សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។អ្នកកំពុងប្រើកំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។លើសពីនេះទៀត ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
បង្ហាញរង្វង់នៃស្លាយបីក្នុងពេលតែមួយ។ប្រើប៊ូតុងមុន និងបន្ទាប់ ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយបីក្នុងពេលតែមួយ ឬប្រើប៊ូតុងគ្រាប់រំកិលនៅចុងបញ្ចប់ ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយបីក្នុងពេលតែមួយ។
របាំងឈាម-ខួរក្បាល និងរបាំងឈាម-ខួរក្បាល ការពារភ្នាក់ងារព្យាបាលជីវសាស្ត្រពីការឈានដល់គោលដៅរបស់ពួកគេនៅក្នុងប្រព័ន្ធសរសៃប្រសាទកណ្តាល ដោយហេតុនេះរារាំងការព្យាបាលប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនៃជំងឺសរសៃប្រសាទ។ដើម្បីស្វែងរកឧបករណ៍ដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលប្រលោមលោកនៅក្នុង vivo យើងបានណែនាំបណ្ណាល័យ T7 phage peptide និងបានប្រមូលឈាម និងសារធាតុរាវខួរក្បាល (CSF) ជាបន្តបន្ទាប់ដោយប្រើគំរូសត្វកណ្តុរធំដែលដឹងខ្លួន។ក្លូន phage ជាក់លាក់ត្រូវបានពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង CSF បន្ទាប់ពីការជ្រើសរើសបួនជុំ។ការធ្វើតេស្ត peptides បេក្ខជនម្នាក់ៗបានបង្ហាញឱ្យឃើញនូវការកើនឡើងច្រើនជាង 1000 ដងនៅក្នុង CSF ។សកម្មភាពជីវសាស្រ្តនៃការចែកចាយ peptide-mediated ទៅកាន់ខួរក្បាលត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការថយចុះ 40% នៃកម្រិតនៃ amyloid-β នៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal ដោយប្រើ BACE1 peptide inhibitor ដែលភ្ជាប់ទៅនឹង peptide ឆ្លងកាត់ប្រលោមលោកដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា peptides ដែលកំណត់ដោយវិធីសាស្រ្តជ្រើសរើស vivo phage អាចជាយានជំនិះដ៏មានប្រយោជន៍សម្រាប់ការចែកចាយជាប្រព័ន្ធនៃ macromolecules ទៅកាន់ខួរក្បាលជាមួយនឹងប្រសិទ្ធភាពព្យាបាល។
ការស្រាវជ្រាវព្យាបាលតាមគោលដៅនៃប្រព័ន្ធសរសៃប្រសាទកណ្តាល (CNS) បានផ្តោតជាសំខាន់លើការកំណត់អត្តសញ្ញាណថ្នាំ និងភ្នាក់ងារដែលបង្កើនប្រសិទ្ធភាពដែលបង្ហាញពីលក្ខណៈសម្បត្តិកំណត់គោលដៅ CNS ដោយមានការខិតខំប្រឹងប្រែងតិចជាងមុនក្នុងការស្វែងរកយន្តការដែលជំរុញការផ្តល់ថ្នាំសកម្មទៅកាន់ខួរក្បាល។នេះកំពុងចាប់ផ្តើមផ្លាស់ប្តូរនៅពេលនេះ ដោយសារការផ្តល់ថ្នាំ ជាពិសេសម៉ូលេគុលធំ គឺជាផ្នែកសំខាន់មួយនៃការអភិវឌ្ឍន៍ថ្នាំសរសៃប្រសាទទំនើប។បរិយាកាសនៃប្រព័ន្ធសរសៃប្រសាទកណ្តាលត្រូវបានការពារយ៉ាងល្អដោយប្រព័ន្ធរបាំងសរសៃឈាមខួរក្បាលដែលមានរបាំងឈាមខួរក្បាល (BBB) ​​និងរបាំងឈាមខួរក្បាល (BCBB)1 ដែលធ្វើឱ្យវាពិបាកក្នុងការបញ្ជូនថ្នាំទៅខួរក្បាល1,2 ។វាត្រូវបានគេប៉ាន់ប្រមាណថាស្ទើរតែគ្រប់ថ្នាំម៉ូលេគុលធំទាំងអស់ និងជាង 98% នៃឱសថម៉ូលេគុលតូចត្រូវបានលុបចេញពីខួរក្បាល 3.នោះហើយជាមូលហេតុដែលវាមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់ក្នុងការកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រព័ន្ធដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលថ្មីដែលផ្តល់នូវប្រសិទ្ធភាព និងជាក់លាក់នៃការផ្តល់ថ្នាំព្យាបាលទៅ CNS 4,5 ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ BBB និង BCSFB ក៏បង្ហាញពីឱកាសដ៏ល្អសម្រាប់ការចែកចាយថ្នាំផងដែរ នៅពេលដែលពួកគេជ្រាបចូល និងចូលទៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទាំងអស់នៃខួរក្បាលតាមរយៈសរសៃឈាមដ៏ធំទូលាយរបស់វា។ដូច្នេះកិច្ចខិតខំប្រឹងប្រែងនាពេលបច្ចុប្បន្នដើម្បីប្រើវិធីសាស្រ្តមិនរាតត្បាតនៃការដឹកជញ្ជូនទៅខួរក្បាលគឺភាគច្រើនផ្អែកលើយន្តការនៃការដឹកជញ្ជូនតាមមធ្យោបាយទទួល (PMT) ដោយប្រើឧបករណ៍ទទួល BBB6 endogenous ។ថ្វីបើមានការជឿនលឿនសំខាន់ៗនាពេលថ្មីៗនេះដោយប្រើប្រាស់ផ្លូវ Transferrin receptor pathway7,8 ក៏ដោយ ការអភិវឌ្ឍន៍បន្ថែមទៀតនៃប្រព័ន្ធចែកចាយថ្មីជាមួយនឹងលក្ខណៈសម្បត្តិដែលប្រសើរឡើងគឺត្រូវបានទាមទារ។ដល់ទីបញ្ចប់នេះ គោលដៅរបស់យើងគឺដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptides ដែលមានសមត្ថភាពសម្របសម្រួលការដឹកជញ្ជូន CSF ដូចដែលពួកគេអាចប្រើជាគោលការណ៍ដើម្បីបញ្ជូន macromolecules ទៅ CNS ឬដើម្បីបើកផ្លូវទទួលថ្មី។ជាពិសេស អ្នកទទួល និងអ្នកដឹកជញ្ជូនជាក់លាក់នៃប្រព័ន្ធសរសៃឈាមខួរក្បាល (BBB និង BSCFB) អាចបម្រើជាគោលដៅសក្តានុពលសម្រាប់ការចែកចាយសកម្ម និងជាក់លាក់នៃឱសថជីវសាស្ត្រ។សារធាតុរាវ Cerebrospinal (CSF) គឺជាផលិតផលសំងាត់នៃ choroid plexus (CS) ហើយមានទំនាក់ទំនងផ្ទាល់ជាមួយសារធាតុរាវ interstitial នៃខួរក្បាលតាមរយៈ subarachnoid space និង ventricular space4 ។ថ្មីៗនេះវាត្រូវបានគេបង្ហាញថាសារធាតុរាវ cerebrospinal subarachnoid សាយភាយខ្លាំងពេកចូលទៅក្នុង interstitium នៃខួរក្បាល។យើងសង្ឃឹមថានឹងចូលប្រើចន្លោះ parenchymal ដោយប្រើផ្លូវលំហូរចូល subarachnoid ឬដោយផ្ទាល់តាមរយៈ BBB ។ដើម្បីសម្រេចបាននូវចំណុចនេះ យើងបានអនុវត្តយុទ្ធសាស្រ្តជ្រើសរើស vivo phage ដ៏រឹងមាំ ដែលកំណត់តាមឧត្ដមគតិ peptides ដែលដឹកជញ្ជូនដោយផ្លូវផ្សេងគ្នាទាំងពីរនេះ។
ឥឡូវនេះ យើងពណ៌នាអំពីវិធីសាស្រ្តពិនិត្យអេក្រង់ vivo phage ជាបន្តបន្ទាប់ជាមួយការយកគំរូតាម CSF គួបផ្សំជាមួយនឹងលំដាប់លំដោយខ្ពស់ (HTS) ដើម្បីតាមដានជុំនៃការជ្រើសរើសដំបូងជាមួយនឹងភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យខ្ពស់បំផុត។ការ​ពិនិត្យ​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​ឡើង​លើ​សត្វ​កណ្តុរ​ដែល​ដឹង​ខ្លួន​ដោយ​មាន​ការ​ផ្សាំ​ជា​អចិន្ត្រៃយ៍ (CM) cannula ដើម្បី​ជៀសវាង​ការ​ចម្លងរោគ​ឈាម។សំខាន់ វិធីសាស្រ្តនេះជ្រើសរើសទាំងការកំណត់គោលដៅខួរក្បាល និង peptides ជាមួយនឹងសកម្មភាពដឹកជញ្ជូនឆ្លងកាត់របាំងសរសៃឈាមខួរក្បាល។យើងបានប្រើ T7 phages ដោយសារតែទំហំតូចរបស់ពួកគេ (~ 60 nm) 10 ហើយបានណែនាំថាពួកវាគឺសមរម្យសម្រាប់ការដឹកជញ្ជូន vesicles ដែលអនុញ្ញាតឱ្យឆ្លងកាត់កោសិកានៃរបាំង endothelial និង / ឬ epithelial-medulla ។បន្ទាប់ពី 4 ជុំនៃការ panning ចំនួនប្រជាជន phage ត្រូវបានញែកដាច់ពីគេដែលបង្ហាញពីភាពរឹងមាំនៅក្នុង vivo CSF ​​​​ពង្រឹងនិងសមាគម microvessel ខួរក្បាល។សំខាន់ យើងអាចបញ្ជាក់ការរកឃើញរបស់យើងដោយបង្ហាញថា peptides បេក្ខជនល្អបំផុតដែលពេញចិត្ត និងសំយោគដោយគីមីគឺអាចដឹកជញ្ជូនទំនិញប្រូតេអ៊ីនទៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal ។ទីមួយ ឥទ្ធិពល pharmacodynamic នៃ CNS ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយការរួមបញ្ចូលគ្នារវាង peptide ឆ្លងកាត់ឈានមុខគេជាមួយនឹង inhibitor នៃ BACE1 peptide ។បន្ថែមពីលើការបង្ហាញថានៅក្នុងយុទ្ធសាស្រ្តពិនិត្យមុខងាររបស់ vivo អាចកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptides ដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលប្រលោមលោកថាជាក្រុមហ៊ុនដឹកជញ្ជូនប្រូតេអ៊ីនដ៏មានប្រសិទ្ធភាព យើងរំពឹងថាវិធីសាស្ត្រជ្រើសរើសមុខងារស្រដៀងគ្នានេះក៏មានសារៈសំខាន់ក្នុងការកំណត់ផ្លូវដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលប្រលោមលោកផងដែរ។
