Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Сұйық биопсиясы (LB) - бұл биомедициналық салада тез танымал болып келе жатқан тұжырымдама.Тұжырымдама негізінен әртүрлі ұлпаларда жасуша өлгеннен кейін шағын фрагменттер түрінде шығарылатын айналымдағы жасушадан тыс ДНҚ (ccfDNA) фрагменттерін анықтауға негізделген.Бұл фрагменттердің кішкене бөлігі бөтен (бөтен) тіндерден немесе ағзалардан шыққан.Ағымдағы жұмыста біз бұл тұжырымдаманы теңіз суын жоғары сүзу қабілетімен танымал мидияларға қолдандық.Біз теңіз жағалауындағы экожүйелердің биоәртүрлілігі туралы ақпарат беру үшін әртүрлі көздерден қоршаған ортаның ДНҚ фрагменттерін алу үшін мидиялардың табиғи сүзгілер ретінде әрекет ету қабілетін пайдаланамыз.Біздің нәтижелеріміз мидия гемолимфасында 1-ден 5 кб-қа дейінгі өлшемдері бойынша әр түрлі ДНҚ фрагменттері бар екенін көрсетті.Мылтық секвенциясы ДНҚ фрагменттерінің үлкен санының бөтен микробтық текті екенін көрсетті.Олардың ішінде біз бактериялардың, археялардың және вирустардың, соның ішінде жағалаудағы теңіз экожүйесінде жиі кездесетін әртүрлі хосттарды жұқтыратын белгілі вирустардың ДНҚ фрагменттерін таптық.Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз мидияларға қолданылатын LB тұжырымдамасы теңіз жағалауындағы экожүйелердегі микробтардың әртүрлілігі туралы білімнің бай, бірақ әлі зерттелмеген көзі екенін көрсетеді.
Теңіз экожүйелерінің биоәртүрлілігіне климаттың өзгеруінің әсері (КК) қарқынды дамып келе жатқан зерттеу саласы болып табылады.Ғаламдық жылыну маңызды физиологиялық күйзелістерді туғызып қана қоймайды, сонымен қатар теңіз ағзаларының жылу тұрақтылығының эволюциялық шегін ығыстырып, бірқатар түрлердің мекендеу ортасына әсер етіп, оларды қолайлы жағдайларды іздеуге итермелейді [1, 2].Метазоандардың биоәртүрлілігіне әсер етумен қатар, CC хост-микробтық өзара әрекеттесулердің нәзік тепе-теңдігін бұзады.Бұл микробтық дисбактериоз теңіз экожүйелеріне үлкен қауіп төндіреді, өйткені ол теңіз ағзаларын жұқпалы патогендерге сезімтал етеді [3, 4].Жаппай өлім-жітімде СС маңызды рөл атқарады деп саналады, бұл жаһандық теңіз экожүйесін басқару үшін күрделі мәселе болып табылады [5, 6].Бұл көптеген теңіз түрлерінің экономикалық, экологиялық және қоректік әсерін ескере отырып, маңызды мәселе.Бұл әсіресе полярлық аймақтарда өмір сүретін қосжақтаулыларға қатысты, мұнда КҚ әсері тезірек және ауыр болады [6, 7].Шын мәнінде, Mytilus spp сияқты қосжақпандарды.теңіз экожүйелеріне СС әсерін бақылау үшін кеңінен қолданылады.Олардың денсаулығын бақылау үшін биомаркерлердің салыстырмалы түрде көп саны ферментативті белсенділікке немесе жасуша өміршеңдігі мен фагоцитарлық белсенділікке негізделген жасушалық функцияларға негізделген функционалды биомаркерлерді қамтитын екі деңгейлі тәсілді жиі қолданатыны таңқаларлық емес [8].Бұл әдістер сонымен қатар теңіз суының көп мөлшерін сіңіргеннен кейін жұмсақ тіндерде жиналатын арнайы қысым көрсеткіштерінің концентрациясын өлшеуді қамтиды.Дегенмен, қосжақпандардың жоғары сүзу қабілеті мен жартылай ашық қанайналым жүйесі пациенттерді басқарудың қарапайым және аз инвазивті тәсілі болып табылатын сұйық биопсияның (LB) тұжырымдамасын пайдалана отырып, жаңа гемолимфа биомаркерлерін әзірлеуге мүмкіндік береді.қан үлгілері [9, 10].Айналымдағы молекулалардың бірнеше түрін адамның LB-де табуға болатынына қарамастан, бұл тұжырымдама ең алдымен плазмадағы айналымдағы жасушадан тыс ДНҚ (ccfDNA) фрагменттерінің ДНҚ секвенирлеу талдауына негізделген.Шындығында, адам плазмасында айналымдағы ДНҚ-ның болуы 20 ғасырдың ортасынан бері белгілі болды [11], бірақ соңғы жылдары ғана жоғары өнімді секвенирлеу әдістерінің пайда болуы ccfDNA негізіндегі клиникалық диагнозға әкелді.Осы айналымдағы ДНҚ фрагменттерінің болуы ішінара жасуша өлгеннен кейін геномдық ДНҚ-ның (ядролық және митохондриялық) пассивті босатылуымен байланысты. Дені сау адамдарда ccfDNA концентрациясы әдетте төмен (<10 нг/мл), бірақ әртүрлі патологиялардан зардап шегетін немесе стреске ұшыраған науқастарда 5-10 есе артуы мүмкін, бұл тіндердің зақымдалуына әкеледі. Дені сау адамдарда ccfDNA концентрациясы әдетте төмен (<10 нг/мл), бірақ әртүрлі патологиялардан зардап шегетін немесе стреске ұшыраған науқастарда 5-10 есе артуы мүмкін, бұл тіндердің зақымдалуына әкеледі. У здоровых адамдар концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), бірақ мүмкін повышься в 5-10 раз у үлкен патологиялық немесе подвергающихся стресске, приводящему к повреждению тканей. Сау адамдарда cccDNA концентрациясы әдетте төмен (<10 нг/мл), бірақ әртүрлі патологиялары бар немесе тіндердің зақымдануына әкелетін стресс жағдайында ол 5-10 есе артуы мүмкін.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мл），但在患有各种病理或各中，加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 戗 病理 戗可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伍 损伍Концентрации ccfDNA өте аз (<10 нг/мл) адам денсаулығына зиян тигізбейді, бірақ пациенттердің әртүрлі патологиялары немесе стресстері бар науқастардың 5-10 разрядында жоғарылауы мүмкін. Дені сау адамдарда ccfDNA концентрациясы әдетте төмен (<10 нг/мл), бірақ әртүрлі патологиялары немесе стресстері бар науқастарда 5-10 есе артуы мүмкін, бұл тіндердің зақымдалуына әкеледі.ccfDNA фрагменттерінің өлшемі кең ауқымда өзгереді, бірақ әдетте 150-ден 200 bp-ге дейін ауытқиды.[12].Өздігінен алынған ccfDNA талдауы, яғни қалыпты немесе трансформацияланған хост жасушаларынан алынған ccfDNA, ядролық және/немесе митохондриялық геномда бар генетикалық және эпигенетикалық өзгерістерді анықтау үшін пайдаланылуы мүмкін, осылайша клиницистерге арнайы молекулалық мақсатты терапияны таңдауға көмектеседі [13].Дегенмен, ccfDNA-ны жүктілік кезінде ұрық жасушаларынан немесе трансплантацияланған мүшелерден ccfDNA сияқты шетелдік көздерден алуға болады [14,15,16,17].ccfDNA сонымен қатар жұқпалы тіннің инвазивті биопсиясын болдырмай, қан культураларымен анықталмаған кең таралған инфекцияларды инвазивті емес анықтауға мүмкіндік беретін инфекциялық агенттің (бөтен) нуклеин қышқылдарының болуын анықтау үшін маңызды ақпарат көзі болып табылады [18].Соңғы зерттеулер шынымен де адам қанында вирустық және бактериялық қоздырғыштарды анықтауға болатын ақпараттың бай көзі бар екенін және адам плазмасында табылған ccfDNA-ның шамамен 1% бөтен текті екенін көрсетті [19].Бұл зерттеулер ағзаның айналымдағы микробиомасының биоәртүрлілігін ccfDNA талдауы арқылы бағалауға болатынын көрсетеді.Дегенмен, соңғы кезге дейін бұл ұғым тек адамдарда және аз дәрежеде басқа омыртқалы жануарларда қолданылды [20, 21].
