សូមអរគុណសម្រាប់ការចូលមើល Nature.com.កំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានកម្រិតគាំទ្រសម្រាប់ CSS។ សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារដែលត្រូវគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្របន្ត យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript ។
morphogenesis ពោះវៀនរបស់មនុស្សបង្កើតលក្ខណៈពិសេស crypt-villus នៃស្ថាបត្យកម្ម 3D epithelial microarchitecture និង spatial organization។ រចនាសម្ព័នពិសេសនេះត្រូវបានទាមទារដើម្បីរក្សាលំនឹងនៃពោះវៀន ដោយការពារកោសិកាដើមនៅក្នុង basal crypt ពី exogenous microbial antigens និង metabolites របស់វា។លើសពីនេះទៅទៀត មុខងារ secretary នៃពោះវៀនដែលមានវត្តមាន mucus និង barliive ផ្សេងគ្នា។ ផ្ទៃ mucosal ពោះវៀន។ ដូច្នេះហើយ ការបង្កើតឡើងវិញនូវរចនាសម្ព័ន្ធ epithelial 3D គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការសាងសង់គំរូ in vitro gut ។ គួរកត់សម្គាល់ថា សរីរាង្គ mimetic gut-on-a-chip អាចបង្កើតឱ្យមាន morphogenesis 3D ដោយឯកឯងនៃ epithelium ពោះវៀន ជាមួយនឹងមុខងារសរីរវិទ្យាដែលប្រសើរឡើង។ morphogenesis ខាងក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប microfluidic ក៏ដូចជានៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់ដែលបានបង្កប់ Transwell។ យើងពិពណ៌នាអំពីវិធីសាស្រ្តលម្អិតសម្រាប់ការផលិតឧបករណ៍ ការដាំដុះ Caco-2 ឬកោសិកា epithelial organoid ពោះវៀននៅក្នុងការកំណត់ធម្មតា ក៏ដូចជានៅលើ microfluidic platform ការចាប់ផ្តើមនៃ morphothelial លក្ខណៈ 3D ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើង និង proposal morphogenesis 3D នេះ។ ការបង្កើតឡើងវិញនៃស្ថាបត្យកម្មពោះវៀនដែលមានមុខងារដោយការគ្រប់គ្រងលំហូរសារធាតុរាវ basolateral សម្រាប់ 5 ឃ។ វិធីសាស្ត្រ morphogenesis in vitro របស់យើងប្រើភាពតានតឹងផ្នែកសរីរវិទ្យា និងចលនាមេកានិច ហើយមិនត្រូវការវិស្វកម្មកោសិកាស្មុគស្មាញ ឬឧបាយកលដែលអាចដំណើរការលើសពីបច្ចេកទេសដែលមានស្រាប់ផ្សេងទៀត។ យើងស្រមៃថាពិធីសារដែលបានស្នើឡើងរបស់យើងអាចមានការធ្វើតេស្តហ្សែនក្នុងសហគមន៍ វិធីសាស្រ្ត 3D យ៉ាងទូលំទូលាយក្នុងការស្រាវជ្រាវ។ ស្រទាប់ lial នៅក្នុង vitro សម្រាប់កម្មវិធីជីវវេជ្ជសាស្ត្រ គ្លីនិក និងឱសថ។
ការពិសោធន៍បង្ហាញថាកោសិកា Caco-2 នៃពោះវៀនដែលត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុង gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ឬ bilayer microfluidic devices6,7 អាចឆ្លងកាត់ការ morphogenesis 3D ដោយឯកឯងនៅក្នុង vitro ដោយមិនមានការយល់ដឹងច្បាស់លាស់អំពីយន្តការមូលដ្ឋាន។ នៅក្នុងការសិក្សាថ្មីៗនេះរបស់យើង យើងបានរកឃើញថាឧបករណ៍ baso morphogenesis ចេញដោយឯកឯងពីផ្នែកខាងក្នុង និងចាំបាច់។ បង្កើត 3D epithelial morphogenesis in vitro ដែលត្រូវបានបង្ហាញដោយ Caco-2 និងសរីរាង្គពោះវៀនដែលបានមកពីអ្នកជំងឺ។កោសិកា Epithelial ត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានផ្តោតជាពិសេសលើការផលិតកោសិកា និងការចែកចាយកំហាប់នៃ Wnt antagonist ដ៏មានឥទ្ធិពល Dickkopf-1 (DKK-1) នៅក្នុង gut-on-a-chip និងឧបករណ៍ microfluidic ដែលបានកែប្រែដែលមានបញ្ចូល Transwell ដែលត្រូវបានគេហៅថា "Hybrid Chip"។ យើងបង្ហាញពីការបន្ថែម Knt-1 ដែលជា exogenists ប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងការកកិត 1 ឬ Soggy-1) ទៅនឹងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបរារាំង morphogenesis ឬរំខានដល់ស្រទាប់ epithelial 3D ដែលបានរៀបចំទុកជាមុន ដោយបង្ហាញថាភាពតានតឹងប្រឆាំងក្នុងអំឡុងពេលវប្បធម៌គឺទទួលខុសត្រូវចំពោះ morphogenesis ពោះវៀននៅក្នុង vitro។ ដូច្នេះហើយ វិធីសាស្រ្តជាក់ស្តែងមួយដើម្បីដកចេញនូវកម្រិតនៃ genesis យ៉ាងរឹងមាំ។ ist in the basolateral compartment by active flushing (ឧ. នៅក្នុង gut-on-a-chip or hybrid-on-a-chip platforms) ឬ diffusion .Basolateral media (ឧ. ពី Transwell បញ្ចូលទៅក្នុងអាងស្តុកទឹក basolateral ធំនៅក្នុងអណ្តូង)។
នៅក្នុងពិធីការនេះ យើងផ្តល់នូវវិធីសាស្រ្តលម្អិតសម្រាប់ការផលិត microdevices gut-on-a-chip និង Transwell-insertable hybrid chips (ជំហានទី 1-5) ទៅកាន់ cell epithelial intestinal cells នៅលើភ្នាស porous ដែលមានមូលដ្ឋានលើ polydimethylsiloxane (PDMS) (ជំហាន 6A, 7A, 8, 9B) និង polyesters (ជំហាន 6A, 7A, 8, 9) induced morphogenesis 3D in vitro (ជំហានទី 10)។ យើងក៏បានកំណត់លក្ខណៈកោសិកា និងម៉ូលេគុលដែលបង្ហាញពី histogenesis ជាក់លាក់នៃជាលិកា និងការខុសប្លែកគ្នានៃកោសិកាដែលអាស្រ័យតាមពូជពង្ស ដោយអនុវត្តទម្រង់រូបភាពច្រើន (ជំហានទី 11-24)។ យើងបង្កើត morphogenesis ដោយប្រើទម្រង់ពោះវៀនរបស់មនុស្ស ដូចជាកោសិកា intestinal ពីរ ឬកោសិកា Cathelial នៃវប្បធម៌។ ព័ត៌មានលម្អិតរួមទាំងការកែប្រែផ្ទៃនៃភ្នាស porous ការបង្កើត monolayers 2D និងជីវគីមីពោះវៀន និងការបន្តពូជនៃ microenvironment.in vitro.in vitro.ដើម្បីជំរុញឱ្យមាន morphogenesis 3D ពី monolayers epithelial 2D យើងបានដកចេញ morphogen antagonists នៅក្នុងទម្រង់វប្បធម៌ទាំងពីរដោយលំហូរផ្នែកមធ្យមនៃវប្បធម៌ចូលទៅក្នុងផ្នែកនៃ baso ។ ស្រទាប់ epithelial 3D ដែលអាចលុបបានដែលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីយកគំរូតាមការលូតលាស់នៃ epithelial ដែលពឹងផ្អែកលើ morphogen, សហវប្បធម៌របស់ម៉ាស៊ីន-microbiome បណ្តោយ, ការឆ្លងមេរោគ, របួសរលាក, ភាពមិនដំណើរការនៃរបាំង epithelial និងការព្យាបាលដោយប្រើ probiotics Example.influences ។
ពិធីការរបស់យើងអាចមានប្រយោជន៍សម្រាប់អ្នកវិទ្យាសាស្ត្រជាច្រើនក្នុងមូលដ្ឋាន (ឧ. ជីវវិទ្យា mucosal ពោះវៀន ជីវវិទ្យាកោសិកាដើម និងជីវវិទ្យានៃការអភិវឌ្ឍន៍) និងការស្រាវជ្រាវដែលបានអនុវត្ត (ឧទាហរណ៍ ការធ្វើតេស្តថ្នាំ preclinical គំរូជំងឺ វិស្វកម្មជាលិកា និងក្រពះពោះវៀន) ផលប៉ះពាល់យ៉ាងទូលំទូលាយ។ ដោយសារតែភាពអាចបន្តពូជបាន និងភាពរឹងមាំនៃកោសិកាបន្តពូជក្នុងកម្រិត 3 នៃប្រូសេស្តេរ៉ូនរបស់យើង vitro យើងស្រមៃថាយុទ្ធសាស្រ្តបច្ចេកទេសរបស់យើងអាចត្រូវបានផ្សព្វផ្សាយដល់ទស្សនិកជនដែលសិក្សាពីសក្ដានុពលនៃសញ្ញាកោសិកាអំឡុងពេលការវិវឌ្ឍន៍នៃពោះវៀន ការបង្កើតឡើងវិញ ឬ homeostasis។ លើសពីនេះ ពិធីសាររបស់យើងមានប្រយោជន៍សម្រាប់ការសួរចម្លើយការឆ្លងមេរោគក្រោមភ្នាក់ងារបង្ករោគផ្សេងៗដូចជា Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV, Salchomonella orffilest) .ទស្សនិកជននៃរោគសាស្ត្រ និងរោគវិទ្យាក៏មានប្រយោជន៍ផងដែរ។ ការប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធមីក្រូសរីរវិទ្យាពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបអាចអនុញ្ញាតឱ្យមានវប្បធម៌រួមបណ្តោយ 10 និងការវាយតម្លៃជាបន្តបន្ទាប់នៃការការពារម៉ាស៊ីន ការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំ និងការជួសជុលរបួសដែលទាក់ទងនឹងភ្នាក់ងារបង្ករោគនៅក្នុងការរលាកក្រពះពោះវៀន (GI) ផ្លូវ 11 .ជំងឺផ្សេងៗដែលទាក់ទងនឹងជំងឺ GI, ជំងឺដំបៅក្រពះ ជំងឺរលាកស្រោមខួរ ឬរោគសញ្ញាពោះវៀនដែលឆាប់ខឹង អាចត្រូវបានក្លែងបន្លំនៅពេលដែលស្រទាប់ epithelial ពោះវៀន 3D ត្រូវបានរៀបចំដោយប្រើស្រទាប់ epithelial ពោះវៀន 3D របស់អ្នកជំងឺ ជំងឺទាំងនេះរួមមានការ atrophy villous, បង្រួមខ្លី, ការខូចខាត mucosal, ឬ impaired epithelial barrier ។ បរិស្ថាន អ្នកអានអាចពិចារណាបន្ថែមប្រភេទកោសិកាដែលទាក់ទងនឹងជំងឺ ដូចជាកោសិកា mononuclear ឈាមគ្រឿងកុំព្យូទ័រ (PBMCs) ទៅនឹងគំរូដែលមានមីក្រូស្ថាបត្យកម្ម 3D intestinal villus-crypt ។កោសិកាភាពស៊ាំជាក់លាក់នៃជាលិកា, 5.
