Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) - тамақ өнімдерін өндіру және топырақты жақсарту үшін пайдаланылатын бұршақ тұқымдас өсімдік.NLL-нің дақыл ретінде жаһандық кеңеюі көптеген патогенді саңырауқұлақтарды, соның ішінде жойқын антракноз ауруын тудыратын люпин антракнозын тартты.Қарсылықты жоғарылататын екі аллель, Lanr1 және AnMan NLL өсіруде қолданылған, бірақ негізгі молекулалық механизмдер белгісіз болып қалады.Бұл зерттеуде Lanr1 және AnMan маркерлері еуропалық NLL үлгілерін скрининг үшін пайдаланылды.Вакцинаны бақыланатын ортада сынау екі төзімді донордың да тиімділігін растады.Дифференциалды ген экспрессиясының профилі репрезентативті және сезімтал сызықтарда орындалды.Антракнозға төзімділік «GO:0006952 Defence Response», «GO:0055114 Redox Process» және «GO:0015979 Photosynthesis» гендік онтология терминдерінің шамадан тыс экспрессиясымен байланысты болды.Сонымен қатар, Lanr1(83A:476) сызығы егуден кейін транскриптомды жылдам қайта бағдарламалауды көрсетті, ал басқа жолдар бұл жауаптың шамамен 42 сағатқа кешігуін көрсетті.Қорғаныс реакциялары TIR-NBS, CC-NBS-LRR және NBS-LRR гендерімен, патогенезге қатысатын 10 ақуыздармен, липидтерді тасымалдаушы ақуыздармен, эндоглюкан-1,3-β-глюкозидазамен, глицинге бай жасуша қабырғасының ақуыздарымен және оттегінің реактивті жолындағы гендермен байланысты.83A:476-ға ерте жауаптар, соның ішінде фотосинтезге байланысты гендерді мұқият басу, саңырауқұлақ биологиясының вегетативті өсу фазасында сәтті қорғаныспен сәйкес келді, бұл эффектордың иммунитетті тудыратынын көрсетеді.Манделуп реакциясы жалпы көлденең кедергі сияқты баяулайды.
Тар жапырақты люпин (NLL, Lupinus angustifolius L.) – Батыс Жерорта теңізі өңірінен шыққан ақуызы жоғары дәнді дақыл1,2.Қазіргі уақытта жануарлар мен адамдарға азық ретінде өсіріледі.Ол сондай-ақ симбиотикалық азотты бекітетін бактериялар арқылы азотты бекітуге және топырақ құрылымын жалпы жақсартуға байланысты ауыспалы егіс жүйесінде жасыл көң болып саналады.NLL өткен ғасырда тез қолға үйрету процесін бастан өткерді және әлі де жоғары асыл тұқымды қысым астында қалды3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.NLL-ді кеңінен өсірумен патогенді саңырауқұлақтардың сабақтастығы жаңа ауылшаруашылық тауашаларды жасап, жаңа дақылдарды бұзатын ауруларды тудырды. Люпин өсірушілері мен өсірушілері үшін ең қызықтысы патогендік саңырауқұлақ Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 тудырған антракноздың пайда болуы болды. Люпин өсірушілері мен өсірушілері үшін ең қызықтысы патогендік саңырауқұлақ Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 тудырған антракноздың пайда болуы болды. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенді грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Люпин өсірушілер мен өсірушілер үшін ең маңыздысы Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 патогенді саңырауқұлағы тудырған антракноздың пайда болуы болды.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它的出现，它眯由onB renberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它的出现，它眯由on嵵Шашты。1 Наиболее поразительным для фермеров және селекционеров люпина является появление антракноза, патогенді грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Люпин өсірушілер мен өсірушілерді ең таң қалдыратыны - Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 патогенді саңырауқұлақтарынан туындаған антракноздың пайда болуы.Ауру туралы ең алғашқы есептер Бразилия мен Америка Құрама Штаттарынан келді, типтік белгілері сәйкесінше 1912 және 1929 жылдары пайда болды.Алайда, шамамен 30 жылдан кейін қоздырғыш Colletotrichum gloeosporioides (Пенц.) Пенц деп белгіленді. & Сак., телеоморф Glomerella cingulata (Тас адамы) Spauld. & Сак., телеоморф Glomerella cingulata (Тас адамы) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Сак., Glomerella cingulata телеоморфы (Тас адамы) Спульд. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Спульд мақсатты морфологиядағы. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .және Х.Шренк. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。және Х. Шленк, .20 ғасырдың ортасында жүргізілген аурудың алдын ала фенотипі NLL және сары люпин (L. luteus L.) қосындыларында біршама төзімділік көрсетті, бірақ тексерілген барлық ақ люпин (L. albus L.) қосындылары өте сезімтал болды15,16.Зерттеулер көрсеткендей, антакнозаның дамуы жоғары температурада (12-28 ° C диапазонымен) және температураның жоғарылауымен (12-28 ° C диапазонында) (12-28 ° C диапазонында) жоғары температура бұзылуымен (7 ° C), басталуға, жоғары ылғалдылық жағдайында (16 сағат) қарағанда, сағат 15 ° C (16 сағат).Осылайша, жалғасып жатқан жаһандық жылыну антракноздың таралуына әкелді.Алайда, ауру Францияда (1982) және Украинада (1983) жақындап келе жатқан қауіптің хабаршысы ретінде байқалды, бірақ ол кезде люпин өнеркәсібі оны елемеді20,21.Бірнеше жылдан кейін бұл жойқын ауру бүкіл әлемге таралып, Австралия, Польша және Германия сияқты ірі люпин өндіретін елдерге де әсер етті22,23,24.1990 жылдардың ортасында антракноздың өршуінен кейін кең ауқымды скрининг нәтижесінде NLL19 үлгілерінде бірнеше төзімді донорлар анықталды.Антракнозға NLL төзімділігі әртүрлі гермплазма көздерінде кездесетін екі бөлек басым аллельдермен бақыланады: Танжил және Вонга сортындағы Lanr1 және сорттағы AnMan.Мандалай 25, 26. Бұл аллельдер селекциялық бағдарламаларда төзімді микроплазманы таңдауды қолдайтын молекулалық маркерлерді толықтырады25,26,27,28,29,30.Антракнозға төзімділік үшін бөлетін RIL популяциясын алу үшін Lanr1 аллельін алып жүретін 83A:476 төзімді тұқымдық сызығы P27255 сезімтал жабайы сызығымен қиылысады, бұл NLL-1131, 32, 33 хромосомаларына Lanr1 локусын тағайындауға мүмкіндік берді. LL бір хромосомада (NLL-11) барлық үш аллельдің орналасуын анықтады, бірақ әртүрлі позицияларда29,34,35.Дегенмен, RIL санының аздығына және маркерлер мен сәйкес аллельдердің арасындағы үлкен генетикалық қашықтыққа байланысты олардың негізгі гендері туралы сенімді қорытынды жасауға болмайды.Екінші жағынан, люпиндерде кері генетиканы қолдану олардың өте төмен регенерация потенциалына байланысты қиын, бұл генетикалық манипуляцияны ауыр етеді37.
83A:476 (Lanr1) және Mandelup (AnMan) сияқты гомозиготалы күйде қажетті аллельді алып жүретін қолға үйретілген ұрықтың дамуы жабайы популяциялардағы аллельдердің қарама-қарсы комбинацияларының болуы жағдайында антракнозға төзімділікті зерттеуге жол ашты.Молекулалық механизмдердің мүмкіндіктері.Арнайы генотиптер тудырған қорғаныс реакцияларын салыстырыңыз.Бұл зерттеу NLL-дің C. lupini вакцинациясына ерте транскриптомдық реакциясын бағалады.Алдымен, Lanr1 және AnMan аллельдерін белгілейтін молекулалық маркерлердің көмегімен 215 жолды қамтитын еуропалық NLL гермплазмалық панель скринингтен өтті.Содан кейін антракнозды фенотиптеу бақыланатын жағдайларда молекулалық маркерлер үшін бұрын таңдалған 50 NLL сызығында орындалды.Осы эксперименттердің негізінде антракнозға төзімділік пен Lanr1/AnMan аллельдік құрамы бойынша ерекшеленетін төрт сызық екі қосымша тәсілдерді пайдалана отырып дифференциалды қорғаныс генінің экспрессиясын анықтау үшін таңдалды: жоғары өткізу қабілетті РНҚ секвенирлеу және нақты уақыттағы ПТР сандық анықтау.
