Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Дәрі-дәрмекті сынау үшін жүректің физиологиялық ортасын дәл қайталай алатын сенімді in vitro жүйесі қажет.Адамның жүрек тінінің мәдениеті жүйелерінің шектеулі қолжетімділігі жүрек дәрілерінің әсерлерін дұрыс емес түсіндіруге әкелді.Мұнда біз жүрек тілімдерін электромеханикалық түрде ынталандыратын және жүрек циклінің систолалық және диастолалық фазалары кезінде физиологиялық созылудан өтетін жүрек тінінің культурасының үлгісін (CTCM) жасадық.12 күндік мәдениеттен кейін бұл тәсіл жүрек бөлімдерінің өміршеңдігін ішінара жақсартты, бірақ олардың құрылымдық тұтастығын толық сақтамады.Сондықтан шағын молекулалық скринингтен кейін біз ортамызға 100 нМ трийодтиронин (T3) және 1 мкм дексаметазон (Декс) қосу 12 күн бойы кесінділердің микроқұрылымын сақтағанын анықтадық.T3/Dex емдеуімен үйлесімде CTCM жүйесі транскрипциялық профильдерді, өміршеңдігін, метаболикалық белсенділікті және құрылымдық тұтастықты 12 күн бойы жаңа жүрек тінімен бірдей деңгейде сақтады.Сонымен қатар, культурадағы жүрек тінінің шамадан тыс созылуы гипертрофиялық жүрек сигналын тудырады, бұл CTCM-нің жүрек созылуынан туындаған гипертрофиялық жағдайларды имитациялау қабілетіне дәлелді қамтамасыз етеді.Қорытындылай келе, CTCM ұзақ уақыт бойы мәдениетте жүректің физиологиясы мен патофизиологиясын модельдей алады, бұл сенімді дәрілік скринингке мүмкіндік береді.
Клиникалық зерттеулерге дейін адам жүрегінің физиологиялық ортасын дәл қайталай алатын сенімді in vitro жүйелері қажет.Мұндай жүйелер өзгерген механикалық созылу, жүрек соғу жиілігі және электрофизиологиялық қасиеттерге ұқсауы керек.Жануарлар үлгілері әдетте жүрек физиологиясының скринингтік платформасы ретінде пайдаланылады, адамның жүрегіне есірткі әсерін көрсетуде сенімділігі шектеулі.1,2.Сайып келгенде, жүрек тінінің культурасының идеалды эксперименттік моделі (CTCM) адам жүрегінің физиологиясы мен патофизиологиясын дәл жаңғыртып, әртүрлі терапевтік және фармакологиялық араласулар үшін жоғары сезімтал және ерекше үлгі болып табылады3.Мұндай жүйенің болмауы жүрек жеткіліксіздігін емдеудің жаңа әдістерін ашуды шектейді4,5 және нарықтан шығудың негізгі себебі ретінде дәрілік кардиоуыттылыққа әкелді6.
Соңғы онжылдықта сегіз жүрек-қантамырлық емес препараттар клиникалық қолданудан алынып тасталды, себебі олар QT аралығының ұзаруын тудырады, бұл қарыншалық аритмияға және кенет өлімге әкеледі7.Осылайша, жүрек-қантамыр жүйесінің тиімділігі мен уыттылығын бағалау үшін сенімді клиникаға дейінгі скринингтік стратегияларға қажеттілік артып отыр.Дәрілік заттарды скринингте және уыттылық сынауында адам индукциялаған плюрипотентті бағаналы жасушадан алынған кардиомиоциттерді (hiPS-CM) жақында пайдалану бұл мәселені ішінара шешуге мүмкіндік береді.Дегенмен, hiPS-CMs жетілмеген табиғаты және жүрек тінінің көп жасушалы күрделілігінің болмауы бұл әдістің негізгі шектеулері болып табылады.Жақында жүргізілген зерттеулер бұл шектеуді ерте hiPS-CM қолдану арқылы жүрек тінінің гидрогельдерін спонтанды жиырылулар басталғаннан кейін көп ұзамай қалыптастыру және уақыт өте келе электрлік ынталандыруды біртіндеп арттыру арқылы ішінара жеңуге болатынын көрсетті.Дегенмен, бұл hiPS-CM микротіндерінде ересек миокардтың жетілген электрофизиологиялық және жиырылу қасиеттері жоқ.Сонымен қатар, адамның жүрек ұлпасы жасушадан тыс матрицалық ақуыздардың белгілі бір жиынтығымен өзара байланысқан эндотелий жасушаларын, нейрондарды және стромальды фибробласттарды қоса алғанда, әртүрлі жасуша түрлерінің гетерогенді қоспасынан тұратын күрделі құрылымға ие.Ересек сүтқоректілердің жүрегіндегі кардиомиоциттік емес популяциялардың гетерогенділігі 11,12,13 жеке жасуша түрлерін пайдалана отырып, жүрек тінін модельдеу үшін негізгі кедергі болып табылады.Бұл негізгі шектеулер физиологиялық және патологиялық жағдайларда интактілі миокард тінін өсіру әдістерін әзірлеудің маңыздылығын көрсетеді.
Адам жүрегінің өсірілген жұқа (300 мкм) кесінділері адам миокардының бүлінбеген перспективті үлгісі болып табылады.Бұл әдіс адамның жүрек тініне ұқсас толық 3D көп жасушалы жүйеге қол жеткізуді қамтамасыз етеді.Дегенмен, 2019 жылға дейін өсірілген жүрек бөлімдерін пайдалану қысқа (24 сағат) мәдениеттің сақталуымен шектелді.Бұл физикалық-механикалық созудың болмауы, ауа-сұйықтық интерфейсі және жүрек тінінің қажеттіліктерін қолдамайтын қарапайым ортаны пайдалану сияқты бірқатар факторларға байланысты.2019 жылы бірнеше зерттеу топтары жүрек тінінің мәдениеті жүйелеріне механикалық факторларды енгізу культура өмірін ұзартуға, жүрек экспрессиясын жақсартуға және жүрек патологиясын имитациялауға болатындығын көрсетті.17 және 18 екі талғампаз зерттеулер бір осьті механикалық жүктеме мәдениет кезінде жүрек фенотипіне оң әсер ететінін көрсетеді.Дегенмен, бұл зерттеулер жүрек циклінің динамикалық үш өлшемді физика-механикалық жүктемесін пайдаланбады, өйткені жүрек бөлімдері не изометриялық созылу күштерімен 17, не сызықтық ауксотоникалық жүктемемен 18 жүктелді.Тіндердің созылуының бұл әдістері көптеген жүрек гендерінің басылуына немесе анормальды созылу реакцияларымен байланысты гендердің шамадан тыс экспрессиясына әкелді.Атап айтқанда, Питулис және т.б.19 күш түрлендіргішінің кері байланысын және кернеу жетектерін пайдаланып, жүрек циклін қалпына келтіруге арналған динамикалық жүрек тілімінің мәдениет ваннасын әзірледі.Бұл жүйе in vitro жүрек циклін дәлірек модельдеуге мүмкіндік бергенімен, әдістің күрделілігі мен төмен өткізу қабілеті бұл жүйені қолдануды шектейді.Жақында біздің зертхана шошқа және адамның жүрек тінінің бөлімдерінің өміршеңдігін 6 күнге дейін сақтау үшін электрлік ынталандыруды және оңтайландырылған ортаны қолданатын оңайлатылған культура жүйесін әзірледі20,21.
Ағымдағы қолжазбада біз жүрек циклі кезінде үш өлшемді жүрек физиологиясын және патофизиологиялық созылуды қайталау үшін гуморальды белгілерді қамтитын шошқа жүрегінің бөлімдерін пайдалана отырып, жүрек тінінің мәдениет үлгісін (CTCM) сипаттаймыз.Бұл CTCM дәрі-дәрмектің клиникаға дейінгі сынағы үшін сүтқоректілер жүрегінің физиологиясын/патофизиологиясын имитациялайтын үнемді, орташа өнімділік жүрек жүйесін қамтамасыз ету арқылы клиникаға дейінгі дәрілік болжамның дәлдігін бұрын-соңды болмаған деңгейге дейін арттыра алады.
Гемодинамикалық механикалық сигналдар in vitro 22,23,24 кардиомиоциттердің қызметін қолдауда маңызды рөл атқарады.Диастола кезінде тіндердің шамадан тыс созылуын болдырмау үшін тіннің өлшемін 25%-ға ұлғайту үшін 3D басып шығару құрылғысы пайдаланылды (1б-сурет).
a Құрылғының культура камерасының ішіндегі көк түспен көрсетілген 7 мм тірек сақинасына ұлпа бөлігін бекітіңіз.Культуралық камера ауа камерасынан жұқа иілгіш силиконды мембранамен бөлінген.Ағып кетпес үшін әр камераның арасына тығыздағышты қойыңыз.Құрылғының қақпағында электрлік ынталандыруды қамтамасыз ететін графит электродтары бар.b Үлкен тіндік құрылғының, бағыттаушы сақинаның және тірек сақинасының схемалық көрінісі.Тіндердің кесінділері (қоңыр) аспаптың сыртқы жиегіндегі ойыққа орналастырылған бағыттаушы сақинамен үлкен өлшемді құрылғыға орналастырылады.Бағыттауыштың көмегімен тіндік акрил желімімен қапталған тірек сақинасын жүрек тінінің кесіндісіне мұқият орналастырыңыз.c Бағдарламаланатын пневматикалық жетек (PPD) арқылы басқарылатын ауа камерасының қысымының функциясы ретінде электрлік ынталандыру уақытын көрсететін график.Қысым сенсорлары арқылы электрлік ынталандыруды синхрондау үшін деректерді жинау құрылғысы пайдаланылды.Мәдениет камерасындағы қысым белгіленген шекке жеткенде, электрлік ынталандыруды іске қосу үшін импульстік сигнал C-PACE-EM-ге жіберіледі.d Инкубатор сөресінде орналасқан төрт CTCM кескіні.Әрбір құрылғы алты ұлпа бөлімінен тұрады.
