBB және/немесе BCSFB арқылы көктамыр ішіне енгізілетін (iv) T7 фагының идентификациясын жеңілдету үшін саналы егеуқұйрықтардың CM ішіне канюляны хирургиялық имплантациялау арқылы орындауға болады (сурет 1a-b).In vivo таңдаудың алғашқы үш раундында біз екі тәуелсіз іріктеу құралын (А және В қолдарын) қолдандық (Cурет 1c).Біз іріктеудің алғашқы үш раундында енгізілген фагтың жалпы мөлшерін азайту арқылы іріктеудің қатаңдығын біртіндеп арттырдық.Панораманың төртінші раунды үшін біз A және B тармақтарынан үлгілерді біріктіріп, үш қосымша тәуелсіз таңдауды орындадық.Осы үлгідегі T7 фаг бөлшектерінің in vivo қасиеттерін зерттеу үшін жабайы типтегі фаг (PAGISRELVDKL негізгі кірістіру) құйрық венасы арқылы егеуқұйрықтарға енгізілді.Цереброспинальды сұйықтық пен қаннан фагтарды әртүрлі уақыт нүктелерінде қалпына келтіру салыстырмалы түрде кішкентай T7 икосаэдрлік фагтардың қан бөлімінен жылдам бастапқы тазарту фазасы бар екенін көрсетті (қосымша 3-сурет).Енгізілген титрлерге және егеуқұйрықтардың қан көлеміне сүйене отырып, біз салмағы шамамен 1% ғана екенін есептедік.енгізілген дозадан фаг көктамыр ішіне енгізгеннен кейін 10 минуттан кейін қанда анықталды.Осы бастапқы жылдам төмендеуден кейін жартылай шығарылу кезеңі 27,7 минут болатын баяу бастапқы клиренс өлшенді.Маңыздысы, CSF бөлімінен өте аз фагтар ғана алынды, бұл жабайы типтегі фагтардың CSF бөліміне көшуінің төмен фонын көрсетеді (қосымша сурет 3).Орташа алғанда, сынама алудың барлық кезеңінде (0-250 мин) ми-жұлын сұйықтығында қандағы T7 фагының шамамен 1 x 10-3% титрі және бастапқы енгізілген фагтардың 4 х 10-8% ғана анықталды.Атап айтқанда, жабайы фагтың цереброспинальды сұйықтықтағы жартылай шығарылу кезеңі (25,7 мин) қанда байқалғанға ұқсас болды.Бұл деректер CSF бөлімін қаннан бөлетін тосқауылдың CM-каннуляцияланған егеуқұйрықтарда бұзылмағанын көрсетеді, бұл қаннан CSF бөліміне оңай тасымалданатын клондарды анықтау үшін фаг кітапханаларын in vivo таңдауға мүмкіндік береді.
(a) Үлкен бассейннен жұлын сұйықтығын (ЦСФ) қайта іріктеу әдісін орнату.(b) Орталық жүйке жүйесінің (ОЖЖ) тосқауылының жасушалық орналасуын және гематоэнцефалдық бөгет (BBB) ​​және гематоэнцефалдық бөгет арқылы өтетін пептидтерді анықтау үшін қолданылатын таңдау стратегиясын көрсететін диаграмма.(c) In vivo фаг дисплейінің скринингтік схемасы.Таңдаудың әрбір раундында фагтар (көрсеткілер ішіндегі жануарлар идентификаторлары) көктамыр ішіне енгізілді.Екі тәуелсіз альтернативті тармақтар (A, B) іріктеудің 4-ші турына дейін бөлек сақталады.3 және 4 іріктеу раундтары үшін CSF-дан алынған әрбір фаг клоны қолмен реттелген.(d) T7 пептидтік кітапханасын (2 x 1012 фаг/жануар) көктамырішілік инъекциядан кейін каннуляцияланған екі егеуқұйрықтағы іріктеудің бірінші раундында қаннан (қызыл шеңберлер) және ми-жұлын сұйықтығынан (жасыл үшбұрыштар) бөлінген фаг кинетикасы.Көк квадраттар қанның жалпы көлемін ескере отырып, енгізілген фаг мөлшерінен есептелетін қандағы фагтың орташа бастапқы концентрациясын көрсетеді.Қара квадраттар қандағы фаг концентрациясынан экстраполяцияланған y сызығының қиылысу нүктесін көрсетеді.(e,f) Пептидте табылған барлық ықтимал қабаттасатын трипептид мотивтерінің салыстырмалы жиілігін және таралуын көрсетіңіз.1000 оқылымда табылған мотивтер саны көрсетілген.Айтарлықтай (p < 0,001) байытылған мотивтер қызыл нүктелермен белгіленген.(e) №1.1 және №1.2 жануарлардан алынған қаннан алынған фагпен енгізілген кітапхананың трипептид мотивінің салыстырмалы жиілігін салыстыратын корреляциялық шашырау сызбасы.(f) Қан мен жұлын сұйықтығында оқшауланған №1.1 және №1.2 жануарлар фагының трипептид мотивтерінің салыстырмалы жиіліктерін салыстыратын корреляциялық шашырау сызбасы.(g, h) Қанмен байытылған фагтың (g) инъекцияланған кітапханалармен салыстырғанда және CSF (h) қанмен байытылған фагтың екі жануарда да in vivo іріктеу раундынан кейін қанмен салыстырғанда реттілік идентификаторы.Бір әріптік кодтың өлшемі сол амин қышқылының осы позицияда қаншалықты жиі болатынын көрсетеді.Жасыл = полярлық, күлгін = бейтарап, көк = негіздік, қызыл = қышқыл және қара = гидрофобты аминқышқылдары.1a, b суретін Эдуард Урич құрастырған және жасаған.
Біз фаг пептидтерінің кітапханасын екі CM аспаптық егеуқұйрықтарға (А және В қабаттары) және жұлын сұйықтығы мен қаннан оқшауланған фагты енгіздік (1d сурет).Кітапхананың бастапқы жылдам клиренсі жабайы типтегі фагпен салыстырғанда азырақ болды.Екі жануарда да инъекцияланған кітапхананың орташа жартылай шығарылу кезеңі жабайы типтегі фагқа ұқсас қанда 24,8 минутты және CSF-де 38,5 минутты құрады.Әрбір жануардан алынған қан және ми-жұлын сұйықтығының фаг үлгілері HTS-ке ұшырады және барлық анықталған пептидтер қысқа трипептид мотивінің болуына талдау жасалды.Трипептидті мотивтер таңдалды, себебі олар құрылымның қалыптасуы мен пептид-белок әрекеттесуі үшін минималды негіз береді14,15.Біз инъекцияланған фаг кітапханасы мен екі жануардың қанынан алынған клондар арасындағы мотивтердің таралуында жақсы корреляцияны таптық (сурет 1e).Мәліметтер кітапхана құрамының қан бөлімінде аз ғана байытылғанын көрсетеді.Аминқышқылдарының жиіліктері мен консенсус реттілігі Weblogo16 бағдарламалық құралын бейімдеу арқылы әр позицияда әрі қарай талданды.Бір қызығы, қандағы глицин қалдықтарында күшті байытуды таптық (1g-сурет).Қанды CSF ішінен таңдалған клондармен салыстырған кезде, күшті таңдау және мотивтердің кейбір таңдаусыздығы байқалды (1f-сурет) және белгілі бір аминқышқылдары 12 мүшеде алдын ала анықталған позицияларда артықшылықты болды (1h-сурет).Атап айтқанда, жеке жануарлар цереброспинальды сұйықтықта айтарлықтай ерекшеленеді, ал қандағы глицинді байыту екі жануарда байқалды (қосымша 4a-j сурет).№1.1 және №1.2 жануарлардың жұлын сұйықтығындағы реттілік деректерін қатаң сүзгілеуден кейін барлығы 964 және 420 бірегей 12-мер пептидтері алынды (Қосымша 1d-e сурет).Оқшауланған фаг клондары күшейтілді және in vivo іріктеудің екінші кезеңіне ұшырады.Таңдаудың екінші турынан алынған фаг әрбір жануарда HTS-ке ұшырады және барлық анықталған пептидтер трипептид мотивтерінің пайда болуын талдау үшін мотивті тану бағдарламасына кіріс ретінде пайдаланылды (2а, б, еф-сурет).CSF-дан қалпына келтірілген фагтың бірінші циклімен салыстырғанда, біз А және В тармақтарында CSF-де көптеген мотивтердің одан әрі іріктелуін және таңдалуын байқадық (2-сурет).Желіні сәйкестендіру алгоритмі олардың дәйекті дәйектіліктің әртүрлі үлгілерін көрсететінін анықтау үшін қолданылды.Баламалы A класында (2c, d) және В класында (2g, h-сурет) CSF арқылы қалпына келтірілген 12 өлшемді тізбектер арасында айқын ұқсастық байқалды.Әрбір тармақта біріктірілген талдау 12-мер пептидтері үшін әртүрлі таңдау профильдерін анықтады (қосымша 5c,d сурет) және іріктеудің бірінші турымен салыстырғанда біріктірілген клондар үшін уақыт өте келе CSF/қан титрінің арақатынасының жоғарылауы (Қосымша 5e сурет).).