Lanr1 (Anseq3 және Anseq4) және AnMan (Anseq4) және AnMan (AnManM1) маркерлерімен NLL ұрықтарының жиынтығын (N = 215) скринингтік тексеру көрсеткендей, тек бір сызық (95726, Саламанка-b маңында) барлық «қарсылық» аллельін күшейтеді, ал барлық «П» маркерлерінің барлық процепттері үшін табылған, 158 (~73,5%) жолда.Он үш жол Lanr1 маркерінің екі «төзімді» аллельдерін, ал 8 жол Lanr1 «төзімді» аллельдерін шығарды.маркер.AnMan маркерінің «қарсылық» аллелі (қосымша кесте S1).Екі сызық Anseq3 маркері үшін гетерозиготалы және AnManM1 маркері үшін бір гетерозиготалы болды.42 жол (19,5%) Anseq3 және Anseq4 аллельдерінің қарама-қарсы фазаларын тасымалдады, бұл осы екі локус арасындағы рекомбинацияның жоғары жиілігін көрсетеді.Бақыланатын жағдайларда антракноз фенотиптері (Қосымша S2 кесте) антракноздың ауырлық дәрежесінде көрінетін сыналған генотиптердің төзімділігінің өзгермелілігін анықтады.Орташа баллдардағы айырмашылықтар 1,8 (орташа төзімді) пен 6,9 (сезімтал) аралығында және өсімдік салмағының айырмашылығы 0,62 (сезімтал) пен 4,45 г (төзімді) аралығында болды. Тәжірибенің екі қайталауында байқалған мәндер арасында (аурудың ауырлық ұпайлары үшін 0,51, P = 0,00017 және өсімдік салмағы үшін 0,61, P <0,0001), сондай-ақ осы екі параметр арасында (− 0,59 және − 0,77, P < 0,0001) айтарлықтай корреляция болды. Тәжірибенің екі қайталануында байқалған мәндер арасында (аурудың ауырлық ұпайлары үшін 0,51, P = 0,00017 және өсімдік салмағы үшін 0,61, P < 0,0001), сондай-ақ осы екі параметр арасында (− 0,59 және − 0,77, P < 0,001) айтарлықтай корреляция болды. Выявлена ​​достверная корреляция арасындағы значениями, наблюдаемыми в в в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 және 0,61 үшін массы растения, P < 0,0001), а также- 0,0001 параметрі, Р < 0,0001 параметрі, а также-7, - параметрі - < 0,0001) 0,0001). Тәжірибенің екі қайталауында байқалған мәндер арасында (аурудың ауырлық көрсеткіші үшін 0,51, P = 0,00017 және өсімдік салмағы үшін 0,61, P < 0,0001), сондай-ақ осы екі параметр арасында (- 0,59 және -0,77, P < 0,0001) айтарлықтай корреляция анықталды.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分重程度评分0.（5）0.－物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 严重 程度 为 为 冈 为1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（，.–0,9 （（（（（59.和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция аралығы значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 және масса растения 0,61, P <0,0001), и двиум00, и двиум00, параметр - 0,009 0,77, P <0,0001. Екі данада бақыланатын мәндер арасында (аурудың ауырлық көрсеткіші 0,51, P = 0,00017 және өсімдік салмағы 0,61, P < 0,0001) және осы екі параметр арасында (-0,59 және -0 ,0001) 0,77, P<0,000 айтарлықтай корреляция болды. ).Сезімтал өсімдіктерде байқалатын типтік белгілерге «қойшы садағына» ұқсайтын сабақтың майысуы және бұралуы, содан кейін қызғылт сары/қызғылт спорозоиттері бар сопақша зақымданулар жатады (Қосымша 1-сурет).Lanr1 (83A:476 және Tanjil) және AnMan (Манделуп) гендерін тасымалдайтын австралиялық қосындылар орташа төзімді, 0,0331 және 0,0036.«Төзімді» Lanr1 және/немесе AnMan аллельдері бар кейбір сызықтар аурудың белгілерін көрсетеді.
Бір қызығы, кез келген «төзімді» маркер аллелі жоқ бірнеше NLL сызықтары антракнозға төзімділіктің жоғары деңгейін (Lanr1 немесе AnMan генотиптерінен салыстырмалы немесе жоғары) анықтады, мысалы, Борегин (екі параметр үшін P мәні < 0,0001), Божар (популяция үшін P мәні < 0,0001 және популяция үшін 0,0001 мән) және <0,0001 (B-509b үшін). 01 ұпай үшін және салмақ үшін маңызды емес). Бір қызығы, кез келген «төзімді» маркер аллелі жоқ бірнеше NLL сызықтары антракнозға төзімділіктің жоғары деңгейін (Lanr1 немесе AnMan генотиптерінен салыстырмалы немесе жоғары) анықтады, мысалы, Борегин (екі параметр үшін P мәні < 0,0001), Божар (популяция үшін P мәні < 0,0001 және популяция үшін 0,0001 мән) және <0,0001 (B-509b үшін). 01 ұпай үшін және салмақ үшін маңызды емес). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый немесе более высокий, чем генотипов үшін Lanr1 немесе AnMan), сондай-ақ, <0, дляйх как параметров Lanr1, Bojar (масса растения үшін значение P < 0,0001 және массы растения үшін 0,001) және танымал B-549/79b (значение P <0,0001 үшін осценки және незначимо үшін массы). Бір қызығы, кез келген «төзімді» маркер аллелі жоқ бірнеше NLL линиялары антракнозға төзімділіктің жоғары деңгейін көрсетті (Lanr1 немесе AnMan генотиптерімен салыстырғанда немесе одан жоғары), мысалы, Борегин (екі параметр үшін P мәні < 0,0001 ), Божар (бағалау үшін P мәні < 0,0001 және өсімдік салмағы үшін < 0,0001) және B/P <0,59b популяциясы үшін (0,59b). Бағалау үшін 0,0001 және салмақ үшін маңызды емес).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的示出高水平的炭L，一些缺乏任何“抗性”基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分不0.（0.（0.） 001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Бір қызығы, ешқандай «антигендік» маркерлері жоқ кейбір NLL жүйелері Boregine (екі параметр де P < 0,0001), Bojar (P мәні < 0,0001, өсімдік салмағы 0,001) және штамм <9/790, маңызды емес салмағы) (Lanr1 немесе AnMan гендеріне баламалы немесе одан жоғары) жоғары көлденең қарсылықты көрсетеді. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые немесе выше, чем у генотипов Lanr1 немесе AnMan), сондай-ақ параметр Boregine00, обзначение как Boregine00, ение P <0,0001, масса растения 0,001) және популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Бір қызығы, кез келген «қарсылық» маркер аллельдері жоқ кейбір NLL желілері антракнозға төзімділіктің жоғары деңгейін көрсетті (Lanr1 немесе AnMan генотиптерімен салыстырмалы немесе жоғары), мысалы, Борегин (екі параметр үшін де P мәні <0,0001) , Божар (P-мәні < 0,0001, өсімдік салмағы <0,0001 және В-59,б) .0001, салмағы маңызды емес).Бұл құбылыс маркер генотиптері мен ауру фенотиптері арасында байқалған корреляцияның жоқтығын түсіндіре отырып, төзімділіктің жаңа генетикалық көзін құру мүмкіндігін болжайды (P мәндері ~0,42-ден ~0,98-ге дейін).Осылайша, Колмогоров-Смирнов сынағы антракнозға төзімділік туралы деректер баллдар (P-мәндері 0,25 және 0,11) және өсімдік массасы (P-мәндері 0,47 және 0,55) үшін шамамен қалыпты түрде таралғанын көрсетті, бұл менің болжамым бойынша Lanr1 және AnMan-ға қарағанда көбірек аллельдер қатысады.
Антракнозға төзімділікті скрининг нәтижелері бойынша транскриптомды талдау үшін 4 жол таңдалды: 83A:476, Boregine, Mandelup және Population 22660. Бұл сызықтар алдыңғы сынақтағыдай болған жағдайда, РНҚ секвенциясы бойынша егу эксперименттерінде сібір жарасына төзімділікке қайта тексерілді.Ұпай мәндері келесідей болды: Борегин (1,71 ± 1,39), 83А: 476 (2,09 ± 1,38), Манделуп (3,82 ± 1,42) және халық саны 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 хаттамасы бір үлгіге орта есеппен 40,5 Mread жұбына (29,7 - 54,4 Mreads) қол жеткізді (Қосымша кесте S3).Анықтамалық реттіліктегі туралау ұпайлары 75,5%-дан 88,6%-ға дейін ауытқиды.Биологиялық көшірмелер арасындағы эксперименттік нұсқалар арасындағы оқылған санау деректерінің орташа корреляциясы 0,812-ден 0,997-ге дейін ауытқиды (орташа 0,959). Талданған 35 170 геннің 2917-де экспрессия анықталмады, ал қалған 4785 ген елеусіз деңгейде экспрессияланды (негізгі орташа <5). Талданған 35 170 геннің 2917-де экспрессия анықталмады, ал қалған 4785 ген елеусіз деңгейде экспрессияланды (негізгі орташа <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, және негізгі 4785 генов экспрессирование на незначительном уровне (базовое среднее <5). Талданған 35 170 геннің 2917-сі экспрессияны көрсетпеді, ал қалған 4785 ген шамалы деңгейде экспрессияланды (базалық орташа <5).在分析的35 170 个基因中， 2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可中可以） 5）.35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировать, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Талданған 35 170 геннің 2917-сі экспрессияланбады, ал қалған 4785 геннің экспрессиясы шамалы болды (негізгі орташа <5).Осылайша, эксперимент кезінде экспрессияланған (негізгі орташа ≥ 5) гендердің саны 27 468 (78,1%) болды (S4 қосымша кестесі).