Бір пневматикалық жетекті пайдалана отырып, біз 4 CTCM құрылғысын басқара алдық, олардың әрқайсысы 6 ұлпа секциясын ұстай алады (сурет 1d).CTCM-де ауа камерасындағы ауа қысымы сұйықтық камерасындағы синхронды қысымға айналады және жүрек тілігінің физиологиялық кеңеюін тудырады (2а-сурет және 1-қосымша фильм).80 мм Hg кезінде тіндердің созылуын бағалау.Өнер.ұлпа кесінділерінің 25%-ға созылуын көрсетті (2б-сурет).Бұл пайыздық созылу жүрек секциясының қалыпты жиырылу қабілеті үшін физиологиялық саркомера ұзындығы 2,2–2,3 мкм сәйкес келетіні көрсетілген17,19,25.Тіндердің қозғалысы реттелетін камера параметрлері арқылы бағаланды (қосымша 1-сурет).Жиырылу және босаңсу кезіндегі жүрек тінінің созылуы мен жылдамдығы мәдениетте 12 күн бойы тұрақты болып қалды (2f-сурет).Жүректің сол бөлімі (2f-сурет).
Ауа камерасының қысымының, сұйықтық камерасының қысымының және тіндердің қозғалысы өлшемдерінің репрезентативті іздері камера қысымының сұйықтық камерасының қысымын өзгертіп, тін тілігінің сәйкес қозғалысын тудыратынын растайды.b пайыздық созылу (көк) пайыздық созылу (қызғылт сары) сәйкес келетін ұлпа бөлімдерінің репрезентативті іздері.c Жүрек тілігінің өлшенген қозғалысы өлшенген қозғалыс жылдамдығына сәйкес келеді.(d) Жүректің бір бөлігіндегі циклдік қозғалыстың (көк сызық) және жылдамдықтың (қызғылт сары нүктелі сызық) репрезентативті траекториялары.e Цикл уақытының сандық көрсеткіші (әр топқа n = 19 тілім, әр түрлі шошқалардан), жиырылу уақыты (n = әр топқа 19 тілім), релаксация уақыты (n = әр топқа 19 тілім, әртүрлі шошқалардан), тіндердің қозғалысы (n = 25).тілімдер)/әртүрлі шошқалардан алынған топ), ең жоғары систолалық жылдамдық (n = 24(D0), 25(D12) әр түрлі шошқалардан алынған тілімдер/топ) және ең жоғары релаксация жылдамдығы (n=24(D0), 25(D12) әр түрлі шошқалардан алынған тілімдер/топ).Екі жақты Студенттің t-тесті ешбір параметрде айтарлықтай айырмашылықты көрсетпеді.f Электрлік стимуляциясы бар (қызыл) және жоқ (көк) ұлпа бөлімдерінің штаммдарының репрезентативті талдауы, сол секциядағы ұлпа бөлімдерінің он аймақтық аймағы. (n = 8 тілім/топ әр түрлі шошқалардан, Екі құйрықты студент t-сынағы орындалады; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 тілім/топ әр түрлі шошқалардан, Екі құйрықты студент t-сынағы орындалады; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 бөлім/әртүрлі шошқалардан алынған топ, екі құйрықты Студенттің t-сынағы; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，*5）0. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，*5）0. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, екі жақты критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 бөлім/топ, әр түрлі шошқалардан, екі құйрықты Студенттің t-сынағы; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Қате жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Біздің алдыңғы статикалық биомиметикалық жүрек тілімдерін өсіру жүйесінде [20, 21] біз электрлік ынталандыруды қолдану және орта құрамын оңтайландыру арқылы жүрек кесектерінің өміршеңдігін, функциясын және құрылымдық тұтастығын 6 күн бойы сақтадық.Алайда 10 күннен кейін бұл көрсеткіштер күрт төмендеді.Біз алдыңғы статикалық биомиметикалық культура жүйесінде 20, 21 бақылау шарттарында (Ctrl) өсірілген бөлімдерге сілтеме жасаймыз және біз бұрын оңтайландырылған ортаны MC шарттары және бір мезгілде механикалық және электрлік ынталандыру (CTCM) жағдайында мәдениет ретінде қолданамыз.деп аталады.Біріншіден, біз электрлік ынталандырусыз механикалық ынталандыру тіндердің өміршеңдігін 6 күн бойы сақтау үшін жеткіліксіз екенін анықтадық (Қосымша сурет 3a, b).Бір қызығы, STCM көмегімен физикалық-механикалық және электрлік ынталандыруды енгізу арқылы 12 күндік жүрек бөлімдерінің өміршеңдігі MS жағдайында жаңа жүрек бөлімдеріндегідей болды, бірақ MTT талдауы көрсеткендей Ctrl жағдайында емес (1-сурет).3a).Бұл жүрек циклін механикалық ынталандыру және модельдеу тіндік бөлімдерді біздің алдыңғы статикалық мәдениет жүйемізде көрсетілгеннен екі есе ұзақ өміршеңдігін сақтай алатынын көрсетеді.Дегенмен, жүрек тропонин T және коннексин 43 иммунотаңбалауы арқылы тін бөліктерінің құрылымдық тұтастығын бағалау коннексин 43 экспрессиясының сол күні бақылау тобына қарағанда MC тіндерінде 12-ші күні айтарлықтай жоғары екенін көрсетті.Дегенмен, біркелкі коннексин 43 өрнегі және Z-дискінің қалыптасуы толығымен сақталмады (3б-сурет).Біз тіннің құрылымдық тұтастығын26 сандық бағалау үшін жасанды интеллект (AI) құрылымын, локализация күші тұрғысынан жүрек тілімдерінің құрылымдық тұтастығы мен флуоресценциясын автоматты түрде сандық анықтау үшін тропонин-Т және коннексинді бояуға43 негізделген кескінге негізделген терең оқыту құбырын қолданамыз.Бұл әдіс анықтамада сипатталғандай автоматтандырылған және бейтарап түрде жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сенімді түрде анықтау үшін конволюционды нейрондық желіні (CNN) және терең оқыту негізін пайдаланады.26. MC тінінің статикалық бақылау бөлімдерімен салыстырғанда 0-күнге жақсартылған құрылымдық ұқсастығын көрсетті.Сонымен қатар, Массонның трихромды бояуы культураның 12-ші күніндегі бақылау жағдайларымен салыстырғанда MS жағдайында фиброздың айтарлықтай төмен пайызын анықтады (3c-сурет).CTCM 12-ші күні жүрек тінінің бөлімдерінің өміршеңдігін жаңа жүрек тініне ұқсас деңгейге дейін арттырғанымен, ол жүрек бөлімдерінің құрылымдық тұтастығын айтарлықтай жақсартпады.