Осы мақалада біз 35 миллион жыл бұрын пайда болған үлкен үстірт үстіндегі аралдар тобы, субантарктикалық Кергулен аралдарында жиі кездесетін оңтүстік түр Аулакомия атрасының ccfDNA-сын талдау үшін LB потенциалын қолданамыз.жанартау атқылауы.In vitro эксперименттік жүйені пайдалана отырып, біз теңіз суындағы ДНҚ фрагменттерін мидиялар тез қабылдап, гемолимфа бөліміне енетінін анықтадық.Мылтық секвенциясы мидия гемолимфасының ccfDNA құрамында өзіндік және өздігінен емес ДНҚ фрагменттері бар екенін көрсетті, оның ішінде симбиотикалық бактериялар мен салқын жанартаулық теңіз жағалауындағы экожүйелерге тән биомдардан алынған ДНҚ фрагменттері.Гемолимфтік ccfDNA сонымен қатар әртүрлі хост диапазоны бар вирустардан алынған вирустық тізбектерді қамтиды.Біз сондай-ақ сүйекті балықтар, теңіз анемондары, балдырлар және жәндіктер сияқты көп жасушалы жануарлардың ДНҚ фрагменттерін таптық.Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз LB тұжырымдамасын теңіз экожүйелерінде бай геномдық репертуар жасау үшін теңіз омыртқасыздарына сәтті қолдануға болатындығын көрсетеді.
Ересек (ұзындығы 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) және Aulacomya atra (A. atra) Порт-о-Франстың (049°21.235 S., 070°13.490 E.) толқын аралық жартасты жағалауларынан жиналды.Кергулен аралдары 2018 жылдың желтоқсанында. Басқа ересек көк мидиялар (Mytilus spp.) коммерциялық жеткізушіден (PEI Mussel King Inc., Принс Эдвард аралы, Канада) алынды және 10–20 л 32‰ жасанды тұзды ерітіндісі бар температура бақыланатын (4°C) газдалған резервуарға орналастырылды.(жасанды теңіз тұзы Риф Кристал, Instant Ocean, Вирджиния, АҚШ).Әрбір тәжірибе үшін жеке қабықшалардың ұзындығы мен салмағы өлшенді.
Бұл бағдарлама үшін тегін ашық қол жеткізу хаттамасы желіде қолжетімді (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Қысқаша айтқанда, LB гемолимфа сипатталғандай [22] ұрлаушы бұлшықеттерден жиналды.Гемолимфа 3 минут бойы 1200 × г центрифугалау арқылы тазартылды, үстіңгі зат пайдаланылғанға дейін мұздатылған (-20 ° C).cfDNA оқшаулау және тазарту үшін үлгілер (1,5-2,0 мл) өндірушінің нұсқауларына сәйкес NucleoSnap cfDNA жинағы (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) арқылы ерітілді және өңделді.ccfDNA одан әрі талдауға дейін -80°C температурада сақталды.Кейбір эксперименттерде ccfDNA QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада) көмегімен оқшауланған және тазартылған.Тазартылған ДНҚ стандартты PicoGreen талдауы арқылы сандық анықталды.Оқшауланған ccfDNA фрагменттерінің таралуы Agilent 2100 биоанализері (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) көмегімен жоғары сезімталдық ДНҚ жинағы арқылы капиллярлық электрофорез арқылы талданды.Талдау өндірушінің нұсқауларына сәйкес ccfDNA үлгісінің 1 мкл көмегімен орындалды.
Гемолимфа ccfDNA фрагменттерін секвенирлеу үшін Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) Illumina MiSeq PE75 жинағының Illumina DNA Mix жинағын пайдаланып, шолақ мылтық кітапханаларын дайындады.Стандартты адаптер (BioO) пайдаланылды.Шикі деректер файлдары NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 және SRR8924809) қол жетімді.Негізгі оқу сапасы FastQC [23] арқылы бағаланды.Trimmomatic [24] адаптерлерді кесу және сапасыз оқу үшін қолданылған.Жұпталған ұштары бар шолақ мылтық көрсеткіштері сәйкес келмеу үшін FLASH ең аз қабаттасуы 20 бит болатын ұзағырақ бір оқуға біріктірілді [25]. Біріктірілген оқулар қосжақпалы NCBI таксономиясы дерекқорын (e мәні < 1e−3 және 90% гомология) пайдалана отырып, BLASTN-мен түсіндірілді және күрделілігі төмен тізбектерді маскировкалау DUST [26] көмегімен орындалды. Біріктірілген оқулар қосжақпалы NCBI таксономиясы дерекқорын (e мәні < 1e−3 және 90% гомология) пайдалана отырып, BLASTN-мен түсіндірілді және күрделілігі төмен тізбектерді маскировкалау DUST [26] көмегімен орындалды. Объединенные чтения были аннотирование с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 және 90% гомологии), а маскирование кейінірек [DUST2] қысқа мерзімде орындалады. Біріктірілген оқулар NCBI қосжақпалы таксономия дерекқорын (e мәні < 1e-3 және 90% гомология) пайдалана отырып, BLASTN көмегімен түсіндірілді және DUST [26] көмегімен күрделілігі төмен тізбекті маскалау орындалды.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释）用BLASTN 注释（并的读合并的读合并的读合并的读）读读读低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 合并 读数 合并 读数 ，轿弰复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотирование с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 және 90% гомологии), а маскирование кейіннен [DU6] қысқа мерзімде жұмыс істейді. Біріктірілген оқулар NCBI қосжақпалы таксономиялық дерекқорын (e мәні <1e-3 және 90% гомология) пайдалану арқылы BLASTN көмегімен түсіндірілді және DUST [26] көмегімен төмен күрделілік қатарын бүркемелеу орындалды.Оқылымдар екі топқа бөлінді: қосжақпалы тізбектерге қатысты (мұнда өздігінен оқылатындар деп аталады) және байланыссыз (өзіндік оқылмайтындар).Контигтерді генерациялау үшін MEGAHIT көмегімен екі топ бөлек жиналды [27].Сонымен қатар, бөтен микробиома оқуларының таксономиялық таралуы Kraken2 [28] көмегімен жіктелді және графикалық түрде Галактикадағы Krona дөңгелек диаграммасымен ұсынылды [29, 30].