Алғашқы уақыттан бастап барлық NLL желілері транскриптомды қайта бағдарламалау арқылы C. lupini (Col-08 штамы) егуіне жауап берді (1-кесте), алайда сызықтар арасында айтарлықтай айырмашылықтар байқалды.Осылайша, қарсылық сызығы 83A:476 (Lanr1 генін тасымалдаушы) осы уақыт нүктесінде басқа уақыт нүктелерімен салыстырғанда оқшауланған жоғары және төмен гендер санының 31-69 есе артуымен бірінші уақыт нүктесінде (6 а.к.) айтарлықтай транскриптомды қайта бағдарламалауды көрсетті.Сонымен қатар, бұл шың қысқа мерзімді болды, өйткені тек бірнеше гендердің экспрессиясы екінші уақыт нүктесінде (12 а.к.) айтарлықтай өзгерді.Бір қызығы, трансплантациялық сынақта да жоғары қарсылық көрсеткен Борегин эксперимент барысында мұндай жаппай транскрипциялық қайта бағдарламалаудан өтпеді.Дегенмен, дифференциалды экспрессияланған гендердің саны (DEG) Борегин үшін бірдей және 12 HPI кезінде 83A:476 болды.Манделуп пен 22660 популяциясы соңғы уақыт нүктесінде (48 л/с) DEG шыңдарын көрсетті, бұл қорғаныс реакцияларының салыстырмалы кешігуін көрсетеді.
83A:476 барлық басқа жолдармен салыстырғанда 6 HPI деңгейінде C. lupini-ге жауап ретінде ауқымды транскриптомды қайта бағдарламалаудан өткендіктен, осы уақытта байқалған DEG-тің ~91%-ы тектік спецификалық болды (Cурет 1).Дегенмен, зерттеу жолдарының арасындағы ерте жауаптарда кейбір қайталанулар болды, өйткені Борегиндегі, Манделуптағы және 22660 популяциясындағы сәйкесінше 68,5%, 50,9% және 52,6% DEG белгілі бір уақыт аралығында 83A:476-да табылғандармен қабаттасады.Дегенмен, бұл DEG қазіргі уақытта 83A:476 көмегімен анықталған барлық DEG-дің аз ғана бөлігін (0,97–1,70%) құрады.Сонымен қатар, осы уақытта барлық сызықтардағы 11 DEG когерентті болды (Қосымша кестелер S4-S6), соның ішінде өсімдіктердің қорғаныс реакцияларының жалпы компоненттері: липидті тасымалдаушы ақуыз (TanjilG_32225), эндоглюкан-1,3-β-глюкозид ферменті (TanjilG_23384), екі стресс-TanjilG_23384 ilG_31531), негізгі латекс ақуызы (TanjilG_32352) және екі глицинге бай құрылымдық жасуша қабырғасының ақуыздары (TanjilG_19701 және TanjilG_19702).Сондай-ақ 24 HPI (барлығы 16-38% DEG) кезінде 83A:476 және Борегин арасында және 48 HPI кезінде Манделуп пен Популяция 22660 арасында (барлығы 14-20% DEG) транскриптомдық жауаптарда салыстырмалы түрде жоғары сәйкестік болды.
Colletotrichum lupini егілген тар жапырақты люпин (NLL) линияларындағы дифференциалды экспрессияланған гендердің (DEG) санын көрсететін Венн диаграммасы (Верженице, Польша, 1999 жылы люпин алқаптарынан алынған Col-08 штамы).Талданған NLL сызықтары: 83A:476 (төзімді, Lanr1 аллелі бар), Борегин (төзімді, генетикалық фон белгісіз), Манделуп (орташа төзімді, AnMan аллелі бар) және популяция 22660 (өте сезімтал).Hpi аббревиатурасы вакцинациядан кейін бірнеше сағат бойы сақталады.Графикті жеңілдету үшін нөлдік мәндер жойылды.
6 hpi шамадан тыс экспрессияланған гендер жиынтығы R генінің канондық домендерінің болуы үшін талданды (Қосымша кесте S7).Бұл зерттеу NBS-LRR домендері бар классикалық ауруға төзімділік гендерінің транскриптомдық индукциясын тек 83A:476 кезінде анықтады.Бұл жинақ бір TIR-NBS-LRR генінен (tanjilg_05042), бес CC-NBS-LRR генінен (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 және tanjilg_16162) және төрт, NBSLR2 (Four, NBSLR2) және Four, NBSL1lg-) jilg_16162), сондай-ақ Төрт NBS-Lrr (tanjilg_16162) және Төрт NBS-LRR (TANJILG_16162).Бұл гендердің барлығында сақталған реттілікте орналасқан канондық домендер бар.NBS-LRR домендік гендеріне қоса, бірнеше RLL киназалары 6 hpi-де белсендірілді, атап айтқанда біреуі Борегинде (TanjilG_19877), екеуі Манделупта (TanjilG_07141 және TanjilG_19877) және 22660 популяциясында (TanjilG_03_03 және TanjilG_028) екі. :476.
C. lupini (Col-08 штамы) егуге жауап ретінде экспрессиясы айтарлықтай өзгерген гендер Ген Онтологиясының (GO) байыту талдауына ұшырады (Қосымша S8 кесте). Ең жиі шамадан тыс ұсынылған биологиялық процесс термині «GO:0006952 қорғаныс реакциясы» болды, ол 16 комбинацияның 6-да (уақыт × сызық) маңыздылығы жоғары (P мәні < 0,001) пайда болды (Cурет 2). Ең жиі шамадан тыс ұсынылған биологиялық процесс термині «GO:0006952 қорғаныс реакциясы» болды, ол 16 комбинацияның 6-да (уақыт × сызық) маңыздылығы жоғары (P мәні < 0,001) пайда болды (Cурет 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологиялық процесс «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001). Ең жиі шамадан тыс ұсынылған биологиялық процесс термині «GO:0006952 қорғаныс реакциясы» болды, ол маңыздылығы жоғары (P мәні < 0,001) 16 комбинацияның 6 (уақыт × тегі) комбинациясында пайда болды (Cурет 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 渪（个（个（店个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Биологиялық процестің ең танымал термині – «GO:0006952 қорғаныс реакциясы», ол 16 (时间×线) комбинацияның 6-ында кездеседі, жоғары мәнді (P мәні <0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологиялық процесс «GO: 0006952 Defense Response», 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0.001) 6-дан 16-ға дейін негіз болады. Ең жиі шамадан тыс ұсынылған биологиялық процесс термині «GO:0006952 қорғаныс реакциясы» болды, ол 16 комбинацияның 6-да (уақыт × сызық) маңыздылығы жоғары (P мәні < 0,001) пайда болды (Cурет 2).Бұл термин 83A екі уақыт нүктесінде шамадан тыс көрсетілді: 476 және Борегин (6 және 24 а.к.) және бір уақытта Mandelup және Population 22660 (тиісінше 12 және 6 а.к.).Бұл төзімді сызықтардың зеңге қарсы реакциясын көрсететін күтілетін нәтиже.Сонымен қатар, 83A:476 арнайы қорғаныс реакциясын көрсететін "GO:0055114 тотығу-тотықсыздану процесі" терминімен ұсынылған тотығу жарылуына қатысты гендерді жылдам индукциялау арқылы C. lupini-ге жауап берді, ал Борегин "GO" терминіне қатысты арнайы қорғаныс жауаптарын ашты.:0006950 Стресске жауап беру».22660 популяциясы «GO:0016104 Процесс тритерпен биосинтезі» және «GO:0006722 Процесс тритерпен метаболизмі» терминдерінің шамадан тыс санын ерекшелеп, қайталама метаболиттерді қамтитын көлденең қарсылық реакциясын белсендірді (екі термин де гендердің бір тобына жатады, гендердің бай реакциясының нәтижелерін ескере отырып, МанГО-ның байытылған реакциясы болды. және Популяция 22660. Сонымен қатар, ерте реакция 83A:476 (6 hpi) және кешіктірілген реакция Mandelup және Population 22660 GO:0015979 «фотосинтез» терминін және басқа да қатысты биологиялық процестерді қамтиды.
Сібір жарасының люпинімен егілген тар жапырақты люпиннің (NLL) транскриптомдық реакциялары кезінде дифференциалды түрде экспрессияланған гендердің аннотациясында таңдалған биопроцесс генінің онтологиясы терминдері (1999 жылы Польшаның Вирженице қаласындағы люпин алқаптарынан алынған Col-08 штаммы) жоғары дәрежеде көрсетілген.Талданған NLL желілері: 83A:476 (төзімді, Lanr1 гомозиготалы аллелі бар), Борегин (төзімді, белгісіз генетикалық фон), Манделуп (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллелі бар) және популяция 22660 (сезімтал).