Бағаналы диаграмма статикалық культурада (D12 Ctrl) немесе CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12/MC) 12 күн бойына жаңа жүрек тілімдерінің (D0) немесе жүрек тілімдері культурасының MTT өміршеңдігінің сандық көрсеткіштерін көрсетеді. D0-мен салыстырғанда 0,0001 және D12 Ctrl-мен салыстырғанда **p < 0,01). Бағаналы диаграмма статикалық культурада (D12 Ctrl) немесе CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 pi/NOVA) 12 күн бойы жаңа жүрек тілімдерінің (D0) немесе жүрек тілімдері культурасының 12 күн бойы өміршеңдігінің сандық көрсеткішін көрсетеді. D0-мен салыстырғанда < 0,0001 және D12 Ctrl-мен салыстырғанда **p < 0,01).гистограмма статикалық культурада (D12 бақылау) немесе CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 бақылау). ) ) ), 12 (D12 MC) MTT жаңа жүрек бөлімдерінің 12 күн бойына өміршеңдігінің сандық көрсеткішін немесе жүрек бөлімдерінің культурасын көрсетеді.####p < 0,0001 по сравнению с D0 және **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0 салыстырғанда және **p < 0,01 D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12 Ctrl) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测#0#0#0#0#0.；，来自不同猪的12 (D12 MC) 猪的12 01，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12 Ctrl)(D12 Ctrl) 12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比；,####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相。＀**p)жаңа жүрек бөлімдеріндегі (D0) немесе статикалық культурада (D12 бақылау) немесе CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 бақылау)) , 12 (D12 MC) секцияларда/топта 12 күн бойы өсірілген жүрек бөлімдерінде 12 күн бойы өсірілген жүрек бөліктеріндегі (D0) немесе әртүрлі ANOVA сынағы сынамасын көрсететін гистограмма;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0 салыстырғанда, **p < 0,01 D12 Ctrl). Жасанды интеллект жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сандық бағалау (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) әр түрлі шошқалардан алынған кесек/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ####p <0,0001 D0 және D0.020-мен салыстырғанда C0.02-ге қарағанда). Жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сандық анықтауға арналған жасанды интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) секциялар/топтар әр түрлі шошқалар, бір жақты ANOVA сынағы; ####p<0.0001 және .D0 Салыстыру үшін C0120). c Массон трихром дақтарымен боялған жүрек тілімдері үшін репрезентативті кескіндер (сол жақта) және сандық анықтау (оң жақта) (масштабы жалаңаш = 500 мкм) (n = 10 тілім/топ әр түрлі шошқадан, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ####p < 0,0000 және D1-мен салыстырғанда ***p <0,0001 және D1). c Массон трихром дақтарымен боялған жүрек тілімдері үшін репрезентативті кескіндер (сол жақта) және сандық анықтау (оң жақта) (масштабы жалаңаш = 500 мкм) (n = 10 тілім/әр әр түрлі шошқалардан алынған топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; #### p < 0,0001 және D0,0001-мен салыстырғанда #### p < 0,0001 және ***01-мен салыстырғанда). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выпнолня тесті, pNO0#0#0; по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массон трихром бояуымен боялған жүрек бөлімдерінің репрезентативті кескіндері (сол жақта) және сандық көрсеткіші (оң жақта) (жабылмаған шкала = 500 мкм) (n = 10 секция/әртүрлі шошқалардан алынған топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; D0 және ***1tr салыстырғанда #### p < 0 .0001 C <1.0). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸（右）（裸（右）（裸m =（裸（右）（裸（0µn（裸尺0Ｚ伺切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，0.1*p ). C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度） 裸尺度度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova （0#0.0 p 测0#0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньова дисвиньи, протесно#; ## #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массон трихром бояуымен боялған жүрек бөлімдерінің репрезентативті кескіндері (сол жақта) және сандық көрсеткіші (оң жақта) (n = 10 секция/топ, әрқайсысы басқа шошқадан алынған, дисперсияның бір жақты талдауымен сыналған ;### # p < 0,0001 Dl0-мен салыстырғанда D10, ***p <0.1 салыстырғанда).Қате жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Біз қоректік ортаға шағын молекулаларды қосу арқылы кардиомиоциттердің тұтастығын жақсартуға және CTCM өсіру кезінде фиброздың дамуын азайтуға болатынын болжадық.Сондықтан біз шатастыратын факторлардың аздығына байланысты статикалық бақылау мәдениеттерімізді20,21 пайдалана отырып, шағын молекулаларды тексердік.Бұл экран үшін дексаметазон (Декс), трийодтиронин (T3) және SB431542 (SB) таңдалды.Бұл шағын молекулалар бұрын саркомер ұзындығын, Т-түтікшелерін және өткізгіштік жылдамдығын арттыру арқылы кардиомиоциттердің жетілуін индукциялау үшін hiPSC-CM дақылдарында қолданылған.Сонымен қатар, Dex (глюкокортикоид) және SB екеуі де қабынуды басатыны белгілі29,30.Сондықтан біз осы шағын молекулалардың біреуін немесе комбинациясын қосу жүрек бөлімдерінің құрылымдық тұтастығын жақсарта ма, жоқ па, соны тексердік.Бастапқы скрининг үшін әрбір қосылыстың дозасы жасуша культурасының үлгілерінде жиі қолданылатын концентрациялар негізінде таңдалды (1 μM Dex27, 100 nM T327 және 2,5 μM SB31).12 күндік мәдениеттен кейін T3 және Dex комбинациясы кардиомиоциттердің оңтайлы құрылымдық тұтастығына және минималды талшықты қайта құруға әкелді (қосымша 4 және 5 суреттер).Сонымен қатар, бұл T3 және Dex концентрацияларының екі еселенген немесе екі еселенген қолданылуы қалыпты концентрациялармен салыстырғанда зиянды әсерлер туғызды (Қосымша 6a, b сурет).
Бастапқы скринингтен кейін біз 4 культура жағдайын бетпе-бет салыстыруды орындадық (4а-сурет): Ctrl: оңтайландырылған ортаны пайдаланып, бұрын сипатталған статикалық мәдениетте өсірілген жүрек бөлімдері;20.21 TD: Сәрсенбіде T3 және Ctrl s Қосымша Dex;MC: бұрын оңтайландырылған ортаны пайдаланып CTCM-де өсірілген жүрек бөлімдері;және MT: ортаға қосылған T3 және Dex бар CTCM.12 күн өсіруден кейін MS және MT тіндерінің өміршеңдігі MTT талдауымен бағаланған жаңа тіндердегідей болды (4б-сурет).Бір қызығы, трансвелл культураларына (TD) T3 және Dex қосу Ctrl жағдайларымен салыстырғанда өміршеңдіктің айтарлықтай жақсаруына әкелмеді, бұл жүрек бөлімдерінің өміршеңдігін сақтауда механикалық ынталандырудың маңызды рөлін көрсетеді.
Механикалық ынталандырудың және T3/Dex қоспасының ортаға 12 күн бойы әсерін бағалау үшін пайдаланылатын төрт культура жағдайын бейнелейтін эксперименталды дизайн диаграммасы. b Бағаналы график жаңа жүрек тілімдерімен (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), 12 (D12 MC) 4 культура жағдайында (Ctrl, TD, MC және MT) салыстырғанда дақылдан кейінгі 12 күннен кейінгі өміршеңдіктің сандық көрсеткішін көрсетеді. 0,0001, D0-мен салыстырғанда ###p < 0,001 және D12 Ctrl-мен салыстырғанда **p < 0,01). b Бағаналы график жаңа жүрек тілімдерімен (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), 12 (D12 MC) 4 культура жағдайында (Ctrl, TD, MC және MT) салыстырғанда дақылдан кейінгі 12 күннен кейінгі өміршеңдіктің сандық көрсеткішін көрсетеді. 0,0001, D0 салыстырғанда ###p < 0,001 және D12 ctrl салыстырғанда **p < 0,01). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней культивирование всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC және MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = D0, D12) (D0, D12), 2 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 және **p < 0,01 по сравнению с D12). b Бағаналы график жаңа жүрек кесінділерімен (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), 12 (D12 MC және D12 MT), 12 (D12 MC) әр түрлі бөлімдерден алынған 4 культура жағдайында (бақылау, TD, MC және MT) салыстырғанда барлық 4 культура жағдайында (бақылау, TD, MC және MT) культурадан кейінгі 12 күндегі өміршеңдіктің сандық көрсеткішін көрсетеді. 0001, ###p < 0,001 қарсы D0 және **p < 0,01 бойынша D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (CD15)Dl) D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，##0#p <0,0001，##0#p <0.0.D12 MC .01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), от 2012 срезы, 2 разных) оронний тест ANOVA;####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Жаңа жүрек секцияларымен (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT)), әртүрлі шошқалардан алынған 12 (D12 MC) секциялар/топтар, бір жақты ANOVA сынағы (D0) салыстырғанда барлық 4 культура жағдайын (бақылау, TD, MC және MT) көрсететін гистограмма (D0) #0#0, бір жақты ANOVA сынағы #0#0. 0, **p<0,01 қарсы D12 бақылау). c Бағаналы график культурадан кейінгі 12 күн ішінде барлық 4 культура жағдайында (Ctrl, TD, MC және MT) жаңа жүрек тілімдерімен (D0) салыстырғанда глюкоза ағынының сандық көрсеткішін көрсетеді (n = 6 тілім/әртүрлі шошқалардан алынған топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ###p < 0,001 және ***p <1, D0-мен салыстырғанда C1.0). c Бағаналы график культурадан кейінгі 12 күн ішінде барлық 4 культура жағдайында (Ctrl, TD, MC және MT) жаңа жүрек тілімдерімен (D0) салыстырғанда глюкоза ағынының сандық көрсеткішін көрсетеді (n = 6 тілім/әртүрлі шошқалардан алынған топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ###p < 0,001 және ***p <1, D0-мен салыстырғанда C1.0). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы cherez 12 дней кейін культивирование всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезолевня), ся тест ANOVA;###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). C Гистограмма гистограмма, глюкоза ағынының (Control, TD, MC және MT) әр түрлі жүрекке (Close, TD, MC және MT), әр түрлі шошқалардан (D0) (N = 6 бөлімдер / топтар, бір жақты анова тестімен салыстырғанда; ### p <0.001 D12 CTRLмен салыстырғанда). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比所有4糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D01，与D0.0.01，与D0. trl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 新鲜 心脏 戇片 切片 切片 切片 切片养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， － AN ， 窍 养测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирование для всех 4 условий культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n/) или проведены тесты ANOVA;###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (бақылау). c Жаңа жүрек кесінділерімен (D0) салыстырғанда барлық 4 культура жағдайына (бақылау, TD, MC және MT) (n = 6 секция/топ, әртүрлі шошқалардан, бір жақты ANOVA сынақтары орындалды ма, ###p < 0,000, ***p <1 - бақылау D.0, ***01-мен салыстырғанда) салыстырғанда, өсіруден кейінгі 12 күндегі глюкоза ағынының сандық көрсеткішін көрсететін гистограмма.d Жаңа піскен (көк), 12 күн MC (жасыл) және 12 күн МТ (қызыл) тіндердің он аймақтық тін секциясының нүктелеріндегі штамм талдау учаскелері (n = 4 тілім/топ, бір жақты ANOVA сынағы; топтар арасында айтарлықтай айырмашылық болмады).e 10-12 күн ішінде статикалық жағдайларда (Ctrl) немесе MT жағдайында (MT) өсірілген жүрек бөлімдерімен салыстырғанда жаңа жүрек бөлімдеріндегі (D0) дифференциалды түрде экспрессияланған гендерді көрсететін жанартау сызбасы.f Әрбір мәдениет жағдайында өсірілген жүрек бөлімдері үшін саркомер гендерінің жылу картасы.Қате жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Май қышқылдарының тотығуынан гликолизге ауысуына метаболикалық тәуелділік кардиомиоциттердің дифференциациясының белгісі болып табылады.Пісіп жетілмеген кардиомиоциттер АТФ өндіру үшін ең алдымен глюкозаны пайдаланады және аздаған кристалдары бар гипопластикалық митохондрияларға ие болады5,32.Глюкозаны пайдалану талдаулары MC және MT жағдайында глюкозаны пайдалану 0-күндік ұлпалардағыға ұқсас екенін көрсетті (4c-сурет).Дегенмен, Ctrl үлгілері жаңа тінмен салыстырғанда глюкозаны пайдаланудың айтарлықтай артқанын көрсетті.Бұл CTCM және T3/Dex комбинациясы тіндердің өміршеңдігін арттыратынын және 12 күндік өсірілген жүрек бөлімдерінің метаболикалық фенотипін сақтайтынын көрсетеді.Сонымен қатар, штамм талдауы штамм деңгейлерінің MT және MS жағдайында 12 күн бойы жаңа жүрек тіндеріндегідей болғанын көрсетті (4d-сурет).