ដោយផ្អែកលើឯកតាបង្កើតបន្ទះ (PFU) បន្ទាប់ពីជំហានវេចខ្ចប់ phage បណ្ណាល័យនៃ peptides លីនេអ៊ែរ 12-mer ចៃដន្យ T7 ដែលមានភាពចម្រុះប្រហែល 109 ត្រូវបានរចនា និងបង្កើត (សូមមើលសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត)។វាជារឿងសំខាន់ក្នុងការកត់សម្គាល់ថា យើងបានវិភាគដោយប្រុងប្រយ័ត្ននូវបណ្ណាល័យនេះពីមុននៅក្នុង vivo panning ។ការពង្រីក PCR នៃគំរូបណ្ណាល័យ phage ដោយប្រើ primers ដែលបានកែប្រែបានបង្កើត amplicons ដែលត្រូវបានអនុវត្តដោយផ្ទាល់ទៅ HTS (រូបភាពបន្ថែម 1a) ។ដោយសារតែ ក) កំហុសនៃលំដាប់ HTS11, ខ) ផលប៉ះពាល់លើគុណភាពនៃ primers (NNK)1-12, និង c) វត្តមានរបស់ wild-type (wt) phage (skeleton inserts) នៅក្នុងបណ្ណាល័យរង់ចាំ នីតិវិធីចម្រោះតាមលំដាប់ត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីទាញយកតែព័ត៌មានលំដាប់ដែលបានផ្ទៀងផ្ទាត់ (រូបភាពបន្ថែម 1b)។ជំហានតម្រងទាំងនេះអនុវត្តចំពោះបណ្ណាល័យលំដាប់ HTS ទាំងអស់។សម្រាប់បណ្ណាល័យស្ដង់ដារ ការអានសរុបចំនួន 233,868 ត្រូវបានទទួល ដែលក្នុងនោះ 39% បានឆ្លងកាត់លក្ខណៈវិនិច្ឆ័យតម្រង ហើយត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគ និងការជ្រើសរើសបណ្ណាល័យសម្រាប់ជុំជាបន្តបន្ទាប់ (រូបភាពបន្ថែម 1c–e)។ការអានត្រូវបានគុណច្រើនលើសលុបនៃ 3 គូគោលដែលមានប្រវែងជាមួយនឹងកំពូលនៅ 36 nucleotides (រូបភាពបន្ថែម 1c) ដោយបញ្ជាក់ពីការរចនាបណ្ណាល័យ (NNK) 1-12 ។គួរកត់សម្គាល់ ប្រហែល 11% នៃសមាជិកបណ្ណាល័យមានផ្ទុកនូវ 12-dimensional wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL ហើយស្ទើរតែពាក់កណ្តាលនៃលំដាប់ (49%) មានការបញ្ចូល ឬការលុប។HTS នៃបណ្ណាល័យបណ្ណាល័យបានបញ្ជាក់ពីភាពចម្រុះខ្ពស់នៃ peptides នៅក្នុងបណ្ណាល័យ: ច្រើនជាង 81% នៃលំដាប់ peptide ត្រូវបានរកឃើញតែម្តងគត់ ហើយមានតែ 1.5% ប៉ុណ្ណោះដែលកើតឡើងក្នុង≥4ច្បាប់ចម្លង (រូបភាពបន្ថែម 2a)។ប្រេកង់នៃអាស៊ីដអាមីណូ (aa) នៅគ្រប់មុខតំណែងទាំង 12 នៅក្នុង repertoire មានទំនាក់ទំនងយ៉ាងល្អជាមួយនឹងប្រេកង់ដែលរំពឹងទុកសម្រាប់ចំនួន codons ដែលបង្កើតដោយ degenerate NKK repertoire (រូបភាពបន្ថែម 2b) ។ប្រេកង់សង្កេតនៃសំណល់ aa ដែលត្រូវបានអ៊ិនកូដដោយការបញ្ចូលទាំងនេះមានទំនាក់ទំនងយ៉ាងល្អជាមួយនឹងប្រេកង់ដែលបានគណនា (r = 0.893) (រូបភាពបន្ថែម 2c) ។ការរៀបចំបណ្ណាល័យ phage សម្រាប់ការចាក់បញ្ចូលរួមមានជំហាននៃការពង្រីក និងការយកចេញនៃ endotoxin ។នេះត្រូវបានបង្ហាញពីមុនថាអាចកាត់បន្ថយភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យ phage12,13។ដូច្នេះហើយ យើងបានតម្រៀបបណ្ណាល័យ phage ដែលពង្រីកដោយចានដែលបានឆ្លងកាត់ការដកយកចេញនូវសារធាតុ endotoxin ហើយប្រៀបធៀបវាជាមួយបណ្ណាល័យដើម ដើម្បីប៉ាន់ស្មានប្រេកង់ AA ។ការជាប់ទាក់ទងគ្នាខ្លាំង (r = 0.995) ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញរវាងអាងដើម និងអាងពង្រីក និងបន្សុត (រូបភាពបន្ថែម 2d) ដែលបង្ហាញថាការប្រកួតប្រជែងរវាងក្លូនដែលបានពង្រីកនៅលើចានដោយប្រើ T7 phage មិនបង្កឱ្យមានភាពលំអៀងធំនោះទេ។ការប្រៀបធៀបនេះគឺផ្អែកលើភាពញឹកញាប់នៃគំនូរ tripeptide នៅក្នុងបណ្ណាល័យនីមួយៗ ដោយហេតុថាភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យ (~109) មិនអាចចាប់យកបានពេញលេញសូម្បីតែជាមួយ HTS ក៏ដោយ។ការវិភាគប្រេកង់នៃ aa នៅទីតាំងនីមួយៗបានបង្ហាញឱ្យឃើញពីភាពលំអៀងអាស្រ័យលើទីតាំងតូចមួយនៅក្នុងមុខតំណែងបីចុងក្រោយនៃ repertoire ដែលបានបញ្ចូល (រូបភាពបន្ថែម 2e) ។សរុបសេចក្តីមក យើងបានសន្និដ្ឋានថា គុណភាព និងភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យគឺអាចទទួលយកបាន ហើយមានតែការផ្លាស់ប្តូរតិចតួចនៅក្នុងភាពចម្រុះប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានសង្កេតឃើញដោយសារតែការពង្រីក និងការរៀបចំបណ្ណាល័យ phage រវាងការជ្រើសរើសជាច្រើនជុំ។
ការធ្វើសំណាកសារធាតុរាវ cerebrospinal សៀរៀលអាចត្រូវបានអនុវត្តដោយការវះកាត់ដាក់ cannula ចូលទៅក្នុង CM នៃកណ្តុរដឹងខ្លួន ដើម្បីជួយសម្រួលដល់ការកំណត់អត្តសញ្ញាណ T7 phage ដែលចាក់តាមសរសៃឈាម (iv) តាមរយៈ BBB និង/ឬ BCSFB (រូបភាព 1a-b)។យើងបានប្រើអាវុធជ្រើសរើសឯករាជ្យចំនួនពីរ (ដៃ A និង B) ក្នុងបីជុំដំបូងនៃការជ្រើសរើសនៅក្នុង vivo (រូបភាព 1c) ។យើងបានបង្កើនភាពតឹងរ៉ឹងនៃការជ្រើសរើសជាបណ្តើរៗ ដោយកាត់បន្ថយចំនួនសរុបនៃ phage ដែលបានណែនាំនៅក្នុងបីជុំដំបូងនៃការជ្រើសរើស។សម្រាប់ការប្រកួតជុំទីបួន យើងបានបញ្ចូលគំរូពីសាខា A និង B ហើយធ្វើការជ្រើសរើសឯករាជ្យចំនួនបីបន្ថែមទៀត។ដើម្បីសិក្សាពីលក្ខណៈសម្បត្តិនៅក្នុង vivo នៃភាគល្អិត T7 phage នៅក្នុងគំរូនេះ សារធាតុ phage ប្រភេទព្រៃ (PAGISRELVDKL master insert) ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងសត្វកណ្តុរតាមរយៈសរសៃកន្ទុយ។ការងើបឡើងវិញនៃ phages ពីសារធាតុរាវ cerebrospinal និងឈាមនៅចំណុចពេលវេលាផ្សេងគ្នាបានបង្ហាញថា T7 icosahedral phages តិចតួចមានដំណាក់កាលនៃការបោសសំអាតដំបូងយ៉ាងឆាប់រហ័សពីផ្នែកឈាម (រូបភាពបន្ថែម 3) ។ដោយផ្អែកលើ titers គ្រប់គ្រង និងបរិមាណឈាមរបស់សត្វកណ្តុរ យើងបានគណនាថាមានតែប្រហែល 1% wt ប៉ុណ្ណោះ។phage ពីកម្រិតថ្នាំត្រូវបានគេរកឃើញនៅក្នុងឈាម 10 នាទីបន្ទាប់ពីការចាក់តាមសរសៃឈាម។បន្ទាប់ពីការធ្លាក់ចុះយ៉ាងឆាប់រហ័សដំបូងនេះ ការបោសសំអាតបឋមយឺតជាងនេះត្រូវបានវាស់វែងជាមួយនឹងពាក់កណ្តាលជីវិត 27.7 នាទី។សំខាន់គឺមានតែ phages តិចតួចប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានទាញយកពីផ្នែក CSF ដែលបង្ហាញពីផ្ទៃខាងក្រោយទាបសម្រាប់ការធ្វើចំណាកស្រុក phage ប្រភេទព្រៃចូលទៅក្នុងផ្នែក CSF (រូបភាពបន្ថែម 3) ។ជាមធ្យមមានតែប្រហែល 1 x 10-3% titers នៃ T7 phage នៅក្នុងឈាមនិង 4 x 10-8% នៃ phages ដែលបញ្ចូលដំបូងត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal ក្នុងរយៈពេលគំរូទាំងមូល (0-250 នាទី) ។គួរកត់សម្គាល់ថាពាក់កណ្តាលជីវិត (25.7 នាទី) នៃ phage ប្រភេទព្រៃនៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលបានសង្កេតនៅក្នុងឈាម។ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថារបាំងបំបែកផ្នែក CSF ពីឈាមគឺនៅដដែលនៅក្នុងកណ្តុរដែលប្រើដោយ CM ដែលអនុញ្ញាតឱ្យ vivo ជ្រើសរើសបណ្ណាល័យ phage ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណក្លូនដែលត្រូវបានដឹកជញ្ជូនយ៉ាងងាយស្រួលពីឈាមទៅក្នុងផ្នែក CSF ។