Бұл зерттеу антракнозға төзімділікке ықпал ететін гендерді анықтауға бағытталғандықтан, GO «GO: 0006952 Қорғаныс реакциялары» және «GO: 0055114 Тотығу-тотықсыздану процестері» терминдеріне тағайындалған гендер кесінділермен талданды, өйткені бастапқы мән ≥ 30 кем дегенде бір сызықпен.× log2 статистикалық маңызды мәндерін біріктіретін уақыт нүктесі (бүктеудің өзгеруі).Осы критерийлерге сәйкес келетін гендер саны GO:0006952 үшін 65 және GO:0055114 үшін 524 болды.
83A:476 GO:0006952 терминімен аннотацияланған екі DEG шыңын көрсетті, біріншісі дюймге 6 ген (64 ген, жоғары және төмен реттеу) және екіншісі дюймге 24 ген (15 ген, тек жоғары реттеу).Boregine сонымен қатар GO:0006952 бір уақытта шыңға жеткенін көрсетті, бірақ аз DEG (11 және 8) және артықшылықты белсендіру.Mandeloop GO:0006952 екі шыңын 12 және 48 HPI-де көрсетті, екеуі де 12 генді (біріншісінде белсендіруші гендермен, екіншісінде тек супрессиялық гендермен), ал 6 HPI (13 ген) бойынша 22660 популяцияда өсу шыңының басымдығы жоғары болды.реттеу.Осы шыңдардағы GO:0006952 DEG 96,4% жауаптың бірдей түріне (жоғары немесе төмен) ие болғанын атап өткен жөн, бұл тартылған гендер санындағы айырмашылықтарға қарамастан қорғаныс жауаптарының елеулі қабаттасуын көрсетеді.GO:0006952 терминіне қатысты тізбектердің ең үлкен тобы патогенезбен байланысты 10-сыныпқа жататын ақуыз (PR-10) ақуыз тобына және негізгі ақуыз латексіне жататын аштық күйзелісімен байланысты хабар ақуызын 22 (SAM22 тәрізді) кодтайды.ұқсас (MLP тәрізді) ақуыз) ақуыз (3-сурет).Екі топ өрнектің сипаты мен жауап беру бағыты бойынша бір-бірінен ерекшеленді.SAM22 тәріздес ақуыздарды кодтайтын гендер ерте уақыт нүктелерінде (6 немесе 12 а.к.) тұрақты және маңызды индукцияны көрсетті және әдетте тәжірибенің соңында жауап бермеді (48 а.к.), ал MLP тәрізді ақуыздар 6 а.к.hpi.83A:476 және Mandelup 48 а.к/д, басқа деректер нүктелерінің барлығы дерлік жауап бермеді.Сонымен қатар, SAM22-тәрізді ақуыз гендерінің экспрессиялық профильдеріндегі айырмашылықтар антракнозға төзімділіктің байқалатын өзгермелілігінен кейін болды, өйткені төзімді линияларда сезімтал гендерге қарағанда бұл гендерді айтарлықтай индукциялайтын уақыт нүктелері көп болды.Басқа LlR18A/B тәрізді PR-10 гені SAM22 тәрізді ақуыз геніне өте ұқсас экспрессия үлгісін көрсетті.
«GO:0006952 Defence Response» биологиялық процесс терминінің негізгі компоненттері және Lanr1 және AnMan аллельдерінің кандидат гендерінің экспрессиялық үлгілері анықталды.Log2 шкаласы бір уақытта егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, люпин алқаптарынан алынған, Виженица, Польша, 1999) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы log2 мәндерін (қатпарлы өзгерту) білдіреді.Келесі тар жапырақты люпин линиялары талданды: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдаушы), Борегин (резистентті, генетикалық фон белгісіз), Манделуп (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллельін тасымалдаушы) және Популяция 22660 (сезімтал).
Сонымен қатар, Lanr1 (TanjilG_05042) және AnMan (TanjilG_12861) RNA-seq кандидат гендерінің экспрессиялық профильдері бағаланды (3-сурет).TanjilG_05042 гені 83A:476-да тек бірінші уақыт нүктесінде (6 л.к.) маңызды жауап (белсендендіру) көрсетті, ал TanjilG_12861 Mandeloop-та тек екі уақыт нүктесінде маңызды болды: 6 а.к. (төмен реттеу) және 24 а.к. (6 а.к.).бірге.).реттелетін)).
GO:0055114 «тотықсыздану процесі» терминінде ең шамадан тыс экспрессияланған гендер P450 цитохромы ақуыздары мен пероксидазаны кодтайтын гендер болды (4-сурет).6 HPI кезінде 83A:476 оқшауланған үлгілер үшін ең жоғары немесе ең төменгі log2 (қатпарлы өзгеріс) мәндері (гендердің 86,6% үшін) әдетте егілген және бақылаушы өсімдіктер арасында байқалды, бұл генотиптің егілетін жынысқа жоғары реакциясын көрсетеді.83A:476 ең маңызды GO көрсетті: 0055114 DEG 6 а.к. (503 ген), ал қалған сызықтар 48 а.к. (Борегине, 31 ген; Манделуп, 85 ген; және Популяция 22660, 78 ген)).GO:0055114 отбасының гендерінің көпшілігінде вакцинацияға жауаптардың екі түрі (белсендіру және тежелу) байқалды.Бір қызығы, GO: 0055114 Манделупеде 48 а.к. термині үшін анықталған DEG-тердің 97,6%-ға дейіні Бұл бақылаулар айтарлықтай кішірек масштабқа қарамастан (яғни, мутацияланған тотығу-тотықсыздандырылған гендер саны, 85-ке қарсы 503), кешіктірілген транскриптомалық реакцияның үлгісі адамның ерте реакциясына ұқсас екенін көрсетеді: .Boregine және 22660 популяциясында бұл конвергенция сәйкесінше 51,6% және 75,6% төмен.
«GO:0055114 Тотығу-тотықсыздану процесі» биологиялық процесс терминінің негізгі компоненттерін білдіру заңдылықтары анықталды.Log2 шкаласы бір уақытта егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, люпин алқаптарынан алынған, Виженица, Польша, 1999) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы log2 мәндерін (қатпарлы өзгерту) білдіреді.Келесі тар жапырақты люпин линиялары талданды: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдаушы), Борегин (резистентті, генетикалық фон белгісіз), Манделуп (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллельін тасымалдаушы) және Популяция 22660 (сезімтал).
83A:476 C. lupini (Col-08 штамы) егуге транскриптомиялық жауаптар сонымен қатар GO:0015979 «фотосинтез» терминіне жатқызылған гендердің үйлестірілген дыбыссыздануын және басқа да байланысты биологиялық процестерді қамтиды (Cурет 5).Бұл GO:0015979 DEG жинағында 83A:476 кезінде 6 а.к. күшінде айтарлықтай басылған 105 ген бар.Бұл жиынтықта 37 ген Манделупта 48 HPI деңгейінде және бір уақытта 22660 популяцияда 35 ген төмендетілді, оның ішінде екі генотипке де ортақ 19 DEG.GO: 0015979 терминіне қатысты DEG ешбір комбинацияда айтарлықтай белсендірілмеген (жол x уақыты).
«GO:0015979 Фотосинтез» биологиялық процесс терминінің негізгі компоненттерінің экспрессия заңдылықтары анықталды.Log2 шкаласы бір уақытта егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, люпин алқаптарынан алынған, Виженица, Польша, 1999) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы log2 мәндерін (қатпарлы өзгерту) білдіреді.Келесі тар жапырақты люпин линиялары талданды: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдаушы), Борегин (резистентті, генетикалық фон белгісіз), Манделуп (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллельін тасымалдаушы) және Популяция 22660 (сезімтал).
Дифференциалды экспрессиялық талдау нәтижелерінің негізінде және патогендік саңырауқұлақтарға қарсы қорғаныс реакцияларына қатысты болуы мүмкін, жеті геннің бұл жиынтығы нақты уақыттағы ПТР әдісімен экспрессия профильдерін сандық анықтау үшін таңдалды (Қосымша кесте S9).