Оңтайлы кмерлер біздің алдын ала эксперименттерімізден кмерлер-59 болып анықталды. Содан кейін өзіндік контигтер соңғы аннотация үшін BLASTN (қосжақты NCBI дерекқоры, e мәні < 1e−10 және 60% гомология) теңестіру арқылы анықталды. Содан кейін өзіндік контигтер соңғы аннотация үшін BLASTN (қосжақты NCBI дерекқоры, e мәні < 1e−10 және 60% гомология) теңестіру арқылы анықталды. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 және гомология 60%) үшін окончательной аннотации. Содан кейін қорытынды аннотация үшін BLASTN (NCBI қосжақтаулы дерекқор, e мәні <1e-10 және 60% гомология) сәйкестендіру арқылы өзіндік контигтер анықталды.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицирование собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 және гомология 60%). Содан кейін BLASTN (NCBI қосжақтаулы дерекқор, e мәні <1e-10 және 60% гомология) сәйкестік арқылы қорытынды аннотация үшін өзіндік контигтер анықталды. Параллельді түрде BLASTN (nt NCBI дерекқоры, e мәні < 1e−10 және 60% гомология) арқылы өздігінен емес топ контигтері аннотацияланды. Параллельді түрде BLASTN (nt NCBI дерекқоры, e мәні < 1e−10 және 60% гомология) арқылы өздігінен емес топ контигтері аннотацияланды. Параллельно чужеродные групповые контигімен аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 және гомология 60%). Сонымен қатар, шетелдік топ контигтері BLASTN (NT NCBI дерекқоры, e мәні <1e-10 және 60% гомология) арқылы аннотацияланды.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重非参参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重非参参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 және гомология 60%). Сонымен қатар, өздік емес топ контигтері BLASTN (nt NCBI дерекқоры, e мәні <1e-10 және 60% гомология) арқылы түсіндірілді. BLASTX сонымен қатар nr және RefSeq протеині NCBI дерекқорларын (e мәні < 1e−10 және 60% гомология) пайдалана отырып, өздігінен емес контигтерде жүргізілді. BLASTX сонымен қатар nr және RefSeq протеині NCBI дерекқорларын (e мәні < 1e−10 және 60% гомология) пайдалана отырып, өздігінен емес контигтерде жүргізілді. BLASTX сонымен қатар несамостоятельных контигахтарды пайдалану арқылы баз данных белка nr және RefSeq NCBI (значение e <1e-10 және гомология 60%) арқылы дәлелденді. BLASTX сонымен қатар nr және RefSeq NCBI протеин дерекқорларын (e мәні < 1e-10 және 60% гомология) пайдалана отырып, өздігінен емес контигтерде орындалды.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧。 BLASTX сондай-ақ несамостоятельных контигахтарды пайдалану арқылы баз данных белка nr және RefSeq NCBI (значение e <1e-10 және гомология 60%). BLASTX сонымен қатар nr және RefSeq NCBI ақуыз дерекқорларын (e мәні <1e-10 және 60% гомология) пайдалана отырып, өздігінен емес контигтерде орындалды.Өздігінен контигтердің BLASTN және BLASTX пулдары соңғы контигтерді білдіреді (Қосымша файлды қараңыз).
ПТР үшін қолданылатын праймерлер S1 кестесінде келтірілген.Taq ДНҚ полимеразасы (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA мақсатты гендерін күшейту үшін пайдаланылды.Келесі реакция жағдайлары қолданылды: денатурация 95°C 3 минут, 95°C 1 минут, орнатылған күйдіру температурасы 1 минут, ұзарту 72°C 1 минут, 35 цикл және ең соңында 72°C 10 минут ішінде..ПТР өнімдері 95 В кернеуінде SYBRTM Қауіпсіз ДНҚ гель бояуы (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) бар агарозды гельдерде (1,5%) электрофорез арқылы бөлінді.
Мидиялар (Mytilus spp.) 500 мл оттегімен қаныққан теңіз суында (32 PSU) 24 сағат бойы 4°C температурада акклиматизацияланды.Құтыға 190 мкг/мкл соңғы концентрациясында адамның галектин-7 cDNA тізбегін кодтайтын кірістіру (NCBI қосылу нөмірі L07769) бар плазмидтік ДНҚ қосылды.ДНҚ қоспай бірдей жағдайларда инкубацияланған мидиялар бақылау болды.Үшінші бақылау цистернасында мидиясыз ДНҚ болды.Теңіз суындағы ДНҚ сапасын бақылау үшін көрсетілген уақытта әр резервуардан теңіз суының үлгілері (20 мкл; үш қайталау) алынды.Плазмидті ДНҚ қадағалануы үшін LB мидиялары көрсетілген уақытта жиналды және qPCR және ddPCR арқылы талданды.Теңіз суындағы тұздың жоғары болуына байланысты аликвоттар барлық ПТР талдауларының алдында ПТР сапалы суда (1:10) сұйылтылған.
Цифрлық тамшы ПТР (ddPCR) BioRad QX200 хаттамасы (Миссиссауга, Онтарио, Канада) арқылы орындалды.Оңтайлы температураны анықтау үшін температура профилін пайдаланыңыз (S1 кесте).Тамшылар QX200 тамшы генераторының (BioRad) көмегімен жасалды.ddPCR келесідей орындалды: 95°C 5 минут, 50 цикл 95°C 30 с және берілген күйдіру температурасы 1 мин және 72°C 30 с, 4°C 5 мин және 90°C 5 минут ішінде.Тамшылар саны және оң реакциялар (көшірмелер саны/мкл) QX200 тамшы оқу құралының (BioRad) көмегімен өлшенді.10 000 тамшыдан аз үлгілер қабылданбады.ddPCR іске қосылған сайын үлгіні басқару орындалмады.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) және LGALS7 арнайы праймерлері арқылы орындалды.Барлық сандық ПТР QuantiFast SYBR Green ПТР жинағы (QIAGEN) арқылы 20 мкл орындалды.qPCR 95°C температурада 15 минуттық инкубациямен, содан кейін бір деректер жинаумен 95°C температурада 10 секунд және 60°C температурада 60 секунд ішінде 40 циклден басталды.Балқу қисықтары qPCR соңында 95°C температурада 5 секунд, 65°C 60 секунд және 97°C температурасында дәйекті өлшеулер арқылы жасалды.Әрбір qPCR бақылау үлгілерін қоспағанда, үш данада орындалды.