(ក) រៀបចំវិធីសាស្រ្តសម្រាប់ការយកគំរូឡើងវិញសារធាតុរាវ cerebrospinal (CSF) ពីអាងធំមួយ។(b) ដ្យាក្រាមបង្ហាញពីទីតាំងកោសិកានៃរបាំងប្រព័ន្ធសរសៃប្រសាទកណ្តាល (CNS) និងយុទ្ធសាស្រ្តជ្រើសរើសដែលប្រើដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptides ដែលឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាល (BBB) ​​និងរបាំងឈាមខួរក្បាល។(គ) គំនូសតាងនៃការបញ្ចាំងអេក្រង់ vivo phage ។នៅក្នុងការជ្រើសរើសនីមួយៗ phages (ឧបករណ៍កំណត់អត្តសញ្ញាណសត្វនៅខាងក្នុងព្រួញ) ត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាម។សាខាជម្រើសឯករាជ្យពីរ (A, B) ត្រូវបានរក្សាទុកដោយឡែកពីគ្នារហូតដល់ជុំទី 4 នៃការជ្រើសរើស។សម្រាប់ការជ្រើសរើសជុំទី 3 និងទី 4 ក្លូន phage នីមួយៗដែលស្រង់ចេញពី CSF ត្រូវបានតម្រៀបដោយដៃ។(ឃ) Kinetics នៃ phage ដាច់ដោយឡែកពីឈាម (រង្វង់ក្រហម) និងសារធាតុរាវ cerebrospinal (ត្រីកោណពណ៌បៃតង) កំឡុងពេលជុំទី 1 នៃការជ្រើសរើសនៅក្នុងសត្វកណ្តុរពីរក្បាលបន្ទាប់ពីការចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាមនៃបណ្ណាល័យ T7 peptide (2 x 1012 phages/សត្វ)។ការ៉េពណ៌ខៀវបង្ហាញពីកំហាប់បឋមជាមធ្យមនៃ phage នៅក្នុងឈាម គណនាពីបរិមាណនៃ phage ដែលត្រូវបានចាក់ដោយគិតគូរពីបរិមាណឈាមសរុប។ការ៉េខ្មៅបង្ហាញពីចំណុចប្រសព្វនៃបន្ទាត់ y ដែលត្រូវបានបន្ថែមចេញពីការប្រមូលផ្តុំ phage ឈាម។(e,f) បង្ហាញប្រេកង់ដែលទាក់ទង និងការចែកចាយនៃគំនូរ tripeptide ត្រួតស៊ីគ្នាដែលអាចធ្វើបានទាំងអស់ដែលមាននៅក្នុង peptide ។ចំនួននៃគំនូរដែលបានរកឃើញនៅក្នុងការអាន 1000 ត្រូវបានបង្ហាញ។យ៉ាងសំខាន់ (p < 0.001) គំនូរដែលសំបូរបែបត្រូវបានសម្គាល់ដោយចំណុចក្រហម។(ង) គ្រោងការជាប់ទាក់ទងគ្នា ការប្រៀបធៀបប្រេកង់ដែលទាក់ទងនៃគំនូរ tripeptide នៃបណ្ណាល័យដែលបានចាក់ជាមួយ phage ដែលបានមកពីឈាមពីសត្វ #1.1 និង #1.2។(f) គ្រោងការជាប់ទាក់ទងគ្នាដោយប្រៀបធៀបប្រេកង់ដែលទាក់ទងនៃគំនូរសត្វ phage tripeptide #1.1 និង #1.2 ដាច់ដោយឡែកពីក្នុងឈាម និងសារធាតុរាវ cerebrospinal ។(g, h) តំណាងលេខសម្គាល់លំដាប់នៃ phage សំបូរទៅដោយឈាម (g) ធៀបនឹងការចាក់បញ្ចូលក្នុងបណ្ណាល័យ និង phage ដែលសំបូរទៅដោយ CSF (h) ធៀបនឹងឈាម បន្ទាប់ពីជុំនៃការជ្រើសរើស vivo នៅក្នុងសត្វទាំងពីរ។ទំហំ​នៃ​កូដ​មួយ​អក្សរ​បង្ហាញ​ពី​ចំនួន​ញឹកញាប់​ដែល​អាស៊ីត​អាមីណូ​កើតឡើង​នៅ​ទីតាំង​នោះ។បៃតង = ប៉ូល, ពណ៌ស្វាយ = អព្យាក្រឹត, ខៀវ = មូលដ្ឋាន, ក្រហម = អាសុីត និងខ្មៅ = អាស៊ីតអាមីណូ hydrophobic ។រូបភាពទី 1a, b ត្រូវបានរចនា និងផលិតដោយ Eduard Urich ។
យើងបានចាក់បណ្ណាល័យ phage peptide ទៅក្នុងកណ្តុរឧបករណ៍ CM ចំនួនពីរ (clades A និង B) និង phage ដាច់ដោយឡែកពីសារធាតុរាវ cerebrospinal និងឈាម (រូបភាពទី 1d) ។ការបោសសំអាតយ៉ាងឆាប់រហ័សដំបូងនៃបណ្ណាល័យគឺមិនសូវច្បាស់ទេបើប្រៀបធៀបទៅនឹង phage ប្រភេទព្រៃ។រយៈពេលពាក់កណ្តាលជីវិតជាមធ្យមនៃបណ្ណាល័យដែលបានចាក់នៅក្នុងសត្វទាំងពីរគឺ 24.8 នាទីក្នុងឈាម ស្រដៀងទៅនឹង phage ប្រភេទព្រៃ និង 38.5 នាទីនៅក្នុង CSF ។សំណាកឈាម និងសារធាតុរាវ cerebrospinal phage ពីសត្វនីមួយៗត្រូវបានទទួលរងនូវ HTS ហើយ peptides ដែលត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណទាំងអស់ត្រូវបានវិភាគសម្រាប់វត្តមាននៃគំនូរ tripeptide ខ្លីមួយ។គំនូរ Tripeptide ត្រូវបានជ្រើសរើសព្រោះវាផ្តល់នូវមូលដ្ឋានតិចតួចបំផុតសម្រាប់ការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធ និងអន្តរកម្មនៃប្រូតេអ៊ីន peptide14,15។យើងបានរកឃើញទំនាក់ទំនងល្អក្នុងការចែកចាយគំនូររវាងបណ្ណាល័យ phage ដែលត្រូវបានចាក់ និងក្លូនដែលស្រង់ចេញពីឈាមរបស់សត្វទាំងពីរ (រូបទី 1e)។ទិន្នន័យបង្ហាញថា សមាសភាពនៃបណ្ណាល័យគឺសម្បូរទៅដោយផ្នែកឈាមតិចតួចប៉ុណ្ណោះ។ប្រេកង់អាស៊ីតអាមីណូ និងលំដាប់នៃការយល់ស្របត្រូវបានវិភាគបន្ថែមទៀតនៅទីតាំងនីមួយៗដោយប្រើការសម្របសម្រួលនៃកម្មវិធី Weblogo16 ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ យើងបានរកឃើញការពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំងក្លានៅក្នុងសំណល់គ្លីសេរីនក្នុងឈាម (រូបភាព 1 ក្រាម)។នៅពេលដែលឈាមត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយនឹងក្លូនដែលបានជ្រើសរើសពី CSF ការជ្រើសរើសខ្លាំង និងការលុបចោលគំនូរមួយចំនួនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ (រូបភាពទី 1f) ហើយអាស៊ីតអាមីណូមួយចំនួនមានវត្តមានជាអាទិភាពនៅទីតាំងដែលបានកំណត់ទុកជាមុនក្នុងសមាជិក 12 នាក់ (រូបភាព 1 ម៉ោង)។គួរកត់សម្គាល់ថាសត្វនីមួយៗមានភាពខុសគ្នាយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal ចំណែកឯការបង្កើនជាតិស្ករក្នុងឈាមត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងសត្វទាំងពីរ (រូបភាពបន្ថែម 4a-j) ។បន្ទាប់ពីការត្រងតឹងរ៉ឹងនៃទិន្នន័យលំដាប់នៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal របស់សត្វ #1.1 និង #1.2 សរុប 964 និង 420 peptides 12-mer តែមួយគត់ត្រូវបានទទួល (រូបភាពបន្ថែម 1d-e)។ក្លូន phage ដាច់ស្រយាលត្រូវបានពង្រីក និងត្រូវបានឆ្លងកាត់ការជ្រើសរើសជុំទីពីរនៅក្នុង vivo ។Phage ដែលត្រូវបានដកស្រង់ចេញពីការជ្រើសរើសជុំទីពីរត្រូវបានទទួលរងនូវ HTS នៅក្នុងសត្វនីមួយៗ ហើយ peptides ដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណទាំងអស់ត្រូវបានប្រើជាធាតុបញ្ចូលទៅក្នុងកម្មវិធីសម្គាល់គំនូរដើម្បីវិភាគការកើតឡើងនៃគំនូរ tripeptide (រូបភាព 2a, b, ef) ។បើប្រៀបធៀបទៅនឹងវដ្តដំបូងនៃ phage ដែលទទួលបានពី CSF យើងបានសង្កេតឃើញការជ្រើសរើសបន្ថែមទៀត និងការលុបចោលនូវគំនូរជាច្រើននៅក្នុង CSF នៅក្នុងសាខា A និង B (រូបភាព 2)។ក្បួនដោះស្រាយការកំណត់អត្តសញ្ញាណបណ្តាញត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីកំណត់ថាតើពួកវាតំណាងឱ្យលំនាំផ្សេងគ្នានៃលំដាប់ស្រប។ភាពស្រដៀងគ្នាច្បាស់លាស់មួយត្រូវបានគេសង្កេតឃើញរវាងលំដាប់ 12 វិមាត្រដែលបានរកឃើញដោយ CSF នៅក្នុងក្របជំនួស A (រូបភាព 2c, d) និង clade B (រូបភាព 2g, h)។ការវិភាគរួមបញ្ចូលគ្នានៅក្នុងសាខានីមួយៗបានបង្ហាញពីទម្រង់នៃការជ្រើសរើសខុសៗគ្នាសម្រាប់ peptides 12-mer (រូបភាពបន្ថែម 5c,d) និងការកើនឡើងនៃសមាមាត្រ CSF/blood titer តាមពេលវេលាសម្រាប់ការក្លូនរួមបញ្ចូលគ្នាបន្ទាប់ពីជុំទីពីរនៃការជ្រើសរើសបើប្រៀបធៀបទៅនឹងជុំទីមួយនៃការជ្រើសរើស (រូបភាពបន្ថែម 5e)។)
ការបង្កើនគំនូរ និង peptides នៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal ដោយពីរជុំបន្តបន្ទាប់គ្នានៃជម្រើសអេក្រង់ phage មុខងារ vivo ។