CTCM және T3/Dex-тің жүрек тілігі тінінің жаһандық транскрипциялық ландшафтына жалпы әсерін талдау үшін біз барлық төрт түрлі мәдениет жағдайында жүрек тілімдері бойынша RNAseq орындадық (Қосымша деректер 1).Бір қызығы, МТ бөлімдері жаңа жүрек тініне жоғары транскрипциялық ұқсастықты көрсетті, 13 642 геннің 16-сы ғана дифференциалды түрде экспрессияланған.Дегенмен, біз бұрын көрсеткендей, Ctrl тілімдері мәдениетте 10-12 күннен кейін 1229 дифференциалды түрде экспрессияланған гендерді көрсетті (4e-сурет).Бұл деректер жүрек және фибробласт гендерінің qRT-ПТР көмегімен расталды (Қосымша 7a-c сурет).Бір қызығы, Ctrl бөлімдері жүрек және жасушалық цикл гендерінің төмендеуін және қабыну гендік бағдарламаларының белсендірілуін көрсетті.Бұл деректер ұзақ мерзімді өсіруден кейін әдетте пайда болатын дифференциацияның MT жағдайында толығымен әлсірегенін көрсетеді (Қосымша 8a, b сурет).Саркомер гендерін мұқият зерттеу тек MT жағдайында ғана саркомерді кодтайтын гендер (4f-сурет) және иондық арнаны (Қосымша сурет 9) Ctrl, TD және MC жағдайларында басылудан қорғайтынын көрсетті.Бұл деректер механикалық және гуморальды ынталандырудың (T3/Dex) комбинациясы кезінде жүрек тілігінің транскриптомы культурада 12 күннен кейін жаңа жүрек тілімдері сияқты қалуы мүмкін екенін көрсетеді.
Бұл транскрипциялық тұжырымдар жүрек бөлімдеріндегі кардиомиоциттердің құрылымдық тұтастығы MT жағдайында 12 күн бойы жақсы сақталғандығымен расталады, бұл бұзылмаған және локализацияланған коннексин 43 (5а-сурет).Сонымен қатар, MT жағдайында жүрек бөлімдеріндегі фиброз Ctrl және жаңа жүрек бөлімдерімен салыстырғанда айтарлықтай төмендеді (Cурет 5b).Бұл деректер механикалық ынталандыру мен T3/Dex емдеудің үйлесімі мәдениеттегі жүрек бөлімдеріндегі жүрек құрылымын тиімді сақтайтынын көрсетеді.
a тропонин-Т (жасыл), коннексин 43 (қызыл) және DAPI (көк) репрезентативті иммунофлуоресценциялық суреттері жаңадан оқшауланған жүрек бөлімдерінде (D0) немесе жүрек секциясының барлық төрт культура жағдайында 12 күн бойы өсірілген (шкала жолағы = 100 мкм).). Жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын жасанды интеллектпен сандық анықтау (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) әр түрлі шошқалардан алынған кесек/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ####p < 0,000 және *01-ге дейін D0,000 *01, немесе *0.0. D12 Ctrl-мен салыстырғанда). Жасанды интеллектпен жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сандық анықтау (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) әр түрлі шошқалардан алынған кесек/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; #### p < 0,000 және *01-ге қарағанда D <0,0000 *01, немесе D12 MC және D12 MT) D12 Ctrl-мен салыстырғанда). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллект (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) срезов/группу от разных свиней, провеный pNO0, провеный p#0, A#0; равнению с D0 и *p < 0,05 немесе ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жасанды интеллект (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), әр түрлі шошқалардан алынған 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) секциялар/топтарды пайдалана отырып, жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сандық анықтау, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; #### p < 0,000 және *50.0-мен салыстырғанда D****0.0. D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 和D12）工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,000 相比，或****p < 0,000D对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 以缺缉智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 済0 書l 丈02p相比）.Бір жақты ANOVA сынағы арқылы әртүрлі шошқаларда (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) секциялар/топ) жасанды интеллект көмегімен жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сандық анықтау;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 немесе ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### D0 салыстырғанда p < 0,0001 және *p < 0,05 немесе ****p < 0,0001 D12 Ctrl). b Массон трихром дақтарымен боялған жүрек тілімдерінің репрезентативті кескіндері және сандық көрсеткіші (Масштаб жолағы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), 9 (D12 MT) тілім/топ әр түрлі шошқалардан алынған #NOVA#0 #п салыстырылды; D0 және ***p < 0,001 немесе D12 Ctrl салыстырғанда ****p < 0,0001). b Массон трихром дақтарымен боялған жүрек тілімдерінің репрезентативті кескіндері және сандық көрсеткіші (Масштаб жолағы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), 9 (D12 MT) тілім/топ әр түрлі шошқалардан алынған #NOVA#0 #п салыстырылды; D0 және ***p < 0,001 немесе D12 Ctrl салыстырғанда ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения және количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 TD және D12 в MT2), 9 (сыпах) ется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 және ***p < 0,001 немесе ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массон трихромды дақпен боялған жүрек бөлімдерінің репрезентативті кескіндері және сандық көрсеткіші (шкала жолағы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), әр түрлі шошқалардан алынған 9 (D12 MT) секциялар/топ, бір жақты ANOVA және ##00. қарсы орындалды. *** ##00. 001 немесе ****p < 0,0001 қарсы D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 мкм）1！lD1D1D））1！lD1D和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；###0**p <0.#0#0D p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 B 用 Массон . b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), 9 (D12 MT от VA), 9 (D12 MT және NO) ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 немесе ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массон трихромымен (шкала жолағы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), 9 (D12 MT) әртүрлі шошқалардан/топтардан алынған 9 (D12 MT) секциялар, бір ANOVA әдісі, бір ANOVA әдісімен Массон трихромымен (шкала жолағы = 500 мкм) боялған жүрек бөлімдерінің репрезентативті суреттері және сандық көрсеткіштері; ##0#0 немесе салыстырылған D#0#0. ****p < 0,0001 D12 Ctrl салыстырғанда).Қате жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Соңында, CTCM-нің жүрек гипертрофиясын имитациялау қабілеті жүрек тінінің созылуын арттыру арқылы бағаланды.CTCM-де ауа камерасының ең жоғары қысымы 80 мм-ден 80 мм-ге дейін көтерілді.Өнер.(қалыпты созылу) 140 мм сынап бағанасына дейін Арт.(6а-сурет).Бұл бұрын гипертрофияда байқалатын саркомер ұзындығына жету үшін жүрек бөлімдері үшін қажетті сәйкес пайыздық созылу ретінде көрсетілген созудың 32% ұлғаюына сәйкес келеді (6б-сурет).Жиырылу және босаңсу кезіндегі жүрек тінінің созылуы мен жылдамдығы мәдениеттің алты күнінде тұрақты болып қалды (6c-сурет).MT жағдайындағы жүрек тіндері алты күн бойы қалыпты созылу (MT (Қалыпты)) немесе шамадан тыс созылу жағдайларына (MT (OS)) ұшырады.Мәдениетте төрт күн өткеннен кейін NT-ProBNP гипертрофиялық биомаркері MT (қалыпты) жағдайлармен салыстырғанда MT (OS) жағдайында ортада айтарлықтай жоғарылады (7а-сурет).Сонымен қатар, алты күндік өсіруден кейін МТ (ОС) жасушаларының мөлшері (7б-сурет) МТ жүрек бөлімдерімен салыстырғанда (қалыпты) айтарлықтай өсті.Сонымен қатар, NFATC4 ядролық транслокациясы шамадан тыс созылған тіндерде айтарлықтай өсті (7c-сурет).Бұл нәтижелер гипердистензиядан кейін патологиялық қайта құрудың прогрессивті дамуын көрсетеді және CTCM құрылғысын созылудан туындаған жүрек гипертрофиясы сигналын зерттеу үшін платформа ретінде пайдалануға болатын тұжырымдаманы қолдайды.