Мидиялар жоғары фильтрация жылдамдығымен танымал болғандықтан, біз алдымен олардың теңіз суындағы ДНҚ фрагменттерін сүзіп, сақтай алатынын зерттедік.Бізді бұл фрагменттердің жартылай ашық лимфа жүйесінде жинақталатыны да қызықтырды.Біз бұл мәселені көк мидия цистерналарына қосылған еритін ДНҚ фрагменттерінің тағдырын бақылау арқылы эксперименталды түрде шештік.ДНҚ фрагменттерін бақылауды жеңілдету үшін біз адамның галектин-7 гені бар бөтен (өзіндік емес) плазмидті ДНҚ-ны қолдандық.ddPCR теңіз суы мен мидиядағы плазмидті ДНҚ фрагменттерін қадағалайды.Біздің нәтижелеріміз көрсеткендей, егер теңіз суындағы ДНҚ фрагменттерінің мөлшері мидиялар болмаған кезде салыстырмалы түрде тұрақты болып қалатын болса (7 күнге дейін), онда мидиялар болған кезде бұл деңгей 8 сағат ішінде толығымен дерлік жойылды (1а,б-сурет).Экзогендік ДНҚ фрагменттері 15 минут ішінде клапанішілік сұйықтық пен гемолимфада оңай анықталды (1в-сурет).Бұл фрагменттерді экспозициядан кейін 4 сағатқа дейін анықтауға болады.ДНҚ фрагменттеріне қатысты бұл сүзу белсенділігі бактериялар мен балдырлардың сүзу белсенділігімен салыстырылады [31].Бұл нәтижелер мидиялар өздерінің сұйықтық бөлімдерінде бөгде ДНҚ-ны сүзіп, жинақтай алатынын көрсетеді.
ddPCR арқылы өлшенген мидиялардың (A) немесе жоқтығындағы (B) теңіз суындағы плазмидті ДНҚ-ның салыстырмалы концентрациясы.А ішінде нәтижелер 75-ші және 25-ші процентильді көрсететін ұяшықтардың жиектерімен пайыздар түрінде көрсетіледі.Орнатылған логарифмдік қисық қызыл түспен көрсетілген, ал сұр түспен боялған аумақ 95% сенімділік аралығын білдіреді.В тілінде қызыл сызық орташа мәнді, ал көк сызық концентрация үшін 95% сенімділік интервалын білдіреді.C Плазмидті ДНҚ-ны қосқаннан кейін әр түрлі уақытта мидиялардың гемолимфа және қақпақша сұйықтығында плазмидті ДНҚ жиналуы.Нәтижелер анықталған абсолютті көшірмелер/мл (±SE) түрінде көрсетіледі.
Әрі қарай, біз антропогендік әсері шектеулі аралдардың шалғай тобы Кергулен аралдарында мидия төсектерінен жиналған мидияларда ccfDNA шығу тегін зерттедік.Осы мақсатта мидия гемолимфаларынан cccDNA оқшауланып, адамның cccDNA тазарту үшін жиі қолданылатын әдістермен тазартылды [32, 33].Мидиялардағы орташа гемолимфа ccfDNA концентрациясы мл гемолимфа диапазонында төмен микрограммда екенін анықтадық (S2 кестені, Қосымша ақпаратты қараңыз).Бұл концентрация диапазоны сау адамдарға қарағанда әлдеқайда үлкен (миллитрге төмен нанограмма), бірақ сирек жағдайларда онкологиялық науқастарда ccfDNA деңгейі миллилитрге бірнеше микрограммға жетуі мүмкін [34, 35].Гемолимфа ccfDNA мөлшерінің таралуын талдау бұл фрагменттердің өлшемдері бойынша 1000 бит-тен 1000 бит-ке дейін өзгеретінін көрсетті.5000 битке дейін (Cурет 2).Ұқсас нәтижелер кремний негізіндегі Qiamam-ді тергеуші жинағы арқылы алынған, көбінесе сот ғылымында жиі қолданылатын әдіс, геномдық ДНҚ-ны, оның ішінде CCFDNA-дан геномдық диспені тазартады және тазартады.
Мидия гемолимфасының ccfDNA репрезентативті электрофореграммасы.NucleoSnap плазма жинағы (жоғарғы) және QIAamp ДНҚ зерттеу жинағы арқылы алынған.B Мидиялардағы гемолимфа ccfDNA концентрациясының (±SE) таралуын көрсететін скрипка сызбасы.Қара және қызыл сызықтар сәйкесінше медиана мен бірінші және үшінші квартилді білдіреді.
Адамдар мен приматтардағы ccfDNA-ның шамамен 1% бөтен көзге ие [21, 37].Қосжақпандардың жартылай ашық қанайналым жүйесін, микробқа бай теңіз суын және мидия ccfDNA мөлшерінің таралуын ескере отырып, біз мидия гемолимфа ccfDNA микробтық ДНҚ-ның бай және әртүрлі пулын қамтуы мүмкін деп болжадық.Бұл гипотезаны тексеру үшін біз Кергулен аралдарынан жиналған Aulacomya atra үлгілерінен гемолимфа ccfDNA ретін алдық, 10 миллионнан астам оқу нәтижесін берді, оның 97,6% сапа бақылауынан өтті.Одан кейін көрсеткіштер BLASTN және NCBI қосжақпалы дерекқорлары арқылы өзіндік және өздігінен емес көздерге сәйкес жіктелді (Cурет S1, Қосымша ақпарат).
Адамдарда ядролық және митохондриялық ДНҚ қанға түсуі мүмкін [38].Алайда, қазіргі уақытта, осы зерттеуде Атра геномының десансельдермен танысқан ядролық геномдық ДНҚ-ны егжей-тегжейлі сипаттау мүмкін болмады, бұл A. Atra Genome-дің дәйекті немесе сипатталмағанын ескере отырып.Дегенмен, біз қосжақпалы кітапхананы пайдалана отырып, өзіміздің шыққан ccfDNA фрагменттерінің бірқатарын анықтай алдық (Cурет S2, Қосымша ақпарат).Біз сонымен бірге PCR-ді PCR-дің DNA фрагменттерінің бар екенін, сол A. Atra гендерін күшейту арқылы растадық (Cурет 3).Сол сияқты, A. Atha-ның митохондриялық геномын ескере отырып, қоғамдық мәліметтер базасында қол жетімді, өйткені A. Atra гемолимфіндегі цитохондриялық CCFDNA фрагменттерінің бар екендігі дәлел табуға болады.Митохондриялық ДНҚ фрагменттерінің болуы ПТР күшейту арқылы расталды (3-сурет).
ПТР арқылы күшейтілген A. atra (қызыл нүктелер – қор нөмірі: SRX5705969) және M. platensis (көк нүктелер – қор нөмірі: SRX5705968) гемолимфасында әртүрлі митохондриялық гендер болды.Сурет Бретон және басқаларынан бейімделген, 2011 B A. atra гемолимфа супернатантын күшейту FTA қағазында сақталған.ПТР қоспасы бар ПТР түтігіне тікелей қосу үшін 3 мм пуансонды пайдаланыңыз.