TanjilG_10657 болжамды ақуыз гені бақылау (мимиктік) өсімдіктермен салыстырғанда барлық зерттелген жолдар мен уақыт нүктелерінде айтарлықтай индукцияланды (Қосымша кесте S10, S11).Сонымен қатар, TanjilG_10657 өрнек профилі эксперимент барысында барлық жолдар үшін өсу үрдісін көрсетті.22660 популяциясы TanjilG_10657 егуге ең жоғары сезімталдығын 114 есе белсендірумен және 24 HPI кезінде салыстырмалы экспрессияның ең жоғары деңгейін (4,4 ± 0,4) көрсетті (6а-сурет).PR10 LlR18A ақуыз гені TanjilG_27015 сонымен қатар көптеген деректер нүктелерінде статистикалық маңыздылығы бар барлық сызықтар мен уақыт нүктелері бойынша белсендіруді көрсетті (6б-сурет).TanjilG_10657 сияқты, TanjilG_27015 ең жоғары салыстырмалы экспрессия деңгейі 24 HPI (19,5 ± 2,4) кезінде егілген 22660 популяцияда байқалды.TanjilG_04706 қышқылдық эндохитиназа гені Boregine 6 hpi-дан басқа барлық жолдарда және барлық уақыт нүктелерінде айтарлықтай жоғары реттелді (6c-сурет).Ол бірінші уақыт нүктесінде (6 HPI) 83A:476 (10,5 есеге) күшті индукцияланды және басқа желілерде орташа өсті (6,6-7,5 есе).Эксперимент барысында TanjilG_04706 өрнегі 83A:476 және Boregine-де ұқсас деңгейде қалды, ал Mandelup және Population 22660-да ол айтарлықтай өсіп, салыстырмалы түрде жоғары мәндерге жетті (тиісінше 5,9 ± 1,5 және 6,2 ± 1,5).Эндоглюкан-1,3-β-глюкозидаза тәрізді TanjilG_23384 гені 22660 популяциядан басқа барлық жолдарда алғашқы екі уақыт нүктесінде (6 және 12 hpi) жоғары белсендіруді көрсетті (6d-сурет).TanjilG_23384 ең жоғары салыстырмалы экспрессия деңгейлері екінші уақыт нүктесінде (12 а.к.) Mandelup (2,7 ± 0,3) және 83A:476 (1,5 ± 0,1) құрылғыларында байқалды.24 HPI кезінде TanjilG_23384 өрнектері барлық зерттелген жолдарда салыстырмалы түрде төмен болды (0,04 ± 0,009-дан 0,44 ± 0,12-ге дейін).
Таңдалған гендердің экспрессиялық профильдері (ag) сандық ПТР арқылы анықталған.6, 12 және 24 сандары вакцинациядан кейінгі сағаттарды білдіреді.LanDExH7 және LanTUB6 гендері қалыпқа келтіру үшін, ал LanTUB6 серияаралық калибрлеу үшін пайдаланылды.Қате жолақтары үш биологиялық көшірмеге негізделген стандартты ауытқуды білдіреді, олардың әрқайсысы үш техникалық қайталаудың орташа мәні болып табылады. Егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штамы, 1999 жылы Польшаның Вирзеница қаласындағы люпин алқабынан алынған) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі айырмашылықтардың статистикалық мәні деректер нүктелерінен жоғары белгіленеді (*P мәні < 0,05, ***≤ 0,0.0. P мәні). ). Егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штамы, 1999 жылы Польшаның Вирзеница қаласындағы люпин алқабынан алынған) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі айырмашылықтардың статистикалық мәні деректер нүктелерінен жоғары белгіленеді (*P мәні < 0,05, ***≤ 0,0.0. P мәні). ). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 ж. с поля люпина в Верженице, Польша) және бақылау (ложно иноческие начемение от* ,05, **значение P ≤ 0,01, *** значение P ≤ 0,001). Мәліметтер нүктелерінің үстінде егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штамы, 1999 жылы Вирженице, Польшадағы люпин алқабынан алынған) және бақылау (план егілген) өсімдіктер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі статистикалық маңызды айырмашылықтар (*P мәні < 0,05, **P-мәні ≤ 0,0.0.0.接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照漈）和对照漈（模对照漈漗漗达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,01, ***P 值0.接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 ж.水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,01。0. Статистические значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) және бақылауды (қолданбалы бақылауды қамтамасыз ету) < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Мәліметтер нүктелерінің үстінде егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штамы, Верженице, Польша, 1999 жылы люпин алқаптарынан алынған) және бақылау (план егілген) өсімдіктер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі статистикалық маңызды айырмашылықтар деректер нүктелерінің үстінде көрсетілген (*P мәні < 0,05 , **P-мәні *** ≤ 0,0.0.0.).Талданған NLL желілері: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдаушы), Манделуп (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллельін тасымалдаушы), Борегин (төзімді, генетикалық фон белгісіз) және популяция 22660 (сезімтал).
Lanr1 локусындағы TanjilG_05042 кандидаттық гені RNA-seq зерттеулерінен алынған профильдерден айтарлықтай өзгеше экспрессия үлгісін көрсетті (6e-сурет).Бұл геннің айтарлықтай активтенуі Манделупта және 22660 популяцияда (тиісінше 39,7 және 11,7 есеге дейін) байқалды, нәтижесінде экспрессия деңгейі салыстырмалы түрде жоғары болды (тиісінше 1,4 ± 0,14 және 7,2 ± 1,3).83A:476 сонымен қатар TanjilG_05042 генінің біршама жоғарылауын (3,8 есеге дейін) анықтады, алайда қол жеткізілген салыстырмалы экспрессия деңгейлері (0,044 ± 0,002) Манделуп пен 22660 популяцияда байқалғандардан 30 есе төмен болды.qPCR арқылы талданған 22660 және 83A:476 популяциялары арасындағы, сондай-ақ 22660 және 22660 популяциялары арасындағы 58 есе айырмашылыққа жетіп, жалған вакцинацияланған (бақылау) нұсқалардағы генотиптер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі елеулі айырмашылықтарды көрсетті. Борегин мен Mandalup арасында екі есе айырмашылыққа қол жеткізілді.
AnMan локусындағы кандидат гені, TanjilG_12861, 83A:476 және Mandelup бойынша вакцинацияға жауап ретінде белсендірілді, 22660 популяциясында бейтарап болды және Борегинде төмендетілді (6f-сурет).TanjilG_12861 генінің салыстырмалы экспрессиясы егілген 83A: 476-да ең жоғары болды (0,14±0,01).17,4 кДа I класты жылу соққысының ақуыз гені TanjilG_05080 HSP17.4 барлық зерттелген штаммдар мен уақыт нүктелерінде салыстырмалы экспрессияның төмен деңгейін көрсетті (6g-сурет).Ең жоғары мән 22660 популяцияда 24 HPI кезінде байқалды (0,14 ± 0,02, вакцинацияға жауаптың сегіз есе артуы).
Ген экспрессиялық профильдерін салыстыру (7-сурет) TanjilG_10657 және төрт басқа гендер арасында жоғары корреляцияны анықтады: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) және TanjilG_07 (r = 0,80) және TanjilG_07.Мұндай нәтижелер қорғаныс реакциялары кезінде осы гендердің бірлескен реттелуін көрсетуі мүмкін.TanjilG_12861 және TanjilG_23384 гендері басқа гендермен салыстырғанда Пирсон корреляция коэффициентінің мәндері төмен (тиісінше 0,08-ден 0,43-ке және -0,19-дан 0,28-ге дейін) әртүрлі экспрессиялық профильдерді көрсетті.
Геннің экспрессиялық профильдері арасындағы корреляция сандық ПТР көмегімен анықталды.Келесі тар жапырақты люпин линиялары талданды: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдаушы), Манделуп (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллелін тасымалдаушы), Борегин (төзімді, генетикалық фон белгісіз) және Популяция 22660 (сезімтал).Үш уақыт нүктесі есептелді (егуден кейін 6, 12 және 24 сағат), оның ішінде егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штамы, 1999 жылы Вирженице, Польшадағы люпин алқаптарынан алынған) және бақылау (план егілген) өсімдіктер.Шкала Пирсон корреляция коэффициентінің мәнін көрсетеді.
Бір дюймге 6 ат күшімен алынған деректер негізінде WGCNA ерте қорғаныс реакцияларына назар аудару үшін егілген және бақылаушы өсімдіктерді салыстыру арқылы анықталған 9981 DEG орындалды (Қосымша кесте S12).Жиырма екі гендік модуль (кластер) генотиптер мен эксперименттік нұсқалар арасында корреляциялық (оң немесе теріс) экспрессия профильдерімен табылды. Орташа алғанда, ген экспрессия деңгейлері 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660 ретімен төмендеді (екі нұсқада да бұл үрдіс бақылаушы өсімдіктерде күштірек болды). Орташа алғанда, ген экспрессия деңгейлері 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660 ретімен төмендеді (екі нұсқада да бұл үрдіс бақылаушы өсімдіктерде күштірек болды). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Халқы 22660 (обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Орташа алғанда, ген экспрессиясы деңгейлері 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660 ретімен төмендеді (бірақ екі нұсқада да бұл үрдіс бақылаушы өсімдіктерде күштірек болды).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> популяция 22660 的 顺序 下降 （， （， （， 在 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Халқы 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Орташа алғанда, 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 сериясында ген экспрессиясының деңгейі төмендеді (бірақ екі нұсқада да бұл үрдіс бақылаушы өсімдіктерде күштірек болды).Вакцинация ген экспрессиясының жоғарылауына әкелді, әсіресе 18, 19, 14, 6 және 1 модульдерде (әсер ету реті бойынша), теріс реттеу (мысалы, 9 және 20 модульдер) немесе бейтарап әсерлермен (мысалы, 11, 22, 8 және 13 модульдер).GO терминін байыту талдауы (Қосымша кесте S13) qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10jilno07, сондай-ақ many supplies) арқылы талданған гендерді қоса алғанда, максималды белсендірумен егілген модуль (18) үшін "GO: 0006952 Қорғау реакциялары" анықталды. ed фотосинтез модульдері (9).Модуль 18 концентраторы (8-сурет) PR-10 тәрізді LlR18B протеинін кодтайтын TanjilG_26536 гені, ал 9-модуль концентраты II фотожүйе PsbQ ақуызын кодтайтын TanjilG_28955 гені ретінде анықталды.Антракнозға төзімділік кандидаты гені Lanr1, TanjilG_05042, 22-модульде (9-сурет) табылды және hu_12 тасымалдайтын "GO:0044260 Жасушалық макромолекулярлық метаболикалық процестер" және "GO:0006355 Транскрипциялық реттеу, ДНҚ шаблондау" терминдерімен байланысты.ген жылу кернеуінің транскрипция факторы A-4a (HSFA4a) кодтайды.