Ауа камерасының қысымының, сұйықтық камерасының қысымының және тіндердің қозғалысы өлшемдерінің репрезентативті іздері камера қысымының сұйықтық камерасының қысымын өзгертіп, тін тілігінің сәйкес қозғалысын тудыратынын растайды.b Қалыпты созылған (қызғылт сары) және шамадан тыс созылған (көк) тін бөліктері үшін репрезентативті созылу пайызы және созылу жылдамдығының қисықтары.c Цикл уақытын көрсететін бағаналы график (n = әр топқа, әр түрлі шошқалардан), жиырылу уақытын (n = әр топқа 18-19 тілім, әртүрлі шошқалардан), релаксация уақытын (n = әр топқа 19 тілім, әртүрлі шошқалардан) ), тін қозғалысының амплитудасын (n = 14, әртүрлі шошқалардан) тілімдер/топ, әртүрлі шошқалардан) және ең жоғары релаксация жылдамдығы (n = 14 (D0), 15 (D6) ) секциялар/топтар) әртүрлі шошқалардан), екі құйрықты Студенттің t-сынағы ешқандай параметрде айтарлықтай айырмашылықты көрсетпеді, бұл осы параметрлердің шамадан тыс кернеумен культураның 6 күнінде тұрақты болғанын көрсетеді.Қате жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
a MT қалыпты созылу (Норм) немесе шамадан тыс созылу (OS) жағдайларында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm және D4 MTOS) культура ортасындағы NT-ProBNP концентрациясының жолақ сызбадағы сандық өлшемдері (N = 4 (D2 MTNorm және D4 MTOS) тілімдері/топтары қалыпты ANO01-ге дейін салыстырылды, екі қалыпты ANO01-ге дейін салыстырылды. tch). a MT қалыпты созылу (Норм) немесе шамадан тыс созылу (OS) жағдайында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm және D4 MTOS) кесінділер/топтар бойынша өсірілген жүрек тіліктерінен алынған қоректік ортадағы NT-ProBNP концентрациясының штрих-графигі сандық көрсеткіші қалыпты A2 0p және D4 MTOS кесінділері/топтарымен салыстырылды, екі A-0 п.** әр түрлі жолмен салыстырылады. созылу).Қалыпты MT созылу (норма) немесе шамадан тыс созылу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm және D4).MTOS) жағдайында өсірілген жүрек тіліктерінен қоректік ортадағы NT-ProBNP концентрациясының сандық гистограммасы, екі түрлі пигменттік талдаудан алынған екі диапазондық талдау;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p <0,01 қалыпты созылумен салыстырғанда). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差（伛游**比，p <0,01）。 a MT қалыпты созылу (Норм) немесе шамадан тыс созылу (OS) жағдайында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) әртүрлі 猪的切化化化取化化化化化化化北/猪的切）/ MT қалыпты созылу (Норм) немесе шамадан тыс созылу (OS) жағдайында өсірілген жүрек тіліктеріндегі NT-ProBNP концентрациясының сандық көрсеткіші.发发动; **қалыпты созылумен салыстырғанда, p <0,01).гистограмма Қалыпты MT созылу (норма) немесе шамадан тыс созылу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) және D4 MTOS) әртүрлі шошқалардан алынған кесінділер/топ жағдайында өсірілген жүрек тіліктеріндегі NT-ProBNP концентрацияларының сандық көрсеткіштері, екі жақты талдау;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p <0,01 қалыпты созылумен салыстырғанда). b Тропонин-T және WGA (сол жақта) және ұяшық өлшемін анықтау (оң жақта) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ұяшықтар/топ түрлі шошқалардан алынған 10 түрлі тілімдерден алынған, Екі құйрықты студент t-сынағы қалыпты ****01 салыстырғанда орындалды). b Тропонин-T және WGA (сол жақта) және жасуша өлшемін анықтау (оң жақта) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ұяшықтар/топ түрлі шошқалардың 10 түрлі тілімдері, Екі құйрықты студенттің t-stretch t****01 қалыпты салыстырылған). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) және количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm)) ится хвостовой t-критерий Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-T және AZP (сол жақта) және жасуша өлшемін анықтау (оң жақта) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) жасушалар/топ түрлі шошқалардың 10 түрлі секциялары, екі құйрықты Студенттің t-сынағы қалыпты ****00-ге дейін салыстырылды). B 用 肌钙 蛋白-蛋白 -t 和 WGA (左) 和 细胞 大小量化 大小量化 大小量化 的 的 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 (N = 330 (D6 MTO), 来自 不同 猪猪 10 个 切片 切片 切片 切片 切片 的 的 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 的 的 有尾 有尾 有尾 学生 学生 学生有尾 学生学生, 两两, 两两, 两, * 正常, **** p <0.0001). b Calcarein-T және WGA (сол жақта) және ұяшық өлшемі (оң жақта) боялған жүрек тілімдерінің репрезентативті кескіндері (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 түрлі тілімнен (D6 MTNorm)) Cells/组，两方组，两方t 攰tpar test ，****p <0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т және АЗП (слева) және количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 түрлі срезовниктер/ е критерий Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-T және AZP боялған жүрек бөлімдерінің репрезентативті суреттері (сол жақта) және жасуша өлшемін сандық анықтау (оң жақта) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) әр түрлі шошқалардан алынған 10 түрлі бөлімнен) Жасушалар/топ, екі құйрықты Студент критерийі;**** P <0.0001 қалыпты штамммен салыстырғанда). c Тропонин-T және NFATC4 үшін иммунотаңбаланған MTOS жүрек тілімдерінің 0-күні және 6-күні үшін репрезентативті кескіндер және NFATC4-тің CM ядроларына транслокациясының сандық көрсеткіші (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) әр түрлі шошқалардан алынған кесінділер/топтар, Екі жақты Студенттер орындалды *t <p0.0). c Тропонин-T және NFATC4 үшін иммунобелгіленген MTOS жүрек тілімдерінің 0-күні және 6-күні үшін репрезентативті кескіндер және NFATC4-тің CM ядроларына транслокациясын сандық анықтау (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) әр түрлі шошқалардан алынған кесек/топтар орындалды , Екі-п.0. Студенттік ;-0.0). c Срезов сердца 0 және 6 дней MTOS, тропонина-Т және NFATC4 үшін иммуномечены, және NFATC4 немесе ядра кавернозных клетоктағы количественная ценка транслокации NFATC4 (n = 4 (D0), 3D срезпулов срезововые MTOS, 3D) няется двусторонний t-критерий Стьюдента;*p < 0,05). c Тропонин-T және NFATC4 үшін иммунобелгіленген MTOS 0 және 6 күндеріндегі жүрек бөлімдерінің репрезентативті суреттері және кавернозды жасушалардың ядросындағы NFATC4 транслокациясының сандық көрсеткіші (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) тілімдері/топтары әртүрлі шошқалар) Студенттің екі құйрықты сынағы;*p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性白-T 和NFATC4的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟t ＀05 бет. С репрезидентатив АЦИИ NFatc4 в Ядраса см разнь свиней (N = 4 (D0), 3 (D6 MTO) СРЕЗ / ГРОПА, ДВА- ХВОСТАТYY T-КРИТЕРИЙ СТЬЮТЕРИЯ; * P <0,05). c 0 және 6-шы күндердегі MTOS жүрек тілімдерінің репрезентативті кескіндері тропонин-T және NFATC4 иммунотаңбалауы және әртүрлі шошқалардан алынған CM ядросындағы NFATC4 транслокациясының сандық көрсеткіштері (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) тілімдері/топ, екі құйрықты Студент *0.c. t.).Қате жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Бұл зерттеуде жүректің ультра жіңішке бөліктерін ынталандыруға болатын CTCM құрылғысы әзірленді және сипатталды.CTCM жүйесі физиологиялық синхрондалған электромеханикалық ынталандыруды және T3 және Dex сұйықтықты байытуды қамтиды.Шошқа жүрегінің бөлімдері осы факторларға әсер еткенде, олардың өміршеңдігі, құрылымдық тұтастығы, метаболикалық белсенділігі және транскрипциялық экспрессиясы 12 күн өсіргеннен кейін жаңа жүрек тініндегідей болып қалды.Сонымен қатар, жүрек тінінің шамадан тыс созылуы гиперэкстензиядан туындаған жүректің гипертрофиясын тудыруы мүмкін.Жалпы алғанда, бұл нәтижелер қалыпты жүрек фенотипін сақтаудағы физиологиялық мәдениет жағдайларының маңызды рөлін қолдайды және есірткі скринингі үшін платформаны қамтамасыз етеді.
Бұл факторлардың ең айқындары (1) жасушааралық өзара әрекеттесу, (2) электромеханикалық стимуляция, (3) гуморальды факторлар және (4) метаболикалық субстраттармен байланысты.Мұндай күрделі жасушалық өзара әрекеттесулерді in vitro жағдайында жасушалардың жеке түрлерін бірге өсіру арқылы қалпына келтіру қиын, бірақ жүрек бөлімдерінің органотиптік табиғатын пайдалану арқылы оңай қол жеткізуге болады.