Теңіз суындағы микробтардың көп мөлшерін ескере отырып, біз бастапқыда гемолимфадағы микробтық ДНҚ тізбегін сипаттауға назар аудардық.Ол үшін біз екі түрлі стратегияны қолданамыз.Бірінші стратегия, kraken2, алгоритмдік реттілікке негізделген, ол дюякпен салыстырылатын және басқа құралдармен салыстырылатын дәлдікпен микробтық тізбекті анықтай алатын алгоритмдік реттілікті жіктеу бағдарламасы [28].6719-дан астам көрсеткіш бактериялық, ал 124 және 64-і архейлер мен вирустардан болғаны анықталды (4-сурет).Ең көп таралған бактериялық ДНҚ фрагменттері Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) және Bacteriidetes (17%) болды (4а-сурет).Бұл бөлу теңіз көк мидия микробиомасының алдыңғы зерттеулеріне сәйкес келеді [39, 40].Гаммапротеобактериялар Протеобактериялардың негізгі класы болды (44%), соның ішінде көптеген вибрионалдар (4б-сурет).ddPCR әдісі A. atra гемолимфтің ccfDNA-да Vibrio ДНҚ фрагменттерінің болуын растады (4c-сурет) [41].ccfDNA бактериялық шығу тегі туралы қосымша ақпарат алу үшін қосымша тәсіл қабылданды (S2-сурет, Қосымша ақпарат). Бұл жағдайда қабаттасатын оқулар жұптастырылған оқулар ретінде жинақталған және BLASTN және e мәні 1e−3 және >90% гомологиясы бар кесіндіні пайдаланып өздігінен (қосжарақты) немесе өздігінен емес шыққан деп жіктелген. Бұл жағдайда қабаттасатын оқулар жұптастырылған оқулар ретінде жинақталған және BLASTN және e мәні 1e−3 және >90% гомологиясы бар кесіндіні пайдаланып өздігінен (қосжарақты) немесе өздігінен емес шыққан деп жіктелген. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и был классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) немесе чужие по происхождению с использованием BLASTN және значения гомея 190-дан астам. Бұл жағдайда қабаттасатын оқулар жұптастырылған оқулар ретінде жиналды және BLASTN және e мәні 1e-3 және >90% гомологиясы бар кесіндіні пайдалану арқылы табиғи (қосжақпа) немесе түпнұсқа емес деп жіктелді.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 匀1e-3 暄e 值0%值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 使用 嚄用 嚄用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В Этом случае перекрывающиес ланп несобственные по проицождению Бұл жағдайда бір-біріне сәйкес оқылған оқылымдар жұптастырылған (Bival (Bivalves) немесе түпнұсқалық емес, e Blastn және 1E-3 мәндері және гомология шегі> 90% -ы ретінде жіктелген.A. Atra геномынан бері әлі реттелмегендіктен, біз Megahit Megahit-тің келесі буынын (NGS) жиынтықтарын қолдандық.Барлығы 147 188 контиг шығу тегі тәуелді (қосжарақты) ретінде анықталды.Содан кейін бұл контигтер BLASTN және BLASTX көмегімен 1e-10 электрондық мәндерімен жарылды.Бұл стратегия A. atra ccfDNA-да бар 482 қосжақтаулы емес фрагменттерді анықтауға мүмкіндік берді.Осы ДНҚ-ның жартысынан көбі бактериялардан (57%) бактериялардан, негізінен гиль симбияларынан, соның ішінде сульфотрофиялық симбиондардан және Гилл Синбионттардан Солемя Велумнан алынды (5-сурет).
Түр деңгейіндегі салыстырмалы молшылық.B Екі негізгі филаның микробтық әртүрлілігі (Firmicutes және Proteobacteria).ddPCR C Vibrio spp репрезентативті күшейту.A. Үш атра гемолимфадағы 16S рРНҚ генінің фрагменттері (көк).
Барлығы 482 жиналған контигтерге талдау жасалды.Метагеномдық контиг аннотацияларының таксономиялық таралуының жалпы профилі (прокариоттар мен эукариоттар).B BLASTN және BLASTX арқылы анықталған бактериялық ДНҚ фрагменттерінің егжей-тегжейлі таралуы.
KRAKEN2 талдауы сонымен қатар Mussel CCFDNA-ның архимниялық ДНҚ-дағы фрагменттерден, соның ішінде Euryarhaeota (65%), Кренархаеоо (24%), және Таурмарчеота (11%) (сурет).Калифорниялық мидиялардың микробтық қоғамдастығынан алынған «euryaraeota» және Кренархаеотта алынған ДНҚ фрагменттерінің болуы тосынсый болмауы керек [42].EuryArchaeota жиі төтенше жағдайларға байланысты болса да, қазір Euryarchaeota және Crenarcheota да теңіз криогендік ортасындағы ең көп кездесетін прокариоттардың бірі болып саналады [43, 44].Мидрогенді микроорганизмдердің болуы таңда таңғылар емес, Кергельген астарындағы астыңғы су ағып кетулерінен, Кергелден аралдарының астындағы метанның ағып кетуі туралы және Ықтимал микробты метан өндірісі (46).
Содан кейін біздің назарымыз ДНҚ вирустарының көрсеткіштеріне аударылды.Біздің білуімізше, бұл мидиялардың вирустық құрамын мақсатты емес бірінші зерттеу.Күтілгендей, біз бактериофагтардың (Caudovirales) ДНҚ фрагменттерін таптық (6б-сурет).Дегенмен, ең көп таралған вирустық ДНҚ кез келген вирустың ең үлкен геномы бар ядролық цитоплазмалық үлкен ДНҚ вирусы (NCLDV) деп те белгілі нуклеоцитовирустар филумынан келеді.Бұл топта ДНҚ тізбектерінің көпшілігі Mimimidoviridae (58%) және Poxviridae (21%) тұқымдастарына жатады, олардың табиғи иелері омыртқалылар мен буынаяқтыларды қамтиды, ал бұл ДНҚ тізбектерінің аз бөлігі белгілі вирусологиялық балдырларға жатады.Теңіз эукариоттық балдырларын зақымдайды.Тізбектер сонымен қатар кез келген белгілі вирустық ұрпақтардың геномының ең үлкен өлшемі бар алып вирус Pandora вирусынан алынды.Бір қызығы, гемолимфа ccfDNA реттілігі арқылы анықталған вирус жұқтырғаны белгілі хосттардың ауқымы салыстырмалы түрде үлкен болды (S3-сурет, Қосымша ақпарат).Оған Baculoviridae және Iridoviridae сияқты жәндіктерді зақымдайтын вирустар, сондай-ақ амеба, балдырлар және омыртқалы жануарларды зақымдайтын вирустар жатады.Біз сондай-ақ Pithovirus sibericum геномына сәйкес келетін тізбектерді таптық.Питовирустар («зомби вирустары» деп те аталады) алғаш рет Сібірдегі 30 000 жылдық мәңгі тоңдардан оқшауланған [47].Осылайша, біздің нәтижелеріміз осы вирустардың барлық заманауи түрлері жойылмағанын көрсететін алдыңғы есептермен сәйкес келеді [48] және бұл вирустар шалғай субарктикалық теңіз экожүйесінде болуы мүмкін.
Ақырында, біз басқа көп жасушалы жануарлардың ДНҚ фрагменттерін таба алатынымызды тексеру үшін сынақтан өткіздік.NT, nr және RefSeq кітапханалары (геномдық және ақуыз) бар BLASTN және BLASTX арқылы барлығы 482 шетелдік контиг анықталды.Біздің нәтижелеріміз көрсеткендей, көп жасушалы жануарлардың ccfDNA бөтен фрагменттері арасында сүйек сүйектерінің ДНҚ-сы басым (5-сурет).Сондай-ақ жәндіктер мен басқа түрлерден алынған ДНҚ фрагменттері табылды.ДНҚ фрагменттерінің салыстырмалы түрде көп бөлігі анықталған жоқ, мүмкін жер үсті түрлеріндегі теңіз түрлерінің көптеген түрлерімен салыстырғанда жер үсті түрлерімен салыстырғанда [49].