Жұлын сұйықтығындағы мотивтер мен пептидтерді in vivo функционалды фаг дисплейін таңдаудың екі дәйекті айналымы арқылы байыту.
Әрбір жануардың (№1.1 және №1.2 жануарлар) бірінші раундынан алынған барлық цереброспинальды сұйықтық фагтары біріктірілді, күшейтілді, HT-тізбектелді және бірге қайта енгізілді (2 x 1010 фаг/жануар) 2 SM каннуляцияланған егеуқұйрықтар (№1.1 → #).2.1 және 2.2, 1.2 → 2.3 және 2.4).(a,b,e,f) Бірінші және екінші іріктеу раундтарындағы барлық CSF туынды фагтарының трипептид мотивтерінің салыстырмалы жиілігін салыстыратын корреляциялық шашырау диаграммалары.Екі бағыттағы пептидтерде кездесетін барлық ықтимал қабаттасатын трипептидтерді білдіретін мотивтердің салыстырмалы жиілігі мен таралуы.1000 оқылымда табылған мотивтер саны көрсетілген.Салыстырылған кітапханалардың бірінде айтарлықтай таңдалған (p <0,001) мотивтер қызыл нүктелермен бөлектеледі.(c, d, g, h) In vivo таңдаудың 2 және 1 раундтарына негізделген барлық CSF-қа бай 12 амин қышқылы ұзын тізбектерінің реттілік логотипі.Бір әріптік кодтың өлшемі сол амин қышқылының осы позицияда қаншалықты жиі болатынын көрсетеді.Логотипті көрсету үшін екі іріктеу раундының арасында жеке жануарлардан алынған CSF тізбектерінің жиілігі салыстырылады және екінші раундтағы байытылған тізбектер көрсетіледі: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 және (h) #1.2–#2.4.(c, d) жануарларда берілген позициядағы ең байытылған аминқышқылдары №.2.1 және №.2.2 немесе (г, h) жануарларда №.2.3 және жоқ.2.4 түспен көрсетілген.Жасыл = полярлық, күлгін = бейтарап, көк = негіздік, қызыл = қышқыл және қара = гидрофобты аминқышқылдары.
Іріктеудің үшінші раундынан кейін біз екі жануардан оқшауланған 332 CSF қалпына келтірілген фаг клондарынан 124 бірегей пептидтер тізбегін (№3.1 және №3.2) анықтадық (қосымша 6a сурет).LGSVS (18,7%) тізбегі ең жоғары салыстырмалы пропорцияға ие болды, одан кейін PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) және SARGSWREIVSLS (2,2%) жабайы түрдегі кірістірулер болды.Соңғы төртінші айналымда біз үш бөлек жануардан тәуелсіз таңдалған екі бұтақты біріктірдік (Cурет 1c).CSF-дан алынған 925 реттелген фаг клондарының ішінде төртінші раундта біз 64 бірегей пептидтік тізбекті таптық (Қосымша 6b-сурет), олардың арасында жабайы фагтың салыстырмалы үлесі 0,8%-ға дейін төмендеді.Төртінші раундтағы ең көп таралған CSF клондары LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) және RLSSVDLSG (3,6%) болды.%)).Таңдалған пептидтердің ұзындық диапазоны NNK кітапханасының дизайны үшін дегенерацияланған кодондарды пайдалану кезінде кітапханалық праймерлердегі нуклеотидтерді енгізу/делециялар немесе мерзімінен бұрын тоқтату кодондарына байланысты.Мерзімінен бұрын тоқтату кодондары қысқа пептидтерді жасайды және оларда қолайлы aa мотиві бар болғандықтан таңдалады.Ұзынырақ пептидтер синтетикалық кітапханалардың праймерлеріне енгізу/жою нәтижесінде пайда болуы мүмкін.Бұл жобаланған тоқтату кодонын кадрдың сыртына орналастырады және төменгі ағында жаңа тоқтату кодоны пайда болғанша оны оқиды.Жалпы алғанда, біз кіріс деректерін үлгі шығыс деректерімен салыстыру арқылы барлық төрт іріктеу туры үшін байыту коэффициенттерін есептедік.Скринингтің бірінші раунды үшін біз арнайы емес фондық анықтама ретінде жабайы типтегі фаг титрлерін қолдандық.Бір қызығы, теріс фаг таңдауы бірінші CSF циклінде өте күшті болды, бірақ қанда емес (3а-сурет), бұл пептидтік кітапхана мүшелерінің көпшілігінің CSF бөліміне пассивті диффузиясының төмен ықтималдығына байланысты болуы мүмкін немесе салыстырмалы фагтар бактериопталарға қарағанда тиімдірек сақталады немесе қан ағымынан жойылады.Дегенмен, панораманың екінші раундында CSF-те фагтардың күшті таңдауы екі кладта да байқалды, бұл алдыңғы раундтың CSF сіңірілуіне ықпал ететін пептидтерді көрсететін фагтармен байытылғанын көрсетеді (3а-сурет).Тағы да, айтарлықтай қан байытусыз.Сондай-ақ үшінші және төртінші айналымда фаг клондары CSF-де айтарлықтай байытылды.Таңдаудың соңғы екі раундының арасындағы әрбір бірегей пептидтік тізбектің салыстырмалы жиілігін салыстыра отырып, біз таңдаудың төртінші раундында тізбектердің одан да байытылғанын анықтадық (3б-сурет).Барлығы 931 трипептид мотиві екі пептидтік бағдарларды пайдалана отырып, барлық 64 бірегей пептидтік тізбектерден алынды.Төртінші раундтағы ең байытылған мотивтер инъекцияланған кітапханамен салыстырғанда барлық айналымдар бойынша олардың байыту профильдері үшін мұқият зерттелді (кесілген: 10% байыту) (Қосымша 6c сурет).Іріктеудің жалпы заңдылықтары зерделенген мотивтердің көпшілігінің екі іріктеу саласының да алдыңғы барлық турларында байығанын көрсетті.Дегенмен, кейбір мотивтер (мысалы, SGL, VSG, LGS GSV) балама А класынан алынған, ал басқалары (мысалы, FGW, RTN, WGF, NTR) балама В класында байытылған.
