Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз қолданып жатқан шолғыш нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Әзірге қолдауды жалғастыру үшін сайтты мәнерлерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Кеуекті кремнезем бөлшектері макрокеуекті бөлшектерді алу үшін кейбір модификациялары бар золь-гель әдісімен дайындалды. Бұл бөлшектер N-фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PMI) және стиролмен қайтымды қосулы фрагментация тізбегінің тасымалдануы (RAFT) арқылы N-фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PMI) және стиролмен N-фенилмалеймидаралық полимер-фазалық полимер-фазалық полимеридер (ПФФСФ) дайындау арқылы алынған. болат бағаналар (100 × 1,8 мм идентификатор) шламды орау арқылы оралған. Бес пептидтен тұратын пептидтік қоспаның бағаланған PMP бағанының бөлінуі (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг және дигрофикалық альбомдар хромпографиялық өнімділігі) (HAS). Оңтайлы элюция жағдайында пептидтік қоспаның теориялық пластина саны 280 000 пластина/м²-ге дейін жетеді. Әзірленген колоннаның бөлу өнімділігін коммерциялық Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстыру, PMP бағанының бөлу өнімділігінің бөлу тиімділігі және резолюция тұрғысынан коммерциялық бағанға қарағанда жоғары екендігі байқалды.
Соңғы жылдары биофармацевтика өнеркәсібі нарық үлесін айтарлықтай ұлғайтумен кеңейіп келе жатқан жаһандық нарыққа айналды. Биофармацевтикалық өнеркәсіптің қарқынды өсуімен1,2,3 пептидтер мен ақуыздарды талдау өте қажет. Мақсатты пептидтен басқа, пептидтер синтезі кезінде бірнеше қоспалар пайда болады, осылайша пептидтердің хроматографиялық талдауын және хроматты тазартуды қажет етеді. Дене сұйықтықтарындағы, ұлпаларындағы және жасушаларындағы белоктарды анықтау бір үлгідегі потенциалды анықталатын түрлердің көп болуына байланысты өте күрделі тапсырма болып табылады. Масс-спектрометрия пептидтер мен ақуыздарды секвенирлеудің тиімді құралы болғанымен, егер мұндай үлгілер масс-спектрометрге бір өтуде енгізілсе, бөлу идеалды болмайды. белгілі бір уақытта масс-спектрометрге түсетін литтер4,5,6.Сонымен қатар, сұйық фазаны бөлу кезінде талданатын заттар тар аймақтарға шоғырлануы мүмкін, осылайша бұл талданатын заттарды шоғырландырады және MS анықтау сезімталдығын жақсартады.Сұйық хроматография (LC) соңғы онжылдықта айтарлықтай дамыды және протеомдық талдауда танымал әдіске айналды,8,917.
Кері фазалық сұйық хроматография (RP-LC) стационарлық фаза ретінде октадецил-модифицирленген кремнеземді (ODS) пайдаланып, пептидтік қоспаларды тазарту және бөлу үшін кеңінен қолданылады11,12,13. Дегенмен, RP стационарлы фазалары күрделі және арнайы фазалық құрылымы14 үшін арнайы жобаланған пептидтер мен ақуыздардың қанағаттанарлық бөлінуін қамтамасыз етпейді14. s осы талдағыштармен өзара әрекеттесу және оларды сақтау үшін полярлы және полярлы емес бөліктері бар пептидтер мен белоктарды талдау үшін қажет16. Мультимодальдық өзара әрекеттесулерді қамтамасыз ететін аралас режимдегі хроматография пептидтерді, ақуыздарды және басқа да күрделі қоспаларды бөлу үшін RP-LC-ге балама бола алады. Бұл аралас режимді фазалық бағаналар мен белоктарды бөлу үшін бірнеше фазалық пакеттер дайындалды 17,18,19,20,21. Аралас режимдегі стационарлы фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярлық интеркалация/RPLC) полярлы және полярсыз топтардың болуына байланысты пептидтер мен белоктарды бөлу үшін қолайлы. полярлы және полярлы емес талданатын заттар үшін қуат пен бірегей селективтілік, өйткені бөліну талданатын зат пен стационар фазаның өзара әрекеттесуіне байланысты.Мультимодальдық өзара әрекеттесу 29, 30, 31, 32. Жақында, Чжан және т.б.Додецилмен аяқталатын полиамин стационарлық фазасын дайындады және көмірсутектерді, антидепрессанттарды, флавоноидтарды, нуклеозидтерді, эстрогендерді және басқа да бірнеше аналиттерді сәтті бөлді. Полярлық интеркалатордың полярлы және полярлы емес топтары бар, сондықтан оны полярлы және полярлы бағаналы, гидрофобты, гидрофобты бағандары бар пептидтер мен ақуыздарды бөлу үшін пайдалануға болады. C18 бағандары) Ascentis Express RP-Amide бағаналары саудалық атауымен коммерциялық қол жетімді, бірақ бұл бағандар тек 33 аминді талдау үшін пайдаланылады.