Осы мақалада біз гемолимфтік ccfDNA түсіру реттілігі теңіз жағалауындағы экожүйелердің құрамы туралы түсінік бере алатынын дәлелдей отырып, LB тұжырымдамасын мидияларға қолданамыз.Атап айтқанда, біз 1) мидия гемолимфасында салыстырмалы түрде үлкен (~1-5 кб) айналымдағы ДНҚ фрагменттерінің салыстырмалы түрде жоғары концентрациясы (микрограмма деңгейлері) бар екенін анықтадық;2) бұл ДНҚ фрагменттері тәуелсіз де, тәуелсіз де емес 3) Бұл ДНҚ фрагменттерінің бөтен көздерінің ішінде бактериялық, архейлік және вирустық ДНҚ-ны, сонымен қатар басқа да көп жасушалы жануарлардың ДНҚ-сын таптық;4) Осы бөгде ccfDNA фрагменттерінің гемолимфада жиналуы тез жүреді және мидиялардың ішкі сүзу белсенділігіне ықпал етеді.Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз осы уақытқа дейін негізінен биомедицина саласында қолданылған LB концепциясы сентинель түрлері мен олардың қоршаған ортасының өзара әрекеттесуін жақсы түсіну үшін пайдаланылуы мүмкін бай, бірақ зерттелмеген білім көзін кодтайтынын көрсетеді.
Приматтардан басқа, сүтқоректілерде, соның ішінде тышқандарда, иттерде, мысықтарда және жылқыларда ccfDNA оқшаулануы тіркелген [50, 51, 52].Алайда, біздің білуімізше, біздің зерттеуіміз ашық айналым жүйесі бар теңіз түрлерінде ccfDNA анықтау және секвенирлеу туралы бірінші болып табылады.Мидиялардың бұл анатомиялық ерекшелігі және сүзу қабілеті басқа түрлермен салыстырғанда айналымдағы ДНҚ фрагменттерінің әртүрлі өлшемдік сипаттамаларын, кем дегенде, ішінара түсіндіре алады.Адамдарда қанда айналатын ДНҚ фрагменттерінің көпшілігі мөлшері 150-ден 200 бит-ке дейінгі шағын фрагменттер болып табылады.максимум шыңы 167 bp [34, 53].ДНҚ фрагменттерінің кішігірім, бірақ маңызды бөлігінің өлшемі 300-ден 500 битке дейін, ал шамамен 5% -ы 900 бит-тен ұзын.[54].Бұл өлшемнің таралуының себебі плазмадағы ccfDNA-ның негізгі көзі жасуша өлуінің нәтижесінде немесе сау адамдардағы айналымдағы қан жасау жасушаларының некрозынан немесе қатерлі ісікпен ауыратын науқастарда ісік жасушаларының апоптозынан (айналмалы ісік ДНҚ деп аталады) пайда болады., ктДНҚ).Мидияларда табылған гемолимфа ccfDNA мөлшерінің таралуы 1000-нан 5000 битке дейін ауытқиды, бұл мидия ccfDNA-ның шығу тегі басқа екенін көрсетеді.Бұл қисынды гипотеза, өйткені мидиялар жартылай ашық тамыр жүйесі бар және микробтық геномдық ДНҚ жоғары концентрациясы бар теңіз су орталарында өмір сүреді.Шын мәнінде, экзогендік ДНҚ-ны қолданатын зертханалық тәжірибелер мидиялардың теңіз суында ДНҚ фрагменттерін жинайтынын көрсетті, кем дегенде бірнеше сағаттан кейін олар жасушалық сіңіруден кейін бұзылады және/немесе босатылады және/немесе әртүрлі ұйымдарда сақталады.Жасушалардың (прокариоттардың да, эукариоттардың да) сиректігін ескере отырып, интравалвулярлық бөлімдерді қолдану өздігінен, сондай-ақ шетелдік көздерден алынған ccfDNA мөлшерін азайтады.Қосжақпалы туа біткен иммунитеттің маңыздылығын және айналымдағы фагоциттердің көптігін ескере отырып, біз одан әрі бөтен ccfDNA микроорганизмдерді және/немесе жасушалық қалдықтарды жұтқанда бөтен ДНҚ жинайтын айналымдағы фагоциттермен байытылатынын болжадық.Біріктірілген нәтижелер қосжақпалы гемолимфа ccfDNA молекулалық ақпараттың бірегей репозиторийі болып табылатынын және олардың күзетші түр ретіндегі мәртебесін күшейтетінін көрсетеді.
Біздің деректеріміз бактериядан алынған гемолимфа ccfDNA фрагменттерін секвенирлеу және талдау хост бактериялық флора және қоршаған теңіз экожүйесінде бар бактериялар туралы негізгі ақпаратты бере алатынын көрсетеді.Түсірілім секвенирлеу әдістері 16S рРНҚ сәйкестендірудің кәдімгі әдістері қолданылғанда, ішінара анықтамалық кітапхананың қиғаштығына байланысты өткізілмей қалуы мүмкін A. atra gill комменсальды бактерияларының тізбектерін анықтады.Шындығында, Кергулендегі бір мидия қабатында M. platensis-тен жиналған LB деректерін пайдалануымыз желбезекпен байланысты бактериялық симбионттардың құрамы мидиялардың екі түрі үшін де бірдей екенін көрсетті (S4-сурет, Қосымша ақпарат).Генетикалық жағынан әр түрлі екі мидианың бұл ұқсастығы Кергуленнің суық, күкіртті және жанартаулық шөгінділеріндегі бактериялық қауымдастықтың құрамын көрсетуі мүмкін [55, 56, 57, 58].Порт-о-Франс жағалауы сияқты биотурбацияланған жағалау аймақтарынан [59] мидияларды жинау кезінде күкіртті төмендететін микроорганизмдердің жоғары деңгейлері жақсы сипатталған.Тағы бір мүмкіншілік, комменсальды мидия флорасына көлденең берілу әсер етуі мүмкін [60, 61].Теңіз ортасы, теңіз түбінің беті және мидиялардағы симбиотикалық бактериялардың құрамы арасындағы корреляцияны анықтау үшін қосымша зерттеулер қажет.Қазіргі уақытта бұл зерттеулер жалғасуда.
Гемолимфтік ccfDNA-ның ұзындығы мен концентрациясы, оны тазалаудың қарапайымдылығы және шолақ мылтықты жылдам ретке келтіруге мүмкіндік беретін жоғары сапасы теңіз жағалауындағы экожүйелердегі биоәртүрлілікті бағалау үшін мидия ccfDNA пайдаланудың көптеген артықшылықтарының кейбірі болып табылады.Бұл тәсіл әсіресе белгілі бір экожүйедегі вирустық қауымдастықтарды (виромдарды) сипаттау үшін тиімді [62, 63].Бактериялардан, археялардан және эукариоттардан айырмашылығы, вирустық геномдарда 16S тізбегі сияқты филогенетикалық сақталған гендер болмайды.Біздің нәтижелеріміз мидия сияқты индикатор түрлерінен алынған сұйық биопсияларды әдетте жағалаудағы теңіз экожүйелерін мекендейтін хосттарды жұқтыратын белгілі ccfDNA вирус фрагменттерінің салыстырмалы түрде үлкен санын анықтау үшін пайдалануға болатынын көрсетеді.Бұған қарапайымдыларды, буынаяқтыларды, жәндіктерді, өсімдіктерді және бактериялық вирустарды (мысалы, бактериофагтар) жұқтыратын белгілі вирустар жатады.Кергулендегі бір мидия қабатында жиналған көк мидиялардың (M. platensis) гемолимфтік ccfDNA вирусын зерттеген кезде де осындай таралу табылды (S2 кесте, Қосымша ақпарат).ccfDNA-ны шолақ мылтықпен секвенирлеу шын мәнінде адамның немесе басқа түрлердің вирусын зерттеуде қарқын алған жаңа тәсіл [21, 37, 64].Бұл әдіс екі тізбекті ДНҚ вирустарын зерттеу үшін өте пайдалы, өйткені Балтимордағы вирустардың ең алуан түрлі және кең класын көрсететін барлық қос тізбекті ДНҚ вирустары арасында бір ген сақталмаған [65].Бұл вирустардың көпшілігі жіктелмеген күйінде қалып, вирустар әлемінің мүлде белгісіз бөлігіндегі вирустарды қамтуы мүмкін [66] дегенмен, біз A. atra және M. platensis мидияларының виромдары мен хост диапазондары екі түрдің арасында болатынын анықтадық.ұқсас (S3 суретін, қосымша ақпаратты қараңыз).Бұл ұқсастық таңқаларлық емес, өйткені ол қоршаған ортада бар ДНҚ-ны қабылдауда селективтіліктің жоқтығын көрсетуі мүмкін.Қазіргі уақытта РНҚ вирусын сипаттау үшін тазартылған РНҚ қолданатын болашақ зерттеулер қажет.