Стрептавидиннің пайдалы жүктемелерімен конъюгацияланған CSF-байытылған фаг-көрсетілген пептидтердің және биотинленген жетекші пептидтердің CSF тасымалдануын тексеру.
(a) Инъекцияланған (кіріс = I) фаг (PFU) титрлеріне және анықталған CSF фаг титрлеріне (шығыс = O) негізделген барлық төрт айналымда (R1-R4) есептелген байыту коэффициенттері.Соңғы үш раундтың (R2-R4) байыту коэффициенттері алдыңғы раундпен және бірінші раундпен (R1) салмақ деректерімен салыстыру арқылы есептелді.Ашық жолақтар - жұлын сұйықтығы, көлеңкеленген жолақтар - плазма.(***p<0,001, Студенттің t-тестіне негізделген).(b) іріктеудің 4-ші раундынан кейін CSF-де жиналған барлық фагтарға қатысты салыстырмалы пропорциясы бойынша жіктелген ең көп таралған фаг пептидтерінің тізімі.Ең көп таралған алты фаг клондары түспен бөлектелген, нөмірленген және олардың байыту факторлары таңдаудың 3 және 4 раундтары арасында (кірістіру).(c,d) 4-ші раундтағы алты ең байытылған фаг клондары, бос фаг және ата-аналық фаг пептидтерінің кітапханалары CSF сынама үлгісінде жеке талданды.Белгіленген уақыт нүктелерінде CSF және қан үлгілері жиналды.(c) 6 кандидат фаг клонының (2 x 1010 фаг/жануарлар), бос фагтардың (№1779) (2 x 1010 фаг/жануарлар) және қор фагтарының пептидтік кітапханаларының (2 x 1012 фаг/жануарлардың) тең мөлшері.Әрбір енгізілген фаг клонының және фаг пептидтік кітапханасының уақыт бойынша CSF фармакокинетикасы көрсетілген.(d) сынама алу уақытындағы барлық қалпына келтірілген фагтар/мл үшін орташа CSF/қан қатынасын көрсетеді.(e) Төрт синтетикалық жетекші пептидтер және бір шифрланған бақылау биотинмен стрептавидинмен олардың N-терминусы (тетрамер дисплейі), содан кейін инъекция арқылы байланыстырылды (құйрық венасы, 10 мг стрептавидин/кг).Кем дегенде үш интубацияланған егеуқұйрықтар (N = 3).).CSF үлгілері көрсетілген уақыт нүктелерінде жиналды және стрептавидин концентрациясы CSF антистрептавидин ИФА әдісімен өлшенді (nd = анықталмады).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA сынағы негізінде).(f) №2002 ең байытылған фаг-пептид клонының (күлгін) аминқышқылдарының тізбегін таңдаудың 4-ші раундындағы басқа таңдалған фаг пептидтерінің клондарымен салыстыру.Бірдей және ұқсас аминқышқылдарының фрагменттері түспен кодталған.
Төртінші раундтағы барлық байытылған фагтардың ішінен (3b-сурет) CSF сынама үлгісінде одан әрі жеке талдау үшін алты үміткер клон таңдалды.Алты кандидат фагының, бос фагтың (енгізу жоқ) және профагтың пептидтік кітапханаларының бірдей мөлшері үш каннуляцияланған CM жануарына енгізілді және фармакокинетикасы CSF (3c-сурет) және қан (қосымша сурет 7) талдауларында анықталды.Сыналған барлық фаг клондары бос бақылау фагынан (№1779) 10-1000 есе жоғары деңгейде CSF бөліміне бағытталған.Мысалы, №2020 және №2077 клондарында бақылау фагына қарағанда CSF титрлері шамамен 1000 есе жоғары болды.Әрбір таңдалған пептидтің фармакокинетикалық профилі әртүрлі, бірақ олардың барлығында жоғары CSF homing қабілеті бар.Біз №1903 және №2011 клондар үшін уақыт өте тұрақты төмендеуді байқадық, ал №2077, №2002 және №2009 клондар үшін алғашқы 10 минут ішінде жоғарылау белсенді тасымалдауды көрсетуі мүмкін, бірақ оны тексеру қажет.#2020, #2002 және #2077 клондары жоғары деңгейде тұрақтанды, ал #2009 клонының CSF концентрациясы бастапқы өсімнен кейін баяу төмендеді.Содан кейін біз әрбір CSF кандидатының салыстырмалы жиілігін оның қандағы концентрациясымен салыстырдық (3d-сурет).Әрбір CSF кандидатының орташа титрінің оның қан титрімен барлық сынама алу уақытындағы корреляциясы алты кандидаттың үшеуінің қандағы CSF айтарлықтай байытылғанын көрсетті.Бір қызығы, №2077 клон жоғары қан тұрақтылығын көрсетті (қосымша 7 сурет).Пептидтердің өздері фаг бөлшектерінен басқа жүктерді CSF бөліміне белсенді түрде тасымалдауға қабілетті екенін растау үшін біз пептидтер фаг бөлшектеріне қосылатын N-терминуста биотинмен туынды төрт жетекші пептидтерді синтездедік.Биотинилденген пептидтер (№ 2002, 2009, 2020 және 2077) фаг геометриясын біршама еліктейтін мультимерлі пішіндерді алу үшін стрептавидинмен (SA) конъюгацияланды.Бұл формат сонымен қатар жүкті тасымалдайтын ақуыз пептидтері ретінде қан мен жұлын сұйықтығындағы SA экспозициясын өлшеуге мүмкіндік берді.Маңыздысы, синтетикалық пептидтер осы SA-конъюгацияланған форматта енгізілген кезде фаг деректерін жиі шығаруға болады (3e-сурет).Шифрленген пептидтердің бастапқы экспозициясы аз болды және 48 сағат ішінде анықталмаған деңгейлерімен CSF клиренсі жылдамырақ болды.Осы пептидтік фаг клондарының CSF кеңістігіне жеткізілу жолдары туралы түсінік алу үшін біз in vivo көктамыр ішіне енгізгеннен кейін 1 сағаттан кейін фаг бөлшектерін тікелей анықтау үшін иммуногистохимияны (IHC) пайдалана отырып, жеке фаг пептидтерінің локализациясын талдадық.Атап айтқанда, №2002, №2077 және №2009 клондарды ми капиллярларында күшті бояу арқылы анықтауға болады, ал бақылау фаг (№1779) мен №2020 клон анықталмады (қосымша 8 сурет).Бұл бұл пептидтер BBB арқылы дәл миға әсер етеді деп болжайды.Бұл гипотезаны тексеру үшін қосымша егжей-тегжейлі талдау қажет, өйткені BSCFB бағыты да қатысуы мүмкін.Ең байытылған клонның (№ 2002) аминқышқылдарының тізбегін басқа таңдалған пептидтермен салыстыру кезінде олардың кейбіреулерінде ұқсас тасымалдау механизмін көрсетуі мүмкін ұқсас аминқышқылдарының ұзарулары бар екені атап өтілді (3f-сурет).