Ағымдағы зерттеуде HSA пептидтері мен трипсин дайджесттерін бөлу үшін полярлы ендірілген стационарлы фаза (N-фенилмалеймидпен енгізілген полистирол) дайындалды және бағаланды. Стационарлы фаза келесі стратегияны қолдану арқылы дайындалды. Кеуекті кремнезем бөлшектері біздің алдыңғы жарияланымда келтірілген процедураға сәйкес дайындалған, кейбір модификацияланған полиэтилен, г. ), TMOS, су сірке қышқылы үлкен кеуек өлшемі бар кремний диоксиді бөлшектерін дайындау үшін реттелді. Екіншіден, жаңа лиганд, фенилмалеймид-метил винил изоцианаты синтезделді және полярлы кірістірілген стационарлық фазаны дайындау үшін кремний диоксиді бөлшектерін алу үшін пайдаланылды. Алынған стационарлық фазаны пайдаланып, болатсыз қаптамаға оралған ×01 mm0.1. ing схемасы. Колоннада біртекті қабаттың пайда болуын қамтамасыз ету үшін бағанды ​​орау механикалық дірілмен көмектеседі. Бес пептидтен тұратын пептидтік қоспалардың оралған колонналық бөлінуін бағалаңыз;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) және адам сарысуы альбуминінің трипсин дайджесті (HAS). HSA пептидтік қоспасы мен трипсин дайджесті жақсы ажыратымдылықпен бөлінуі байқалды. Ascentis Express RP-Amide бағанына қарағанда тиімдірек болған PMP бағанында пептидтер де, белоктар да жақсы шешілген және тиімді екені байқалды.
PEG (полиэтиленгликоль), мочевина, сірке қышқылы, триметокси ортосиликат (TMOS), триметилхлоросилан (TMCS), трипсин, адам сарысуы альбумині (HSA), аммоний хлориді, несепнәр, гексанметилдисилазан (HMDS), метакрил (HMDS) Бензоил пероксиді (BPO), HPLC дәрежесі ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол және ацетон Сигма-Олдрихтен (Сент-Луис, МО, АҚШ) сатып алынды.
Мочевина (8 г), полиэтиленгликоль (8 г) және 8 мл 0,01 н сірке қышқылы қоспасы 10 минут бойы араластырылды, содан кейін мұздай салқын жағдайда оған 24 мл TMOS қосылды. Реакция қоспасы 6 сағат бойы 40 ° C температурада қыздырылды, содан кейін 120 ° C сусыз температурада 8 сағат бойы суда қалдырылды. қалдық материал 70°C температурада 12 сағат кептірілді. Кептірілген жұмсақ масса пеште тегіс ұнтақталды және 550°C температурада 12 сағат бойы күйдірілді. Бөлшектердің өлшемі, кеуектер өлшемі және бетінің ауданы бойынша қайталану мүмкіндігін тексеру үшін үш партия дайындалды және сипатталды.
Алдын ала синтезделген фенилмалеймид-метилвинилизоцианатпен (PCMP) кремний диоксиді бөлшектерін беттік модификациялау, содан кейін стиролмен радиалды полимерлеу арқылы полярлы топты құрайтын қосылыс дайындалды.Агрегаттар мен полистирол тізбектері үшін стационарлық фаза. Дайындау процесі төменде сипатталған.
N-фенилмалеймид (200 мг) және метилвинил изоцианат (100 мг) құрғақ толуолда ерітілді және фенилмалеймид-метилвинилполимер қоспасын дайындау үшін реакция колбасына 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) қосылды (CP30C температурада қыздырылған). сағат, сүзгіден өткізіп, пеште 40°C температурада 3 сағат бойы кептіреді.