Механикалық ынталандыру hiPSC-CM кондиционерлеу және жетілу үшін кеңінен қолданылғанымен, жақында бірнеше талғампаз зерттеулер бір осьті жүктемені пайдалана отырып, мәдениеттегі жүрек кесектерін механикалық ынталандыруға әрекет жасады.Бұл зерттеулерде жүрек бөлімдері не изометриялық созылу күштерімен17, сызықтық ауксотониялық жүктемемен18 жүктелді немесе жүрек циклі күш түрлендіргішінің кері байланысы мен кернеу жетектері арқылы қайта жасалды.Дегенмен, бұл әдістер қоршаған ортаны оңтайландырусыз бір осьті тіндердің созылуын пайдаланады, нәтижесінде көптеген жүрек гендерінің басылуына немесе анормальды созылу реакцияларымен байланысты гендердің шамадан тыс экспрессиясына әкеледі.Мұнда сипатталған CTCM цикл уақыты мен физиологиялық созылу (25% созылу, 40% систола, 60% диастола және минутына 72 соққы) тұрғысынан табиғи жүрек циклін имитациялайтын 3D электромеханикалық ынталандыруды қамтамасыз етеді.Бұл үш өлшемді механикалық ынталандырудың өзі тіннің тұтастығын сақтау үшін жеткіліксіз болғанымен, тіннің өміршеңдігін, функциясын және тұтастығын барабар қолдау үшін T3/Dex көмегімен гуморальды және механикалық ынталандырудың комбинациясы қажет.
Сонымен қатар, T3 ұрықтың СМ-дегі баяу жиырылатын миофибрилдермен салыстырғанда жетілген кардиомиоциттерде жылдам тартылатын миофибрилдердің түзілуіне ықпал ететін MHC-α экспрессиясын және MHC-β төмендеу реттелуіне ықпал етеді.Гипотиреозы бар науқастарда T3 тапшылығы миофибриллярлық жолақтардың жоғалуына және тонустың даму жылдамдығының төмендеуіне әкеледі37.Декс глюкокортикоидты рецепторларға әсер етеді және оқшауланған перфузиялық жүректерде миокардтың жиырылу қабілетін жоғарылататыны көрсетілген;38 бұл жақсарту кальций депозитіне негізделген кіруге (SOCE) әсермен байланысты деп есептеледі 39,40.Сонымен қатар, Dex оның рецепторларымен байланысып, иммундық функцияны және қабынуды басатын кең жасушаішілік жауап тудырады30.
Біздің нәтижелеріміз физикалық механикалық ынталандыру (MS) Ctrl-мен салыстырғанда жалпы мәдениет өнімділігін жақсартқанын, бірақ мәдениетте 12 күн ішінде өміршеңдігін, құрылымдық тұтастығын және жүрек экспрессиясын сақтай алмағанын көрсетеді.Ctrl-мен салыстырғанда, CTCM (MT) дақылдарына T3 және Dex қосу өміршеңдігін жақсартты және 12 күн бойы жаңа жүрек тінімен ұқсас транскрипция профильдерін, құрылымдық тұтастықты және метаболикалық белсенділікті сақтады.Сонымен қатар, тіндердің созылу дәрежесін бақылау арқылы STCM жүйесінің әмбебаптығын бейнелейтін STCM көмегімен гиперэкстензиядан туындаған жүрек гипертрофиясының үлгісі жасалды.Айта кету керек, жүректің қайта құрылуы мен фиброзына, әдетте, айналымдағы жасушалары тиісті цитокиндерді, сондай-ақ фагоцитозды және басқа да қайта құру факторларын қамтамасыз ете алатын бұзылмаған мүшелерді қамтыса да, жүрек бөліктері стресс пен жарақатқа жауап ретінде фиброздық процесті имитациялай алады.миофибробласттарға айналады.CTCM параметрлерін тахикардия, брадикардия және механикалық қан айналымын қолдау (механикалық жүктемесіз жүрек) сияқты көптеген жағдайларды имитациялау үшін қысымды/электрлік амплитуданы және жиілікті өзгерту арқылы модуляциялауға болатынын атап өткен жөн.CTCM-нің шамадан тыс жүктемеден туындаған жүрек гипертрофиясын модельдеу қабілеті осы жүйені жеке терапия үшін сынауға жол ашады.Қорытындылай келе, осы зерттеу механикалық созылу және гуморальды ынталандыру жүрек тінінің бөлімдерінің мәдениетін сақтау үшін маңызды екенін көрсетеді.
Мұнда келтірілген деректер CTCM интактілі миокардты модельдеу үшін өте перспективалы платформа екенін көрсетсе де, бұл өсіру әдісінің кейбір шектеулері бар.CTCM культурасының негізгі шектеуі оның кесінділерге үздіксіз динамикалық механикалық кернеулерді түсіруі болып табылады, бұл әрбір циклде жүрек тілімдерінің жиырылуын белсенді бақылау мүмкіндігін болдырмайды.Сонымен қатар, жүрек секцияларының (7 мм) шағын өлшемдеріне байланысты, дәстүрлі күш датчиктерін пайдалана отырып, культуралық жүйелерден тыс систолалық функцияны бағалау мүмкіндігі шектеулі.Дегенмен, бұл шектеу қосымша жұмысты қажет етеді және болашақта кальций мен кернеуге сезімтал бояғыштарды пайдаланып оптикалық карталау сияқты мәдениеттегі жүрек тілімдерінің функциясын оптикалық бақылау әдістерін енгізу арқылы шешілуі мүмкін.CTCM-нің тағы бір шектеуі - жұмыс моделі физиологиялық кернеуді (алдын ала және кейінгі жүктеме) манипуляцияламайды.CTCM-де өте үлкен тіндерде диастолада (толық созылу) және систоладағы (электрлік ынталандыру кезіндегі жиырылу ұзақтығы) 25% физиологиялық созылуды жаңғырту үшін қысым қарама-қарсы бағытта индукцияланды.Бұл шектеуді болашақ CTCM конструкцияларында екі жақтан жүрек тініне адекватты қысым жасау және жүрек камераларында пайда болатын қысым-көлем арақатынасын қолдану арқылы жою керек.
Бұл қолжазбада айтылған шамадан тыс созылудан туындаған қайта құру гипертрофиялық гиперсозылу сигналдарын имитациялаумен шектелген.Осылайша, бұл модель гуморальды немесе нейрондық факторларды қажет етпей (бұл жүйеде жоқ) созылған гипертрофиялық сигналдарды зерттеуге көмектесе алады.CTCM көптігін арттыру үшін қосымша зерттеулер қажет, мысалы, иммундық жасушалармен бірге өсіру, айналымдағы плазмалық гуморальды факторлар және нейрондық жасушалармен бірге өсіру кезінде иннервация CTCM көмегімен ауруды модельдеу мүмкіндіктерін жақсартады.
Бұл зерттеуде он үш шошқа қолданылды.Жануарларға қатысты барлық процедуралар институционалдық нұсқауларға сәйкес орындалды және Луисвилл университетінің жануарларды күту және пайдалану жөніндегі институттық комитетімен мақұлданды.Қолқа доғасы қысылып, жүрекке 1 л стерильді кардиоплегия (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 У/мл гепарин, рН 7.7. дейін) перфузияланды; жүректер әдетте <10 мин болатын мұзда зертханаға тасымалданғанға дейін мұзды салқын кардиоплегиялық ерітіндіде сақталды. жүректер әдетте <10 мин болатын мұзда зертханаға тасымалданғанға дейін мұзды салқын кардиоплегиялық ерітіндіде сақталды. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. жүректер мұздың үстіндегі зертханаға тасымалданғанға дейін мұздай кардиоплегиялық ерітіндіде сақталды, бұл әдетте <10 минутты алады. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин.
Диаметрі 7 мм сақина ортасында тығыздығы жоғары полиэтиленнен (HDPE) жасалған және астындағы баспа материалын тығыздау үшін қолданылатын силиконды тығыздағыш сақинаны орналастыру үшін тығыздағыш сақинасы бар.Жұқа кремнеземдік мембрана культура камерасын бөлу пластинасынан бөледі.Силиконды мембрана 0,02 дюймдік қалың силикон парақтан лазермен кесілген және қаттылығы 35А.Төменгі және үстіңгі силикон тығыздағыштар 1/16 дюймдік қалың силикон парақтан лазермен кесілген және қаттылығы 50А.316L тот баспайтын болаттан жасалған бұрандалар мен қанатты гайкалар блокты бекіту және ауа өткізбейтін тығыздағышты жасау үшін қолданылады.
Арнайы баспа схемасы (ПХД) C-PACE-EM жүйесімен біріктіру үшін жасалған.ПХД-дағы швейцариялық машина қосқышының розеткалары графит электродтарына күміс жалатылған мыс сымдармен және электродтарға бұрандалы 0-60 қола бұрандалармен қосылады.Баспа схемасы 3D принтерінің қақпағына орналастырылған.
CTCM құрылғысы жүрек цикліне ұқсас басқарылатын айналым қысымын жасайтын бағдарламаланатын пневматикалық жетек (PPD) арқылы басқарылады.Релаксацияның шыңында графит электродтары арқылы электрлік ынталандыру қолданылды, бұл ауа камерасындағы қысымды төмендетіп, тіндердің секцияларының жиырылуын тудырды.Құбырдың ішінде ауа жүйесіндегі қысымды анықтау үшін қысым сенсоры бар гемостатикалық клапан бар.Қысым сенсоры арқылы сезілетін қысым ноутбукке қосылған деректер жинағышқа қолданылады.Бұл газ камерасының ішіндегі қысымды үздіксіз бақылауға мүмкіндік береді.Камераның максималды қысымына жеткенде (стандартты 80 мм сынап бағанасы, 140 мм Hg ОЖ), деректерді жинау құрылғысына 4 В-қа орнатылған 2 мс үшін екі фазалы кернеу сигналын жасау үшін C-PACE-EM жүйесіне сигнал жіберуге бұйрық берілді.