Бірегей плазмалық профильге және уақыт өте келе CSF-тің айтарлықтай ұлғаюына байланысты, №2077 фагтық дисплей клоны 48 сағаттық ұзағырақ кезеңде әрі қарай зерттелді және тұрақты SA деңгейлерімен байланысты байқалған CSF-тің жылдам өсуін қайта жасай алды (4а-сурет).Басқа анықталған фаг клондарына қатысты, №2077 ми капиллярлары үшін қатты боялған және жоғары ажыратымдылықта қараған кезде капиллярлық маркерлік лектинмен айтарлықтай коллокализацияны және паренхималық кеңістікте кейбір бояулар болуы мүмкін екенін көрсетті (4б-сурет).ОЖЖ-де пептидтік-делдалдық фармакологиялық әсерлердің алынуы мүмкін екендігін зерттеу үшін біз эксперимент жүргіздік, онда i) #2077 транзиттік пептидтің және ii) BACE1 тежегіш пептидінің биотинленген нұсқалары екі түрлі қатынаста SA-мен араласқан.Бір комбинация үшін біз тек BACE1 пептид тежегішін пайдаландық, ал екіншісі үшін BACE1 пептидінің ингибиторының №2077 пептидіне 1:3 қатынасын қолдандық.Екі үлгі де көктамыр ішіне енгізілді және бета-амилоидты пептид 40 (Abeta40) қан мен жұлын сұйықтығының деңгейлері уақыт өте келе өлшенді.Абета40 ми паренхимасында BACE1 тежелуін көрсететіндіктен CSF-де өлшенді.Күтілгендей, екі кешен де қандағы Abeta40 деңгейін айтарлықтай төмендетті (4c, d-сурет).Дегенмен, тек пептидті қоспасы бар үлгілер ғана.2077 және SA конъюгацияланған BACE1 пептидінің ингибиторы ми-жұлын сұйықтығында Abeta40 айтарлықтай төмендеуіне әкелді (4c-сурет).Деректер пептидтің нөмірін көрсетеді.2077 60 кДа SA протеинін ОЖЖ-ге тасымалдауға қабілетті, сонымен қатар BACE1 пептидінің SA-конъюгацияланған тежегіштерімен фармакологиялық әсерлерді тудырады.
(a) CSF пептидінің №2077 (RLSSVDSDLSGC) және инъекцияланбаған бақылау фагының (№1779) ұзақ мерзімді фармакокинетикалық профилін көрсететін T7 фагының клондық инъекциясы (2 × 10 фаг/жануар) кемінде үш CM интубацияланған егеуқұйрықтарда.(b) №2077 пептидінің және тамырлардың (лектин) қарсы бояуын көрсететін фагпен инъекцияланған егеуқұйрықтардағы (2 × 10 10 фаг/жануар) өкілдік қыртыстық микротамырлардың конфокальды микроскопиялық кескіні.Бұл фаг клондары 3 егеуқұйрықтарға енгізілді және перфузия алдында 1 сағат бойы айналымға жіберілді.Милар кесіліп, T7 фаг капсидіне қарсы поликлоналды FITC таңбаланған антиденелермен боялған.Перфузиядан және кейінгі бекітуден он минут бұрын DyLight594 таңбаланған лектин көктамыр ішіне енгізілді.Капиллярлар мен периваскулярлы ми тіндерінің люменіндегі микротамырлар мен фагтардың (жасыл) жарық жағының лектинді бояуын (қызыл) көрсететін флуоресцентті суреттер.Масштаб жолағы 10 мкм-ге сәйкес келеді.(c, d) Биотинилденген BACE1 тежегіш пептидтің өзі немесе №2077 биотинденген транзиттік пептидпен біріктірілімде стрептавидинге қосылды, содан кейін кем дегенде үш каннуляцияланған CM егеуқұйрықтарын (10 мг стрептавидин/кг) көктамыр ішіне енгізді.BACE1 пептидінің ингибиторы арқылы Aβ40 азаюы көрсетілген уақыт нүктелерінде қандағы (қызыл) және цереброспинальды сұйықтықтағы (қызғылт сары) Aβ1-40 ELISA арқылы өлшенді.Жақсырақ түсінікті болу үшін графикте 100% масштабта нүктелі сызық сызылады.(c) 3:1 қатынасында №2077 транзиттік пептидпен конъюгацияланған стрептавидинмен және BACE1 тежегіш пептидпен өңделген егеуқұйрықтардағы қандағы (қызыл үшбұрыштар) және жұлын сұйықтығындағы (қызғылт сары үшбұрыштар) Aβ40 деңгейінің пайыздық төмендеуі.(d) Тек BACE1 тежегіш пептидімен біріктірілген стрептавидинмен емделген егеуқұйрықтардың қанының Aβ40 (қызыл шеңберлер) және жұлын сұйықтығының (қызғылт сары шеңберлер) пайыздық төмендеуі.Бақылаудағы Aβ концентрациясы 420 пг/мл болды (стандартты ауытқу = 101 пг/мл).
Фагтарды көрсету биомедициналық зерттеулердің бірнеше салаларында сәтті қолданылды17.Бұл әдіс қан тамырларының әртүрлілігін in vivo зерттеулерінде18,19, сонымен қатар церебральды тамырларға бағытталған зерттеулер20,21,22,23,24,25,26 үшін қолданылған.Бұл зерттеуде біз осы таңдау әдісін қолдануды тек церебральды тамырларға бағытталған пептидтерді тікелей анықтауға ғана емес, сонымен қатар гематоэнцефалдық бөгет арқылы өту үшін белсенді тасымалдау қасиеттері бар кандидаттарды ашуға дейін кеңейттік.Біз енді CM интубацияланған егеуқұйрықтарда in vivo таңдау процедурасының дамуын сипаттаймыз және оның CSF гомингтік қасиеттері бар пептидтерді анықтау мүмкіндігін көрсетеміз.12-мер кездейсоқ пептидтердің кітапханасын көрсететін T7 фагының көмегімен біз T7 фагының гематоэнцефалдық бөгетке бейімделу үшін жеткілікті кішкентай (диаметрі шамамен 60 нм)10 екенін көрсете алдық, осылайша гематоэнцефалдық тосқауылдан немесе хороидты өрімнен тікелей өтеді.Біз кануляцияланған CM егеуқұйрықтарынан CSF жинау жақсы бақыланатын in vivo функционалдық скрининг әдісі екенін және алынған фаг қан тамырларымен байланысып қана қоймай, сонымен қатар гематоэнцефалдық бөгет арқылы тасымалдаушы қызметін атқаратынын байқадық.Сонымен қатар, бір уақытта қан жинау және CSF және қаннан алынған фагтарға HTS қолдану арқылы біз CSF таңдауымызға қанның байытылуы немесе іріктеу раундтары арасындағы кеңейтуге жарамдылығы әсер етпегенін растадық.Дегенмен, қан бөлімі іріктеу процедурасының бөлігі болып табылады, өйткені CSF бөліміне жетуге қабілетті фагтар миды байыту үшін жеткілікті ұзақ өмір сүріп, қан ағымында айналуы керек.Шикі HTS деректерінен сенімді реттілік ақпаратын алу үшін біз талдау жұмыс процесінде платформаға тән реттілік қателеріне бейімделген сүзгілерді енгіздік.Скрининг әдісіне кинетикалық параметрлерді енгізу арқылы біз қандағы 24, 27, 28 жабайы типті T7 фагтарының жылдам фармакокинетикасын (t½ ~ 28 мин) растадық, сондай-ақ олардың цереброспинальды сұйықтықтағы жартылай шығарылу кезеңін (минутына t½ ~ 26 мин) анықтадық).Қандағы және ликвордағы ұқсас фармакокинетикалық профильдерге қарамастан, фагтың қандағы концентрациясының тек 0,001%-ы ликворда анықталуы мүмкін, бұл жабайы типті T7 фагының гематоэнцефалдық бөгет арқылы төмен фондық қозғалғыштығын көрсетеді.Бұл жұмыс in vivo панорамалау стратегияларын пайдалану кезінде таңдаудың бірінші раундының маңыздылығын көрсетеді, әсіресе қан айналымынан жылдам тазартылатын фагтық жүйелер үшін, өйткені бірнеше клондар ОЖЖ бөліміне жете алады.Осылайша, бірінші раундта кітапхананың әртүрлілігінің төмендеуі өте үлкен болды, өйткені бұл өте қатаң CSF үлгісінде клондардың шектеулі саны ғана жиналды.Бұл in vivo панорамалау стратегиясы CSF бөлімінде белсенді жинақтау, қан бөлімінде клондардың өмір сүруі және алғашқы 10 минут ішінде қаннан T7 фаг клондарын жылдам жою сияқты бірнеше іріктеу қадамдарын қамтыды (сурет 1d және қосымша сурет. 4M).).Осылайша, бірінші айналымнан кейін CSF-де әртүрлі фаг клондары анықталды, дегенмен жеке жануарлар үшін бірдей бастапқы пул пайдаланылды.Бұл кітапхана мүшелерінің көп саны бар бастапқы кітапханалар үшін бірнеше қатаң таңдау қадамдары әртүрліліктің айтарлықтай төмендеуіне әкелетінін көрсетеді.Сондықтан кездейсоқ оқиғалар бастапқы таңдау процесінің ажырамас бөлігіне айналады, нәтижеге үлкен әсер етеді.Түпнұсқа кітапханадағы клондардың көпшілігінің CSF байытуға бейімділігі өте ұқсас болуы мүмкін.Дегенмен, тіпті бірдей эксперименттік жағдайларда, таңдау нәтижелері бастапқы пулдағы әрбір нақты клонның санының аздығына байланысты әртүрлі болуы мүмкін.