Біздің зерттеуімізде біз Коварски мен әріптестердің [37] жұмыстарына бейімделген өте қатаң құбыр желісін қолдандық, олар жергілікті ccfDNA құрастырылғанға дейін және кейін біріктірілген оқулар мен контигтерді екі сатылы жоюды қолданды, нәтижесінде салыстырылмаған оқулардың жоғары үлесі болды.Сондықтан, біз бұл салыстырылмаған оқылымдардың кейбірінің әлі де өзіндік шығу тегі болуы мүмкін екенін жоққа шығара алмаймыз, ең алдымен, бізде бұл мидия түріне сілтеме геномы жоқ.Біз сондай-ақ бұл құбырды пайдаландық, өйткені біз өздігінен және өздігінен емес оқулар арасындағы химералар және Illumina MiSeq PE75 арқылы жасалған оқу ұзақтығы туралы алаңдадық.Белгіленбеген көрсеткіштердің көпшілігінің тағы бір себебі - теңіз микробтарының көпшілігі, әсіресе Кергулен сияқты шалғай аудандарда аннотацияланбаған.Біз Illumina MiSeq PE75 қолдандық, адамның ccfDNA-ға ұқсас ccfDNA фрагментінің ұзындығын болжадық.Болашақ зерттеулер үшін гемолимфа ccfDNA адамдарға және/немесе сүтқоректілерге қарағанда ұзағырақ оқылатынын көрсететін нәтижелерімізді ескере отырып, ұзағырақ ccfDNA фрагменттері үшін қолайлы секвенирлеу платформасын пайдалануды ұсынамыз.Бұл тәжірибе тереңірек талдау үшін көбірек көрсеткіштерді анықтауды әлдеқайда жеңілдетеді.Қазіргі уақытта қол жетімсіз толық A. atra ядролық геномының ретін алу сонымен қатар ccfDNA-ны өзіндік және өздігінен емес көздерден дискриминациялауды айтарлықтай жеңілдетеді.Біздің зерттеулеріміз сұйық биопсияның тұжырымдамасын мидияларға қолдану мүмкіндігіне бағытталғанын ескере отырып, бұл тұжырымдама болашақ зерттеулерде пайдаланылғандықтан, мидиялардың микробтық әртүрлілігін зерттеу үшін осы әдістің әлеуетін арттыру үшін жаңа құралдар мен құбырлар әзірленеді деп үміттенеміз.теңіз экожүйесі.
Инвазивті емес клиникалық биомаркер ретінде адам плазмасындағы ccfDNA деңгейінің жоғарылауы әртүрлі аурулармен, тіндердің зақымдалуымен және стресс жағдайларымен байланысты [67,68,69].Бұл ұлғаю тіндердің зақымдануынан кейін өзіндік шыққан ДНҚ фрагменттерінің шығуымен байланысты.Біз бұл мәселені өткір жылу күйзелісі арқылы шештік, онда мидиялар 30 ° C температураға қысқа уақытқа әсер етті.Біз бұл талдауды үш тәуелсіз экспериментте үш түрлі мидия түріне жасадық.Дегенмен, біз өткір қызу стрессінен кейін ccfDNA деңгейінде ешқандай өзгеріс таппадық (S5 суретін, қосымша ақпаратты қараңыз).Бұл жаңалық, ең болмағанда, мидиялардың жартылай ашық қанайналым жүйесі бар екенін және олардың жоғары сүзу белсенділігіне байланысты бөтен ДНҚ-ның көп мөлшерін жинақтайтынын түсіндіре алады.Екінші жағынан, мидиялар, көптеген омыртқасыздар сияқты, стресстен туындаған тіндердің зақымдалуына төзімді болуы мүмкін, осылайша олардың гемолимфасында ccfDNA босатылуын шектейді [70, 71].
Бүгінгі күні су экожүйелеріндегі биоәртүрліліктің ДНҚ талдауы негізінен қоршаған ортаның ДНҚ (eDNA) метабаркодтауына бағытталған.Дегенмен, бұл әдіс әдетте праймерлер пайдаланылған кезде биоәртүрлілікті талдауда шектеледі.Мылтық секвенирлеуін пайдалану ПТР шектеулерін және праймер жиынтықтарын біржақты таңдауды айналып өтеді.Осылайша, белгілі бір мағынада біздің әдіс фрагменттелген ДНҚ-ны тікелей ретке келтіруге және барлық дерлік ағзаларды талдауға қабілетті, жақында қолданылған жоғары өнімді eDNA Shotgun секвенирлеу әдісіне жақынырақ [72, 73].Дегенмен, LB стандартты eDNA әдістерінен ерекшеленетін бірқатар іргелі мәселелер бар.Әрине, eDNA мен LB арасындағы негізгі айырмашылық табиғи сүзгі хосттарын пайдалану болып табылады.еДНҚ зерттеу үшін табиғи сүзгі ретінде губкалар мен қосжарнақтылар (Dresseina spp.) сияқты теңіз түрлерін пайдалану туралы хабарланды [74, 75].Дегенмен, Драйсенаның зерттеуінде ДНҚ алынған тіндердің биопсиясы қолданылды.LB-дан ccfDNA талдауы тіннің биопсиясы, мамандандырылған және кейде қымбат тұратын жабдық пен eDNA немесе тін биопсиясымен байланысты логистиканы қажет етпейді.Шын мәнінде, біз жақында LB-дан алынған ccfDNA-ны суық тізбекті сақтамай FTA қолдауымен сақтауға және талдауға болатынын хабарладық, бұл шалғай аймақтардағы зерттеулер үшін үлкен қиындық болып табылады [76].Сұйық биопсиялардан ccfDNA экстракциясы да қарапайым және мылтық секвенциясы мен ПТР талдауы үшін жоғары сапалы ДНҚ қамтамасыз етеді.Бұл eDNA талдауымен байланысты кейбір техникалық шектеулерді ескере отырып, үлкен артықшылық [77].Сынама алу әдісінің қарапайымдылығы мен төмен құны да ұзақ мерзімді мониторинг бағдарламалары үшін әсіресе қолайлы.Жоғары фильтрлеу қабілетінен басқа, қосжақпандардың тағы бір белгілі ерекшелігі олардың шырыштарының вирустардың сіңуіне ықпал ететін химиялық мукополисахаридтік құрамы болып табылады [78, 79].Бұл қосжақпандарды берілген су экожүйесінде биологиялық әртүрлілікті және климаттың өзгеруінің әсерін сипаттайтын тамаша табиғи сүзгіге айналдырады.Хосттан алынған ДНҚ фрагменттерінің болуын eDNA-мен салыстырғанда әдістің шектеуі ретінде қарастыруға болады, бірақ eDNA-мен салыстырғанда мұндай жергілікті ccfDNA-ға ие болумен байланысты шығындар денсаулықты зерттеу үшін қолжетімді ақпараттың үлкен көлемі үшін бір уақытта түсінікті.офсеттік хост.Бұған иесінің геномына біріктірілген вирустық тізбектердің болуы кіреді.