phages សារធាតុរាវ cerebrospinal ទាំងអស់ដែលបានជាសះស្បើយពីជុំទីមួយនៃសត្វនីមួយៗ (សត្វ #1.1 និង #1.2) ត្រូវបានបញ្ចូលគ្នា ពង្រីក HT-sequenced និងចាក់បញ្ចូលជាមួយគ្នា (2 x 1010 phages/animal) 2 SM cannulated rats (#1.1 → #)។2.1 និង 2.2, 1.2 → 2.3 និង 2.4) ។(a, b, e, f) គ្រោងការជាប់ទាក់ទងគ្នាដែលប្រៀបធៀបប្រេកង់ដែលទាក់ទងនៃគំនូរ tripeptide នៃ phages ដែលបានមកពី CSF ទាំងអស់នៅក្នុងជុំជ្រើសរើសទីមួយ និងទីពីរ។ប្រេកង់ដែលទាក់ទង និងការចែកចាយនៃគំនូរដែលតំណាងឱ្យ tripeptides ត្រួតស៊ីគ្នាទាំងអស់ដែលអាចរកបាននៅក្នុង peptides ក្នុងទិសដៅទាំងពីរ។ចំនួននៃគំនូរដែលបានរកឃើញនៅក្នុងការអាន 1000 ត្រូវបានបង្ហាញ។គំនូរដែលត្រូវបានជ្រើសរើសយ៉ាងសំខាន់ (p < 0.001) ត្រូវបានជ្រើសរើស ឬដកចេញនៅក្នុងបណ្ណាល័យមួយក្នុងចំណោមបណ្ណាល័យដែលបានប្រៀបធៀបនោះ ត្រូវបានរំលេចដោយចំណុចក្រហម។(c, d, g, h) និមិត្តសញ្ញាលំដាប់តំណាងនៃអាស៊ីតអាមីណូទាំង 12 ដែលសំបូរទៅដោយ CSF ទាំងអស់ ដោយផ្អែកលើជុំទី 2 និងទី 1 នៃការជ្រើសរើស vivo ។ទំហំ​នៃ​កូដ​មួយ​អក្សរ​បង្ហាញ​ពី​ចំនួន​ញឹកញាប់​ដែល​អាស៊ីត​អាមីណូ​កើតឡើង​នៅ​ទីតាំង​នោះ។ដើម្បីតំណាងឱ្យរូបសញ្ញា ភាពញឹកញាប់នៃលំដាប់ CSF ដែលស្រង់ចេញពីសត្វនីមួយៗរវាងជុំជ្រើសរើសពីរត្រូវបានប្រៀបធៀប ហើយលំដាប់ដែលសំបូរទៅដោយនៅក្នុងជុំទីពីរត្រូវបានបង្ហាញ៖ (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 និង (h) #1.2–#2.4។អាស៊ីតអាមីណូដែលសំបូរជាងគេនៅទីតាំងដែលបានផ្តល់ឱ្យនៅក្នុងសត្វ (គ, ឃ) លេខ។2.1 និងទេ។2.2 ឬ (g, h) នៅក្នុងសត្វ No.2.3 និងទេ។2.4 ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌។បៃតង = ប៉ូល, ពណ៌ស្វាយ = អព្យាក្រឹត, ខៀវ = មូលដ្ឋាន, ក្រហម = អាសុីត និងខ្មៅ = អាស៊ីតអាមីណូ hydrophobic ។
បន្ទាប់ពីជុំទី 3 នៃការជ្រើសរើស យើងបានរកឃើញលំដាប់ peptide តែមួយគត់ 124 (#3.1 និង #3.2) ពី 332 CSF-reconstituted phage clones ដាច់ដោយឡែកពីសត្វពីរ (រូបភាពបន្ថែម 6a)។លំដាប់ LGSVS (18.7%) មានសមាមាត្រដែលទាក់ទងខ្ពស់បំផុត បន្ទាប់មកដោយការបញ្ចូលប្រភេទព្រៃ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) និង SARGSWREIVSLS (2.2%)។នៅក្នុងជុំទី 4 ចុងក្រោយ យើងបានប្រមូលផ្តុំសាខាពីរដែលជ្រើសរើសដោយឯករាជ្យពីសត្វបីដាច់ដោយឡែកពីគ្នា (រូបភាព 1c) ។ក្នុងចំណោម 925 បណ្តុំ phage បន្តបន្ទាប់គ្នាដែលបានរកឃើញពី CSF នៅជុំទី 4 យើងបានរកឃើញ 64 លំដាប់ peptide តែមួយគត់ (រូបភាពបន្ថែម 6b) ដែលក្នុងនោះសមាមាត្រដែលទាក់ទងនៃ phage ប្រភេទព្រៃបានធ្លាក់ចុះដល់ 0.8% ។ក្លូន CSF ទូទៅបំផុតនៅក្នុងជុំទី 4 គឺ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) និង RLSSVDSDL2%) (3, RLSSVDSDLSGC)។%)).ជួរប្រវែងនៃ peptides ដែលបានជ្រើសរើសគឺដោយសារតែការបញ្ចូល/លុប nucleotide ឬ codons បញ្ឈប់មិនគ្រប់ខែនៅក្នុងបណ្ណាល័យ primers នៅពេលប្រើ codons degenerate សម្រាប់ការរចនាបណ្ណាល័យ NNK ។codons បញ្ឈប់មុនអាយុបង្កើត peptides ខ្លីជាង ហើយត្រូវបានជ្រើសរើស ដោយសារពួកវាមាន aa motif អំណោយផល។peptides យូរជាងនេះអាចបណ្តាលមកពីការបញ្ចូល/លុបនៅក្នុង primers នៃបណ្ណាល័យសំយោគ។វាកំណត់ទីតាំង stop codon ដែលបានរចនានៅខាងក្រៅស៊ុម ហើយអានវារហូតទាល់តែ stop codon ថ្មីលេចឡើងនៅខាងក្រោម។ជាទូទៅ យើងបានគណនាកត្តាពង្រឹងសម្រាប់ជុំជ្រើសរើសទាំងបួនដោយប្រៀបធៀបទិន្នន័យបញ្ចូលជាមួយនឹងទិន្នន័យលទ្ធផលគំរូ។សម្រាប់ការបញ្ចាំងជុំទីមួយ យើងបានប្រើប្រភេទ phage titers ជាឯកសារយោងផ្ទៃខាងក្រោយមិនជាក់លាក់។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ការជ្រើសរើស phage អវិជ្ជមានគឺខ្លាំងនៅក្នុងវដ្ត CSF ដំបូង ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុងឈាមទេ (រូបភាពទី 3a) ដែលអាចបណ្តាលមកពីប្រូបាប៊ីលីតេទាបនៃការសាយភាយអកម្មនៃសមាជិកភាគច្រើននៃបណ្ណាល័យ peptide ទៅក្នុង CSF compartment ឬ phages ដែលទាក់ទងគ្នាទំនងជាត្រូវបានរក្សាទុកឬដកចេញពីចរន្តឈាមយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាពជាង bacteriophages ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយនៅក្នុងជុំទីពីរនៃការ panning ការជ្រើសរើសដ៏ខ្លាំងនៃ phages នៅក្នុង CSF ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុង clades ទាំងពីរដែលបង្ហាញថាជុំមុនគឺសំបូរទៅដោយ phages ដែលបង្ហាញពី peptides ដែលជំរុញការស្រូបយក CSF (រូបភាព 3a) ។ជាថ្មីម្តងទៀតដោយគ្មានការបង្កើនឈាមដ៏សំខាន់។ផងដែរនៅក្នុងជុំទី 3 និងទី 4 ក្លូន phage ត្រូវបានពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង CSF ។ការប្រៀបធៀបប្រេកង់ដែលទាក់ទងគ្នានៃលំដាប់ peptide នីមួយៗរវាងការជ្រើសរើសពីរជុំចុងក្រោយ យើងបានរកឃើញថា លំដាប់នេះកាន់តែមានភាពសម្បូរបែបនៅក្នុងជុំទី 4 នៃការជ្រើសរើស (រូបភាព 3b) ។គំនូរ tripeptide សរុបចំនួន 931 ត្រូវបានស្រង់ចេញពីលំដាប់ peptide តែមួយគត់ទាំង 64 ដោយប្រើការតំរង់ទិស peptide ទាំងពីរ។គំនូរដែលសម្បូរបែបបំផុតនៅក្នុងជុំទី 4 ត្រូវបានពិនិត្យយ៉ាងដិតដល់ជាងមុនសម្រាប់ទម្រង់ការពង្រឹងរបស់ពួកគេនៅគ្រប់ជុំបើប្រៀបធៀបទៅនឹងបណ្ណាល័យដែលបានចាក់បញ្ចូល (កាត់ផ្តាច់: ការពង្រឹង 10%) (រូបភាពបន្ថែម 6c) ។គំរូទូទៅនៃការជ្រើសរើសបានបង្ហាញថា ភាគច្រើននៃការជម្រុញដែលបានសិក្សាត្រូវបានពង្រឹងនៅក្នុងជុំមុនទាំងអស់នៃសាខាជ្រើសរើសទាំងពីរ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ គំនូរមួយចំនួន (ឧទាហរណ៍ SGL, VSG, LGS GSV) មានច្រើនលើសលុបពីក្ដាប់ជំនួស A ខណៈពេលដែលគំនូរផ្សេងទៀត (ឧទាហរណ៍ FGW, RTN, WGF, NTR) ត្រូវបានបង្កើននៅក្នុងក្របជំនួស B ។
សុពលភាពនៃការដឹកជញ្ជូន CSF នៃ peptides បង្ហាញ phage ដែលសំបូរទៅដោយ CSF និង peptides អ្នកដឹកនាំ biotinylated ដែលភ្ជាប់ទៅបន្ទុក streptavidin ។
(a) អនុបាតការពង្រឹងដែលបានគណនាក្នុងជុំទាំងបួន (R1-R4) ដោយផ្អែកលើការបញ្ចូល (បញ្ចូល = I) phage (PFU) titers និងបានកំណត់ CSF phage titers (ទិន្នផល = O) ។កត្តាពង្រឹងសម្រាប់ជុំបីចុងក្រោយ (R2-R4) ត្រូវបានគណនាដោយការប្រៀបធៀបជាមួយនឹងជុំមុន និងជុំទីមួយ (R1) ជាមួយនឹងទិន្នន័យទម្ងន់។របារបើកចំហគឺជាសារធាតុរាវ cerebrospinal, របារស្រមោលគឺជាប្លាស្មា។(***p<0.001, ផ្អែកលើ t-test របស់សិស្ស)។(b) បញ្ជីនៃ phage peptides ដែលមានច្រើនក្រៃលែងបំផុត ចាត់ចំណាត់ថ្នាក់តាមសមាមាត្រដែលទាក់ទងរបស់ពួកគេទៅនឹង phage ទាំងអស់ដែលប្រមូលបាននៅក្នុង CSF បន្ទាប់ពីជុំទី 4 នៃការជ្រើសរើស។ក្លូន phage ទូទៅបំផុតចំនួនប្រាំមួយត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ លេខរៀង និងកត្តាពង្រឹងរបស់ពួកគេនៅចន្លោះជុំទី 3 និងទី 4 នៃការជ្រើសរើស (inset)។(c,d) ក្លូន phage ដ៏សំបូរបែបបំផុតចំនួនប្រាំមួយ ផាចទទេ និងបណ្ណាល័យ peptide phage ឪពុកម្តាយពីជុំទី 4 ត្រូវបានវិភាគជាលក្ខណៈបុគ្គលនៅក្នុងគំរូគំរូ CSF ។CSF និងសំណាកឈាមត្រូវបានប្រមូលនៅចំណុចពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។(គ) បរិមាណស្មើគ្នានៃ 6 phage clones បេក្ខជន (2 x 1010 phages/animals), phaages ទទេ (#1779) (2 x 1010 phages/animals) និង stock phage peptide libraries (2 x 1012 phages/animals) ចាក់យ៉ាងហោចណាស់ 3 CM ត្រូវបានគ្រប់គ្រងទៅលើសត្វដែលបំបែកដោយ cannulated ។ឱសថស្ថាន CSF នៃក្លូន phage ដែលត្រូវបានចាក់នីមួយៗ និងបណ្ណាល័យ phage peptide តាមពេលវេលាត្រូវបានបង្ហាញ។(d) បង្ហាញសមាមាត្រ CSF/ឈាមជាមធ្យមសម្រាប់ phages/mL