CSF-де байытылған мотивтер қандағылардан ерекшеленеді.Бір қызығы, біз жеке жануарлардың қанындағы глицинге бай пептидтерге бірінші ауысуды атап өттік.(1g-сурет, Қосымша 4e, 4f-суреттер).Құрамында глицин пептидтері бар фагтар тұрақтырақ болуы және айналымнан шығарылу ықтималдығы аз болуы мүмкін.Дегенмен, бұл глицинге бай пептидтер цереброспинальды сұйықтық үлгілерінде анықталмады, бұл кураторлық кітапханалар екі түрлі таңдау сатысынан өтті: біреуі қанда, екіншісі ми жұлын сұйықтығында жиналуға мүмкіндік берді.Іріктеудің төртінші турының нәтижесінде алынған CSF-мен байытылған клондар жан-жақты сынақтан өтті.Жеке тексерілген клондардың барлығы дерлік бос бақылау фагымен салыстырғанда CSF-те байытылғаны расталды.Бір пептидті соққы (№2077) толығырақ қарастырылды.Ол басқа хиттермен салыстырғанда плазманың жартылай шығарылу кезеңін ұзағырақ көрсетті (3d-сурет және қосымша 7-сурет) және бір қызығы, бұл пептидте C-терминусында цистеин қалдығы болды.Жақында пептидтерге цистеинді қосу альбуминмен 29 байланысу арқылы олардың фармакокинетикалық қасиеттерін жақсарта алатыны анықталды.Бұл қазіргі уақытта №2077 пептид үшін белгісіз және қосымша зерттеуді қажет етеді.Кейбір пептидтер CSF байытуда валенттілікке тәуелділікті көрсетті (деректер көрсетілмеген), бұл T7 капсидінің көрсетілген бетінің геометриясына қатысты болуы мүмкін.Біз пайдаланған T7 жүйесі әрбір фаг бөлшекке әрбір пептидтің 5-15 көшірмесін көрсетті.IHC егеуқұйрықтардың ми қыртысына көктамыр ішіне енгізілген қорғасын фаг кандидаттарының клондарында орындалды (Қосымша 8-сурет).Деректер кем дегенде үш клонның (№ 2002, № 2009 және № 2077) BBB-мен әрекеттесетінін көрсетті.Бұл BBB өзара әрекеттесу CSF жинақталуына немесе осы клондардың тікелей BCSFB-ге қозғалысына әкелетінін анықтау керек.Маңыздысы, таңдалған пептидтер синтезделген және ақуыз жүктерімен байланысқан кезде олардың CSF тасымалдау қабілетін сақтайтынын көрсетеміз.N-терминалды биотинилденген пептидтердің SA-мен байланысуы қан мен жұлын сұйықтығындағы олардың сәйкес фаг клондарымен алынған нәтижелерді қайталайды (сурет 3e).Соңында, біз қорғасын №2077 пептидінің SA-мен конъюгацияланған BACE1 биотинленген пептид тежегішінің ми әрекетін ынталандыруға қабілетті екенін көрсетеміз, бұл CSF-дегі Abeta40 деңгейін айтарлықтай төмендету арқылы ОЖЖ-де айқын фармакодинамикалық әсерлерді тудырады (4-сурет).Біз барлық хиттердің пептидтік реттілігінің гомологиясын іздеу арқылы дерекқордағы гомологтарды анықтай алмадық.Айта кету керек, T7 кітапханасының өлшемі шамамен 109, ал 12-мерс үшін теориялық кітапхана өлшемі 4 x 1015. Сондықтан, біз 12-мер пептидтік кітапхананың әртүрлілік кеңістігінің аз ғана бөлігін таңдадық, бұл осы іргелес анықталған тізбектердің кеңістігін бағалау арқылы оңтайландырылған пептидтерді анықтауға болатынын білдіруі мүмкін.Гипотетикалық тұрғыдан алғанда, біз осы пептидтердің табиғи гомологтарын таппауымыздың себептерінің бірі белгілі бір пептидтік мотивтердің миға бақылаусыз енуіне жол бермеу үшін эволюция кезінде таңдаудан бас тарту болуы мүмкін.
Бірге алғанда, біздің нәтижелер in vivo толығырақ цереброваскулярлық тосқауылдың тасымалдау жүйелерін анықтау және сипаттау бойынша болашақ жұмыс үшін негіз болады.Бұл әдістің негізгі қондырғысы церебральды тамырларды байланыстыру қасиеттері бар клондарды анықтап қана қоймай, сонымен қатар табысты клондардың ОЖЖ бөліміне in vivo биологиялық кедергілерді кесіп өту үшін өзіндік белсенділігі бар маңызды қадамды қамтитын функционалды таңдау стратегиясына негізделген.Бұл пептидтердің тасымалдану механизмін және олардың ми аймағына тән микротамырлармен байланысуын қалайтындығын түсіндіру.Бұл BBB және рецепторларды тасымалдаудың жаңа жолдарының ашылуына әкелуі мүмкін.Анықталған пептидтер цереброваскулярлық рецепторлармен немесе BBB немесе BCSFB арқылы тасымалданатын айналымдағы лигандтармен тікелей байланыса алады деп күтеміз.Осы жұмыста ашылған CSF тасымалдау белсенділігі бар пептидтік векторлар әрі қарай зерттелетін болады.Қазіргі уақытта біз осы пептидтердің ми ерекшелігін олардың BBB және/немесе BCSFB арқылы өту қабілетін зерттеп жатырмыз.Бұл жаңа пептидтер жаңа рецепторларды немесе жолдарды әлеуетті ашу және биологиялық препараттар сияқты макромолекулаларды миға жеткізу үшін жаңа жоғары тиімді платформаларды әзірлеу үшін өте құнды құралдар болады.