ដោយសារ microstructure epithelial 3D អាចត្រូវបានជួសជុល និងមើលឃើញដោយគ្មានដំណើរការផ្នែក អ្នកមើលដែលធ្វើការលើ spatial transcriptomics និងរូបភាពដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ ឬ super-resolution ប្រហែលជាចាប់អារម្មណ៍លើការគូសផែនទីរបស់យើងអំពីឌីណាមិក spatiotemporal នៃហ្សែន និងប្រូតេអ៊ីននៅលើ niches epithelial ។ចាប់អារម្មណ៍លើបច្ចេកវិទ្យា។ ការឆ្លើយតបទៅនឹងការរំញោចនៃអតិសុខុមប្រាណ ឬភាពស៊ាំ។ លើសពីនេះ មីក្រូប៊ីយ៉ូមឆ្លងតាមបណ្តោយ 10, 14 ដែលសម្របសម្រួលការរំលាយអាហារពោះវៀនអាចត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅក្នុងស្រទាប់ mucosal ពោះវៀន 3D ដោយការបង្កាត់ពូជអតិសុខុមប្រាណផ្សេងៗ សហគមន៍អតិសុខុមប្រាណ ឬ microbiota fecal-giopon ។នៅក្នុងវេទិកា។ វិធីសាស្រ្តនេះគឺមានភាពទាក់ទាញជាពិសេសចំពោះទស្សនិកជនដែលកំពុងសិក្សាអំពី mucosal immunology, gastroenterology, microbiome របស់មនុស្ស, culturomics និង microbiology គ្លីនិកដែលស្វែងរកការដាំដុះ microbiota gut uncultured ពីមុននៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍។ ប្រសិនបើ in vitro morphogenesis protocol របស់យើងអាចត្រូវបានសម្របខ្លួនទៅនឹងទម្រង់វប្បធម៌ plates 4 បន្តបន្ទាប់ 6, multi6 ជាបន្តបន្ទាប់។ ish basolateral compartments ពិធីការក៏អាចត្រូវបានផ្សព្វផ្សាយទៅកាន់អ្នកដែលកំពុងអភិវឌ្ឍឱសថ ជីវវេជ្ជសាស្រ្ដ ឬការពិនិត្យមើលតាមរយៈកម្រិតខ្ពស់ ឬវេទិកាបញ្ជាក់សុពលភាពសម្រាប់ឧស្សាហកម្មម្ហូបអាហារ។ ជាគោលការណ៍ភស្តុតាង យើងថ្មីៗនេះបានបង្ហាញពីលទ្ធភាពនៃការផលិត multiplex high-throughput morphogenesis system ដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបាន 4-multiple-1 organisation ។ ,17,18.ហេតុដូច្នេះហើយ សុពលភាពនៃវិធីសាស្ត្រ morphogenesis in vitro របស់យើងអាចត្រូវបានពន្លឿន និងអាចទទួលយកបានដោយមន្ទីរពិសោធន៍ស្រាវជ្រាវជាច្រើន ឧស្សាហកម្ម ឬរដ្ឋាភិបាល និងទីភ្នាក់ងារនិយតកម្ម ដើម្បីយល់ពីការសរសេរឡើងវិញកោសិកានៃកោសិកាពោះវៀនក្នុងកម្រិត transcriptomic ដើម្បីសាកល្បងថ្នាំ ឬជីវគីមីវិទ្យា ការស្រូបចូល និងដឹកជញ្ជូនតាមបែបពាណិជ្ជកម្ម ឬការប្រើប្រាស់ថ្នាំ surrogess 3 - គំរូបន្ទះឈីប ដើម្បីវាយតម្លៃលទ្ធភាពផលិតឡើងវិញនៃដំណើរការ morphogenesis ពោះវៀន។
ចំនួនមានកំណត់នៃគំរូពិសោធន៍ទាក់ទងនឹងមនុស្សត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សា morphogenesis នៃ epithelial ពោះវៀន ជាចម្បងដោយសារតែកង្វះនៃពិធីការដែលអាចអនុវត្តបានដើម្បីជំរុញឱ្យមាន morphogenesis 3D នៅក្នុង vitro។ តាមពិត ចំណេះដឹងបច្ចុប្បន្នភាគច្រើនអំពី morphogenesis ពោះវៀនគឺផ្អែកលើការសិក្សាអំពីសត្វ (ឧទាហរណ៍ zebrafish20, mice21H) ។ សំខាន់បំផុត មិនត្រូវកំណត់យ៉ាងជាក់លាក់នូវដំណើរការអភិវឌ្ឍរបស់មនុស្សទេ។ គំរូទាំងនេះក៏មានកម្រិតផងដែរនៅក្នុងសមត្ថភាពរបស់ពួកគេក្នុងការធ្វើតេស្តក្នុងលក្ខណៈដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបានច្រើនវិធី។ ដូច្នេះហើយ ពិធីសាររបស់យើងសម្រាប់ការបង្កើតឡើងវិញនូវរចនាសម្ព័ន្ធជាលិកា 3D នៅក្នុង vitro ដំណើរការប្រសើរជាងនៅក្នុងគំរូសត្វ vivo ក៏ដូចជាគំរូវប្បធម៌កោសិកា 2D បែបប្រពៃណីដទៃទៀត។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន រចនាសម្ព័ន្ធ 3D បានអនុញ្ញាតឱ្យយើងប្រើប្រាស់នូវរចនាសម្ព័ន្ធផ្សេងៗគ្នា។ កោសិកានៅក្នុងអ័ក្ស crypt-villus ក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការរំញោចផ្សេងៗនៃ mucosal ឬ immune ។ ស្រទាប់ epithelial 3D អាចផ្តល់កន្លែងមួយដើម្បីសិក្សាពីរបៀបដែលកោសិកា microbial ប្រកួតប្រជែងដើម្បីបង្កើត spatial niches និងការវិវត្តន៍នៃប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងកត្តាម៉ាស៊ីន (ឧទាហរណ៍ ខាងក្នុងធៀបនឹងស្រទាប់ស្លសខាងក្រៅ ការសំងាត់នៃ IgA និង antimicrobial ដែលអាចឱ្យយើងយល់បាននូវ peptide 3) ។ របៀបដែល microbiota ពោះវៀនរៀបចំសហគមន៍របស់វា និងផលិតសំយោគមេតាបូលីតរបស់អតិសុខុមប្រាណ (ឧ. អាស៊ីតខ្លាញ់ខ្សែសង្វាក់ខ្លី) ដែលបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធកោសិកា និងកោសិកាដើមនៅក្នុង basal crypts។ លក្ខណៈពិសេសទាំងនេះអាចបង្ហាញបានលុះត្រាតែស្រទាប់ epithelial 3D ត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅក្នុង vitro ។
បន្ថែមពីលើវិធីសាស្រ្តនៃការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធ epithelial ពោះវៀន 3D របស់យើង មានវិធីសាស្រ្តជាច្រើននៅក្នុង vitro ។ វប្បធម៌សរីរាង្គពោះវៀនគឺជាបច្ចេកទេសវិស្វកម្មជាលិកាដ៏ទំនើបដោយផ្អែកលើការដាំដុះកោសិកាដើមពោះវៀនក្រោមលក្ខខណ្ឌជាក់លាក់នៃសារធាតុ morphogen 23,24,25។ទោះជាយ៉ាងណា ការប្រើប្រាស់នៃ 3D organoid model ជាញឹកញាប់គឺការធ្វើមាតុភូមិនិយតកម្មសម្រាប់ការដឹកជញ្ជូន។ lumen ត្រូវបានរុំព័ទ្ធនៅក្នុងសរីរាង្គ ហើយដូច្នេះការណែនាំនៃសមាសធាតុ luminal ដូចជាកោសិកា microbial ឬ exogenous antigens ត្រូវបានកំណត់។ការចូលទៅកាន់ organoid lumens អាចត្រូវបានកែលម្អដោយប្រើ microinjector, 26,27 ប៉ុន្តែវិធីសាស្រ្តនេះគឺឈ្លានពាន និងពឹងផ្អែកលើកម្លាំងពលកម្ម ហើយទាមទារចំណេះដឹងឯកទេសដើម្បីអនុវត្ត។ លើសពីនេះ វប្បធម៌សរីរាង្គប្រពៃណីដែលរក្សានៅក្នុងរន្ទា hydrogel ក្រោមលក្ខខណ្ឌឋិតិវន្តមិនឆ្លុះបញ្ចាំងយ៉ាងត្រឹមត្រូវនូវសកម្មនៅក្នុង vivo biomechanics ទេ។