Кептірілген кремний диоксиді бөлшектері (2 г) құрғақ толуолда (100 мл) дисперстіленді, араластырылды және 500 мл дөңгелек түбі бар колбада 10 минут бойы ультрадыбыспен өңделді. PMCP (10 мг) толуолда ерітілді және тамшылататын воронка арқылы реакциялық колбаға тамшылатып қосылды. Қоспа 1 сағат бойы сүзгіден өткізіліп, сүзгіден өткізілген. 60°C температурада 3 сағат бойы. Содан кейін PMCP-байланысқан кремний диоксиді бөлшектері (100 г) толуолда (200 мл) ерітілді және катализатор ретінде 100 мкл дибутилтин дилуратының қатысуымен 4-гидрокси-ТЕМПО (2 мл) қосылды. Қоспа 8°C температурада сүзіліп, 8°5 сағат бойы сүзілді, 50°C температурада сүзілді. 3 сағат.
Стирол (1 мл), бензоил асқын тотығы BPO (0,5 мл) және TEMPO-PMCP қосылған кремний диоксиді бөлшектері (1,5 г) толуолда дисперстіленді және азотпен тазартылды. Стиролды полимерлеу 100°C температурада 12 сағат бойы жүргізілді. Алынған өнім 12 сағат бойы метолмен жуылады. мен 1-суретте көрсетілген.
Үлгілер 10-3 Torr-дан аз қалдық қысымды алу үшін 1 сағат бойы 393 К температурада газсыздандырылды. P/P0 = 0,99 салыстырмалы қысымда адсорбцияланған N2 мөлшері жалпы кеуек көлемін анықтау үшін пайдаланылды. Жалаңаш және лиганд-байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің морфологиясы (жоғары технологиялы сканерлеумен, жапондық микроскопиялық зерттеулермен) зерттелді. өңделген үлгілер (жалаңаш кремний тотығы және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері) жабысқақ көміртекті таспаны пайдаланып алюминий бағанына орналастырылды. Үлгілерге Q150T шашыратқыш қаптаманы пайдаланып алтын жағылды және үлгілерге 5 нм Au қабаты қойылды. Бұл төмен кернеулерді пайдалана отырып, процестің тиімділігін жақсартады және спрейттер АҚШ-ты қамтамасыз етеді. Элементтік талдау үшін 1112 элементтік анализатор пайдаланылды. Бөлшек өлшемдерінің таралуын алу үшін Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 бөлшектер өлшемі анализаторы пайдаланылды. Жалаңаш кремний бөлшектері мен лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері (әрқайсысы 5 мг) 5 мл изопропанолға дисперстіленді, опропанолға ұсақталған және миниализацияланған. Mastersizer. Термогравиметриялық талдау 30-дан 800 °C-қа дейінгі температура диапазонында минутына 5 °C жылдамдықпен орындалды.
Өлшемдері (100 × 1,8 мм идентификатор) әйнекпен қапталған тот баспайтын болаттан жасалған тар саңылаулы бағандар нөлдік буып-түю әдісін қолданып, Нұсқада қолданылған процедураны қолданып оралған.31. Тот баспайтын болаттан жасалған колонна (әйнекпен қапталған, 100 × 1,8 мм идентификаторы) құрамында 1 мкм фриті бар шығыс фитингі суспензияны орауышқа (Alltech Deerfield, IL, АҚШ) қосылды. 150 мг стационарлы бағананы суспензиялау арқылы стационарлы фазалық суспензия дайындаңыз және оны 1 2 мг стационарлық фазада пайдаланылған бағанға жіберіңіз. суспензия еріткіші, сондай-ақ қозғаушы еріткіш ретінде. 10 минут бойы 100 МП, 15 минут бойы 80 МП және 30 минут бойы 60 МП қысымды қолдану арқылы колонканы дәйекті түрде толтырыңыз. Орау кезінде екі GC колонна шайқағышымен (Alltech, Дирфилд, IL) механикалық тербеліс қолданылды. бағандағы кез келген зақымның алдын алу үшін баяу қысым жасаңыз. Бағананы шламды орау блогынан ажыратыңыз және оның жұмысын тексеру үшін кіріс пен LC жүйесіне басқа фитингті қосыңыз.