«GO: 0006952 Қорғаныс жауаптары» шамадан тыс ұсынылған биологиялық процесс терминдері бар модульдердің гендік экспрессиясының салмақты желілік талдауы.qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 және TanjilG_27015) арқылы талданған төрт генді бөлектеу үшін лигатура жеңілдетілді.
«GO: 0006355: Транскрипциялық реттеу, ДНҚ шаблондау» және антракнозға төзімділік кандидаты Lanr1 TanjilG_05042 генін тасымалдаушы артық көрсетілген биологиялық процесс термині бар модульдің гендік коэкспрессиясының салмақты желілік талдауы.TanjilG_05042 генін және орталық TanjilG_01212 генін оқшаулау үшін байлау жеңілдетілді.
Австралияда жиналған антракнозға төзімділік скринингі ерте босатылған сорттардың көпшілігінің сезімтал екенін көрсетті;Каля, Коромуп және Манделуп орташа төзімді деп сипатталған, ал Вонга, Танжил және 83A:476 жоғары төзімді деп сипатталған26,27,31.Lanr1 деп белгіленген бірдей қарсылық аллелі болды, ал Коромуп пен Манделупта AnMan10, 26, 39 деп белгіленген басқа аллель болды, ал Каля басқа аллельді берді., Lanr2.Германиядағы антракнозға төзімділікке скрининг нәтижесінде LanrBo36 деп белгіленген Lanr1-ден басқа кандидат аллелі бар Bo7212 төзімді сызығы анықталды.
Біздің зерттеуіміз тексерілген гермплазмада Lanr1 аллельінің өте төмен жиілігін (шамамен 6%) анықтады.Бұл бақылау Anseq3 және Anseq4 маркерлерінің көмегімен Шығыс Еуропалық гермплазманы скрининг нәтижелеріне сәйкес келеді, бұл Lanr1 аллелі тек екі беларусь сызығында бар екенін көрсетті.Бұл Lanr1 аллельінің жергілікті селекциялық бағдарламаларда әлі кеңінен қолданылмағанын көрсетеді, Австралиядан айырмашылығы, ол маркер көмегімен өсіру үшін негізгі аллельдердің бірі болып табылады.Бұл австралиялық есеппен салыстырғанда еуропалық өріс жағдайында Lanr1 аллелімен қамтамасыз етілген қарсылықтың төмен деңгейіне байланысты болуы мүмкін.Сонымен қатар, Австралиядағы жауын-шашын көп жерлерде антракнозды зерттеу Lanr1 аллелі арқылы жүргізілген қарсылық реакциялары патогеннің өсуі мен жылдам дамуына қолайлы ауа райы жағдайында тиімді болмауы мүмкін екенін көрсетті19,42.Шын мәнінде, осы зерттеуде антракноздың кейбір белгілері Lanr1 аллелі бар генотиптерде де байқалды, бұл қарсылық C. lupini дамуы үшін оңтайлы жағдайларда жойылуы мүмкін деген болжам жасайды.Сонымен қатар, Lanr1 локусынан шамамен 1 см қашықтықта орналасқан Anseq3 және Anseq4 маркерлерінің болуы туралы жалған оң интерпретациялар мүмкін 28,30,43 .
Біздің зерттеуіміз көрсеткендей, Lanr1 аллелі бар 83A:476 бірінші талданған уақыт нүктесінде (6 а.к.) ауқымды транскриптомды қайта бағдарламалау арқылы C. lupini инокуляциясына жауап берді, ал AnMan аллелі бар Манделупта транскриптомиялық жауаптар әлдеқайда кейінірек байқалды.(24-тен 48 а.к. дейін).Қорғаныс жауаптарындағы бұл уақытша ауытқулар ауру белгілерінің айырмашылығымен байланысты, төзімділікке сәтті жауап беру үшін патогенді ерте танудың маңыздылығын көрсетеді.Өсімдік тінін жұқтыру үшін сібір жарасының споралары иесінің бетінде бірнеше даму сатыларынан өтуі керек, соның ішінде өну, жасушаның бөлінуі және аппрессориум түзілуі.Қосымша - иесінің бетіне жабысатын және иесінің тіндеріне енуін жеңілдететін инфекциялық құрылым.Сонымен, бұршақ сығындысындағы C. gloeosporioides споралары 75-90 минут инкубациядан кейін ядроның бірінші бөлінуін, 90-120 минуттан кейін ұрық түтігінің пайда болуын және 4 сағаттан кейін басылуын көрсетті 45 .Mango C. gloeosporioides 3 сағат инкубациядан кейін 40%-дан астам конидиальды өнгіштік пен 4 сағаттан кейін 20%-ға жуық апппрессорлардың түзілуін көрсетті.C. gloeosporioides вирусының вируленттілікпен байланысты CAP20 гені 4 сағат 46 минуттан кейін CAP20 ақуызының жоғары концентрациясы бар авокадо бетінің балауызында 3,5 сағат инкубациялаудан кейін эпифит түзетін конидияларда транскрипциялық белсенділікті көрсетті.Сол сияқты, C. trifolii меланин биосинтезі гендерінің белсенділігі 2 сағаттық инкубация кезінде индукцияланды, содан кейін 1 сағаттан кейін аппрессориум түзілді.Жапырақ ұлпаларын зерттеу көрсеткендей, C. acutatum егілген құлпынай 8 л.с., ал C. коккодтарымен егілген қызанақ 4 с.б.48,49 бірінші басуды алады.негізінен Colletotrichum spp уақыт шкаласына сәйкес келеді.инфекциялық процесс.83A:476-ға жылдам қорғаныс жауаптары осы жолға өсімдік төзімділігі мен эффектор-триггерленген иммунитет (ETI) гендерінің қатысуын болжайды, ал Манделуптың кешіктірілген жауаптары микро-ассоциацияланған молекулалық үлгі-триггерленген иммунитет (MTI) гипотезасын қолдайды 50. 83A-ға ерте жауаптар: 476 және Mandelup.Кешіктірілген жауаптағы жоғары немесе төмен реттелетін гендер арасындағы ішінара қабаттасу да осы тұжырымдаманы қолдайды, өйткені ETI көбінесе анафилактикалық шок деп аталатын инфекция орнында бағдарламаланған жасуша өлімімен аяқталатын жеделдетілген және күшейтілген MTI реакциясы болып саналады 51,52 .
Ген онтологиясы GO:0006952 «Қорғаныс реакциясы» шамадан тыс ұсынылған терминіне жатқызылған гендердің көпшілігі стресстен туындаған аштық хабарының 22 протеинінің (SAM22-ге ұқсас) 11 гомологы және жеті негізгі латекс протеиніне ұқсас (MLP) болып табылады.- 31, 34, 43 және 423 тәрізді белоктар реттілік ұқсастығын көрсетті.SAM22 тәріздес гендер антракнозға төзімділіктің жоғарылау деңгейін көрсететін (83A:476 және Boregine) ұзаққа созылған айтарлықтай белсендіруді көрсетті.Дегенмен, MLP тәрізді гендер кандидаттық қарсылық аллелі бар сызықтарда ғана төмендетілді (83A:476/Lanr1 6 а.к. және Mandelup/AnMan 24 а.к.).Барлық анықталған SAM22 тәрізді гомологтар шамамен 105 кб ауқымды қамтитын гендік кластерден, ал MLP тәрізді гендер геномның жекелеген аймақтарынан шыққанын атап өткен жөн.Мұндай SAM22-тәрізді гендердің үйлестірілген активтенуі Diaporthetoxica егуіне NLL төзімділігі туралы алдыңғы зерттеуімізде де табылды, бұл олардың қорғаныс реакциясының көлденең құрамдас бөліктеріне қатысатынын болжайды.Бұл қорытынды сонымен қатар SAM22 тәрізді гендердің жарақатқа немесе салицил қышқылымен, саңырауқұлақ индукторларымен немесе сутегі асқын тотығымен емдеуге оң реакциясы туралы есептермен расталады.