ដែលបានជាសះស្បើយទាំងអស់ក្នុងរយៈពេលគំរូ។(ង) សារធាតុ peptides អ្នកដឹកនាំសំយោគចំនួនបួន និងការគ្រប់គ្រងច្របូកច្របល់មួយត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹង biotin ទៅ streptavidin តាមរយៈ N-terminus របស់ពួកគេ (ការបង្ហាញ tetramer) អមដោយការចាក់ (tail vein iv, 10 mg streptavidin/kg) ។យ៉ាងហោចណាស់សត្វកណ្តុរបីក្បាល (N = 3) ។)សំណាក CSF ត្រូវបានប្រមូលតាមពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញ ហើយកំហាប់ streptavidin ត្រូវបានវាស់ដោយ CSF anti-streptavidin ELISA (nd = មិនត្រូវបានរកឃើញ) ។(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 ផ្អែកលើការធ្វើតេស្ត ANOVA)។(f) ការប្រៀបធៀបនៃលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូនៃក្លូន phage peptide ដ៏សម្បូរបែបបំផុត #2002 (ពណ៌ស្វាយ) ជាមួយនឹងក្លូន phage peptide ដែលបានជ្រើសរើសផ្សេងទៀតពីជុំទី 4 នៃការជ្រើសរើស។បំណែកអាស៊ីតអាមីណូដូចគ្នា និងស្រដៀងគ្នាត្រូវបានសរសេរកូដពណ៌។
ក្នុងចំណោម phages ដែលត្រូវបានពង្រឹងទាំងអស់នៅក្នុងជុំទី 4 (រូបភាព 3b) ក្លូនបេក្ខជនចំនួនប្រាំមួយត្រូវបានជ្រើសរើសសម្រាប់ការវិភាគបុគ្គលបន្ថែមទៀតនៅក្នុងគំរូគំរូ CSF ។បរិមាណស្មើគ្នានៃ phage បេក្ខជនប្រាំមួយ, phage ទទេ (គ្មានការបញ្ចូល) និង prophage peptide libraries ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងសត្វ CM បី cannulated ហើយ pharmacokinetics ត្រូវបានកំណត់នៅក្នុង CSF (Fig ។ 3c) និងឈាម (រូបភាពបន្ថែម 7) ការវិភាគ។ក្លូន phage ទាំងអស់ដែលបានសាកល្បងបានកំណត់គោលដៅនៃផ្នែក CSF នៅកម្រិត 10-1000 ដងខ្ពស់ជាងកម្រិតនៃការគ្រប់គ្រងទទេ (#1779) ។ឧទាហរណ៍ ក្លូន #2020 និង #2077 មាន CSF titers ប្រហែល 1000 ដងខ្ពស់ជាង control phage ។ទម្រង់ pharmacokinetic នៃ peptide ដែលបានជ្រើសរើសនីមួយៗគឺខុសគ្នា ប៉ុន្តែពួកវាទាំងអស់មានសមត្ថភាព CSF homeing ខ្ពស់។យើងបានសង្កេតឃើញថាមានការថយចុះជាបន្តបន្ទាប់សម្រាប់ក្លូន #1903 និង #2011 ខណៈពេលដែលក្លូន #2077, #2002 និង #2009 ការកើនឡើងក្នុងអំឡុងពេល 10 នាទីដំបូងអាចបង្ហាញពីការដឹកជញ្ជូនសកម្ម ប៉ុន្តែចាំបាច់ត្រូវផ្ទៀងផ្ទាត់។ក្លូន #2020, #2002 និង #2077 មានស្ថេរភាពក្នុងកម្រិតខ្ពស់ ខណៈពេលដែលកំហាប់ CSF នៃក្លូន #2009 បានថយចុះបន្តិចម្តងៗ បន្ទាប់ពីការកើនឡើងដំបូង។បន្ទាប់មកយើងប្រៀបធៀបប្រេកង់ដែលទាក់ទងនៃបេក្ខជន CSF នីមួយៗជាមួយនឹងកំហាប់ឈាមរបស់វា (រូបភាព 3d)។ការជាប់ទាក់ទងគ្នានៃ titer មធ្យមរបស់បេក្ខជន CSF នីមួយៗជាមួយនឹងឈាមរបស់វានៅគ្រប់ពេលនៃការធ្វើតេស្តបានបង្ហាញថាបេក្ខជនបីនាក់ក្នុងចំណោម 6 នាក់ត្រូវបានពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងឈាម CSF ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ក្លូន #2077 បានបង្ហាញពីស្ថេរភាពឈាមខ្ពស់ (រូបភាពបន្ថែម 7) ។ដើម្បីបញ្ជាក់ថា peptides ខ្លួនឯងមានសមត្ថភាពដឹកជញ្ជូនទំនិញយ៉ាងសកម្មក្រៅពីភាគល្អិត phage ចូលទៅក្នុងបន្ទប់ CSF យើងបានសំយោគ peptides នាំមុខចំនួន 4 ដែលបានមកពី biotin នៅ N-terminus ដែល peptides ភ្ជាប់ទៅនឹងភាគល្អិត phage ។Biotinylated peptides (nos. 2002, 2009, 2020 និង 2077) ត្រូវបានផ្សំជាមួយ streptavidin (SA) ដើម្បីទទួលបានទម្រង់ multimeric ដែលធ្វើត្រាប់តាមធរណីមាត្រ phage ។ទម្រង់នេះក៏អនុញ្ញាតឱ្យយើងវាស់ស្ទង់ការប៉ះពាល់ SA នៅក្នុងឈាម និងសារធាតុរាវ cerebrospinal ជា peptides ប្រូតេអ៊ីនដឹកជញ្ជូនទំនិញ។សំខាន់ ទិន្នន័យ phage ជាញឹកញាប់អាចត្រូវបានផលិតឡើងវិញនៅពេលដែល peptides សំយោគត្រូវបានគ្រប់គ្រងក្នុងទម្រង់ SA-conjugated នេះ (រូបភាព 3e)។peptides ច្របល់មានការប៉ះពាល់ដំបូងតិចជាង និងការបោសសំអាត CSF លឿនជាងមុន ជាមួយនឹងកម្រិតមិនអាចរកឃើញក្នុងរយៈពេល 48 ម៉ោង។ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងអំពីផ្លូវបញ្ជូននៃក្លូន peptide phage ទាំងនេះទៅក្នុងលំហ CSF យើងបានវិភាគការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៃ phage peptide hits បុគ្គលដោយប្រើ immunohistochemistry (IHC) ដើម្បីរកឃើញភាគល្អិត phage ដោយផ្ទាល់ 1 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាមនៅក្នុង vivo ។គួរកត់សម្គាល់ថាក្លូន #2002, #2077, និង #2009 អាចត្រូវបានរកឃើញដោយស្នាមប្រឡាក់ខ្លាំងនៅក្នុងសរសៃឈាមខួរក្បាល ខណៈពេលដែលការគ្រប់គ្រង phage (#1779) និងក្លូន #2020 មិនត្រូវបានរកឃើញទេ (រូបភាពបន្ថែម 8)។នេះបង្ហាញថា peptides ទាំងនេះរួមចំណែកដល់ឥទ្ធិពលលើខួរក្បាលយ៉ាងជាក់លាក់តាមរយៈការឆ្លងកាត់ BBB ។ការវិភាគលម្អិតបន្ថែមទៀតគឺត្រូវបានទាមទារដើម្បីសាកល្បងសម្មតិកម្មនេះ ព្រោះផ្លូវ BSCFB ក៏អាចពាក់ព័ន្ធផងដែរ។នៅពេលប្រៀបធៀបលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូនៃក្លូនដែលសំបូរសារធាតុចិញ្ចឹមច្រើនបំផុត (#2002) ជាមួយ peptides ដែលបានជ្រើសរើសផ្សេងទៀត វាត្រូវបានគេកត់សម្គាល់ថាពួកវាមួយចំនួនមានផ្នែកបន្ថែមអាស៊ីតអាមីណូស្រដៀងគ្នា ដែលអាចបង្ហាញពីយន្តការដឹកជញ្ជូនស្រដៀងគ្នា (រូបភាព 3f)។
ដោយសារតែទម្រង់ប្លាស្មាតែមួយគត់របស់វា និងការកើនឡើងយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុង CSF ក្នុងរយៈពេលកន្លងមក ក្លូនការបង្ហាញ phage #2077 ត្រូវបានរុករកបន្ថែមទៀតក្នុងរយៈពេល 48 ម៉ោងយូរជាងនេះ ហើយអាចបង្កើតឡើងវិញនូវការកើនឡើងយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃ CSF ដែលសង្កេតឃើញទាក់ទងនឹងកម្រិត SA ដែលមាននិរន្តរភាព (រូបភាព 4a)។ទាក់ទងនឹងក្លូន phage ផ្សេងទៀតដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ #2077 បានប្រឡាក់យ៉ាងខ្លាំងសម្រាប់សរសៃឈាមខួរក្បាល និងបានបង្ហាញពីការធ្វើឱ្យមានពណ៌ចម្រុះយ៉ាងសំខាន់ជាមួយនឹង capillary marker lectin នៅពេលមើលនៅកម្រិតច្បាស់ខ្ពស់ និងអាចមានស្នាមប្រឡាក់ខ្លះនៅក្នុងចន្លោះ parenchymal (រូបភាពទី 4b) ។ដើម្បីស៊ើបអង្កេតថាតើឥទ្ធិពលឱសថសាស្រ្តដែលសម្របសម្រួលដោយ peptide អាចទទួលបាននៅក្នុង CNS ដែរឬទេ យើងបានធ្វើការពិសោធន៍មួយដែលក្នុងនោះ biotinylated versions នៃ i) the #2077 transit peptide និង ii) BACE1 inhibitor peptide ត្រូវបានលាយជាមួយ SA ក្នុងសមាមាត្រពីរផ្សេងគ្នា។សម្រាប់ការរួមបញ្ចូលគ្នាមួយ យើងប្រើតែ BACE1 peptide inhibitor ហើយសម្រាប់មួយទៀត យើងបានប្រើសមាមាត្រ 1:3 នៃ BACE1 peptide inhibitor ទៅ #2077 peptide ។សំណាកទាំងពីរត្រូវបានចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាម ហើយកម្រិតឈាម និងសារធាតុរាវ cerebrospinal នៃ beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) ត្រូវបានវាស់តាមពេលវេលា។Abeta40 ត្រូវបានវាស់នៅក្នុង CSF ព្រោះវាឆ្លុះបញ្ចាំងពីការរារាំង BACE1 នៅក្នុង parenchyma ខួរក្បាល។ដូចដែលបានរំពឹងទុក ស្មុគ្រស្មាញទាំងពីរបានកាត់បន្ថយកម្រិតឈាមរបស់ Abeta40 យ៉ាងខ្លាំង (រូបភាព 4c, ឃ)។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ មានតែសំណាកដែលមានល្បាយនៃ peptide no.2077 និងសារធាតុ inhibitor នៃ BACE1 peptide conjugated ទៅ SA បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃ Abeta40 នៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal (រូបភាព 4c) ។ទិន្នន័យបង្ហាញថា peptide no.2077 អាចដឹកជញ្ជូនប្រូតេអ៊ីន 60 kDa SA ចូលទៅក្នុង CNS ហើយថែមទាំងបង្កើតឥទ្ធិពលឱសថសាស្ត្រជាមួយនឹង SA-conjugated inhibitors នៃ BACE1 peptide ។