Бұл әсіресе мидиялар үшін өте маңызды, өйткені қосжарнақтыларда көлденең тасымалданатын лейкозды ретровирустар бар [80, 81].LB-нің eDNA-дан тағы бір артықшылығы - ол микроорганизмдерді (және олардың геномдарын) жұтып алатын гемолимфадағы айналымдағы қан жасушаларының фагоцитарлық белсенділігін пайдаланады.Фагоцитоз – қосжақпандарды қан жасушаларының негізгі қызметі [82].Ақырында, әдіс мидиялардың жоғары сүзу қабілетін (орта есеппен 1,5 л/сағ теңіз суы) және екі күндік циркуляцияны пайдаланады, бұл теңіз суының әртүрлі қабаттарының араласуын арттырады, гетерологиялық eDNA-ны түсіруге мүмкіндік береді.[83, 84].Осылайша, мидия ccfDNA талдауы мидиялардың тағамдық, экономикалық және қоршаған ортаға әсерін ескере отырып, қызықты жол болып табылады.Адамдардан жиналған LB талдауына ұқсас, бұл әдіс экзогендік заттарға жауап ретінде иесі ДНҚ-дағы генетикалық және эпигенетикалық өзгерістерді өлшеу мүмкіндігін ашады.Мысалы, нанопора секвенирлеуді пайдалана отырып, жергілікті ccfDNA-да геномдық метилдену талдауын орындау үшін үшінші буынды секвенирлеу технологияларын қарастыруға болады.Бұл процесті мидия ccfDNA фрагменттерінің ұзындығы ұзақ оқылатын секвенирлеу платформаларымен тамаша үйлесетіндігімен жеңілдету керек, бұл химиялық трансформацияларды қажет етпестен бір реттік тізбегінен ДНҚ метилденуінің геномдық талдауын жүргізуге мүмкіндік береді.85,86] Бұл қызықты мүмкіндік, өйткені ДНҚ-ның көптеген стресті генерацияға жауап беретіні көрсетілген.Сондықтан ол климаттың өзгеруіне немесе ластаушы заттардың әсерінен кейін әрекетті реттейтін негізгі механизмдер туралы құнды түсінік бере алады [87].Дегенмен, LB пайдалану шектеусіз емес.Бұл экожүйеде индикаторлық түрлердің болуын қажет ететінін айтудың қажеті жоқ.Жоғарыда айтылғандай, берілген экожүйенің биоәртүрлілігін бағалау үшін LB пайдалану, сонымен қатар, көзден ДНҚ фрагменттерінің болуын ескеретін қатаң биоинформатика құбырын қажет етеді.Тағы бір маңызды мәселе - теңіз түрлері үшін анықтамалық геномдардың болуы.Теңіз сүтқоректілерінің геномдары жобасы және жақында құрылған Fish10k жобасы [88] сияқты бастамалар болашақта мұндай талдауды жеңілдетеді деп үміттенеміз.LB концепциясын теңіз сүзгісімен қоректенетін организмдерге қолдану сонымен қатар секвенирлеу технологиясының соңғы жетістіктерімен үйлеседі, бұл оны қоршаған ортаның күйзелісіне жауап ретінде теңіз мекендейтін орталардың денсаулығы туралы маңызды ақпаратты қамтамасыз ету үшін көп омдық биомаркерлерді әзірлеуге өте қолайлы етеді.
Genome Selectance деректері NCBI тізбегіне сақталған, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/srrr8924808-де, SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Климаттың өзгеруінің теңіз өміріне және экожүйеге әсері.Коул биологиясы.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S және т.б.Климаттың өзгеруінің және басқа жергілікті стресс факторларының теңіз ортасына бірлескен әсерін қарастырыңыз.жалпы ғылыми орта.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P және т.б.).Бірінші наурыз туралы ғылым.2020;7:48.
Серонт Л, Никастро Кр, Зарди Ги, Гобервиль Е. Қайталанатын жылу кернеулеріндегі жылу толерленгені көгілдір мидиялардың жоғары жазғы өлімін түсіндірді.Ғылыми есеп 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, т.б.Жануарлардың өлім-жітімінің жиілігінің, себептері мен дәрежесінің соңғы өзгерістері.Proc Natl Acad Sci АҚШ.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugetti D, Cerruti F, Hosseini S және т.б.Көптеген түрлерге тән емес патогендер Pinna nobilis-тің жаппай өліміне себеп болуы мүмкін.Өмір.2020;10:238.
Брэдли М, Коуттс СДж, Дженкинс Е, О'Хара Т.М.Климаттың өзгеруінің арктикалық зооноздық ауруларға ықтимал әсері.Int J Циркумполярлық денсаулық.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Көк мидиялар (Mytilus edulis spp.) жағалаудағы ластануды бақылауда сигналдық организмдер ретінде: шолу.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Ісікті емдеудегі сұйық биопсияның интеграциясы.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, т.б.Сұйық биопсияның жетілуі: Ісік ДНҚ-сының айналуына мүмкіндік береді.Nat Rev қатерлі ісігі.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Адам плазмасындағы нуклеин қышқылдары.Soc Biol еншілес компанияларының жиналыс хаттамалары.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Қатерлі ісіктерді емдеуге арналған молекулалық маркер ретінде жасушасыз ДНҚ үшін жаңа рөл.Бимолярлық талдаудың сандық көрсеткіштері.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Сұйық биопсиясы клиникаға кіреді – іске асыру мәселелері және болашақ қиындықтар.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW және т.б.Ұрықтың ДНҚ ана плазмасында және қан сарысуында болады.Лансет.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Жүктілік кезіндегі әйелдердің қанындағы айналымдағы жасушадан тыс РНҚ көмегімен жүктілік ағымын және оның асқынуларын зерттеу.Допедиатрия.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, т.б.Сұйық биопсия: донорлық жасушасыз ДНҚ бүйрек трансплантатындағы аллогенді зақымдануларды анықтау үшін қолданылады.Нат Рев Нефрол.2021;17:591–603.
Хуан ФК, Ло ЮМ Пренатальды диагностикадағы инновациялар: ана плазмасының геномының реттілігі.Анна MD.2016;67:419-32.
Гу В, Дэн Х, Ли М, Суку Ю.Д., Аревало С, Стрике Д, т.б.Инфекцияланған дене сұйықтықтарының келесі буын метагеномдық реттілігі арқылы патогенді жылдам анықтау.Нат медицинасы.2021;27:115-24.