MLP тәрізді гендер әртүрлі абиотикалық және биотикалық стресстерге, соның ішінде көптеген өсімдіктер түрлеріндегі бактериялық, вирустық және патогенді саңырауқұлақ инфекцияларына жауап беретіні көрсетілген55.Өсімдіктер мен қоздырғыштардың белгілі өзара әрекеттесуіне жауап беру бағыттары күшті жоғарылаудан (яғни, мақтаны Verticillium dahliae инвазиясы кезінде) айтарлықтай төмендеуіне дейін (яғни, алма ағашының Alternaria spp. жұқтыруынан кейін) 56,57 болды.F. niger инфекциясына авокадо қорғанысы кезінде және алма ағашының Botryosphaeria berengeriana f жұқтырылуы кезінде MLP-тәрізді 423 генінің айтарлықтай төмендеуі байқалды.cn.piricola және Alternaria alternata алма патотиптеріне жатады58,59.Сонымен қатар, MLP-тәрізді 423 генін шамадан тыс экспрессиялайтын алма каллдары төзімділікпен байланысты гендердің экспрессиясы төмен болды және саңырауқұлақ инфекциясына көбірек сезімтал болды59.Fusarium oxysporum f-дан кейін MLP-тәрізді 423 гені төзімді қарапайым бұршақ ұрықтарында да басылған.cn.Бұршақ инфекциясы 60.
Біздің RNA-seq зерттеуімізде анықталған PR-10 отбасының басқа мүшелері жоғары реттеуге жауап ретінде LlR18A және LlR18B гендері, сондай-ақ DIR1 липидті тасымалдау ақуызы үшін жоғары реттелетін (1 ген) немесе төмендетілген (3 ген) гені болды..Сонымен қатар, WGCNA LlR18B генін осы модульдегі хаб ретінде көрсетеді, ол вакцинацияға өте сезімтал және бірнеше қорғаныс реакциясы гендерін алып жүреді.LlR18A және LlR18B гендері патогендік бактерияларға жауап ретінде сары люпин жапырақтарында, сондай-ақ D. toxica егілгеннен кейін NLL сабақтарында индукцияланды, ал бұл гендердің күріш гомологы, RSOsPR10, саңырауқұлақ инфекциясы арқылы жылдам индукцияланған, мүмкін, жасмоникалық қышқыл, гендік гендік қышқыл, D162. Жүйелік жүре пайда болған резистенттіліктің (SAR) басталуы үшін қажет цификалық липидті тасымалдау ақуыздары.Қорғаныс реакцияларының дамуымен DIR1 протеині инфекция ошағынан флоэма арқылы алыстағы органдарда АҚҚ индукциялау үшін тасымалданады.Бір қызығы, TanjilG_02313 DIR1 гені 84A:476 және Популяция 22660 жолдарында бірінші уақыт нүктесінде айтарлықтай индукцияланған, бірақ антракнозға төзімділік тек 84A:476 жолында сәтті дамыды.Бұл NLL-де DIR1 генінің кейбір субфункциялануын көрсетуі мүмкін, өйткені қалған үш гомолог тек 83A:476 жолында 6 л.с. күшімен егуге жауап берді және бұл жауап төменге бағытталған.
Біздің зерттеуімізде «GO:0055114 Тотығу-тотықсыздану процесі» деп аталатын биологиялық процеске сәйкес келетін ең көп таралған компоненттер Р450 цитохромы ақуызы, пероксидаза, линол қышқылы 9S-/13S-липоксигеназа және 1-аминоциклопропан-1-карбон қышқылы оксидазасы болды.Сонымен қатар, біздің WGCNA HSFA4a гомологын Lanr1 қарсылық генінің кандидаты TanjilG_05042 сияқты модульдерді тасымалдаушы хаб ретінде анықтайды.HSFA4a өсімдіктердегі ядролық транскрипцияның тотығу-тотықсыздануға тәуелді реттелуінің құрамдас бөлігі болып табылады.
Цитохром Р450 белоктары – ксенобиотиктердің, сондай-ақ гормондардың, май қышқылдарының, стеролдардың, жасуша қабырғасының құрамдас бөліктерінің, биополимерлердің және биосинтезін қоса алғанда, бастапқы және қайталама метаболизмде NADPH және/немесе O2-ге тәуелді гидроксилдену реакцияларын катализдейтін оксидоредуктазалар. 50 функциясы өзгертілген гомологтардың көп санына (37) және жоғары қарай қайта қарауды көрсететін нақты гендер арасындағы жауап үлгілеріндегі айырмашылықтарға байланысты -10,6 log2-ден (есептік өзгеріс) 5,7-ге дейін төмендеді..Осындай үлкен белок суперфамилиясындағы NLL гендерінің болжамды биологиялық функциясын түсіндіру үшін тек РНҚ-секв деректерін пайдалану өте алыпсатарлық болар еді.Дегенмен, кейбір P450 цитохромы гендері патогендік саңырауқұлақтарға немесе бактерияларға төзімділіктің жоғарылауымен, соның ішінде аллергиялық реакцияларға үлес қосатынын атап өткен жөн69,70,71.
ІІІ класс пероксидазалары өсімдіктердің өсуі мен дамуы кезіндегі метаболикалық процестердің кең ауқымына қатысатын, сондай-ақ тұздылық, құрғақшылық, жоғары жарық қарқындылығы және қоздырғыштардың шабуылы сияқты қоршаған ортаның стресстеріне жауап беретін көп функциялы өсімдік ферменттері болып табылады72.Пероксидазалар бірнеше өсімдік түрлерінің Anthracis-пен әрекеттесуіне қатысады, соның ішінде Stylosanthes humilis және C. gloeosporioides, Lens culinaris және C. truncatum, Phaseolus vulgaris және C. lindemuthianum, Cucumis sativus және C. lagenarium753,76,.Жауап өте жылдам, кейде тіпті 4 HPI кезінде саңырауқұлақтар өсімдік тініне енгенге дейін жүреді73.Пероксидаза гені D. toxica NLL егуіне де жауап берді.Тотығу жарылуын реттеуге немесе тотығу стрессін жоюға арналған типтік функцияларына қоса, пероксидазалар лигнификация, суббірлік немесе нақты қосылыстардың айқаспалы байланысы кезінде жасуша қабырғасының күшейтілуіне негізделген физикалық кедергілер жасау арқылы патогендердің өсуіне кедергі келтіруі мүмкін.Бұл функцияны кремнийде лигнин түзетін аниондық пероксидазаны кодтайтын TanjilG_03329 геніне жатқызуға болады, ол біздің зерттеуімізде 6 HPI деңгейінде 83A:476 төзімді сызығында айтарлықтай жоғары реттелді, бірақ жауап бермеген басқа штамдар мен уақыт нүктелерінде емес.
Линол қышқылының 9S-/13S-липоксигеназасы липидтер биосинтезінің тотығу жолының бірінші сатысы болып табылады78.Бұл жолдың өнімдері өсімдік қорғанысында көптеген функцияларға ие, соның ішінде каллоза мен пектин шөгінділерінің қалыптасуы арқылы жасуша қабырғасын нығайту және реактивті оттегі түрлерін өндіру арқылы тотығу стрессін реттеу79,80,81,82,83.Осы зерттеуде линол қышқылының 9S-/13S-липоксигеназаның экспрессиясы барлық штамдарда өзгерді, бірақ сезімтал популяцияда 22660, жоғарылау әртүрлі уақыт нүктелерінде басым болды, ал тұрақты Lanr1 және AnMan аллелі бар штаммдарда бұл оксилипиктердегі қорғаныс қабатының диверсификациясын атап көрсетеді.
Люпинмен егілгенде 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат оксидазасының (ACO) гомологы айтарлықтай жоғары (9 ген) немесе төмендетілген (2 ген) болды.Екі қоспағанда, бұл жауаптардың барлығы 6 а.к.83А:476 бойынша.ACO ақуыздары арқылы жүзеге асырылатын ферментативті реакция этилен өндірісіндегі жылдамдықты шектейтін қадам болып табылады және сондықтан жоғары деңгейде реттеледі84.Этилен - өсімдіктің дамуын реттеуде және абиотикалық және биотикалық стресс жағдайларына жауап беруде әртүрлі рөлдерді атқаратын өсімдік гормоны.ACO транскрипциясын индукциялау және этиленді сигнал беру жолын белсендіру реактивті оттегі түрлері мен фитоалексиндердің өндірісін реттеу арқылы күріштің oryzae гемибиотрофты саңырауқұлақтарына төзімділігін арттыруға қатысады.M. oryzae және C. lupini88,89 арасында табылған өте ұқсас жапырақ инфекциясы процесі, осы зерттеуде хабарланған 83A:476 жолындағы ACO гомологтарының айтарлықтай жоғарылауы фонында, NLL антракноза Этиленге төзімділік беру мүмкіндігін молекулалық жолдардағы сигналдық орталық қадамға ауыстырады.