វិធីសាស្រ្តផ្សេងទៀតដែលប្រើប្រាស់ដោយក្រុមស្រាវជ្រាវជាច្រើនប្រើប្រាស់រន្ទា hydrogel 3D ដែលបានរៀបចំទុកជាមុនដើម្បីធ្វើត្រាប់តាមរចនាសម្ព័ន្ធនៃក្រពេញពោះវៀនដោយបណ្តុះកោសិកាពោះវៀនរបស់មនុស្សដាច់ដោយឡែកនៅលើផ្ទៃជែល។ បង្កើតរន្ទា hydrogel ដោយប្រើ 3D-printed, micro-milled, ឬ lithographically fabricated molds. នេះបង្ហាញពីការរៀបចំកោសិកាដែលពាក់ព័ន្ធដោយកោសិកាដែលពាក់ព័ន្ធ។ ជម្រាល morphogen បង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធ epithelial សមាមាត្រខ្ពស់ និង stroma-epithelial crosstalk ដោយការរួមបញ្ចូលកោសិកា stromal នៅក្នុងរន្ទា។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ធម្មជាតិនៃរន្ទាដែលបានរៀបចំទុកជាមុនអាចរារាំងការបង្ហាញនៃដំណើរការ morphogenetic ដោយឯកឯង។ គំរូទាំងនេះក៏មិនត្រូវការកោសិកា luminial fluid in interst ដែរ។ sis និងទទួលបានមុខងារសរីរវិទ្យា។ ការសិក្សាថ្មីមួយទៀតបានប្រើរន្ទា hydrogel នៅក្នុង microfluidic platform និងលំនាំនៃរចនាសម្ព័ន្ធ epithelial ពោះវៀនដោយប្រើប្រាស់បច្ចេកទេស laser-etching ។ Mouse intestinal organoids ធ្វើតាមលំនាំឆ្លាក់ដើម្បីបង្កើតជារចនាសម្ព័ន្ធបំពង់ពោះវៀន ហើយលំហូរសារធាតុរាវ intraluminal អាចត្រូវបាន recapitulated ដោយប្រើម៉ូឌុល microfluithere ដំណើរការ tic ក៏មិនរាប់បញ្ចូលចលនាមេកានិចនៃពោះវៀនដែរ។ បច្ចេកទេសបោះពុម្ព 3D ពីក្រុមតែមួយអាចបង្កើតបំពង់ពោះវៀនតូចៗជាមួយនឹងដំណើរការ morphogenetic ដោយឯកឯង។ ទោះបីជាមានការប្រឌិតស្មុគស្មាញនៃផ្នែកពោះវៀនផ្សេងៗគ្នានៅក្នុងបំពង់ក៏ដោយ ម៉ូដែលនេះក៏ខ្វះលំហូរសារធាតុរាវពន្លឺ និងការខូចទ្រង់ទ្រាយមេកានិកផងដែរ។ លើសពីនេះទៀត លក្ខខណ្ឌនៃដំណើរការបោះពុម្ព ឬដំណើរការពេញលេញនៃកោសិកាអាចមានកម្រិត។ ផ្ទុយទៅវិញ ពិធីការដែលបានស្នើឡើងរបស់យើង ផ្តល់នូវការបង្កើតកោសិកាពោះវៀនដោយឯកឯង ភាពតានតឹងផ្នែកសរីរវិទ្យាដែលពាក់ព័ន្ធ យន្តការជីវសាស្ត្រដែលធ្វើត្រាប់តាមចលនាពោះវៀន លទ្ធភាពប្រើប្រាស់នៃផ្នែក apical និង basolateral compartments និងការបង្កើតឡើងវិញនូវមីក្រូជីវសាស្ត្រស្មុគស្មាញនៃម៉ូឌុល។ ដូច្នេះហើយការរួមផ្សំគ្នានៃវីរ៉ុសតូរីស 3 របស់យើងអាចនឹងមាន វិធីសាស្រ្តដែលមានស្រាប់។
ពិធីការរបស់យើងគឺផ្តោតទាំងស្រុងលើ 3D epithelial morphogenesis ដោយមានកោសិកា epithelial តែមួយគត់នៅក្នុងវប្បធម៌ និងមិនមានប្រភេទផ្សេងទៀតនៃកោសិកាដែលនៅជុំវិញដូចជាកោសិកា mesenchymal កោសិកា endothelial និងកោសិកាភាពស៊ាំ។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន ស្នូលនៃពិធីការរបស់យើងគឺការបញ្ចូលកោសិកា epithelial morphogenesis ដោយការយកចេញនៃផ្នែកខាងក្នុងនៃ morphogen សម្ងាត់។ ម៉ូឌុលនៃ gut-on-a-chip និង hybrid-on-a-chip របស់យើងអនុញ្ញាតឱ្យយើងបង្កើតឡើងវិញនូវស្រទាប់ epithelial 3D undulating, ស្មុគស្មាញជីវសាស្រ្តបន្ថែមដូចជា epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) de deposition 35 ហើយនៅក្នុងគំរូរបស់យើង crypt conveys កោសិកាដែលនៅតែជាមុខងាររបស់កោសិកា។ (ឧ. fibroblasts) នៅក្នុង mesenchyme ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការផលិតប្រូតេអ៊ីន ECM និងបទប្បញ្ញត្តិនៃ morphogenesis ពោះវៀននៅក្នុង vivo35,37,38.ការបន្ថែមកោសិកា mesenchymal ទៅនឹងគំរូរបស់យើងបានបង្កើនដំណើរការ morphogenetic និងប្រសិទ្ធភាពនៃការភ្ជាប់កោសិកា។ ស្រទាប់ endothelial (ពោលគឺ capillaries ឬ lymphatics តួនាទីសំខាន់ 3 g) ដើរតួក្នុងការដឹកជញ្ជូន g. microenvironment.លើសពីនេះទៅទៀត សមាសធាតុ vasculature ដែលអាចភ្ជាប់គ្នារវាងគំរូជាលិកា គឺជាតម្រូវការជាមុន នៅពេលដែលគំរូជាលិកាត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីបង្ហាញពីអន្តរកម្មពហុសរីរាង្គ។ ដូច្នេះហើយ កោសិកា endothelial ប្រហែលជាត្រូវបញ្ចូល ដើម្បីយកគំរូតាមលក្ខណៈសរីរវិទ្យាដែលត្រឹមត្រូវជាងមុនជាមួយនឹងដំណោះស្រាយកម្រិតសរីរាង្គ។ កោសិកាភាពស៊ាំដែលបានមកពីអ្នកជំងឺក៏មានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការបង្ហាញនូវការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំ ភាពស៊ាំឆ្លងពីកំណើត និងភាពស៊ាំពីកំណើតផងដែរ។ ភាពស៊ាំ fic នៅក្នុងបរិបទនៃការធ្វើត្រាប់តាមជំងឺពោះវៀន។
ការប្រើប្រាស់បន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់គឺមានភាពត្រង់ជាងបន្ទះឈីប gut-on-a-chip ដោយសារតែការដំឡើងឧបករណ៍គឺសាមញ្ញជាង ហើយការប្រើប្រាស់ Transwell inserts អនុញ្ញាតឱ្យមានវប្បធម៌នៃ epithelium gut ដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបាន។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សិលាចារឹក Transwell ដែលអាចប្រើបានជាមួយភ្នាស polyester គឺមិនមានភាពយឺតទេ ហើយមិនអាចក្លែងធ្វើចលនាដូច peristaltic ។ លើសពីនេះទៅទៀត បន្ទះឈីបដែលដាក់នៅលើ transwell នេះនៅតែមិនមានដាក់នៅលើស្ថានីយ apical hybrid ។ ច្បាស់ណាស់ លក្ខណៈសម្បត្តិឋិតិវន្តនៅក្នុងផ្នែក apical កម្រនឹងអនុញ្ញាតឱ្យមានសហវប្បធម៌បាក់តេរីរយៈពេលវែងនៅក្នុងបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់។ ខណៈពេលដែលយើងអាចបង្កើត morphogenesis 3D យ៉ាងរឹងមាំនៅក្នុងការបញ្ចូល Transwell នៅពេលប្រើបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ កង្វះខាតនៃជីវមេកានិចដែលពាក់ព័ន្ធខាងសរីរវិទ្យា និងលទ្ធភាពនៃលំហូរនៃបន្ទះសៀគ្វី apical អាចកំណត់លំហូរនៃសារធាតុរាវ apical ។
ការស្ថាបនាឡើងវិញទ្រង់ទ្រាយពេញលេញនៃអ័ក្សគ្រីបវីឡារបស់មនុស្សនៅក្នុងវប្បធម៍ពោះវៀននៅលើឈីប និងកូនកាត់នៅលើឈីបមិនត្រូវបានបង្កើតឡើងពេញលេញទេ។ ចាប់តាំងពី morphogenesis ចាប់ផ្តើមពីស្រទាប់អេពីដេលីល ស្ថាបត្យកម្ម 3D មិនចាំបាច់ផ្តល់នូវភាពស្រដៀងគ្នាខាងសរីរវិទ្យាទៅនឹងការគ្រីបកោសិកាដែលបង្កើតជាលក្ខណៈកោសិកានៅក្នុងជីវិតរបស់ពួកយើង។ epithelium 3D ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយវិស្វកម្ម តំបន់គ្រីប និង villous មិនត្រូវបានកំណត់យ៉ាងច្បាស់ទេ។ ទោះបីជាបណ្តាញខាងលើខ្ពស់នៅលើបន្ទះឈីបនាំឱ្យកើនឡើងកម្ពស់នៃ epithelium microengineered ក៏ដោយ កម្ពស់អតិបរមានៅតែត្រូវបានកំណត់ត្រឹម ~ 300-400 µm។ ជម្រៅជាក់ស្តែងនៃពោះវៀនរបស់មនុស្សនៅក្នុងពោះវៀនតូច និងធំគឺ ~ 0µm និង 135 μm កម្ពស់ 135 μm។ ផ្ទះល្វែងគឺ ~ 600 µm41 ។