LC сорғы (10AD Shimadzu, Жапония), инжектор (Valco (АҚШ) C14 W.05), 50 нл инъекциялық ілмегі бар мембраналық газсыздандырғыш (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капиллярлық терезесі арнайы μLC құрылғысы детекторы (UV-2075) және әйнекпен қысқа жолақтарды өте қысқа қосатын әсер ету үшін жасалды. Кеңейту. Буып-түйгеннен кейін қалпына келтіретін қосылыстың 1/16″ шығысына капиллярлар (50 мкм идентификатор 365 және редукциялық капиллярлар (50 мкм) орнатылды. Деректерді жинау және хроматографиялық өңдеу Multichro 2000 бағдарламалық құралын пайдалану арқылы жүзеге асырылды. 254 ультрадыбысты сіңіру сынағы арқылы Chromatographic деректері талданды. (Нортгемптон, MA).
Адам сарысуындағы альбумин, лиофилденген ұнтақ, ≥ 96% (агарозды гель электрофорезі) 3 мг трипсинмен (1,5 мг), 4,0 М мочевинамен (1 мл) және 0,2 М аммоний бикарбонатымен (1 мл) араластырылған. Ерітінді 10 минут бойы араластырып, содан кейін 10 минут бойы араластырылып, содан кейін 100 литр су моншасында 7 сағат бойы ұсталды. 0,1% TFA. Ерітіндіні сүзіп, 4 °C төмен температурада сақтаңыз.
Пептидтік қоспаларды және HSA трипсин дайджесттерін бөлу PMP бағандарында бөлек бағаланды. PMP бағанымен HSA пептидтік қоспасы мен трипсин дайджестінің бөлінуін тексеріңіз және нәтижелерді Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырыңыз. Теориялық пластина нөмірі келесідей есептеледі:
Жалаңаш кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің SEM кескіндері суретте көрсетілген.2 .Жалаң кремнезем бөлшектерінің (A, B) SEM суреттері, біздің алдыңғы зерттеулерімізден айырмашылығы, бұл бөлшектердің бөлшектері ұзартылған немесе дұрыс емес симметрияға ие болатын сфералық екенін көрсетеді. ca бөлшектер.
Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің (A, B) және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің (C, D) сканерленген электронды микроскоптағы суреттері.
Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің және лиганд-байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектер өлшемдерінің үлестірімі 3(A) суретте көрсетілген. Көлемге негізделген бөлшектер өлшемін бөлу қисығы кремний диоксиді бөлшектерінің өлшемі химиялық модификациядан кейін ұлғайғанын көрсетті (3А-сурет). Кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектердің өлшемдерінің таралу деректері ағымдағы зерттеудегі және алдыңғы зерттеудегі T(A) өлшемімен салыстыруға болатын бөлшектердің өлшемі (D1). PMP 3,36 мкм құрайды, бұл біздің ad(0,5) мәні 3,05 мкм (полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері) бар алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда 34. Бұл партияда PEG, мочевина, TMOS және сірке қышқылының қатынасы әртүрлі болғандықтан, біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда бөлшектердің мөлшері тарырақ болды, бұл реакцияның мөлшері бойынша РМП қоспасының мөлшері бойынша полистиролға қарағанда.b. кремний диоксиді бөлшектерінің фазасын біз бұрын зерттеген болатынбыз. Бұл кремний диоксиді бөлшектерінің стиролмен бетінің функционализациясы кремний диоксиді бетінде тек полистирол қабатын (0,97 мкм) тұндырғанын білдіреді, ал PMP фазасында қабат қалыңдығы 1,38 мкм болды.
Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектердің өлшемдерінің таралуы (A) және кеуектерінің таралуы (B).
Ағымдағы зерттеудегі кремний диоксиді бөлшектерінің кеуек өлшемі, кеуек көлемі және бетінің ауданы 1(B) кестеде келтірілген. Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің PSD профильдері 3(B) суретте көрсетілген. Нәтижелер біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырмалы. 1(В)-кестеде көрсетілгендей, химиялық модификациядан кейін кеуектер мөлшері 69-ға азаяды, ал қисық сызықтың өзгеруі 3(В)-суретте көрсетілген. Сол сияқты, кремний диоксиді бөлшектерінің кеуектерінің көлемі химиялық модификациядан кейін 0,67-ден 0,58 см3/г-ға дейін азайды. Қазіргі уақытта зерттелетін 16 м2-ге дейін төмендеген. (124 м2/г). 1(В)-кестеде көрсетілгендей, кремний диоксиді бөлшектерінің бетінің ауданы (м2/г) химиялық модификациядан кейін де 116 м2/г-дан 105 м2/г дейін төмендеді.