(ក) ការចាក់ថ្នាំ Clonal (2 × 10 phages/animal) នៃ T7 phage បង្ហាញទម្រង់ pharmacokinetic រយៈពេលវែងនៃ CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) និង uninjected control phage (#1779) នៅក្នុងកណ្តុរយ៉ាងហោចណាស់បី CM-intubated ។(ខ) រូបភាពមីក្រូទស្សន៍បង្រួបបង្រួមនៃ microvessels cortical តំណាងនៅក្នុងកណ្តុរដែលចាក់បញ្ចូល phage (2 × 10 10 phages / សត្វ) ដែលបង្ហាញពីការប្រឆាំងនៃ peptide #2077 និងនាវា (lectin) ។ក្លូន phage ទាំងនេះត្រូវបានគ្រប់គ្រងទៅកណ្តុរចំនួន 3 ហើយត្រូវបានអនុញ្ញាតឱ្យចរាចររយៈពេល 1 ម៉ោងមុនពេលបញ្ចូល។ខួរក្បាលត្រូវបានកាត់ជាផ្នែក និងប្រឡាក់ដោយអង្គបដិប្រាណដែលមានស្លាក polyclonal FITC ប្រឆាំងនឹង T7 phage capsid ។10 នាទីមុនពេលចាក់បញ្ចូល និងជួសជុលជាបន្តបន្ទាប់ ឡេកទីនដែលមានស្លាក DyLight594 ត្រូវបានគ្រប់គ្រងតាមសរសៃឈាម។រូបភាព fluorescent ដែលបង្ហាញពីស្នាមប្រឡាក់ lectin (ក្រហម) នៃផ្នែកខាង luminal នៃ microvessels និង phages (ពណ៌បៃតង) នៅក្នុង lumen នៃ capillaries និង perivascular ជាលិកាខួរក្បាល។របារមាត្រដ្ឋានត្រូវគ្នាទៅនឹង 10 µm ។(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide តែឯង ឬរួមផ្សំជាមួយ biotinylated transit peptide #2077 ត្រូវបានផ្សំជាមួយ streptavidin អមដោយការចាក់តាមសរសៃឈាមរបស់កណ្តុរ CM cannulated យ៉ាងតិចបី (10 mg streptavidin/kg)។ការកាត់បន្ថយ BACE1 peptide inhibitor-mediated នៅក្នុងAβ40 ត្រូវបានវាស់ដោយAβ1-40 ELISA នៅក្នុងឈាម (ក្រហម) និងសារធាតុរាវ cerebrospinal (ពណ៌ទឹកក្រូច) នៅចំណុចពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។សម្រាប់ភាពច្បាស់លាស់កាន់តែប្រសើរ បន្ទាត់ចំនុចត្រូវបានគូសនៅលើក្រាហ្វក្នុងមាត្រដ្ឋាន 100% ។(គ) ការថយចុះភាគរយនៃAβ40ក្នុងឈាម (ត្រីកោណក្រហម) និងសារធាតុរាវ cerebrospinal (ត្រីកោណពណ៌ទឹកក្រូច) ចំពោះសត្វកណ្តុរដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយថ្នាំ streptavidin ដែលផ្សំជាមួយ transit peptide #2077 និង BACE1 inhibitory peptide ក្នុងសមាមាត្រ 3:1។(ឃ) ការថយចុះភាគរយនៃឈាមAβ40 (រង្វង់ក្រហម) និងសារធាតុរាវ cerebrospinal (រង្វង់ពណ៌ទឹកក្រូច) របស់សត្វកណ្តុរដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយថ្នាំ streptavidin រួមជាមួយនឹង BACE1 inhibitory peptide តែប៉ុណ្ណោះ។កំហាប់Aβនៅក្នុងវត្ថុបញ្ជាគឺ 420 pg/ml (គម្លាតស្តង់ដារ = 101 pg/ml) ។
ការបង្ហាញ Phage ត្រូវបានអនុវត្តដោយជោគជ័យនៅក្នុងផ្នែកជាច្រើននៃការស្រាវជ្រាវជីវវេជ្ជសាស្ត្រ17.វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការសិក្សាអំពីភាពចម្រុះនៃសរសៃឈាម vivo 18,19 ក៏ដូចជាការសិក្សាដែលផ្តោតលើនាវាខួរក្បាល 20,21,22,23,24,25,26។នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានពង្រីកការអនុវត្តវិធីសាស្រ្តជ្រើសរើសនេះមិនត្រឹមតែចំពោះការកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយផ្ទាល់នៃ peptides កំណត់គោលដៅលើនាវាខួរក្បាលប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងការរកឃើញបេក្ខជនដែលមានលក្ខណៈសម្បត្តិដឹកជញ្ជូនសកម្មដើម្បីឆ្លងកាត់របាំងឈាមខួរក្បាលផងដែរ។ឥឡូវនេះ យើងពណ៌នាអំពីការអភិវឌ្ឍន៍នៃនីតិវិធីជ្រើសរើសនៅក្នុង vivo នៅក្នុងកណ្តុរ CM intubated និងបង្ហាញពីសក្តានុពលរបស់វាដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptides ជាមួយនឹងលក្ខណៈសម្បត្តិផ្ទះ CSF ។ដោយប្រើ T7 phage បង្ហាញបណ្ណាល័យនៃ peptides ចៃដន្យ 12-mer យើងអាចបង្ហាញថា T7 phage តូចល្មម (ប្រហែល 60 nm នៅក្នុងអង្កត់ផ្ចិត) 10 ដើម្បីសម្របទៅនឹងរបាំងឈាមខួរក្បាលដោយហេតុនេះឆ្លងកាត់របាំងឈាមខួរក្បាលឬ choroid plexus ដោយផ្ទាល់។យើងបានសង្កេតឃើញថា ការប្រមូលផល CSF ពីកណ្តុរ CM ដែលអាចគ្រប់គ្រងបានគឺជាវិធីសាស្ត្រត្រួតពិនិត្យមុខងាររបស់ vivo ហើយថា phage ដែលបានស្រង់ចេញមិនត្រឹមតែភ្ជាប់ទៅនឹងសរសៃឈាមប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែវាក៏មានមុខងារជាអ្នកដឹកជញ្ជូនឆ្លងកាត់របាំងឈាមខួរក្បាលផងដែរ។លើសពីនេះ តាមរយៈការប្រមូលឈាមក្នុងពេលដំណាលគ្នា និងអនុវត្ត HTS ទៅ CSF ​​និង phages ដែលបានមកពីឈាម យើងបានបញ្ជាក់ថាជម្រើសរបស់យើងនៃ CSF មិនត្រូវបានជះឥទ្ធិពលដោយការបង្កើនឈាម ឬសម្បទាសម្រាប់ការពង្រីករវាងជុំនៃការជ្រើសរើសនោះទេ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ បន្ទប់ឈាមគឺជាផ្នែកមួយនៃដំណើរការជ្រើសរើស ដោយសារ phages ដែលមានសមត្ថភាពឈានដល់ផ្នែក CSF ត្រូវតែរស់រានមានជីវិត និងចរាចរក្នុងចរន្តឈាមបានយូរគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីពង្រឹងខ្លួននៅក្នុងខួរក្បាល។ដើម្បីទាញយកព័ត៌មានលំដាប់លំដោយដែលអាចទុកចិត្តបានពីទិន្នន័យ HTS ឆៅ យើងបានអនុវត្តតម្រងដែលសម្របខ្លួនទៅនឹងកំហុសនៃលំដាប់ជាក់លាក់នៃវេទិកានៅក្នុងលំហូរការងារនៃការវិភាគ។ដោយការបញ្ចូលប៉ារ៉ាម៉ែត្រ kinetic ទៅក្នុងវិធីសាស្ត្រពិនិត្យ យើងបានបញ្ជាក់ពីឱសថការីយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃប្រភេទ T7 phages (t½ ~ 28 នាទី) នៅក្នុងឈាម 24, 27, 28 និងក៏បានកំណត់ពាក់កណ្តាលជីវិតរបស់ពួកគេនៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal (t½ ~ 26 នាទី) ក្នុងមួយនាទី)។ទោះបីជាទម្រង់ pharmacokinetic ស្រដៀងគ្នានៅក្នុងឈាម និង CSF ក៏ដោយ មានតែ 0.001% នៃកំហាប់ឈាមនៃ phage អាចត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង CSF ដែលបង្ហាញពីការចល័តផ្ទៃខាងក្រោយទាបនៃ phage ប្រភេទ wild-type T7 ឆ្លងកាត់របាំងឈាមខួរក្បាល។ការងារនេះបង្ហាញពីសារៈសំខាន់នៃការជ្រើសរើសជុំទីមួយ នៅពេលប្រើនៅក្នុងយុទ្ធសាស្រ្ត panning របស់ vivo ជាពិសេសសម្រាប់ប្រព័ន្ធ phage ដែលត្រូវបានសម្អាតយ៉ាងឆាប់រហ័សពីចរន្ត ព្រោះថាក្លូនមួយចំនួនអាចទៅដល់បន្ទប់ CNS ។ដូច្នេះហើយ នៅក្នុងជុំទីមួយ ការកាត់បន្ថយភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យគឺមានទំហំធំណាស់ ព្រោះមានតែចំនួនកំណត់នៃក្លូនប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រមូលជាចុងក្រោយនៅក្នុងគំរូ CSF ដ៏តឹងរឹងនេះ។នេះនៅក្នុងយុទ្ធសាស្រ្ត panning របស់ vivo រួមបញ្ចូលនូវជំហានជ្រើសរើសជាច្រើនដូចជា ការប្រមូលផ្តុំសកម្មនៅក្នុង CSF compartment