Бұрын сипатталған әдісті модификациялау арқылы үлкен цистернаны (КМ) каннуляциялаңыз.Жансыздандырылған Wistar егеуқұйрықтары (200-350 г) стереотаксикалық аппаратқа орнатылып, бас сүйегінің бетін ашу үшін қырылған және асептикалық түрде дайындалған бас терісіне ортаңғы тілік жасалды.Жоғарғы белдеу аймағында екі тесік бұрғылаңыз және тесіктерге бекіту бұрандаларын бекітіңіз.Тот баспайтын болаттан жасалған канюляны CM-ге стереотактикалық бағыттау үшін латеральды желке қыртысында қосымша тесік бұрғыланды.Канюляның айналасына тіс цементін жағып, бұрандалармен бекітіңіз.Фотокабинациядан және цементті қатайтқаннан кейін тері жарасы 4/0 супрамидті тігіспен жабылды.Канюляның дұрыс орналасуы ми-жұлын сұйықтығының (МСФ) өздігінен ағуымен расталады.Егеуқұйрықты стереотаксикалық аппараттан алып тастаңыз, операциядан кейінгі тиісті күтімді және ауырсынуды емдеуді қабылдаңыз және ми-жұлын сұйықтығында қан белгілері байқалғанға дейін кем дегенде бір апта бойы қалпына келтіруге мүмкіндік беріңіз.Wistar егеуқұйрықтары (Crl:WI/Han) Чарльз өзенінен (Франция) алынды.Барлық егеуқұйрықтар патогенсіз арнайы жағдайларда ұсталды.Жануарларға жасалған барлық эксперименттер Швейцарияның Базель қаласының ветеринариялық кеңсесінде мақұлданды және № 2474 Жануарларға арналған лицензияға (Егеуқұйрықтың ми сұйықтығы мен миындағы терапевтік кандидаттардың деңгейлерін өлшеу арқылы белсенді мидың тасымалдануын бағалау) сәйкес орындалды.
Қолыңызда CM каннуласымен егеуқұйрықты абайлап есінде ұстаңыз.Канюлядан Датураны алып тастап, өздігінен ағып жатқан 10 мкл жұлын сұйықтығын жинаңыз.Канюляның өткізгіштігі ақырында бұзылғандықтан, бұл зерттеуге қанның ластануы немесе түсінің өзгергені туралы ешқандай дәлелі жоқ таза цереброспинальды сұйықтық үлгілері ғана енгізілген.Параллельді түрде құйрықтың ұшындағы кішкене тіліктен гепарин (Сигма-Олдрих) бар түтіктерге шамамен 10-20 мкл қан алынды.Т7 фагты көктамыр ішіне енгізгеннен кейін CSF және қан әртүрлі уақыт нүктелерінде жиналды.Әрбір CSF үлгісін жинамас бұрын шамамен 5-10 мкл сұйықтық тасталды, бұл катетердің өлі көлеміне сәйкес келеді.
Кітапханалар T7Select жүйелік нұсқаулығында сипатталғандай T7Select 10-3b векторы арқылы жасалды (Novagen, Rosenberg және т.б., InNovations 6, 1-6, 1996).Қысқаша, кездейсоқ 12-мер ДНҚ кірістіру келесі форматта синтезделді:
NNK кодоны қос тоқтату кодондарын және кірістірудегі амин қышқылының шамадан тыс экспрессиясын болдырмау үшін пайдаланылды.N - әрбір нуклеотидтің қолмен араласқан эквимолярлық қатынасы, ал K - аденин мен цитозин нуклеотидтерінің қолмен араласқан эквимолярлық қатынасы.Бір тізбекті аймақтар dNTP (Novagen) және Klenow ферментімен (New England Biolabs) Klenow буферінде (New England Biolabs) 3 сағат бойы 37°C температурада одан әрі инкубациялау арқылы қос тізбекті ДНҚ-ға айналдырылды.Реакциядан кейін қос тізбекті ДНҚ EtOH преципитациясымен қалпына келтірілді.Алынған ДНҚ EcoRI және HindIII шектеу ферменттерімен (екеуі де Roche компаниясынан) қорытылды.Бөлінген және тазартылған (QIAquick, Qiagen) кірістіру (T4 ligase, New England Biolabs) содан кейін 10B капсид генінің 348 амин қышқылынан кейін алдын ала бөлінген T7 векторына жақтау ішінде байланыстырылды.Лигация реакциялары in vitro орау алдында 18 сағат бойы 16°C температурада инкубацияланды.Фагты орамдау in vitro T7Select 10-3b клондау жинағымен (Novagen) берілген нұсқауларға сәйкес орындалды және орау ерітіндісі ішек таяқшасын (BLT5615, Novagen) пайдаланып лизис үшін бір рет күшейтілді.Лизаттар центрифугаланған, титрленген және глицериннің қор ерітіндісі ретінде -80°С мұздатылған.
Меншікті 454/Рош-ампликонды біріктіру праймерлерімен сорпада немесе пластинада күшейтілген фагтардың ауыспалы аймақтарын тікелей ПТР күшейту.Алға қарай біріктіру праймерінде айнымалы аймақты (NNK) 12 (үлгіге тән), GS FLX Titanium адаптері A және төрт негізгі кітапханалық пернелер тізбегі (TCAG) (қосымша 1а сурет) жанындағы тізбектер бар:
Кері біріктіру праймерінде сонымен қатар моншақтарды алу үшін бекітілген биотин және эмульсия ПТР кезінде клондық күшейту үшін қажет GS FLX титан адаптері В бар:
Содан кейін ампликондар 454 GS-FLX Titanium протоколына сәйкес 454/Roche пиросквенирлеуіне ұшырады.Қолмен Sanger секвенциясы (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) үшін T7 фаг ДНҚ ПТР арқылы күшейтілді және келесі праймер жұптарымен реттелген:
Жеке бляшкалардан алынған кірістірулер Roche Fast Start DNA Polimerase жинағы (өндірушінің нұсқауларына сәйкес) арқылы ПТР күшейтуге ұшырады.Ыстық іске қосуды (95 °C температурада 10 мин) және 35 күшейту циклін (95 °C температурада 50 с, 50 ​​°C температурада 1 мин және 72 °C температурада 1 мин) орындаңыз.
Кітапханалардан алынған фаг, жабайы типтегі фаг, CSF және қаннан құтқарылған фаг немесе жеке клондар Escherichia coli BL5615 TB сорпасында (Sigma Aldrich) немесе 500 см2 ыдыстарда (Thermo Scientific) 37°C температурада 4 сағат бойы күшейтілді.Пластиналардан фагтар Трис-ЭДТА буферімен (Fluka Analytical) шаю арқылы немесе стерильді тамшуыр ұштары бар тақталарды жинау арқылы шығарылды.Фагтар полиэтиленгликоль (PEG 8000) тұнбасының (Promega) бір раундымен культуралық үстіңгі заттан немесе экстракция буферінен бөлініп алынды және Tris-EDTA буферінде қайта суспензияланды.
Күшейтілген фаг ішілік (IV) инъекция алдында (500 мкл/жануар) эндотоксинді кетіру моншақтары (Miltenyi Biotec) арқылы эндотоксинді жоюдың 2-3 айналымына ұшырады.Бірінші айналымда 2×1012 фагтар енгізілді;екіншісінде 2×1010 фагтар;үшінші және төртінші іріктеу турларында бір жануарға 2×109 фаг.Көрсетілген уақыт нүктелерінде жиналған CSF және қан үлгілеріндегі фаг мазмұны өндірушінің нұсқауларына сәйкес (T7Select жүйелік нұсқаулығы) бляшкаларды санау арқылы анықталды.Фагтарды іріктеу тазартылған кітапханаларды құйрық венасына ішілік енгізу немесе алдыңғы іріктеу раундынан CSF алынған фагты қайта енгізу арқылы орындалды, ал кейінгі жинаулар сәйкесінше 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин және қан үлгісінде орындалды.In vivo панорамалаудың барлығы төрт раунды өткізілді, онда екі таңдалған бұтақ бөлек сақталды және таңдаудың алғашқы үш раундында талданды.Таңдаудың алғашқы екі раундындағы CSF-дан алынған барлық фаг кірістірулері 454/Roche пиросквенирлеуіне ұшырады, бұл ретте таңдаудың соңғы екі раундынан CSF-дан алынған барлық клондар қолмен реттелген.Іріктеудің бірінші раундындағы барлық қан фагтары да 454/Рош пиросеквенциясына ұшырады.Фаг клондарын инъекциялау үшін таңдалған фагтар E. coli (BL5615) ішінде 500 см2 пластиналарда 37°C температурада 4 сағат бойы күшейтілді.Жеке таңдалған және қолмен реттелген клондар туберкулезге қарсы ортада көбейтілді.Фагты экстракциялаудан, тазартудан және эндотоксинді жоюдан кейін (жоғарыда сипатталғандай) 300 мкл көлеміндегі 2 × 1010 фаг/жануар бір құйрық венасына көктамыр ішіне енгізілді.