Стационарлы фазаның элементтік талдауының нәтижелері 2-кестеде көрсетілген. Ағымдағы стационарлы фазаның көміртегі жүктемесі 6,35% құрайды, бұл біздің алдыңғы зерттеудегі көміртегі жүктемесінен төмен (полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері, сәйкесінше 7,93%35 және 10,21%) 42. Себебі СП-дағы ток фазасының қосындысы аз. стирол, фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PCMP) және 4-гидрокси-ТЕМПО сияқты кейбір полярлы лигандтар пайдаланылды. Ағымдағы стационарлық фазадағы азоттың салмағы 2,21% құрайды, 0,1735 және азоттың салмағы бойынша 0,85% салыстырғанда, алдыңғы зерттеулердегі азоттың салмағы бойынша 0,85%, оның фазалық фазасына қарағанда жоғары. фенилмалеймид. Сол сияқты, өнімдердің (4) және (5) көміртегі жүктемелері сәйкесінше 2,7% және 2,9% құрады, ал соңғы өнімнің (6) көміртегі жүктемесі 2-кестеде көрсетілгендей 6,35% болды. Салмақ жоғалту PMP стационарлық фазасымен тексерілді, ал TGA қисығы TGA 6-суретте жақсы салмақ жоғалтуды көрсетеді. көміртегі жүктемесі (6,35%), өйткені лигандтарда тек С ғана емес, сонымен қатар N, O және H бар.
Фенилмалеймид-метилвинилизоцианат лиганды кремний диоксиді бөлшектерінің беттік модификациясы үшін таңдалды, өйткені оның полярлы фенилмалеймид топтары мен винилизоцианат топтары бар. Винил изоцианат топтары тірі радикалды полимерлену арқылы стиролмен одан әрі әрекеттесе алады. Екінші себеп - стационарлық және орташа аналитикалық өзара әрекеттесуі бар топты енгізу. фаза, өйткені фенилмалеймид бөлігінің қалыпты рН кезінде виртуалды заряды жоқ. Стационар фазаның полярлығын стиролдың оңтайлы мөлшерімен және бос радикалды полимерлеудің реакция уақытымен басқаруға болады. Реакцияның соңғы сатысы (бос радикалды полимерлеу) өте маңызды және стационарлық фазаның полярлығын өзгерте алады. Бұл фазаның стационарлық жүктемесін және ұлғаюын тексеру үшін элементтік талдау жүргізілді. реакция уақыты стационарлық фазаның көміртегі жүктемесін арттырды және керісінше. Әртүрлі стирол концентрацияларымен дайындалған SP-тердің көміртегі жүктемелері әртүрлі. Тағы да, бұл стационарлық фазаларды тот баспайтын болаттан жасалған бағандарға жүктеңіз және олардың хроматографиялық өнімділігін тексеріңіз (таңдағыштық, ажыратымдылық, N мәні және т.б.). Осы эксперименттердің негізінде, оңтайландырылған фазалық формула таңдалды.
Бес пептидтік қоспалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) сондай-ақ жылжымалы фазаны пайдалана отырып, PMP бағанының көмегімен бағаланды;60/40 (көлем/көлем) ацетонитрил/су (0,1% TFA) 80 мкл/мин ағын жылдамдығында. Оңтайлы элюция жағдайында бір бағандағы теориялық пластина саны (N) (100 × 1,8 мм идентификатор) 20 000 ± 100 құрайды (200 000 ± 100). роматограммалар 5А-суретте көрсетілген. Жоғары ағын жылдамдығымен (700 мкЛ/мин) PMP бағанында жылдам талдау, бес пептид бір минут ішінде элюцияланды, N мәндері өте жақсы, әр баған үшін 13,500 ± 330 (100 × 1,8 мм идентификатор), сәйкес келеді (135,000 мкл/мин бағанға), 135,000 бағанға сәйкес келеді (500 мкл/мин бағанға). 00 × 1,8 мм идентификатор) қайта шығару мүмкіндігін тексеру үшін PMP стационар фазасының үш түрлі лотымен оралған. Әрбір баған үшін талданатын заттың концентрациясы оңтайлы элюция жағдайлары мен теориялық пластиналардың саны N және әр бағандағы бірдей сынақ қоспасын бөлу үшін ұстау уақыты арқылы жазылды. PMP бағандары үшін қайталану деректері PMP 4 бағандарының қайталану деректері өте төмен сәйкестік көрсеткіштерімен PMP 4 кестеде көрсетілгендей, қайталану мүмкіндігінің өте төмен көрсеткіштерімен % жақсы көрсетілген PRS 4 кестеде көрсетілген. 3-кесте.