តាមទស្សនៈនៃរូបភាព ការថតរូបភាពគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៃមីក្រូស្ថាបត្យកម្ម 3D អាចត្រូវបានកំណត់ត្រឹមពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ដោយសារចម្ងាយការងារដែលត្រូវការពីកញ្ចក់វត្ថុបំណងទៅស្រទាប់ epithelial គឺស្ថិតនៅលំដាប់ពីរបីមិល្លីម៉ែត្រ។ ដើម្បីជម្នះបញ្ហានេះ គោលដៅឆ្ងាយអាចនឹងត្រូវបានទាមទារ។ លើសពីនេះ ការធ្វើឱ្យផ្នែកស្តើងនៃការរៀបចំ PD នឹងធ្វើឱ្យរូបភាពកាន់តែខ្ពស់ផងដែរ។ ដោយសារ microfabrication ស្រទាប់ដោយស្រទាប់នៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបពាក់ព័ន្ធនឹងការស្អិតជាប់គ្នាជាអចិន្ត្រៃយ៍រវាងស្រទាប់នីមួយៗ វាមានការលំបាកខ្លាំងណាស់ក្នុងការបើក ឬយកស្រទាប់ខាងលើចេញ ដើម្បីពិនិត្យមើលរចនាសម្ព័ន្ធផ្ទៃនៃស្រទាប់ epithelial។ ឧទាហរណ៍ ដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងស្កែន (SEM)។
hydrophobicity នៃ PDMS គឺជាកត្តាកំណត់ក្នុងការសិក្សាផ្អែកលើមីក្រូហ្វូលីកដែលទាក់ទងនឹងម៉ូលេគុលតូចៗ hydrophobic ចាប់តាំងពី PDMS អាចស្រូបយកម៉ូលេគុល hydrophobic បែបនេះដោយមិនជាក់លាក់។ ជម្មើសជំនួសចំពោះ PDMS អាចត្រូវបានពិចារណាជាមួយនឹងវត្ថុធាតុ polymeric ផ្សេងទៀត។ ជាជម្រើស ការកែប្រែផ្ទៃនៃ PDMS (ឧ. ថ្នាំកូតអេទីតទី 4 23 កូលលីក) (ឧ. កាត់បន្ថយការស្រូបយកម៉ូលេគុល hydrophobic ។
ជាចុងក្រោយ វិធីសាស្រ្តរបស់យើងមិនមានលក្ខណៈល្អទេ ទាក់ទងនឹងការផ្តល់ការបញ្ចាំងស្គ្រីនកម្រិតខ្ពស់ ឬវេទិកាពិសោធន៍ដែលងាយស្រួលប្រើសម្រាប់ "ទំហំមួយសម-ទាំងអស់"។ ពិធីការបច្ចុប្បន្នតម្រូវឱ្យមានម៉ាស៊ីនបូមទឹកសម្រាប់មីក្រូមួយ ដែលយកកន្លែងទំនេរនៅក្នុងធុងបំពងឧស្ម័នកាបូនិក និងការពារការពិសោធន៍ខ្នាតធំ។ ការកំណត់នេះអាចប្រសើរឡើងយ៉ាងខ្លាំងដោយការធ្វើមាត្រដ្ឋានថ្មី 28, eg8 ឬ scalability នៃវប្បធម៌ 3-9 ។ 4- រន្ធ porous ល្អដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានការបំពេញបន្ថែមជាបន្តបន្ទាប់និងការយកចេញនៃ basolateral media) ។
ដើម្បីបង្កើត 3D morphogenesis នៃ epithelium ពោះវៀនរបស់មនុស្សនៅក្នុង vitro យើងបានប្រើឧបករណ៍ពោះវៀនបន្ទះឈីប microfluidic ដែលមាន microchannels ប៉ារ៉ាឡែលពីរ និងភ្នាស porous បត់បែននៅចន្លោះដើម្បីបង្កើតចំណុចប្រទាក់ lumen-capillary ។ យើងក៏បង្ហាញពីការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ microfluidic ឆានែលតែមួយ (បន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់) ដែលផ្តល់លំហូរបន្តនៃ epithelium basilo ។ វេទិកាទាំងពីរ morphogenesis នៃកោសិកា epithelial ពោះវៀនផ្សេងៗរបស់មនុស្សអាចត្រូវបានបង្ហាញដោយអនុវត្តការរៀបចំទិសដៅនៃលំហូរដើម្បីយក morphogen antagonists ចេញពី basolateral compartment។ ដំណើរការពិសោធន៍ទាំងមូល (រូបភាពទី 1) មាន 5 ផ្នែក៖ (i) microfabrication នៃ gut chip ឬ Transwell insertable chip 1- hybrid (ប្រអប់ទី 1) ។ កោសិកា (កោសិកា Caco-2) ឬសរីរាង្គពោះវៀនរបស់មនុស្ស;ប្រអប់ 2-5), (iii) វប្បធម៌នៃកោសិកា epithelial ពោះវៀននៅលើបន្ទះសៀគ្វីពោះវៀន ឬបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ (ជំហានទី 6-9), (iv) ការចាប់ផ្តើមនៃ 3D morphogenesis in vitro (ជំហានទី 10) និង (v)) ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃ microstructure epithelial 3D (ជំហានទី 11-24 ដែលត្រូវបានរចនាយ៉ាងត្រឹមត្រូវតាមក្រុមខាងក្រោម) F ។ in vitro morphogenesis ដោយប្រៀបធៀប morphogenesis epithelial ទៅនឹង spatial, temporal, conditional, or procedural controls ។
យើងបានប្រើវេទិកាវប្បធម៌ពីរផ្សេងគ្នា៖ gut-on-a-chip ជាមួយនឹងបណ្តាញត្រង់ ឬ nonlinear convoluted channels ឬ chips hybrid ដែលមានបញ្ចូល Transwell (TW) in a microfluidic device, fabricated as described in Box 1, and step 1-5.” Device Fabrication” បង្ហាញពីជំហានសំខាន់ៗក្នុងការបង្កើត chip តែមួយ ឬ hybrid source of Ca-Cell ពន្យល់ពីប្រភពកោសិកា។ 2 ឬសរីរាង្គពោះវៀនរបស់មនុស្ស) និងនីតិវិធីវប្បធម៍ដែលប្រើក្នុងពិធីការនេះ។"In vitro morphogenesis" បង្ហាញពីជំហានរួមដែល Caco-2 ឬកោសិកា epithelial ដែលទទួលបានពីសរីរាង្គត្រូវបានដាំដុះនៅលើបន្ទះឈីបពោះវៀន ឬនៅលើ Transwell បញ្ចូលនៃបន្ទះឈីបកូនកាត់ អមដោយការបញ្ចូលនៃ 3D morphogenesis តួអក្សរខាងក្រោម និងរចនាសម្ព័ន្ធចំនួននៃកម្មវិធីនីមួយៗ។ ផ្តល់នូវឧទាហរណ៍នៃរបៀបដែលស្រទាប់ epithelial ពោះវៀនត្រូវបានបង្កើតឡើង អាចត្រូវបានប្រើ ឧទាហរណ៍ នៅក្នុងការកំណត់លក្ខណៈនៃភាពខុសគ្នានៃកោសិកា ការសិក្សាសរីរវិទ្យាពោះវៀន ការបង្កើតប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីមីក្រូជីវ និងគំរូជំងឺ។ រូបភាព Immunofluorescence នៅក្នុង "ភាពខុសគ្នានៃកោសិកា" ដែលបង្ហាញពីស្នូល, F-actin និង MUC2 ដែលបង្ហាញនៅក្នុងស្រទាប់ 3D នៃកោសិកា Cacout-2 ដែលកំពុងបង្កើតជាសញ្ញា។ និងទឹករំអិលដែលលាក់កំបាំងពីផ្ទៃ mucosal។ រូបភាព fluorescent នៅក្នុង Gut Physiology បង្ហាញពីទឹករំអិលដែលផលិតដោយការប្រឡាក់សម្រាប់អាស៊ីត sialic និងសំណល់ N-acetylglucosamine ដោយប្រើ fluorescent wheat germ agglutinin។ រូបភាពត្រួតស៊ីគ្នាពីរនៅក្នុង "Host-Microbe Co-Cultures" បង្ហាញតំណាង host-microbiome panel នៅក្នុង co-culture ។ ដោយមានប្រូតេអ៊ីន fluorescent ពណ៌បៃតង (GFP) ជាមួយនឹងកោសិកា epithelial 3D Caco-2 ដែលផលិតដោយមីក្រូវិស្វកម្ម។ បន្ទះខាងស្តាំបង្ហាញពីការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៃ GFP E. coli រួមជាមួយនឹងកោសិកា epithelial 3D Caco-2 អមដោយការប្រឡាក់ immunofluorescence ជាមួយ F-actin (ក្រហម) និង nuclei (បន្ទះសៀគ្វីពណ៌ខៀវ) ។ ជាមួយនឹងអង់ទីហ្សែនបាក់តេរី (ឧទាហរណ៍ lipopolysaccharide, LPS) និងកោសិកាភាពស៊ាំ (ឧទាហរណ៍ PBMC;ពណ៌បៃតង)) កោសិកា Caco-2 ត្រូវបានដាំដុះដើម្បីបង្កើតស្រទាប់ epithelial 3D។ Scale bar, 50 µm. រូបភាពនៅជួរខាងក្រោម៖ “ភាពខុសគ្នានៃកោសិកា” សម្របដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។2.សារព័ត៌មានសាកលវិទ្យាល័យ Oxford;ផលិតឡើងវិញដោយមានការអនុញ្ញាតពី Ref.5.NAS;“Host-Microbe Co-Culture” កែសម្រួលដោយមានការអនុញ្ញាតពី ref.3.NAS;"គំរូជំងឺ" ប្រែប្រួលដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង.5.NAS