Кезекті мәліметтерді алдын ала өңдеу және сапалы сүзгілеу.Raw 454/Roche деректері жеткізушінің бағдарламалық құралы арқылы екілік стандартты ағындық карта пішімінен (sff) Pearson адам оқи алатын пішіміне (fasta) түрлендірілді.Нуклеотидтер тізбегін одан әрі өңдеу төменде сипатталғандай меншікті C бағдарламалары мен сценарийлерін (шығармаған бағдарламалық пакет) пайдалану арқылы орындалды.Бастапқы деректерді талдау қатаң көп сатылы сүзу процедураларын қамтиды.Жарамды 12мер кірістіру ДНҚ тізбегін қамтымайтын оқуларды сүзгілеу үшін оқылымдар бастапқы белгіге (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), тоқтату белгісіне (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) және фондық кірістіруге (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCTCGW global test арқылы) ретімен тураланды.бір туралау үшін 2 сәйкессіздікке мүмкіндік беретін туралау31.Сондықтан бастау және тоқтату тегтерінсіз оқулар және фондық кірістірулерді қамтитын оқулар, яғни сәйкессіздіктердің рұқсат етілген санынан асатын туралаулар кітапханадан жойылды.Қалған көрсеткіштерге келетін болсақ, бастапқы белгіден бастап тоқтау белгісіне дейін аяқталатын N-mer ДНҚ тізбегі бастапқы оқу тізбегінен алынып тасталды және одан әрі өңделеді (бұдан әрі «кірістіру» деп аталады).Кірістірме аударылғаннан кейін праймердің 5′ ұшындағы бірінші тоқтату кодонынан кейінгі бөлік кірістіруден алынады.Сонымен қатар, праймердің 3′ ұшында толық емес кодондарға әкелетін нуклеотидтер де жойылды.Тек фондық реттіліктерді қамтитын кірістірулерді алып тастау үшін, "PAG" амин қышқылы үлгісінен басталатын аударылған кірістірулер де жойылды.Посттрансляциялық ұзындығы 3 аминқышқылынан аз пептидтер кітапханадан шығарылды.Соңында кірістіру пулындағы артықшылықты жойып, әрбір бірегей кірістіру жиілігін анықтаңыз.Бұл талдаудың нәтижелері нуклеотидтер тізбегі (кірістіру) және олардың (оқылатын) жиіліктерінің тізімін қамтиды (қосымша 1c және 2 суреттер).
Топ N-mer ДНҚ кірістірулерін реттілік ұқсастығы бойынша: 454/Рош-спецификалық секвенирлеу қателерін (мысалы, гомополимер кеңейтімдерін секвенирлеу проблемалары) жою және маңыздылығы азырақ артықшылықтарды жою үшін бұрын сүзілген N-mer ДНҚ тізбегі кірістірулері (кірістірулер) ұқсастық бойынша сұрыпталады.келесідей анықталған итерациялық алгоритмді қолданатын кірістірулер (сәйкес келмейтін негіздерге 2-ге дейін рұқсат етіледі): кірістірулер алдымен жиілігі бойынша (ең жоғарыдан төменге дейін), ал егер олар бірдей болса, ұзындығы бойынша қайталама сұрыптау бойынша (ең ұзыннан ең қысқасына) сұрыпталады.Осылайша, ең жиі және ең ұзын кірістірулер бірінші «топты» анықтайды.Топтық жиілік негізгі жиілікке орнатылады.Содан кейін сұрыпталған тізімде қалған әрбір кірістіру жұптық Needleman-Wunsch туралау арқылы топқа қосылуға тырысты.Егер туралаудағы сәйкессіздіктер, кірістірулер немесе жоюлар саны 2 шекті мәннен аспаса, кірістіру топқа қосылады және жалпы топ жиілігі кірістіру қаншалықты жиі қосылғанына қарай артады.Топқа қосылған кірістірулер пайдаланылған ретінде белгіленеді және одан әрі өңдеуден шығарылады.Кірістіру ретін бұрыннан бар топқа қосу мүмкін болмаса, кірістіру тізбегі сәйкес кірістіру жиілігі бар жаңа топты жасау үшін пайдаланылады және пайдаланылған ретінде белгіленеді.Итерация әрбір кірістіру реті жаңа топты құру үшін пайдаланылғанда немесе бұрыннан бар топқа қосылуы мүмкін болғанда аяқталады.Өйткені, нуклеотидтерден тұратын топтастырылған кірістірулер ақырында пептидтік тізбектерге (пептидтік кітапханаларға) аударылады.Бұл талдаудың нәтижесі кірістірулер жиынтығы және олардың дәйекті оқулар санын құрайтын сәйкес жиіліктері болып табылады (Қосымша 2-сурет).
Motif Generation: Бірегей пептидтер тізімі негізінде төменде көрсетілгендей барлық ықтимал аминқышқылдарының үлгілері (aa) бар кітапхана жасалды.Ұзындығы 3 болатын әрбір ықтимал үлгі пептидтен алынды және оның кері үлгісі барлық үлгілерді (трипептидтер) қамтитын жалпы мотив кітапханасымен бірге қосылды.Қайталанатын мотивтердің кітапханалары реттелген және артықшылықтар жойылды.Содан кейін мотив кітапханасындағы әрбір трипептид үшін оның кітапханада болуын есептеу құралдары арқылы тексердік.Бұл жағдайда табылған трипептид мотиві бар пептидтің жиілігі қосылады және мотивтер кітапханасындағы мотивке тағайындалады («мотивтер саны»).Мотивтерді құру нәтижесі трипептидтердің (мотивтердің) барлық көріністерін және олардың сәйкес мәндерін қамтитын екі өлшемді массив болып табылады, олар оқылғандар сүзгіленген, топталған және аударылған кезде сәйкес мотивке әкелетін оқу реттілік саны болып табылады.Жоғарыда егжей-тегжейлі сипатталғандай көрсеткіштер.
Мотивтер санын және сәйкес шашыраңқы сызбаларды қалыпқа келтіру: Әрбір үлгі үшін мотивтер саны
мұндағы ni - i тақырыбын қамтитын оқылғандар саны.Осылайша, vi үлгідегі i мотиві бар оқулардың (немесе пептидтердің) пайыздық жиілігін білдіреді.Мотивтердің нормаланбаған саны үшін P-мәндері Фишердің нақты сынағы арқылы есептелді.Мотивтер санының коррелограммаларына қатысты, Спирменнің корреляциясы R-мен мотивтердің нормаланған санын пайдалана отырып есептелді.