Жүрек секциялары алынды және 6 шұңқырдағы культура жағдайлары келесідей орындалды: Жиналған жүректерді тасымалдау ыдысынан салқын (4° C) кардиоплегиясы бар науаға ауыстырыңыз.Сол жақ қарынша зарарсыздандырылған пышақпен оқшауланған және 1-2 см3 кесілген.Бұл тіндік блоктар тіндік желіммен тіндік тіректерге бекітіліп, құрамында Тирод ерітіндісі және үздіксіз оттегі бар (3 г/л 2,3-бутандион монооксим (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г) . ), (6 mM 400 г), ( 6 mM 48 м г) бар дірілдететін микротомды тіндік ваннаға орналастырылды. 6 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М ерітінді), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М ерітінді), 1 л ddH2O дейін).Дірілдейтін микротом 80 Гц жиілікте, көлденең діріл амплитудасы 2 мм және 0,03 мм/с жылдамдықпен қалыңдықтағы 300 мкм тілімдерді кесуге орнатылды.Тін матадан жасалған ваннаны мұзбен қоршап алу үшін қоршалған, салқын ұстау үшін, температура 4 ° C температурада ұсталды.Бір культуралық пластина үшін жеткілікті кесінділер алынғанша, микротомды ваннадан мұзда үздіксіз оттегі бар Тирод ерітіндісі бар инкубациялық ваннаға ұлпа бөліктерін тасымалдаңыз.Трансвелл культуралары үшін тіндердің кесінділері стерильді ені 6 мм полиуретанды тіректерге бекітіліп, 6 мл оңтайландырылған ортаға (199 орта, 1x ITS қосымшасы, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-сілтілі және 2X антибиотик-зеңге қарсы) орналастырылды.C-Pace арқылы тін бөліктеріне электрлік ынталандыру (10 В, жиілігі 1,2 Гц) қолданылды.TD жағдайлары үшін жаңа T3 және Dex 100 нМ және 1 мкМ әрбір орта өзгерісінде қосылды.Ортаны күніне 3 рет ауыстыру алдында оттегімен қанықтырады.Тіндердің кесінділері 37°C және 5% СО2 инкубаторында өсірілді.
Тіндердің бөліктерін тірек сақинасына бекіткеннен кейін, артық тін бөліктерін кесіп тастаңыз және бір құрылғы үшін жеткілікті бөліктер дайындалғанша, бекітілген тін бөліктерін мұздағы (4°C) мұздағы ерітінді ваннасына қайта салыңыз.Барлық құрылғыларға арналған жалпы өңдеу уақыты 2 сағаттан аспауы керек.CTCM Мәдениет камерасы 21 мл алдын-ала отталған ортаға алдын-ала толтырылған.Содан кейін тіндік тесікке басып, орнына ақырын басылған.CTCM құрылғылары инкубаторда 37 ° C және 5% CO2 мекен-жайында өңделген.
Жүрек кесектерінің созылған траекториясын алу үшін арнайы камера жүйесі жасалды.Көру ортаны жаңа ортаға ауыстырғаннан кейін бөлме температурасында орындалды.Камера 51° бұрышта орналасқан және бейне секундына 30 кадрмен жазылады.Біріншіден, ашық бастапқы бағдарламалық құрал (MUSCLEMOTION43) жүрек тілімдерінің қозғалысын сандық анықтау үшін Image-J көмегімен пайдаланылды.Маска MATLAB (MathWorks, Natick, MA, АҚШ) көмегімен шуды болдырмау үшін жүрек тілімдерін соғуға қызығушылық аймақтарын анықтау үшін жасалған.Қолмен сегменттелген маскалар кадр тізбегіндегі барлық кескіндерге қолданылады, содан кейін MUSCLEMOTION қосылатын модуліне жіберіледі.Бұлшықет қозғалысы әр кадрдағы пиксельдердің орташа қарқындылығын анықтайды, олардың қимылын анықтамалық жақтауға қатысты оның қозғалысын анықтайды.Деректер жазылды, сүзілді және цикл уақытын анықтау және жүрек циклі кезінде тіндердің созылуын бағалау үшін пайдаланылды.Жазылған бейне бірінші ретті нөлдік фазалық сандық сүзгіні қолдану арқылы кейінгі өңдеуден өтті.Тіндердің созылуын (төбеден шыңға) сандық бағалау үшін жазылған сигналдағы шыңдар мен ең төмен нүктелерді ажырату үшін шыңнан шыңға талдау жасалды.Сонымен қатар, сигналдың дрейфін жою үшін 6-ші ретті көпмүшенің көмегімен детрендинг орындалады.Бағдарлама коды MATLAB жүйесінде ұлпалардың ғаламдық қозғалысын, цикл уақытын, релаксация уақытын және жиырылу уақытын анықтау үшін әзірленді (Қосымша бағдарлама коды 44).
Штаммды талдау үшін механикалық созылуды бағалау үшін жасалған бірдей бейнелерді пайдалана отырып, біз алдымен MUSCLEMOTION бағдарламалық құралына сәйкес қозғалыс шыңдарын (ең жоғары (жоғарғы) және ең төменгі (төменгі) қозғалыс нүктелері) көрсететін екі кескінді қадағаладық.Содан кейін біз тіндердің аймақтарын сегменттедік және сегменттелген тінге көлеңкелеу алгоритмінің түрін қолдандық (қосымша 2a-сурет).Содан кейін сегменттелген ұлпа он жер асты қабатына бөлініп, әр беттегі кернеу келесі теңдеу арқылы есептелді: Штамм = (Sup-Sdown)/Sdown, мұндағы Sup және Sdown - сәйкесінше матаның жоғарғы және төменгі көлеңкелерінен пішіннің қашықтығы (Қосымша сурет .2b).
Жүрек кесінділері 4% параформальдегидте 48 сағат бойы бекітілді.Бекітілген тіндер 1 сағат ішінде 10% және 20% сахарозада, содан кейін түнде 30% сахарозада сусыздандырылды.Содан кейін кесінділер оңтайлы кесу температурасы қоспасына (OCT қоспасы) ендірілді және изопентанды/құрғақ мұз ваннасында біртіндеп мұздатады.OCT ендіру блоктарын бөлінгенге дейін -80 °C температурада сақтаңыз.Слайдтар қалыңдығы 8 мкм болатын кесінділер ретінде дайындалды.
Жүрек бөлімдерінен OCT алып тастау үшін слайдтарды қыздыру блогында 95 °C температурада 5 минут бойы қыздырыңыз.Әрбір слайдқа 1 мл PBS қосыңыз және бөлме температурасында 30 минут бойы инкубациялаңыз, содан кейін бөлме температурасында 15 минут бойы PBS ішінде 0,1% Triton-X орнату арқылы секцияларды өткізіңіз.Ерекше емес антиденелердің үлгіні байланыстыруын болдырмау үшін, слайдтарға 1 мл 3% BSA ерітіндісін 1 мл қосыңыз және бөлме температурасында 1 сағаттандырыңыз.Содан кейін BSA жойылды және слайдтар PBS көмегімен жуылды.Әр үлгіні қарындашпен белгілеңіз.
5 мкг/мл PBS құрамындағы WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) WGA бояуы үшін қолданылды және бөлме температурасында 30 минут бойы бекітілген бөліктерге қолданылды.Содан кейін слайдтар PBS-пен жуылды және vectashheld ендіру ортасы қосылды.Слайдтар Keyence микроскопында 40 есе ұлғайту арқылы көрсетілді.
OCT жоғарыда сипатталғандай үлгілерден жойылды.ОКТ-ны алып тастағаннан кейін, слайдтарды түні бойы Буин ерітіндісіне батырыңыз.Шаюсыз слайдтарды Oniline көк шешіміне 15 минутқа жіберіңіз.Фиброз аймағының пайызы Keyence Analyzer бағдарламалық құралының көмегімен сандық түрде анықталды.
CyQUANT™ MTT жасушаларының өміршеңдігін талдау (Invitrogen, Carlsbad, CA), каталог нөмірі V13154, кейбір өзгертулері бар өндірушінің хаттамасына сәйкес.Атап айтқанда, MTT талдауы кезінде тіндердің біркелкі мөлшерін қамтамасыз ету үшін диаметрі 6 мм болатын хирургиялық пуансон қолданылды.Тіндер өндірушінің хаттамасына сәйкес құрамында MTT субстраты бар 12 шұңқырлы пластинаның ұңғымаларына жеке-жеке салынды.Бөлімдер 37°С температурада 3 сағат бойы инкубацияланады және тірі ұлпа күлгін формазан қосылысын түзу үшін MTT субстратын метаболиздендіреді.МТТ ерітіндісін 1 мл DMSO-ға ауыстырыңыз және жүрек кесінділерінен күлгін формазанды алу үшін 37 °C температурада 15 минут инкубациялаңыз.Үлгілер DMSO-да 96 шұңқырлы мөлдір төменгі пластиналарда 1:10 сұйылтылған және күлгін түс қарқындылығы Цитация тақтасын оқу құралы (BioTek) арқылы 570 нм өлшенген.Көрсеткіштер жүректің әрбір тілімінің салмағына қалыпқа келтірілді.