ទាំងបន្ទះឈីប gut-on-chip និង hybrid chips ត្រូវបានប្រឌិតដោយប្រើ PDMS ចម្លងពីផ្សិត silicon ដោយ soft lithography1,44 និង patterned with SU-8. ការរចនានៃ microchannels នៅក្នុង chip នីមួយៗត្រូវបានកំណត់ដោយគិតគូរពី hydrodynamics ដូចជា shear stress និង hydrodynamic pressure1,4,12.The original gut-on-achi designd (F2) ដែលមាន 1 ទិន្នន័យ jupos-on-achi ។ ed parallel straight microchannels, បានវិវត្តទៅជាស្មុគស្មាញ gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) ដែលរួមបញ្ចូល microchannels កោងមួយគូ ដើម្បីជំរុញឱ្យមានការកើនឡើងនៃពេលវេលាស្នាក់នៅ fluid លំនាំលំហូរ nonlinear និង multiaxial deformation នៃ celld culture (Fig ។ 2a-f) 12.When complex bechips can be select a biochanics .យើងបានបង្ហាញថា បន្ទះឈីប Gut-Chip ដែលត្រូវបានបង្រួបបង្រួមក៏ជំរុញយ៉ាងខ្លាំងនូវ morphogenesis 3D នៅក្នុងពេលវេលាស្រដៀងគ្នា ជាមួយនឹងកម្រិតនៃការរីកលូតលាស់នៃ epithelial ស្រដៀងគ្នា បើប្រៀបធៀបទៅនឹង Gut-Chip ដើម ដោយមិនគិតពីប្រភេទកោសិកាដែលបានដាំដុះ។ ដូច្នេះហើយ ដើម្បីជម្រុញឱ្យមាន morphogenesis 3D, លីនេអ៊ែរ និងស្មុគស្មាញនៅលើបន្ទះឈីប gut designs ដែលអាចព្យាបាលបានដោយ MSli បន្ទាប់​ពី​ការ​វាយ​លុក (រូប។2a)។ ដើម្បីប្រឌិតពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ស្រទាប់ PDMS ខាងលើដែលបានរៀបចំត្រូវបានភ្ជាប់ជាបន្តបន្ទាប់ទៅនឹងខ្សែភាពយន្ត PDMS porous ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានតម្រឹមជាមួយស្រទាប់ PDMS ខាងក្រោមដោយការផ្សារភ្ជាប់ដែលមិនអាចត្រឡប់វិញបានដោយប្រើឧបករណ៍ព្យាបាល Corona (រូបភាព 2b–f)។ ដើម្បីផលិតបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ ការចម្លង PDMS ដែលត្រូវបានព្យាបាលអាចដាក់បញ្ចូលទៅក្នុងឧបករណ៍បំប្លែងកញ្ចក់តែមួយ (មីក្រូហ្វូន) ។ g. 2h និង Extended Data Fig. 2).ដំណើរការភ្ជាប់ត្រូវបានអនុវត្តដោយការព្យាបាលផ្ទៃនៃ PDMS ចម្លង និងកញ្ចក់ជាមួយនឹងអុកស៊ីសែនប្លាស្មា ឬការព្យាបាល corona ។ បន្ទាប់ពីការក្រៀវនៃឧបករណ៍ microfabricated ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងបំពង់ស៊ីលីកូន ការដំឡើងឧបករណ៍បានត្រៀមរួចរាល់ដើម្បីអនុវត្ត 3D morphogenesis នៃពោះវៀន។ (Figureliumg2) នៃពោះវៀន។
a, គ្រោងការណ៍គំនូរនៃការរៀបចំផ្នែក PDMS ពីផ្សិតស៊ីលីកុនដែលមានលំនាំ SU-8។ ដំណោះស្រាយ PDMS ដែលមិនបានព្យាបាលត្រូវបានចាក់ទៅលើផ្សិតស៊ីលីកុន (ខាងឆ្វេង) ព្យាបាលនៅសីតុណ្ហភាព 60 °C (កណ្តាល) និងរុះរើ (ខាងស្តាំ)។ PDMS ដែលបានកម្ទេចត្រូវបានកាត់ជាបំណែកៗ និងសម្អាតសម្រាប់ការប្រើប្រាស់បន្ថែមទៀត។ បានស៊ី PDMS porous membrane.d, រូបថតស៊េរីនៃសមាសធាតុ PDMS ខាងលើ និងខាងក្រោម និងឧបករណ៍ពោះវៀនដែលភ្ជាប់មកជាមួយបន្ទះឈីប.e, គ្រោងការណ៍នៃការតម្រឹមនៃផ្នែកខាងលើ ភ្នាស និងផ្នែកខាងក្រោមនៃ PDMS ។ ស្រទាប់នីមួយៗត្រូវបានភ្ជាប់ដោយមិនអាចត្រឡប់វិញបានដោយប្លាស្មា ឬ corona treatment.f, Schematicon-con-volamution device and varicose chambers.g, ការដំឡើង gut-on-a-chip សម្រាប់ microfluidic cell culture។ វៀនប្រឌិតនៅលើបន្ទះឈីបដែលផ្គុំដោយបំពង់ស៊ីលីកូន និងសឺរាុំងត្រូវបានដាក់នៅលើគម្រប។ ឧបករណ៍បន្ទះឈីបត្រូវបានដាក់នៅលើគម្របចាន Petri 150 mm សម្រាប់ដំណើរការ។ binder ត្រូវបានប្រើដើម្បីបិទ silicon tube.h, fabrics of Visual bhide chiphysis និង snapshot 3 .Transwell សិលាចារឹកដែលបានរៀបចំដោយឯករាជ្យទៅនឹងវប្បធម៌ 2D monolayers នៃកោសិកា epithelial ពោះវៀនត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់ដើម្បីជំរុញឱ្យមាន morphogenesis ពោះវៀន 3D ។ ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានបំភាយតាមរយៈមីក្រូឆានែលក្រោមស្រទាប់កោសិកាដែលបានបង្កើតឡើងនៅលើរបារ Transwell insert.Scale, 1 cm.h បោះពុម្ពឡើងវិញដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។4.អេលសេវី។
នៅក្នុងពិធីការនេះ ខ្សែកោសិកា Caco-2 និងសរីរាង្គពោះវៀនត្រូវបានប្រើប្រាស់ជាប្រភព epithelial (រូបភាពទី 3a)។ កោសិកាទាំងពីរប្រភេទត្រូវបានដាំដុះដោយឯករាជ្យ (ប្រអប់ទី 2 និងប្រអប់ទី 5) និងបានប្រើដើម្បីបណ្ដុះមីក្រូឆានែលដែលស្រោបដោយ ECM នៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ឬការបញ្ចូល Transwell ។ នៅពេលដែលកោសិកាត្រូវបានគ្របដណ្ដប់លើ Caco-2 (> 95) ។ en passages 10 និង 50) នៅក្នុង T-flasks ត្រូវបានប្រមូលផលដើម្បីរៀបចំការព្យួរកោសិកាដែលបែកគ្នាដោយសារធាតុ trypsinization (ប្រអប់ 2)។ សរីរាង្គពោះវៀនរបស់មនុស្សដែលបានមកពីការធ្វើកោសល្យវិច័យពោះវៀន ឬផ្នែកវះកាត់ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងរន្ទា Matrigel ក្នុង 24-well plates ដើម្បីជួយទ្រទ្រង់រចនាសម្ព័ន្ធ ron-phontum ។ din និង Noggin) និងកត្តាលូតលាស់ដែលបានរៀបចំដូចបានរៀបរាប់ក្នុងប្រអប់ទី 3 ត្រូវបានបំពេញបន្ថែមជារៀងរាល់ថ្ងៃរហូតទាល់តែសរីរាង្គលូតលាស់ដល់ ~500 µm ក្នុងអង្កត់ផ្ចិត។ សរីរាង្គដែលលូតលាស់ពេញលេញត្រូវបានប្រមូលផល និងបំបែកទៅជាកោសិកាតែមួយសម្រាប់ការបណ្តុះនៅលើពោះវៀន ឬ Transwell បញ្ចូលនៅលើបន្ទះសៀគ្វី (ប្រអប់ទី 5) ដូចដែលយើងបានរាយការណ៍ពីមុនមក ជំងឺរលាកពោះវៀនប្រភេទទី 1 វាអាចជាជំងឺផ្សេងៗគ្នា (ប្រភេទទី 1) ។ មហារីកពោះវៀនធំ ឬអ្នកបរិច្ចាគធម្មតា) កន្លែងដំបៅ (ឧ. ដំបៅធៀបនឹងតំបន់ដែលមិនមានដំបៅ) និងទីតាំងនៃក្រពះពោះវៀនក្នុងបំពង់អាហារ (ឧ. duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, or rectum)។ យើងផ្តល់នូវពិធីការដែលប្រសើរក្នុងប្រអប់ទី 5 សម្រាប់បណ្តុះកោសិកាពោះវៀនធំ) ដែលកំហាប់នៃសរីរាង្គតូចៗនៅក្នុងពោះវៀនធំ (coloid test organoids)។ ស.