Пептидтік кітапханадағы әрбір позициядағы аминқышқылдарының мазмұнын визуализациялау үшін 32, 33 веб-логограммалары (http://weblogo.threeplusone.com) жасалды.Біріншіден, 12-мер пептидінің әрбір позициясындағы аминқышқылдарының мазмұны 20×12 матрицада сақталады.Содан кейін әрбір позицияда бірдей салыстырмалы амин қышқылы мазмұнын қамтитын 1000 пептидтер жинағы жылдам реттілік пішімінде жасалады және әрбір позициядағы салыстырмалы амин қышқылы мазмұнының графикалық көрінісін жасайтын 3-веб-логотипіне кіріс ретінде беріледі.берілген пептидтік кітапхана үшін.Көпөлшемді деректер жиынын визуализациялау үшін жылу карталары R жүйесінде ішкі әзірленген құралдың көмегімен жасалды (biosHeatmap, әлі шығарылмаған R пакеті).Жылу карталарында ұсынылған дендрограммалар Уордтың евклидтік қашықтық метрикасы бар иерархиялық кластерлеу әдісі арқылы есептелді.Мотивті бағалау деректерін статистикалық талдау үшін нормаланбаған балл үшін P мәндері Фишердің нақты сынағы арқылы есептелді.Басқа деректер жиыны үшін P-мәндері Student's t-test немесе ANOVA көмегімен R-де есептелді.
Таңдалған фаг клондары мен кірістірулері жоқ фагтар құйрық венасы арқылы көктамыр ішіне енгізілді (300 мкл PBS ішіндегі 2 × 1010 фаг/жануар).Перфузиядан және кейінгі бекітуден он минут бұрын бірдей жануарларға DyLight594 таңбаланған лектин 100 мкл көктамыр ішіне енгізілді (Vector Laboratories Inc., DL-1177).Фагты инъекциядан кейін 60 минуттан кейін егеуқұйрықтар жүрек арқылы 50 мл PBS, содан кейін 50 мл 4% PFA/PBS арқылы перфузияланды.Ми үлгілері түнде 4% PFA/PBS ішінде қосымша бекітіліп, 30% сахарозаға түні бойы 4°C температурада малынған.Үлгілер OCT қоспасында мұздатылған.Мұздатылған үлгілердің иммуногистохимиялық талдауы 1% BSA-мен блокталған және T7 фагына (Novus NB 600-376A) қарсы поликлоналды FITC таңбаланған антиденелермен инкубацияланған 30 мкм криосекцияларда 4 °C температурада бөлме температурасында орындалды.Түнде инкубациялаңыз.Соңында кесінділер PBS-пен 3 рет жуылды және конфокальды лазерлік микроскоппен (Leica TCS SP5) зерттелді.
Ең аз тазалығы 98% болатын барлық пептидтер GenScript USA арқылы синтезделген, биотинделген және лиофилденген.Биотин N-терминуста қосымша үш глициндік аралық арқылы байланысады.Масс-спектрометрия көмегімен барлық пептидтерді тексеріңіз.
Стрептавидин (Sigma S0677) биотинленген пептидтің, биотинленген BACE1 тежегіш пептидінің 5 есе эквимолярлы артық мөлшерімен немесе биотинленген BACE1 тежеу ​​пептидінің және BACE1 тежегіш пептидінің 5–10% PBS/incubat құрамындағы DMSO/in 5-10% құрамдастығымен (3:1 қатынасы) араласқан.Инъекция алдында 1 сағат бөлме температурасында.Стрептавидинмен конъюгацияланған пептидтер ми қуысы бар егеуқұйрықтардың құйрық веналарының біріне 10 мг/кг дозада көктамыр ішіне енгізілді.
Стрептавидин-пептидті кешендердің концентрациясы ИФА әдісімен бағаланды.Nunc Maxisorp микротитр тақталары (Sigma) түні бойы 4°C температурада тышқанның стрептавидинге қарсы 1,5 мкг/мл антиденесімен (Thermo, MA1-20011) қапталған.Блоктаудан кейін (блоктау буфері: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) бөлме температурасында 2 сағат бойы пластинаны 0,05% Tween-20/PBS (жуу буфері) арқылы жуыңыз және 3 секунд бойы плазмадан тазартылған сынамалар қосылған плазмадан тазартылған. 1:10 000, CSF 1:115).Содан кейін пластинаны анықтау антиденелері (1 мкг/мл, антистрептавидин-HRP, Novus NB120-7239) бар түні бойы 4°C температурада инкубациялады.Үш жуу қадамынан кейін стрептавидин TMB субстрат ерітіндісінде (Roche) 20 минутқа дейін инкубациялау арқылы анықталды.1M H2SO4 көмегімен түс дамуын тоқтатқаннан кейін сіңіруді 450 нм-де өлшеңіз.
Стрептавидин-пептид-BACE1 тежегіш кешенінің қызметі өндірушінің хаттамасына (Wako, 294-64701) сәйкес Aβ(1-40) ИФА арқылы бағаланды.Қысқаша айтқанда, CSF үлгілері стандартты еріткіште (1:23) сұйылтылған және BNT77 түсіру антиденесімен қапталған 96 шұңқырлы пластиналарда түні бойы 4°C температурада инкубацияланған.Бес жуу қадамынан кейін HRP конъюгацияланған BA27 антиденесі қосылды және 2 сағат бойы 4°C температурада инкубацияланды, содан кейін бес жуу қадамы орындалды.Aβ(1–40) бөлме температурасында 30 минут бойы TMB ерітіндісінде инкубациялау арқылы анықталды.Түстің дамуы тоқтату ерітіндісімен тоқтатылғаннан кейін сіңіруді 450 нм-де өлшеңіз.Плазма үлгілері Aβ(1–40) ИФА алдында қатты фазалық экстракцияға ұшырады.Плазма 96 шұңқырлы пластиналардағы 0,2% DEA (Sigma) қосылды және бөлме температурасында 30 минут бойы инкубацияланды.SPE пластиналарын (Oasis, 186000679) сумен және 100% метанолмен дәйекті жуғаннан кейін SPE пластиналарына плазма үлгілері қосылды және барлық сұйықтық жойылды.Үлгілер жуылды (алдымен 5% метанолмен, содан кейін 30% метанолмен) және 2% NH4OH/90% метанолмен элюцияланды.Элюатты 55°C температурада тұрақты N2 токта 99 минут кептіргеннен кейін үлгілер стандартты еріткіштерде азайтылды және Aβ(1–40) жоғарыда сипатталғандай өлшенді.
Бұл мақаланы қалай келтіруге болады: Urich, E. et al.In vivo анықталған транзиттік пептидтердің көмегімен жүкті миға жеткізу.ғылым.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB және Moos T. Мақсатты терапияны қолдану арқылы миға макромолекулярлық препараттарды жеткізу.Neurochemistry журналы 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. Гематоэнцефалдық бөгет арқылы пептидтік және ақуыздық препараттарды жеткізу.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, В.М. Гематоэнцефалдық бөгет: мидың дәрілік дамуындағы кедергі.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, Дж.А., Стопа, Э.Г. және Берд, А. Дәрілік заттарды жеткізуді жақсарту және хороидтық плексус-CSF жолы арқылы миға бағыттау перспективалары.Фармацевтикалық зерттеулер 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, WM Миды жеткізу үшін молекулярлық трояндық жылқылармен биофармацевтикалық препараттарды жаңғырту.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, гематоэнцефалдық бөгет арқылы WM рецепторлары арқылы жүретін пептидті тасымалдау.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Моновалентті молекулалық шаттлдарды пайдалана отырып, мидың енуін және емдік антиденелердің тиімділігін арттырыңыз.Нейрон 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Трансферриндік рецепторлардың (TfR) тасымалдануы TfR антиденелерінің аффинді нұсқаларының миды қабылдауын анықтайды.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).