Жүрек кесінділері бұрын сипатталғандай глюкозаны пайдалану талдауы үшін құрамында 1 мкСи/мл [5-3H]-глюкоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, АҚШ) бар медиамен ауыстырылды.4 сағат инкубациядан кейін 100 мкл 0,2 Н HCl бар ашық микроцентрифуга түтігіне 100 мкл ортаны қосыңыз.Содан кейін түтік 72 сағат бойы 37°C температурада [3H]2O булану үшін 500 мкл dH2O бар сцинтилляциялық түтікке орналастырылды.Содан кейін микроцентрифуга түтігін сцинтилляциялық түтіктен шығарып, 10 мл сцинтилляциялық сұйықтықты қосыңыз.Содан кейін глюкозаны пайдалану [5-3H]-глюкозаның спецификалық белсенділігін, толық емес тепе-теңдік пен фондық жағдайды, [5-3H]-таңбаланбаған глюкозаға сұйылтуды және сцинтилляцияны есептегіш тиімділігін ескере отырып есептелді.
Тризолда тіндерді гомогенизациялаудан кейін РНҚ өндірушінің хаттамасына сәйкес Qiagen miRNeasy Micro Kit # 210874 көмегімен жүрек бөліктерінен бөлініп алынды.RNAsec кітапханасын дайындау, секвенирлеу және деректерді талдау келесідей орындалды:
РНҚ кітапханасын дайындау үшін бастапқы материал ретінде бір үлгіге 1 мкг РНҚ пайдаланылды.Свалинг кітапханалары Өндірушінің ұсыныстарымен Илумина (NEB, USA) үшін NEBNEXT Ultratm RNNA кітапханасын қолдану арқылы жасалды және әр үлгі үшін атрибуттар тізбегіне индекс кодтары қосылды.Қысқаша айтқанда, мРНҚ поли-Т олигонуклеотидтерімен бекітілген магниттік моншақтарды пайдаланып, жалпы РНҚ-дан тазартылды.Фрагментация NEBNext Бірінші тізбекті синтездеу реакциясының буферінде (5X) жоғары температурада екі валентті катиондардың көмегімен жүзеге асырылады.Бірінші тізбекті cDNA кездейсоқ гексамер праймерлерін және M-MuLV кері транскриптазаны (RNase H-) пайдаланып синтезделді.Екінші рет CDNA, содан кейін ДНҚ полимеразы мен RNase H. көмегімен синтезделеді.ДНҚ фрагментінің 3 'аяғын аденилациядан кейін, оны будандастыруға дайындау үшін оған арналған LebNext адаптері оған арналған.Таңдаулы ұзындығы 150-200 бит кДНҚ фрагменттерін таңдау үшін.Кітапхана фрагменттері Ampure XP жүйесін (Бекман Култер, Беверли, АҚШ) қолдана отырып тазартылды.Содан кейін, 37 ° C температурада 37 ° C температурада, 37 ° C температурада, 37 ° C температурада, 37 ° C температурада қолданылған, 3 мкл қолданушы (NEB, USA)Содан кейін ПТР Phusion High-Fidelity ДНҚ полимеразасы, әмбебап ПТР праймерлері және Индекс (X) праймерлерімен орындалды.Соңында, ПТР өнімдері тазартылды (AMPure XP жүйесі) және кітапхана сапасы Agilent Bioanalyzer 2100 жүйесінде бағаланды.CDNA кітапханасы содан кейін NovaseQ-SWERSER көмегімен реттелді.Иллюзиядан алынған кескін файлдары Casava базасының негізгі қоңырауларын пайдаланып, шикі оқылымға ауыстырылды.RAW деректері оқу тізбегі мен сәйкес негізгі қасиеттері бар жылдам (FQ) форматтағы файлдарда сақталады.SSCROFA11.1 анықтамалық геномына сәйкес сүзілген реттілікті сәйкестендіру үшін ilsat2 таңдаңыз.Жалпы алғанда, chisat2 кез-келген мөлшердегі геномдарды, оның ішінде 4 миллиард базадан үлкен геномдарды қолдайды, ал көптеген параметрлер үшін әдепкі мәндер орнатылады.RNNA SEQ мәліметтерінен Sprine SEQ мәліметтері кез-келген басқа әдіспен бірдей немесе жақсы дәлдікпен Disat2 көмегімен сәйкестендірілуі мүмкін.
Транскрипттердің көптігі гендік өрнек деңгейінің деңгейін көрсетеді.Геннің өрнек деңгейлері геном немесе эксонсмен байланысты транскрипттердің (реттілік санының) көптігіне бағаланады.Оқу саны гендік өрнек деңгейлеріне, геннің ұзындығына және реттіліктен пропорционалды.Deseq2 пакетін қолдану арқылы дифференциалды өрнектердің дифференциалдық өрнектің (2 мың базалық жұпқа арналған фрагменттер) есептелді және дифференциалды өрнектің P-мәні анықталды.Содан кейін біз «P.Adjust» кіріктірілген R-функциясымен Benjamini-Hochberg әдісі арқылы (Benjamini-Hochberg әдісі арқылы жалған ашу жылдамдығын (FDR) есептейміз.
Жүрек бөлімдерінен бөлінген РНҚ Thermo (Thermo, кат. № 11756050) SuperScript IV Vilo Master қоспасы арқылы 200 нг/мкл концентрацияда cDNA-ға түрлендірілді.Сандық RT-ПТР Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 шұңқырлы мөлдір реакциялық пластинаны (Thermo, кат. № 4483319) және микроамп оптикалық желім (Thermo, кат. № 4311971) арқылы орындалды.Реакция қоспасы 5 мкл Taqman Fast Advanced Master қоспасынан (Thermo, cat № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer және ұңғымаға араластырылған 3,5 мкл H2O болды.Стандартты qPCR циклдері орындалды және CT мәндері Applied Biosystems Quantstudio 5 нақты уақыттағы ПТР құралының көмегімен өлшенді (384 ұңғылық модуль; өнім № A28135).Taqman праймерлері Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (S89629_u1), RGL1 (S89106) сатып алынды. 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss042415 гендік үлгідегі G CT мәндері қалыпты болды. APDH.
NT-ProBNP медиа шығарылымы өндірушінің хаттамасына сәйкес NT-ProBNP жинағы (шошқа) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) арқылы бағаланды.Қысқаша айтқанда, әрбір сынама мен стандарттың 250 мкл әр шұңқырға екі данада қосылды.Үлгіні қосқаннан кейін бірден әрбір ұңғымаға 50 мкл талдау реагенті А қосыңыз.Пластинаны және тығыздағышты жұмсақ шайқаңыз және тығыздағышпен шайқаңыз.Содан кейін таблеткалар 1 сағат бойы 37 ° C температурада инкубацияланды.Содан кейін ерітіндіні сорып алыңыз және ұңғымаларды 350 мкл 1X жуу ерітіндісімен 4 рет жуыңыз, жуу ерітіндісін әр жолы 1-2 минут инкубациялаңыз.Содан кейін әр ұңғымаға 100 мкл талдау реагенті B қосыңыз және пластиналық тығыздағышпен жабыңыз.Планшетті ақырын шайқап, 37°C температурада 30 минут бойы инкубациялады.Ерітіндіні сорып алыңыз және ұңғымаларды 350 мкл 1X жуу ерітіндісімен 5 рет жуыңыз.Әрбір ұңғымаға 90 мкл субстрат ерітіндісін құйып, пластинаны жабыңыз.10-20 минут ішінде табақты 37 ° C температурада инкубациялаңыз.Әр ұңғымаға 50 мкл таңдау шешімін қосыңыз.Пластина 450 нм-ге орнатылған Cytation (BioTek) пластина оқу құралы арқылы бірден өлшенді.
Проект талдары 80% қуатты таңдау үшін жүргізілді, ол 80% қуат береді, бұл параметрдің 10% абсолютті өзгеруін анықтауға арналған 5% қателіктер мен қателіктер жылдамдығы бар. Параметрдегі 10% абсолютті өзгерісті анықтау үшін >80% қуат беретін топ өлшемдерін таңдау үшін қуат талдаулары I типті қателік деңгейі 5% орындалды. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров, которые обеспечат >80% мощности үшін обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. 5% I типті қателік жылдамдығымен 10% абсолютті параметр өзгерісін анықтау үшін >80% қуат беретін топ өлшемдерін таңдау үшін қуат талдауы орындалды... Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности үшін обнаружения 10% абсолютного изменения параметров және 5% частоты ошибок типа I. 10% абсолютті параметр өзгерісін және 5% I типті қателік жылдамдығын анықтау үшін >80% қуат беретін топ өлшемін таңдау үшін қуат талдауы орындалды. Барлық статистика үшін p-мәндері <0,05 мәндерінде маңызды деп саналды. 对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Екі жақты Студенттің t-тесті деректерге тек 2 салыстыру арқылы орындалды.Бірнеше топтар арасындағы маңыздылықты анықтау үшін бір жақты немесе екі жақты ANOVA қолданылды.Пост hoc сынақтарын орындау кезінде көптеген салыстыруларды есепке алу үшін Tukey түзетуі қолданылды.
Зерттеу дизайны туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақалаға сілтеме жасалған Табиғатты зерттеу есебінің аннотациясын қараңыз.