a, លំហូរការងារសម្រាប់ការបញ្ចូលនៃ morphogenesis ពោះវៀននៅក្នុងបន្ទះឈីបពោះវៀន។ Caco-2 នៃ epithelium ពោះវៀនរបស់មនុស្ស និង organoids ពោះវៀនត្រូវបានប្រើនៅក្នុងពិធីការនេះដើម្បីបង្ហាញពី 3D morphogenesis។ កោសិកា epithelial ដាច់ស្រយាលត្រូវបានគ្រាប់ពូជនៅក្នុងឧបករណ៍ gut-on-a-chip ដែលបានរៀបចំ (ការត្រៀមលក្ខណៈ MS) និងភ្ជាប់នៅលើភ្នាស PD ។ ថ្ងៃ 0 (D0), លំហូរ apical (AP) ត្រូវបានផ្តួចផ្តើម និងរក្សាសម្រាប់រយៈពេល 2 ថ្ងៃដំបូង (លំហូរ, AP, D0-D2)។ លំហូរ Basolateral (BL) ក៏ត្រូវបានផ្តួចផ្តើមរួមជាមួយចលនាពង្រីករង្វិល (stretch, flow, AP និង BL) នៅពេលដែលស្រទាប់ monolayer 2D ពេញលេញត្រូវបានបង្កើតឡើង។ Intestinal 3D morponphotanesis វប្បធម៌ 5 ថ្ងៃកើតឡើង។ រូបភាពកម្រិតពណ៌បង្ហាញពីរូបវិទ្យាតំណាងនៃកោសិកា Caco-2 នៅដំណាក់កាលពិសោធន៍នីមួយៗ ឬចំណុចពេលវេលា (ក្រាហ្វរបារ, 100 µm)។ ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍ចំនួនបួនដែលបង្ហាញពីលំហដែលត្រូវគ្នានៃ morphogenesis ពោះវៀន (ខាងលើខាងស្តាំ)។ ព្រួញដាច់ៗនៅក្នុងគ្រោងការណ៍តំណាងឱ្យទិសដៅនៃលំហូររូបភាពនៃផ្ទៃខាងលើ Caco-3 S.b ។ ធាតុបញ្ចូលដែលរំលេចផ្ទៃពង្រីក (ប្រអប់ដាក់សញ្ញាពណ៌ស) បង្ហាញមីក្រូវីឡាដែលបានបង្កើតឡើងវិញនៅលើស្រទាប់ 3D Caco-2 (ស្តាំ)។ គ ទិដ្ឋភាពផ្នែកខាងមុខផ្តេកនៃ Caco-2 3D ដែលបានបង្កើតឡើង, claudin (ZO-1, ក្រហម) និងភ្នាសព្រំដែនជាប់គ្នាដែលមានស្លាក F-actin (បៃតង) និង nuclei (ពណ៌ខៀវ) បន្ទះសៀគ្វីដែលមើលឃើញនៃ Immunocallies ទៅនឹងគ្រោងការណ៍កណ្តាលបង្ហាញពីទីតាំងនៃយន្តហោះប្រសព្វសម្រាប់ confocal view.d នីមួយៗ វគ្គនៃពេលវេលានៃការផ្លាស់ប្តូរ morphological នៅក្នុង organoids ដែលដាំដុះនៅលើបន្ទះឈីបដែលទទួលបានដោយមីក្រូទស្សន៍កម្រិតពណ៌ដំណាក់កាលនៅថ្ងៃទី 3, 7, 9, 11 និង 13.The inset (ខាងលើស្តាំ) បង្ហាញពីការពង្រីកខ្ពស់នៃរូបភាពដែលបានផ្តល់។e, DIC photomicrograph នៅថ្ងៃទី 7 នៃរូបភាពទី 3 ។ បានដាក់រូបភាព immunofluorescence បង្ហាញសញ្ញាសម្គាល់សម្រាប់កោសិកាដើម (LGR5;ពណ៌ស្វាយ) កោសិកា goblet (MUC2; បៃតង) F-actin (ប្រផេះ) និង nuclei (cyan) លូតលាស់នៅលើបន្ទះសៀគ្វីពោះវៀនរយៈពេល 3 ថ្ងៃរៀងគ្នា (ឆ្វេង) និង 13-day (ពាក់កណ្តាល) organoids នៅលើស្រទាប់ epithelial ។ សូមមើលផងដែរនូវទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 3 ដែលរំលេចរូបភាពសញ្ញា LGR5 ។ D organoid epithelium បានបង្កើតឡើងនៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបមួយដោយការប្រឡាក់ភ្នាសប្លាស្មាជាមួយនឹងថ្នាំជ្រលក់ CellMask (ស្តាំ) នៅថ្ងៃទី 13 នៃវប្បធម៌។ Scale bar គឺ 50 μm លុះត្រាតែមានចែងផ្សេង។b បោះពុម្ពឡើងវិញដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។2.សារព័ត៌មានសាកលវិទ្យាល័យ Oxford;c សម្រួលដោយមានការអនុញ្ញាតពី Reference.2.សារព័ត៌មានសាកលវិទ្យាល័យ Oxford;e និង f ប្រែប្រួលដោយមានការអនុញ្ញាតដោយយោង។ 12 ក្រោម Creative Commons License CC BY 4.0 ។
នៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប វាចាំបាច់ក្នុងការកែប្រែផ្ទៃ hydrophobic នៃភ្នាស PDMS សម្រាប់ការ coating ECM ប្រកបដោយជោគជ័យ។ នៅក្នុងពិធីការនេះ យើងអនុវត្តវិធីសាស្រ្តពីរផ្សេងគ្នាដើម្បីកែប្រែ hydrophobicity នៃភ្នាស PDMS ។ សម្រាប់ការដាំដុះកោសិកា Caco-2 ការធ្វើឱ្យផ្ទៃខាងក្រៅដោយការព្យាបាលដោយកាំរស្មី UV/Ozone តែមួយមុខគឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីកាត់បន្ថយការជ្រាបទឹកនៃភ្នាស Caco-PD2 និងភ្នាស Caco-PD CM ។ ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វប្បធម៌មីក្រូហ្វ្លុយឌីកនៃអេពីថេលញ៉ូមសរីរាង្គទាមទារមុខងារផ្ទៃដែលផ្អែកលើសារធាតុគីមី ដើម្បីសម្រេចបាននូវការទម្លាក់ប្រូតេអ៊ីន ECM ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព ដោយអនុវត្តជាបន្តបន្ទាប់នូវសារធាតុ polyethyleneimine (PEI) និង glutaraldehyde ទៅ PDMS microchannels។ បន្ទាប់ពីការកែប្រែផ្ទៃ ប្រូតេអ៊ីន ECM ត្រូវបានដាក់បញ្ចូលដើម្បីគ្របដណ្តប់កោសិកាដែលដំណើរការដោយ PDMA បន្ទាប់មក សរីរាង្គត្រូវបានភ្ជាប់ទៅ PDMA ។ វប្បធម៌កោសិកា fluidic ចាប់ផ្តើមដោយការបញ្ចូលតែឧបករណ៍ផ្ទុកទៅក្នុង microchannel ខាងលើរហូតដល់កោសិកាបង្កើតជា monolayer ពេញលេញ ខណៈពេលដែល microchannel ខាងក្រោមរក្សាលក្ខខណ្ឌឋិតិវន្ត។ វិធីសាស្ត្រធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនេះសម្រាប់ការធ្វើឱ្យសកម្មលើផ្ទៃ និងថ្នាំកូត ECM អាចឱ្យការភ្ជាប់នៃ epithelium សរីរាង្គបង្កើត morphogenesis 3D នៅលើផ្ទៃ PDMS ។
វប្បធម៌ Transwell ក៏ត្រូវការថ្នាំកូត ECM មុនពេលបណ្តុះកោសិកា។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វប្បធម៌ Transwell មិនតម្រូវឱ្យមានជំហានព្យាបាលដ៏ស្មុគ្រស្មាញ ដើម្បីធ្វើឱ្យផ្ទៃនៃសារធាតុបញ្ចូលមានរន្ធញើសនោះទេ។ ចំពោះការរីកលូតលាស់កោសិកា Caco-2 នៅលើសិលាចារឹក Transwell ការស្រោប ECM នៅលើរន្ធបញ្ចូល porous បង្កើនល្បឿននៃការភ្ជាប់កោសិកា Caco-2 ដែលបែកគ្នា (<1 ម៉ោង) និងការបង្កើតរបាំងប្រសព្វតឹង (<1-2 ថ្ងៃ) ចំពោះការបញ្ចូលសរីរាង្គដែលដាក់បញ្ចូលទៅក្នុងសរីរាង្គ ឃើញការបញ្ចូលសរីរាង្គនៅលើ Transwell ។ ផ្ទៃភ្នាស (<3 ម៉ោង) និងរក្សារហូតទាល់តែសរីរាង្គបង្កើតបានជាស្រទាប់ម៉ូណូពេញលេញជាមួយនឹងភាពសុចរិតនៃរបាំង។ វប្បធម៌ Transwell ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងចាន 24 អណ្តូងដោយមិនប្រើបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់។