PMP бағанында (B) және Ascentis Express RP-Amide бағанында (A) пептидті қоспаны бөлу;жылжымалы фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP бағанының өлшемдері (100 × 1,8 мм идентификатор);аналитикалық Қосылыстардың элюция тәртібі: 1 (Гли-Тир), 2 (Гли-Леу-Тир), 3 (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) және 5 (лейцин) энкефалин қышқылы).
PMP бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) жоғары өнімді сұйық хроматографияда адам сарысуы альбуминінің триптикалық дайджесттерін бөлу үшін бағаланды. 6-суреттегі хроматограмма үлгінің жақсы бөлінгенін және ажыратымдылық өте жақсы екенін көрсетеді. HSA дайджесттері 100 мкл/л/мин мобильді фаза және 100% мобильді фаза және 100% су ағыны арқылы талданған. .Хроматограммада (6-сурет) көрсетілгендей, HSA қорытуы 17 пептидке сәйкес 17 шыңға бөлінген. HSA дайджестіндегі әрбір пиктің бөліну тиімділігі есептеліп, мәндері 5-кестеде келтірілген.
HSA (100 × 1,8 мм идентификатор) триптикалық дайджесті PMP бағанында бөлінген;ағын жылдамдығы (100 мкл/мин), жылжымалы фаза 60/40 ацетонитрил/0,1% TFA бар су.
мұндағы L – баған ұзындығы, η – жылжымалы фазаның тұтқырлығы, ΔP – колоннаның кері қысымы және u – жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығы. PMP бағанының өткізгіштігі 2,5 × 10-14 м2, ағынының жылдамдығы 25 мкЛ/мин, ал бағанның 60/40 в/в/в AC 01 МП пайдаланылды. id) біздің алдыңғы зерттеуімізге ұқсас болды. Реф.34. Үсті кеуекті бөлшектермен оралған бағананың өткізгіштігі: 1,3 мкм бөлшектер үшін 1,7 × 10-15, 1,7 мкм бөлшектер үшін 3,1 × 10-15, 5,2 × 10-15 μм бөлшектер үшін және 2,1 × 15 мкм бөлшектер үшін. 5 мкм бөлшектер 43.Сондықтан PMP фазасының өткізгіштігі 5 мкм өзек-қабық бөлшектеріне ұқсас.
мұндағы Wx хлороформмен оралған бағанның салмағы, Wy – метанолмен оралған колоннаның салмағы, ал ρ – еріткіштің тығыздығы. Метанол (ρ = 0,7866) және хлороформ (ρ = 1,484) тығыздығы. SILICA-1301 мм бағанының жалпы кеуектілігі (SILICA-1301) Біз бұрын зерттеген 4 және C18-Мочевина бағандары 31 сәйкесінше 0,63 және 0,55 болды. Бұл несепнәр лигандтарының болуы стационарлық фазаның өткізгіштігін төмендетеді дегенді білдіреді. Екінші жағынан, PMP бағанының жалпы кеуектілігі (100 × 1,8 мм) PMP бағанының жалпы кеуектілігі (100 × 1,8 мм). -байланысқан кремнезем бөлшектері, себебі С18 типті стационар фазаларда С18 лигандтары кремнеземді бөлшектерге сызықтық тізбек ретінде қосылады, ал полистирол типті стационар фазаларда оның айналасында салыстырмалы қалың полимер қабаты түзіледі. Типтік тәжірибеде бағананың кеуектілігі келесідей есептеледі:
7A,B суретінде бірдей элюция шарттарын (яғни, 60/40 ACN/H2O және 0,1% TFA) қолданатын PMP бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) және Ascentis Express RP-Amide бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) көрсетілген.) van Deemter учаскесі.Таңдалған пептидтік қоспалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 мкл/Екі баған үшін ең аз ағын жылдамдығы 800 мкЛ/мин. Express RP-Amide бағаны сәйкесінше 2,6 мкм және 3,9 мкм болды. HETP мәндері PMP бағанының (100 × 1,8 мм идентификаторы) бөлу тиімділігінің коммерциялық қол жетімді Ascentis Express RP-Amide бағанасынан (100 × 1,8 мм идентификатор) әлдеқайда жақсырақ екенін көрсетеді (100 × 1,8 мм идентификатор). алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда маңызды емес. Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырғанда PMP бағанының (100 × 1,8 мм идентификаторы) жоғарырақ бөлу тиімділігі ағымдағы жұмыста қолданылатын бөлшектердің пішінін, өлшемін және күрделі бағанды ​​орау процедураларын жақсартуға негізделген34.