ការរស់រានមានជីវិតរបស់ក្លូនក្នុងបន្ទប់ឈាម និងការដកចេញយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃ T7 phage clones ពីឈាមក្នុងរយៈពេល 10 នាទីដំបូង (រូបភាពទី 1 ឃ និងបន្ថែមរូបភាព 4M)។)ដូច្នេះបន្ទាប់ពីជុំទី 1 ក្លូន phage ផ្សេងគ្នាត្រូវបានកំណត់នៅក្នុង CSF ទោះបីជាអាងដំបូងដូចគ្នាត្រូវបានប្រើសម្រាប់សត្វនីមួយៗក៏ដោយ។នេះបង្ហាញថាជំហានជ្រើសរើសដ៏តឹងរ៉ឹងជាច្រើនសម្រាប់បណ្ណាល័យប្រភពដែលមានសមាជិកបណ្ណាល័យច្រើននាំឱ្យមានការកាត់បន្ថយភាពចម្រុះយ៉ាងច្រើន។ដូច្នេះ ព្រឹត្តិការណ៍ចៃដន្យនឹងក្លាយជាផ្នែកសំខាន់មួយនៃដំណើរការជ្រើសរើសដំបូង ដែលមានឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងទៅលើលទ្ធផល។វាទំនងជាថាក្លូនជាច្រើននៅក្នុងបណ្ណាល័យដើមមានទំនោរនៃការពង្រឹង CSF ស្រដៀងគ្នាខ្លាំងណាស់។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទោះបីជាស្ថិតក្រោមលក្ខខណ្ឌពិសោធន៍ដូចគ្នាក៏ដោយ លទ្ធផលជ្រើសរើសអាចខុសគ្នាដោយសារចំនួនតិចតួចនៃក្លូនជាក់លាក់នីមួយៗនៅក្នុងក្រុមដំបូង។
គំនូរដែលសំបូរទៅដោយ CSF ខុសពីវត្ថុដែលមាននៅក្នុងឈាម។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍, យើងបានកត់សម្គាល់ការផ្លាស់ប្តូរដំបូងឆ្ពោះទៅរក peptides សម្បូរ glycine នៅក្នុងឈាមរបស់សត្វបុគ្គល។(រូបភព 1g, រូបភពបន្ថែម។ 4e, 4f) ។Phage ដែលមានផ្ទុក glycine peptides អាចមានស្ថេរភាពជាង ហើយទំនងជាមិនត្រូវបានគេយកចេញពីឈាមរត់។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សារធាតុ peptides សម្បូរទៅដោយ glycine ទាំងនេះមិនត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសំណាកសារធាតុរាវ cerebrospinal ទេ ដោយបង្ហាញថាបណ្ណាល័យដែលបានរៀបចំបានឆ្លងកាត់ជំហានជ្រើសរើសពីរផ្សេងគ្នា៖ មួយនៅក្នុងឈាម និងមួយទៀតត្រូវបានអនុញ្ញាតឱ្យកកកុញនៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal ។ក្លូនដែលសំបូរទៅដោយ CSF ដែលកើតចេញពីការជ្រើសរើសជុំទី 4 ត្រូវបានសាកល្បងយ៉ាងទូលំទូលាយ។ស្ទើរតែទាំងអស់នៃក្លូនដែលបានសាកល្បងដោយឡែកពីគ្នាត្រូវបានបញ្ជាក់ថាត្រូវបានពង្រឹងនៅក្នុង CSF បើប្រៀបធៀបទៅនឹង blank control phage ។មួយ​ប៉ប្រិ​ត​បុក (#2077) ត្រូវ​បាន​ពិនិត្យ​លម្អិត​បន្ថែម​ទៀត​។វាបង្ហាញពីអាយុកាលពាក់កណ្តាលប្លាស្មាយូរជាងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងការទស្សនាផ្សេងទៀត (រូបភាពទី 3d និងរូបភាពបន្ថែម 7) ហើយគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ peptide នេះមានផ្ទុកនូវសំណល់ cysteine ​​​​នៅស្ថានីយ C ។ថ្មីៗនេះវាត្រូវបានបង្ហាញថាការបន្ថែម cysteine ​​​​ទៅ peptides អាចធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវលក្ខណៈសម្បត្តិ pharmacokinetic របស់ពួកគេដោយភ្ជាប់ទៅនឹងអាល់ប៊ុយមីន 29 ។បច្ចុប្បន្ន​នេះ​មិន​ទាន់​ដឹង​អំពី​សារធាតុ peptide #2077 ហើយ​ទាមទារ​ការ​សិក្សា​បន្ថែម​ទៀត។peptides មួយចំនួនបានបង្ហាញពីភាពអាស្រ័យ valence នៅក្នុងការបង្កើន CSF (ទិន្នន័យមិនត្រូវបានបង្ហាញ) ដែលប្រហែលជាទាក់ទងទៅនឹងធរណីមាត្រផ្ទៃដែលបានបង្ហាញនៃ T7 capsid ។ប្រព័ន្ធ T7 ដែលយើងប្រើបានបង្ហាញ 5-15 ច្បាប់ចម្លងនៃ peptide នីមួយៗក្នុងមួយភាគល្អិត phage ។IHC ត្រូវបានអនុវត្តលើក្លូន phage នាំមុខរបស់បេក្ខជនដែលចាក់តាមសរសៃឈាមចូលទៅក្នុងខួរក្បាលរបស់សត្វកណ្តុរ (រូបភាពបន្ថែម 8) ។ទិន្នន័យបានបង្ហាញថាយ៉ាងហោចណាស់ក្លូនបី (លេខ 2002 លេខ 2009 និងលេខ 2077) បានធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ BBB ។វានៅតែត្រូវកំណត់ថាតើអន្តរកម្ម BBB នេះនាំឱ្យមានការប្រមូលផ្តុំ CSF ឬចលនានៃក្លូនទាំងនេះដោយផ្ទាល់ទៅ BCSFB ដែរឬទេ។សំខាន់ យើងបង្ហាញថា peptides ដែលបានជ្រើសរើសរក្សានូវសមត្ថភាពដឹកជញ្ជូន CSF របស់ពួកគេ នៅពេលដែលសំយោគ និងចងភ្ជាប់ទៅនឹងទំនិញប្រូតេអ៊ីន។ការចង peptides biotinylated N-terminal ទៅ SA ធ្វើឡើងវិញនូវលទ្ធផលដែលទទួលបានជាមួយនឹង phage clones រៀងៗខ្លួននៅក្នុងឈាម និងសារធាតុរាវ cerebrospinal (រូបភាព 3e)។ជាចុងក្រោយ យើងបង្ហាញថា peptide នាំមុខ #2077 អាចលើកកម្ពស់សកម្មភាពខួរក្បាលរបស់ biotinylated peptide inhibitor នៃ BACE1 conjugated ទៅ SA ដែលបណ្តាលឱ្យមានផលប៉ះពាល់ pharmacodynamic យ៉ាងច្បាស់នៅក្នុង CNS ដោយកាត់បន្ថយកម្រិត Abeta40 នៅក្នុង CSF (រូបភាព 4)។យើងមិនអាចកំណត់អត្តសញ្ញាណភាពដូចគ្នាណាមួយនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យដោយធ្វើការស្វែងរកតាមលំដាប់ peptide នៃការទស្សនាទាំងអស់នោះទេ។វាជាការសំខាន់ក្នុងការកត់សម្គាល់ថាទំហំនៃបណ្ណាល័យ T7 គឺប្រហែល 109 ខណៈពេលដែលទំហំបណ្ណាល័យទ្រឹស្តីសម្រាប់ 12-mers គឺ 4 x 1015 ។ ដូច្នេះហើយ យើងជ្រើសរើសតែផ្នែកតូចមួយនៃចន្លោះភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យ peptide 12-mer ប៉ុណ្ណោះ ដែលអាចមានន័យថា peptides ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរជាងនេះអាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការវាយតម្លៃលំហដែលជាប់គ្នា។តាមសម្មតិកម្ម ហេតុផលមួយក្នុងចំណោមហេតុផលដែលយើងមិនបានរកឃើញភាពដូចគ្នាធម្មជាតិនៃ peptides ទាំងនេះអាចជាការលុបចោលការជ្រើសរើសក្នុងអំឡុងពេលការវិវត្តន៍ដើម្បីការពារការបញ្ចូលដែលមិនអាចគ្រប់គ្រងបាននៃគំនូរ peptides មួយចំនួនចូលទៅក្នុងខួរក្បាល។
រួមគ្នា លទ្ធផលរបស់យើងផ្តល់នូវមូលដ្ឋានសម្រាប់ការងារនាពេលអនាគតដើម្បីកំណត់ និងកំណត់លក្ខណៈប្រព័ន្ធដឹកជញ្ជូននៃរបាំងសរសៃឈាមខួរក្បាលនៅក្នុង vivo ឱ្យបានលម្អិតបន្ថែមទៀត។ការរៀបចំជាមូលដ្ឋាននៃវិធីសាស្រ្តនេះគឺផ្អែកលើយុទ្ធសាស្រ្តជ្រើសរើសមុខងារដែលមិនត្រឹមតែកំណត់អត្តសញ្ញាណក្លូនជាមួយនឹងលក្ខណៈសម្បត្តិនៃការភ្ជាប់សរសៃឈាមខួរក្បាលប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងរួមបញ្ចូលនូវជំហានដ៏សំខាន់ដែលក្លូនជោគជ័យមានសកម្មភាពខាងក្នុងដើម្បីឆ្លងកាត់របាំងជីវសាស្រ្តនៅក្នុង vivo ចូលទៅក្នុងផ្នែក CNS ។គឺដើម្បីបំភ្លឺយន្តការនៃការដឹកជញ្ជូន peptides ទាំងនេះ និងចំណូលចិត្តរបស់ពួកគេសម្រាប់ការផ្សារភ្ជាប់ទៅនឹង microvasculature ជាក់លាក់ទៅតំបន់ខួរក្បាល។នេះអាចនាំឱ្យមានការរកឃើញផ្លូវថ្មីសម្រាប់ការដឹកជញ្ជូន BBB និងអ្នកទទួល។យើងរំពឹងថា peptides ដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណអាចភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅនឹង cerebrovascular receptors ឬ ligands ចរាចរដែលដឹកជញ្ជូនតាមរយៈ BBB ឬ BCSFB ។វ៉ិចទ័រ peptide ជាមួយនឹងសកម្មភាពដឹកជញ្ជូន CSF ដែលបានរកឃើញនៅក្នុងការងារនេះនឹងត្រូវបានស៊ើបអង្កេតបន្ថែមទៀត។បច្ចុប្បន្នយើងកំពុងស៊ើបអង្កេតភាពជាក់លាក់ខួរក្បាលនៃ peptides ទាំងនេះសម្រាប់សមត្ថភាពរបស់ពួកគេក្នុងការឆ្លងកាត់ BBB និង/ឬ BCSFB ។peptides ថ្មីទាំងនេះនឹងក្លាយជាឧបករណ៍ដ៏មានតម្លៃបំផុតសម្រាប់ការរកឃើញសក្តានុពលនៃអ្នកទទួលថ្មី ឬផ្លូវ និងសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍនៃវេទិកាដែលមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ថ្មីសម្រាប់ការចែកចាយម៉ាក្រូម៉ូលេគុល ដូចជាជីវវិទ្យាទៅកាន់ខួរក្បាល។