នៅក្នុង vitro morphogenesis 3D អាចត្រូវបានផ្តួចផ្តើមដោយអនុវត្តលំហូរសារធាតុរាវទៅកាន់ផ្នែក basolateral នៃស្រទាប់ epithelial ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើង។ នៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប កោសិកា epithelial morphogenesis បានចាប់ផ្តើមនៅពេលដែលឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានបំភាយចូលទៅក្នុង microchannels ខាងលើ និងខាងក្រោម (រូបភាព 3a)។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន វាមានសារៈសំខាន់ណាស់ក្នុងការណែនាំលំហូរនៃសារធាតុរាវបន្តបន្ទាប់បន្សំក្នុងទម្រង់ជាសម្ងាត់ (fluidorbas) ជាបន្ត សារធាតុ inhibitors ផូហ្សែន។ ដើម្បីផ្តល់សារធាតុចិញ្ចឹម និងសេរ៉ូមគ្រប់គ្រាន់ដល់កោសិកាដែលចងនៅលើភ្នាស porous និងបង្កើតភាពតានតឹងផ្នែកពន្លឺ យើងអនុវត្តលំហូរពីរនៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប។ នៅក្នុងបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ Transwell សិលាចារឹកដែលមានស្រទាប់ epithelial monolayers ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់។ បន្ទាប់មក ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានអនុវត្តនៅក្រោមផ្នែកខាង basomorous នៃ transwell 3 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការបញ្ចូល porous នៃហ្សែន។ ការចាប់ផ្តើមនៃលំហូរ basolateral នៅក្នុងវេទិកាវប្បធម៌ទាំងពីរ។
លក្ខណៈពិសេស morphological នៃស្រទាប់ epithelial 3D របស់មីក្រូវិស្វកម្មអាចត្រូវបានវិភាគដោយអនុវត្តវិធីសាស្ត្ររូបភាពផ្សេងៗ រួមទាំងមីក្រូទស្សន៍កម្រិតពណ៌ដំណាក់កាល មីក្រូទស្សន៍ភាពផ្ទុយគ្នាឌីផេរ៉ង់ស្យែល (DIC) មីក្រូទស្សន៍ SEM ឬមីក្រូទស្សន៍ប្រសព្វ immunofluorescence (រូបភាព 3 និង 4) ។ D ស្រទាប់ epithelial ។ ដោយសារតែតម្លាភាពអុបទិកនៃ PDMS និងខ្សែភាពយន្ត polyester ទាំង gut-on-a-chip និង hybrid chip platforms អាចផ្តល់ពេលវេលាជាក់ស្តែងក្នុងការថត situ ដោយមិនចាំបាច់ត្រូវការផ្នែក ឬ disassembly នៃឧបករណ៍។ ពេលអនុវត្ត immunofluorescence imaging (រូបភាព 1, 4b, 3c, fixed) ជាធម្មតា formaldehyde (PFA) តាមពីក្រោយដោយ Triton X-100 និង 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA) តាមលំដាប់។ អាស្រ័យលើប្រភេទកោសិកា សារធាតុជួសជុលផ្សេងៗ សារធាតុ permeabilizer និងភ្នាក់ងារទប់ស្កាត់អាចត្រូវបានប្រើ។ អង្គបដិប្រាណចម្បងដែលកំណត់គោលដៅលើកោសិកាដែលពឹងផ្អែកលើពូជពង្ស ឬកោសិកាដែលសម្គាល់តំបន់ត្រូវបានប្រើប្រាស់ដើម្បីប្រឆាំងជាមួយបន្ទះសៀគ្វីបន្ទាប់បន្សំ។ ការជ្រលក់ពណ៌ដែលកំណត់គោលដៅទាំងស្នូល (ឧ. 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) ឬ F-actin (ឧ. ហ្វ្លូអ៊ីឌីន ដែលមានស្លាកសញ្ញា fluorescent))។ការថតបន្តផ្ទាល់ដែលមានមូលដ្ឋានលើហ្វ្លុយអូរីសេនក៏អាចត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងទីតាំងដើម្បីរកមើលការផលិតទឹករំអិល (រូបភាពទី 2)។1, “ភាពខុសគ្នានៃកោសិកា” និង “សរីរវិទ្យាពោះវៀន”) ការធ្វើអាណានិគមដោយចៃដន្យនៃកោសិកាអតិសុខុមប្រាណ (រូបភាពទី 1, “ការបង្រួបបង្រួមនៃកោសិកាអតិសុខុមប្រាណ”) ការជ្រើសរើសកោសិកាភាពស៊ាំ (រូបភាពទី 1, 'គំរូជំងឺ') ឬវណ្ឌវង្កនៃ 3D epithelial morphology ។ បំបែកស្រទាប់ខាងលើចេញពីស្រទាប់មីក្រូឆានែលខាងក្រោម ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង ref. ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបទី 2 ទម្រង់រូបវិទ្យា epithelial 3D ក៏ដូចជា microvilli នៅលើព្រំប្រទល់ apical អាចត្រូវបានគេមើលឃើញដោយ SEM (រូបទី 3b)។ ការបញ្ចេញមតិនៃសញ្ញាសម្គាល់ភាពខុសគ្នាអាចត្រូវបានវាយតម្លៃដោយការអនុវត្តកោសិកាបរិមាណ PCR5 ។ នៅក្នុងបន្ទះសៀគ្វីពោះវៀន ឬបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ត្រូវបានប្រមូលផលដោយ trypsinization ហើយបន្ទាប់មកប្រើសម្រាប់ការវិភាគម៉ូលេគុល ឬហ្សែន។
a, លំហូរការងារសម្រាប់ការបង្កើត morphogenesis ពោះវៀននៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់។ Caco-2 និង organoids ពោះវៀនត្រូវបានប្រើនៅក្នុងពិធីការនេះ ដើម្បីបង្ហាញពី morphogenesis 3D នៅក្នុងបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់។ កោសិកា epithelial ដែលមិនជាប់ទាក់ទងគ្នាត្រូវបានបណ្តុះនៅក្នុងប្រដាប់បញ្ចូល Transwell ដែលបានរៀបចំ (TW prep; កោសិកាដែលបានភ្ជាប់ សូមមើលរូបភាពខាងក្រោម) ។ ត្រូវបានដាំដុះក្រោមលក្ខខណ្ឌឋិតិវន្ត (TW culture)។បន្ទាប់ពីរយៈពេល 7 ថ្ងៃ ការបញ្ចូល Transwell តែមួយដែលមានស្រទាប់កោសិកា 2D នៃកោសិកា epithelial ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់ ដើម្បីណែនាំលំហូរ basolateral (Flow, BL) ដែលទីបំផុតនាំទៅដល់ការបង្កើតស្រទាប់ epithelial 3D (morphogenesis) ដំណាក់កាលនៃកោសិកាធម្មតានៃកោសិកា epithelial ដែលបង្ហាញពីលក្ខណៈនៃកោសិកា epithelial កម្រិតពណ៌ 1 ។ 03 បន្ទាត់) ពោះវៀនធំឡើងនៅជំហានពិសោធន៍នីមួយៗ ឬចំណុចពេលវេលា។ គ្រោងការណ៍នៅក្នុងស្រទាប់ខាងលើបង្ហាញពីការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធពិសោធន៍សម្រាប់ជំហាននីមួយៗ។ បន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ (គ្រោងការណ៍ខាងឆ្វេង) អាចនាំទៅរកការបង្កើតកោសិកា 3D នៃកោសិកា epithelial organoid ជាមួយនឹងទិដ្ឋភាពមីក្រូទស្សន៍ប្រសព្វពីលើចុះក្រោម ដែលថតនៅទីតាំង Z, កណ្តាល និងទាប (ខាងលើ)។សូមមើលគ្រោងការណ៍ខាងស្តាំ និងបន្ទាត់ចំនុចដែលត្រូវគ្នា)។បានបង្ហាញពីលក្ខណៈសរីរវិទ្យាជាក់ស្តែង។ F-actin (ខៀវ), ស្នូល (ប្រផេះ).c, មីក្រូក្រាហ្វហ្វ្លុយរ៉េសសេន ប្រសព្វ (ទិដ្ឋភាពមុំ 3D) នៃកោសិកាអេពីថេលៀលដែលទទួលបានពីសរីរាង្គដែលដាំដុះនៅក្នុង ឋិតិវន្ត Transwell (TW; បញ្ចូលក្នុងប្រអប់សញ្ញាដាច់ពណ៌ស) ធៀបនឹងបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ (ការបាញ់ពេញលេញ D ដ៏ធំបំផុត) ប្រៀបធៀប 3 គូ morphology ។ ទិដ្ឋភាពកាត់ (បញ្ចូលនៅជ្រុងខាងស្តាំខាងលើ “XZ”) ក៏បង្ហាញលក្ខណៈពិសេស 2D និង 3D ផងដែរ។ Scale bar, 100 µm.c បោះពុម្ពឡើងវិញដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។4.អេលសេវី។
ការគ្រប់គ្រងអាចត្រូវបានរៀបចំដោយការបណ្តុះកោសិកាដូចគ្នា (Caco-2 ឬកោសិកា epithelial organoid ពោះវៀន) ទៅជាស្រទាប់ monolayers ពីរវិមាត្រក្រោមលក្ខខណ្ឌវប្បធម៌ឋិតិវន្តធម្មតា។ គួរកត់សម្គាល់ថាការថយចុះសារធាតុចិញ្ចឹមអាចបណ្តាលមកពីបរិមាណមានកម្រិតនៃ microchannels (ពោលគឺ ~ 4 µL នៅក្នុងឆានែលកំពូលនៅលើការរចនានៃ gut-chip epithelial ដើម) ។