(A) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O кезінде PMP бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) көмегімен алынған ван Димтер сызбасы (жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығына қарсы). 0/40 ACN/H2O 0,1% TFA.
Жоғары өнімді сұйық хроматографияда адам сарысуы альбуминінің (HAS) синтетикалық пептидті қоспаларын және трипсин дайджесттерін бөлу үшін полярлы кіріктірілген полистирол стационарлық фазасы дайындалды және бағаланды. Пептидті қоспаларға арналған PMP бағандарының хроматографиялық өнімділігі бөлу тиімділігі мен ажыратымдылығы бойынша тамаша. ca бөлшектер, стационарлық фазаның бақыланатын синтезі және күрделі бағанды ​​орау. Жоғары бөлу тиімділігіне қоса, жоғары ағын жылдамдығындағы төмен бағана кері қысымы осы стационарлық фазаның тағы бір артықшылығы болып табылады. PMP бағандары жақсы қайталану мүмкіндігін көрсетеді және пептидтік қоспаларды талдау және әртүрлі ақуыздарды трипсинді ыдырату үшін пайдаланылуы мүмкін. Біз бұл сұйық өсімдіктердің биобелсенді қосылыс сығындысы мен биоактивті қосылыстарды сығындысы үшін пайдалануды көздеп отырмыз. хроматография. Болашақта PMP бағандары белоктар мен моноклоналды антиденелерді бөлу үшін де бағаланады.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Reversed фазалық хроматография арқылы пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: бағанды ​​сипаттау хаттамасын әзірлеу.J.Хроматография.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. және т.б. Жұқпалы ауруларды емдеуге арналған жақсартылған белсенді пептидтер.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетикалық терапевтік пептидтер: ғылым және нарық. дәрі-дәрмектің ашылуы.15 (1-2) бүгін, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2019 (1010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Хроматография.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Advanced сұйық хроматография-масс-спектрометрия кең мақсатты метаболомиканы және протеомиканы қосуға мүмкіндік береді.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Дәрілік заттарды әзірлеудегі UHPLC рөлі.J.Қыркүйек Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM. Жылдам бөлуге арналған ультра жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері.Қыркүйек. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Препаратты әзірлеуде ультра жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясын қолдану.Хроматография.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Энтеровирустарды тиімді тазарту үшін судағы мұнай жоғары ішкі фазалық эмульсиялардан дайындалған монолитті макрокеуекті гидрогельдер.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020 ж.).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. & Уилкинс, Я. Протеомикадағы сұйық хроматографияның рөлі.Хроматография.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Терапевтік пептидтер мен ақуыздардың кері фазалы сұйық хроматография бөлінуіндегі жаңа тенденциялар: теория және қолдану.Фармация.Биомедициналық ғылым.анус.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, АЕ және Геблер, JC. Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН мәндерін пайдалана отырып, RP-RP-HPLC жүйесі арқылы пептидтерді екі өлшемді бөлу.J.Қыркүйек Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. C18 суб-2 мкм толық және үстірт кеуекті бөлшектермен оралған жоғары тиімді хроматографиялық бағандардың масса алмасу сипаттамалары мен кинетикалық өнімділігі зерттелді.J.Қыркүйек Ғылым.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Өсімдіктің биоактивті пептидтерін оқшаулау, идентификациялау және валидациялаудағы соңғы тенденциялар мен аналитикалық қиындықтар.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s002168-01 (s002168-02).
Мюллер, Дж.Б. және т.б. Өмір патшалығының протеомдық ландшафты. Табиғат 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Терапевтік пептидтерді препаративті сұйық хроматография арқылы өңдеу. Молекула (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимдегі хроматография және оның биополимерлерге қолданылуы.Хроматография.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.-Y.& Sun, Y. Аралас режимдегі ақуыз хроматографиясына арналған лигандтар: принципі, сипаттамасы және дизайны.J.Биотехнология.144(1), 3-11 (2009).