Осы зерттеуде фотосинтезге байланысты көптеген гендердің ауқымды басылуы 83A:476-да 6 а.к. және Манделупта 48 а.к. және 22660 популяцияда байқалды.Бұл өзгерістердің көлемі мен дамуы деңгейге пропорционалды.Бұл тәжірибеде антракнозға төзімділік байқалды.Жақында патогендік бактериялар мен саңырауқұлақтарды қоса алғанда, өсімдіктер мен патогендердің өзара әрекеттесуінің бірнеше модельдерінде фотосинтезге байланысты транскрипттердің күшті және ерте репрессиясы туралы хабарланды.Асығыстық (кейбір өзара әрекеттесулерде 2 HPI-ден) және инфекцияға жауап ретінде фотосинтезге байланысты гендердің жаһандық басылуы реактивті оттегі түрлерінің орналасуына және олардың аллергиялық реакцияларға делдалдық жасау үшін салицил қышқылының жолымен өзара әрекеттесуіне негізделген өсімдік иммунитетін тудыруы мүмкін 90,94.
Қорытындылай келе, ең төзімді тегі үшін ұсынылған қорғаныс реакциясының механизмдері (83A:476) R гені арқылы патогенді жылдам тануды (мүмкін TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) және аллергиялық реакция арқылы салицил қышқылы мен этилен сигналын беруді, одан кейін ұзақ диапазонды орнатуды қамтиды.әрекеті DIR-1 протеинімен қамтамасыз етіледі.Айта кету керек, C. lupini инфекциясының биотрофиялық кезеңі өте қысқа (шамамен 2 күн), одан кейін некроздық өсу жүреді95.Бұл сатылар арасындағы ауысу некрозбен және иесі өсімдіктерде жоғары сезімталдық реакцияларының триггерлері ретінде әрекет ететін этилен-индукцияланатын ақуыздардың экспрессиясымен байланысты болуы мүмкін.Сондықтан биотрофиялық кезеңде C. lupini табысты ұстау үшін уақыт терезесі өте тар.83A:476-да 6 л.с. жылдамдықта байқалған тотығу-тотықсыздану және фотосинтезге байланысты гендердің қайта бағдарламалануы саңырауқұлақ гифаларының прогрессиясына сәйкес келеді және биотрофиялық кезеңде сәтті қорғаныс реакциясының дамуын хабарлайды.Манделуп пен 22660 популяциясының транскриптомиялық жауаптары некротикалық өсуге ауысар алдында саңырауқұлақты ұстау үшін тым кешіктірілуі мүмкін, алайда Манделуп 22660 популяциясына қарағанда тиімдірек болуы мүмкін, өйткені PR-10 протеинінің салыстырмалы түрде жылдам реттелуі көлденең төзімділікке ықпал етеді.
Канондық R генімен басқарылатын ETI бұршақтардың антракнозға төзімділігінің жалпы механизмі болып көрінеді.Осылайша, Medicago truncatula үлгісіндегі бұршақ тұқымдасында антракнозаға төзімділік TIR-NBS-LRR97 өсімдік R гені класының мүшесі болып табылатын RCT1 генімен берілген.Бұл ген сезімтал өсімдіктерге ауыстырылған кезде жоңышқада кең спектрлі антракнозға төзімділік береді.Кәдімгі бұршақта (P. vulgaris) осы уақытқа дейін антракнозға төзімділіктің жиырмадан астам гендері анықталды.Бұл гендердің кейбіреулері кез келген канондық R гендері жоқ аймақтарда кездеседі, бірақ басқалары TIR-NBS-LRRs99 қоса, NBS-LRR гендік кластерін тасымалдайтын хромосомалардың шетінде орналасқан.Жалпы геномдық SSR зерттеуі NBS-LRR генінің кәдімгі бұршақтағы антракнозға төзімділікпен байланысын растады.Канондық R гені ақ люпин 101 құрамындағы антракнозға төзімділіктің негізгі локусын алып жүретін геномдық аймақта да табылды.
Біздің жұмысымыз көрсеткендей, өсімдік инфекциясының ерте сатысында белсендірілген дереу қарсылық реакциясы (жақсырақ 12 а.кпи-ден кешіктірмей) тар жапырақты люпинді Collelotrichum lupini патогенді саңырауқұлақтары тудыратын антракноздан тиімді қорғайды.Жоғары өткізу қабілеттілігін секвенирлеуді қолдана отырып, біз Lanr1 және AnMan төзімділік гендері арқылы жүргізілген NLL өсімдіктеріндегі антракнозға төзімділік гендерінің дифференциалды экспрессиялық профильдерін көрсеттік.Табысты қорғаныс өсімдіктің патогенмен алғашқы байланысынан бірнеше сағат ішінде тотығу-тотықсыздануға, фотосинтезге және патогенезге қатысатын ақуыздардың гендерін мұқият жобалауды қамтиды.Ұқсас қорғаныс реакциялары, бірақ уақытында кешіктірілген, өсімдіктерді аурулардан қорғауда әлдеқайда тиімді емес.Lanr1 гені арқылы жүзеге асырылатын сібір жарасына төзімділік R генінің типтік жылдам реакциясына ұқсайды (эффектор-триггерленген иммунитет), ал AnMan гені, ең алдымен, көлденең жауап береді (микробпен байланысты молекулалық үлгі арқылы туындаған иммунитет), тұрақтылықтың қалыпты деңгейін қамтамасыз етеді.
Антракноз маркерлерін скрининг үшін пайдаланылатын 215 NLL сызығы 74 сорттан, айқастыру немесе өсіру арқылы алынған 60 жолдан, 5 мутанттан және 76 жабайы немесе түпнұсқалық микробтардан тұрды.Жолдар 17 елден, негізінен Польшадан (58), Испаниядан (47), Германиядан (27), Австралиядан (26), Ресейден (19), Беларусьтен (7), Италиядан (5) және басқа желілерден келді.10 елден.Жиынтықта сонымен қатар анықтамалық төзімді сызықтар бар: 83A:476, Lanr1 аллелі бар Танжил, Вонга және AnMan аллелі бар Манделуп.Жолдар Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Польша жүргізетін Еуропалық Люпиннің генетикалық ресурстары дерекқорынан алынды (қосымша S1 кесте).
Өсімдіктер бақыланатын жағдайларда өсірілді (фотопериод 16 сағат, күндізгі температура 25 ° C және түнде 18 ° C).Екі биологиялық көшірмеге талдау жасалды.ДНҚ хаттамаға сәйкес DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) көмегімен үш апталық жапырақтардан бөлініп алынды.Оқшауланған ДНҚ сапасы мен концентрациясы спектрофотометриялық әдістермен бағаланды (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, АҚШ).Антракнозға төзімділік AnMan генін белгілейтін AnManM1 маркері (cv. Mandelup алынған) және Lanr1 генінің жанындағы Anseq3 және Anseq4 маркерлері (cv. Tanjil алынған) 11,26,28 талданды.Төзімді аллель үшін гомозиготалар «1″, сезімтал – «0» және гетерозиготалар – 0,5 деп бағаланды.
AnManM1, AnSeq3 және AnSeq4 маркерлеріне скрининг нәтижелері және соңғы кейінгі тәжірибелер үшін тұқымдардың болуы негізінде антракнозға төзімділікті фенотиптеу үшін 50 NLL желісі таңдалды.Талдау күндізгі температура диапазоны 22°C және түнде 19°C болатын 14 сағаттық фотопериодпен компьютермен басқарылатын жылыжайда екі данада орындалды.Тұқым қабығы тым қатты болғандықтан тұқымның тыныштануына жол бермеу және біркелкі өнуін қамтамасыз ету үшін себу алдында тұқымдарды сызады (ұрықтың қарама-қарсы жағындағы тұқым қабығын өткір пышақпен кесіп тастайды).Өсімдіктер стерильді топырақпен (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Польша) құмыраларда (11 × 11 × 21 см) өсірілді.Егу 1999 жылы Верженицадағы (Үлкен Польша) алқапта өсірілген тар жапырақты люпин өсімдіктерінің сабақтарынан өсірілген Colletotrichum lupini Col-08 штаммымен (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) жүргізілді.Аудан алыңыз.Изоляттар 21 күн бойы қара жарық астында 20 ° C температурада SNA ортасында спора түзуді индукциялау үшін өсірілді.Егуден кейін төрт аптадан кейін, өсімдіктер 4-6 жапырақ кезеңіне жеткенде, егу 1 мл-ге 0,5 х 106 конидия концентрациясында конидия суспензиясымен бүрку арқылы жүргізілді.Өсімдіктерді егуден кейін конидийлердің өнуін және инфекция процесін жеңілдету үшін 24 сағат бойы қараңғы жерде шамамен 98% ылғалдылықта және 25 ° C температурада ұстады.Содан кейін өсімдіктер 14 сағаттық фотопериодта 22°C күндіз/түнде 19°C және 70% ылғалдылықта өсірілді.Аурудың көрсеткіші егуден кейін 22 күннен кейін жасалды және сабақтар мен жапырақтарда некротикалық зақымданулардың болуы немесе болмауына байланысты 0-ден (иммунды) 9-ға дейін (өте сезімтал) болды.Сонымен қатар, балл жинағаннан кейін өсімдіктердің салмағы өлшенді.Маркер генотиптері мен ауру фенотиптері арасындағы байланыс нүктелік екі ретті корреляция ретінде есептелді (антракнозға төзімділік фенотипін талдау үшін сызықтар жинағында гетерозиготалы маркерлердің болмауы).