ដំណើរការ lithography ទន់គួរតែត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងបន្ទប់ស្អាតមួយ។ សម្រាប់ស្រទាប់នីមួយៗនៅលើបន្ទះឈីប (ស្រទាប់ខាងលើ និងខាងក្រោម និងស្រទាប់ភ្នាស) និងបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ របាំងរូបថតផ្សេងគ្នាត្រូវបានគេប្រើ និងប្រឌិតនៅលើ wafers ស៊ីលីកុនដាច់ដោយឡែក ដោយសារកម្ពស់របស់ microchannels ខុសគ្នា។ កម្ពស់គោលដៅនៃ microchannels ខាងលើ និងខាងក្រោមនៃ microchannels នៃពោះវៀននៅលើ chip គឺ 500 µm រៀងគ្នា និងកម្ពស់របស់ chip ។ 200 µm
ដាក់ ​​wafer ស៊ីលីកូន 3 អ៊ីញនៅក្នុងចានជាមួយអាសេតូន។ បង្វិលចានថ្នមៗរយៈពេល 30 វិនាទី បន្ទាប់មកខ្យល់ស្ងួត។ ផ្ទេរ wafer ទៅចានជាមួយ IPA បន្ទាប់មកបង្វិលចានរយៈពេល 30 វិនាទីដើម្បីសម្អាត។
ដំណោះស្រាយ piranha (ល្បាយនៃអ៊ីដ្រូសែន peroxide និងអាស៊ីតស៊ុលហ្វួរីកកំហាប់ 1:3 (វ៉ុល/វ៉ុល)) អាចប្រើជាជម្រើស ដើម្បីបង្កើនការយកចេញនូវសំណល់សរីរាង្គចេញពីផ្ទៃស៊ីលីកុន wafer ។
សូលុយស្យុង Piranha មានភាពច្រេះខ្លាំង និងបង្កើតកំដៅ។ ការប្រុងប្រយ័ត្នសុវត្ថិភាពបន្ថែមគឺចាំបាច់។ សម្រាប់ការចោលកាកសំណល់ សូមទុកដំណោះស្រាយឱ្យត្រជាក់ និងផ្ទេរទៅធុងសំរាមស្ងួតស្អាត។ ប្រើធុងបន្ទាប់បន្សំ និងដាក់ស្លាកធុងសំរាមឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។ សូមអនុវត្តតាមគោលការណ៍ណែនាំសុវត្ថិភាពរបស់គ្រឹះស្ថានសម្រាប់នីតិវិធីលម្អិតបន្ថែម។
ខ្សោះជាតិទឹកនៃ wafers ដោយដាក់វានៅលើចានក្តៅ 200 ° C សម្រាប់រយៈពេល 10 នាទី.បន្ទាប់ពីការខះជាតិទឹក wafer ត្រូវបានរង្គោះរង្គើប្រាំដងនៅក្នុងខ្យល់ដើម្បីឱ្យត្រជាក់។
ចាក់សារធាតុ photoresist SU-8 2100 ~10 ក្រាមទៅលើកណ្តាលនៃ silicon wafer ដែលបានសម្អាត។ ប្រើ tweezers ដើម្បីរាលដាល photoresist រាបស្មើនៅលើ wafer។ ដាក់ wafer ម្តងម្កាលនៅលើចានក្តៅ 65°C ដើម្បីធ្វើឱ្យ photoresist កាន់តែស្អិត និងងាយស្រួលក្នុងការរាលដាល។ កុំដាក់ wafer ដោយផ្ទាល់នៅលើចានក្តៅ។
SU-8 ត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នានៅលើ wafer ដោយដំណើរការថ្នាំកូតវិល។ កម្មវិធីការបង្វិលចូលនៃ SU-8 សម្រាប់ 5-10 s ដើម្បីបន្តពូជនៅ 500 rpm ក្នុងល្បឿន 100 rpm/s. កំណត់ការបង្វិលចម្បងសម្រាប់ 200 µm កម្រាស់លំនាំនៅ 1,500 µm កម្រាស់ 500 μmpm សម្រាប់ស្រទាប់ខាងលើនៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប សូមមើល "ជំហានសំខាន់ៗ" ខាងក្រោម) កំណត់នៅការបង្កើនល្បឿន 300 rpm/s 30 វិនាទីនៅ 1,200 rpm ។
ល្បឿនបង្វិលចម្បងអាចត្រូវបានលៃតម្រូវដោយយោងទៅតាមកម្រាស់គោលដៅនៃលំនាំ SU-8 នៅលើ wafer ស៊ីលីកុន។
ដើម្បីប្រឌិតគំរូ SU-8 ដែលមានកម្ពស់ 500 µm សម្រាប់ស្រទាប់ខាងលើនៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ស្រទាប់ស្រោប និងជំហានដុតនំទន់ៗនៃប្រអប់នេះ (ជំហានទី 7 និងទី 8) ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតជាបន្តបន្ទាប់ (សូមមើលជំហានទី 9) ដើម្បីផលិតស្រទាប់ពីរនៃ 250 µm ស្រទាប់ក្រាស់នៃ SU-8 ដែលអាចដាក់ស្រទាប់ និងភ្ជាប់គ្នាក្នុងជំហាន 0 2 μm ស្រទាប់ UV នេះខ្ពស់។
ដុតនំទន់ដែលស្រោបដោយ SU-8 ដោយដាក់ wafers ដោយប្រុងប្រយ័ត្ននៅលើចានក្តៅមួយនៅ 65 °C រយៈពេល 5 នាទី បន្ទាប់មកប្តូរការកំណត់ទៅ 95 °C និង incubate បន្ថែម 40 នាទីទៀត។
ដើម្បីសម្រេចបាននូវកម្ពស់ 500 μm នៃលំនាំ SU-8 នៅក្នុង microchannel ខាងលើ សូមធ្វើជំហានទី 7 និង 8 ម្តងទៀតដើម្បីបង្កើតស្រទាប់ SU-8 ដែលមានកម្រាស់ 250 μm។
ដោយ​ប្រើ​ឧបករណ៍​តម្រឹម​របាំង​កាំរស្មី UV សូម​ធ្វើ​តេស្ត​ចង្កៀង​ដោយ​យោង​តាម​ការ​ណែនាំ​របស់​អ្នក​ផលិត​ដើម្បី​គណនា​ពេល​វេលា​នៃ​ការ​ប៉ះពាល់​របស់ wafer។(ពេលវេលា​ប៉ះពាល់, ms) = (កម្រិត​ពន្លឺ, mJ/cm2)/(ថាមពល​ចង្កៀង, mW/cm2)។
បន្ទាប់ពីកំណត់ពេលវេលានៃការប៉ះពាល់ សូមដាក់ photomask លើគម្របរបាំងមុខរបស់ឧបករណ៍តម្រឹមរបាំង UV ហើយដាក់ photomask នៅលើ SU-8 coated wafer ។
ដាក់ផ្ទៃដែលបានបោះពុម្ពនៃ photomask ដោយផ្ទាល់នៅលើផ្នែកខាងថ្នាំកូត SU-8 នៃ wafer ស៊ីលីកូន ដើម្បីកាត់បន្ថយការបែកខ្ចាត់ខ្ចាយនៃកាំរស្មីយូវី។
លាតត្រដាង SU-8 coated wafer និង photomask បញ្ឈរទៅ 260 mJ/cm2 នៃពន្លឺ UV សម្រាប់ពេលវេលាប៉ះពាល់ដែលបានកំណត់ទុកជាមុន (សូមមើលជំហានទី 10 នៃប្រអប់នេះ)។
បន្ទាប់ពីការប៉ះពាល់នឹងកាំរស្មីយូវី ម្សៅស៊ីលីកុនដែលស្រោបដោយ SU-8 ត្រូវបានដុតនំនៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 5 នាទី និង 95°C រយៈពេល 15 នាទីនៅលើចានក្តៅនីមួយៗ ដើម្បីផលិតលំនាំដែលមានកម្ពស់ 200 μm។ ពង្រីកពេលវេលាក្រោយដុតនំនៅសីតុណ្ហភាព 95 °C ដល់ 30 នាទី ដើម្បីប្រឌិតលំនាំដែលមានកម្ពស់ µm 50 ។
អ្នកអភិវឌ្ឍន៍ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងចានកែវ ហើយ wafer ដុតនំត្រូវបានដាក់ក្នុងចាន។ បរិមាណនៃ SU-8 developer អាចប្រែប្រួលអាស្រ័យលើទំហំនៃចានកញ្ចក់។ ត្រូវប្រាកដថាប្រើ SU-8 developer ឱ្យបានគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីយក SU-8 ដែលមិនប៉ះពាល់ទាំងស្រុង។ ឧទាហរណ៍ នៅពេលប្រើចានកែវដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 150 មីលីម៉ែត្រដែលមានសមត្ថភាព 1 L សូមប្រើ 300 mL នៃផ្សិត SU-28 ។ ការ​ធ្វើ​ដំណើរ។
លាងជម្រះផ្សិតដែលបានបង្កើតជាមួយនឹងអ្នកអភិវឌ្ឍន៍ស្រស់ ~ 10 មីលីលីត្រ បន្តដោយ IPA ដោយបាញ់ថ្នាំដំណោះស្រាយដោយប្រើបំពង់។
ដាក់ ​​wafer នៅក្នុងម៉ាស៊ីនសម្អាតប្លាស្មា ហើយបញ្ចោញទៅប្លាស្មាអុកស៊ីសែន (ឧស្ម័នបរិយាកាស សម្ពាធគោលដៅ 1 × 10−5 Torr ថាមពល 125 W) រយៈពេល 1.5 នាទី។
ដាក់ ​​wafer នៅក្នុងម៉ាស៊ីនបូមធូលីដែលមានស្លាយកញ្ចក់នៅខាងក្នុង។ Wafers និង slides អាចត្រូវបានដាក់នៅម្ខាង។ ប្រសិនបើ desiccator vacuum ត្រូវបានបែងចែកទៅជាស្រទាប់ជាច្រើនដោយចានមួយ ដាក់ស្លាយនៅក្នុងបន្ទប់ខាងក្រោម និង wafers នៅក្នុងបន្ទប់ខាងលើ។ ទម្លាក់ដំណោះស្រាយ 100 μL នៃ trichloro (1H, 1H, 2H) លើកញ្ចក់។ អូមសម្រាប់ការស៊ីលីន។
បោះដបកោសិកា Caco-2 ដែលកកក្នុងទឹក 37°C បន្ទាប់មកផ្ទេរកោសិកាដែលរលាយទៅធុងទឹក T75 ដែលមានផ្ទុក 15 mL នៃ Caco-2 មធ្យម 37°C ជាមុន។
ដើម្បីឆ្លងកាត់កោសិកា Caco-2 នៅកម្រិតភាពច្របូកច្របល់ 90% ទីមួយ Caco-2 medium warms, PBS, និង 0.25% trypsin/1 mM EDTA ក្នុងអាងទឹក 37°C។
បញ្ចោញឧបករណ៍ផ្ទុកដោយការស្រូបខ្យល់។ លាងសម្អាតកោសិកាពីរដងជាមួយនឹង 5 mL នៃ PBS ក្តៅដោយធ្វើម្តងទៀតនូវ vocuum aspiration និងបន្ថែម PBS ស្រស់។