កំណត់​ទ្រុង​ធំ (CM) ដោយ​ប្រើ​ការ​កែប្រែ​វិធីសាស្ត្រ​ដែល​បាន​ពិពណ៌នា​ពីមុន។កណ្តុរ Wistar ដែលត្រូវបានចាក់ថ្នាំស្ពឹក (200-350 ក្រាម) ត្រូវបានតំឡើងនៅលើឧបករណ៍ស្តេរ៉េអូតាកស៊ីក ហើយការវះកាត់មធ្យមត្រូវបានធ្វើឡើងនៅលើស្បែកក្បាលដែលកោរ និងរៀបចំដោយ aseptically ដើម្បីលាតត្រដាងលលាដ៍ក្បាល។ខួងរន្ធពីរនៅក្នុងតំបន់នៃខ្សែខាងលើ ហើយភ្ជាប់វីសជួសជុលនៅក្នុងរន្ធ។រន្ធ​បន្ថែម​មួយ​ត្រូវ​បាន​ខួង​នៅ​ផ្នែក​ខាង​ក្រោយ occipital crest សម្រាប់​ការ​ណែនាំ stereotactic នៃ cannula ដែក​អ៊ីណុក​ចូល​ទៅ​ក្នុង CM ។លាបស៊ីម៉ងត៍ធ្មេញជុំវិញ cannula និងធានាដោយវីស។បន្ទាប់ពីការកែច្នៃរូបថត និងការឡើងរឹងរបស់ស៊ីម៉ងត៍ របួសស្បែកត្រូវបានបិទជាមួយនឹង 4/0 supramid suture ។ការដាក់ត្រឹមត្រូវនៃ cannula ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការលេចធ្លាយដោយឯកឯងនៃសារធាតុរាវ cerebrospinal (CSF) ។យកសត្វកណ្ដុរចេញពីឧបករណ៍ស្តេរ៉េអូតាកស៊ីក ទទួលការថែទាំក្រោយការវះកាត់សមស្រប និងការគ្រប់គ្រងការឈឺចាប់ ហើយអនុញ្ញាតឱ្យវាជាសះស្បើយយ៉ាងហោចណាស់មួយសប្តាហ៍រហូតដល់មានសញ្ញានៃឈាមនៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal ។កណ្តុរ Wistar (Crl:WI/Han) ទទួលបានពី Charles River (ប្រទេសបារាំង)។សត្វកណ្ដុរទាំងអស់ត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌជាក់លាក់ដែលគ្មានមេរោគ។ការពិសោធន៍សត្វទាំងអស់ត្រូវបានអនុម័តដោយការិយាល័យពេទ្យសត្វនៃទីក្រុង Basel ប្រទេសស្វីស ហើយត្រូវបានអនុវត្តដោយអនុលោមតាមអាជ្ញាប័ណ្ណសត្វលេខ 2474 (ការវាយតម្លៃនៃការដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលសកម្មដោយការវាស់វែងកម្រិតនៃបេក្ខជនព្យាបាលនៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង និងខួរក្បាលរបស់កណ្តុរ)។
រក្សាសត្វកណ្តុរដោយថ្នមៗដោយប្រើ cannula CM នៅក្នុងដៃ។យក Datura ចេញពី cannula ហើយប្រមូល 10 µl នៃសារធាតុរាវ cerebrospinal ដែលហូរដោយឯកឯង។ដោយសារភាពធន់នៃ cannula ត្រូវបានសម្របសម្រួលនៅទីបំផុត មានតែសំណាកសារធាតុរាវ cerebrospinal ច្បាស់លាស់ដែលមិនមានភស្តុតាងនៃការចម្លងរោគនៃឈាម ឬការប្រែពណ៌ត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅក្នុងការសិក្សានេះ។ស្របគ្នានោះ ឈាមប្រមាណ ១០-២០ μl ត្រូវបានគេយកចេញពីស្នាមវះតូចមួយនៅចុងកន្ទុយ ចូលទៅក្នុងបំពង់ដែលមានសារធាតុ heparin (Sigma-Aldrich) ។CSF និងឈាមត្រូវបានប្រមូលតាមពេលវេលាផ្សេងៗគ្នាបន្ទាប់ពីការចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាមនៃ T7 phage ។ប្រហែល 5-10 μlនៃសារធាតុរាវត្រូវបានបោះចោលមុនពេលសំណាក CSF នីមួយៗត្រូវបានប្រមូល ដែលត្រូវនឹងបរិមាណដែលស្លាប់របស់បំពង់បូម។
បណ្ណាល័យត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើវ៉ិចទ័រ T7Select 10-3b ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសៀវភៅណែនាំប្រព័ន្ធ T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) ។ដោយសង្ខេប ការបញ្ចូល DNA ចៃដន្យ 12-mer ត្រូវបានសំយោគក្នុងទម្រង់ដូចខាងក្រោម៖
NNK codon ត្រូវបានប្រើដើម្បីជៀសវាង codons បញ្ឈប់ពីរដង និងការបញ្ចេញអាស៊ីតអាមីណូច្រើនពេកនៅក្នុងការបញ្ចូល។N គឺជាសមាមាត្រសមមូលចម្រុះដោយដៃនៃនុយក្លេអូទីតនីមួយៗ ហើយ K គឺជាសមាមាត្រសមមូលចម្រុះដោយដៃនៃនុយក្លេអូទីត adenine និង cytosine ។តំបន់ដែលមានខ្សែតែមួយត្រូវបានបំប្លែងទៅជា DNA ដែលជាប់គាំងពីរដងដោយការភ្ញាស់បន្ថែមជាមួយ dNTP (Novagen) និងអង់ស៊ីម Klenow (New England Biolabs) នៅក្នុង Klenow buffer (New England Biolabs) រយៈពេល 3 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C។បន្ទាប់​ពី​មាន​ប្រតិកម្ម DNA ខ្សែ​ពីរ​ត្រូវ​បាន​រក​ឃើញ​ដោយ​ទឹកភ្លៀង EtOH ។DNA លទ្ធផលត្រូវបានរំលាយដោយអង់ស៊ីមកម្រិត EcoRI និង HindIII (ទាំងពីរមកពី Roche) ។ការបញ្ចូលដែលបានសម្អាត និងបន្សុត (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) ត្រូវបានភ្ជាប់ក្នុងស៊ុមទៅជាវ៉ិចទ័រ T7 ដែលត្រូវបានសម្អាតមុនបន្ទាប់ពីអាស៊ីតអាមីណូ 348 នៃហ្សែន 10B capsid ។ប្រតិកម្ម Ligation ត្រូវបាន incubated នៅ 16 ° C. សម្រាប់រយៈពេល 18 ម៉ោងមុនពេលការវេចខ្ចប់នៅក្នុង vitro ។ការវេចខ្ចប់ phage នៅក្នុង vitro ត្រូវបានអនុវត្តដោយយោងតាមការណែនាំដែលបានផ្គត់ផ្គង់ជាមួយឧបករណ៍ក្លូន T7Select 10-3b (Novagen) ហើយដំណោះស្រាយវេចខ្ចប់ត្រូវបានពង្រីកម្តងដើម្បី lysis ដោយប្រើ Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ។lysates ត្រូវបាន centrifuged, titrated និង កកនៅ -80 ° C. ជាដំណោះស្រាយស្តុកនៃ glycerol ។
ការពង្រីក PCR ដោយផ្ទាល់នៃតំបន់អថេរ phage ត្រូវបានពង្រីកនៅក្នុងទំពាំងបាយជូរ ឬចានដោយប្រើ 454/Roche-amplicon fusion primers ដែលមានកម្មសិទ្ធិ។primer fusion ឆ្ពោះទៅមុខមានលំដាប់ដែលនៅខាងមុខតំបន់អថេរ (NNK) 12 (template-specific), GS FLX Titanium Adapter A, និង 4-base library key sequence (TCAG) (រូបភាពបន្ថែម 1a):
primer fusion បញ្ច្រាសក៏មាន biotin ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងការចាប់យកអង្កាំនិង GS FLX Titanium Adapter B ដែលត្រូវការសម្រាប់ការពង្រីកក្លូនក្នុងអំឡុងពេល emulsion PCR:
បន្ទាប់មក amplicons ត្រូវបានទទួលរងនូវ 454/Roche pyrosequencing យោងទៅតាមពិធីការ 454 GS-FLX Titanium ។សម្រាប់ការរៀបចំតាមលំដាប់ Sanger ដោយដៃ (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) T7 phage DNA ត្រូវបានពង្រីកដោយ PCR និងបន្តបន្ទាប់គ្នាជាមួយនឹងគូបឋមខាងក្រោម៖
ការបញ្ចូលពីបន្ទះនីមួយៗត្រូវបានទទួលរងនូវការពង្រីក PCR ដោយប្រើ Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត)។ចាប់ផ្តើមក្តៅ (10 នាទីនៅ 95 °C) និង 35 វដ្តជំរុញ (50 វិនាទីនៅ 95 °C, 1 នាទីនៅ 50 °C និង 1 នាទីនៅ 72 °C) ។
Phage ពីបណ្ណាល័យ, phage ប្រភេទព្រៃ, phage ត្រូវបានជួយសង្គ្រោះពី CSF និងឈាម, ឬក្លូនបុគ្គលត្រូវបានពង្រីកនៅក្នុង Escherichia coli BL5615 នៅក្នុងទំពាំងបាយជូរ TB (Sigma Aldrich) ឬក្នុងចាន 500 cm2 (Thermo Scientific) រយៈពេល 4 ម៉ោងនៅ 37 ° C ។Phage ត្រូវ​បាន​ស្រង់​ចេញ​ពី​ចាន​ដោយ​លាង​ចាន​ដោយ​ប្រើ Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) ឬ​ដោយ​ការ​ប្រមូល​បន្ទះ​ជាមួយ​នឹង​គន្លឹះ pipette មាប់មគ។Phage ត្រូវ​បាន​ញែក​ដាច់​ដោយ​ឡែក​ពី​វប្បធម៌​លើស​ដើម ឬ​បណ្ដោះ​អាសន្ន​ការ​ទាញ​យក​ដោយ​មួយ​ជុំ​នៃ polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) ហើយ​បាន​ផ្អាក​នៅ​ក្នុង​បណ្តុំ Tris-EDTA ។
ការពង្រីក phage ត្រូវបានទទួលរងនូវការដកយកចេញនូវសារធាតុ endotoxin ចំនួន 2-3 ជុំដោយប្រើគ្រាប់ថ្នាំបំបាត់ជាតិពុល endotoxin (Miltenyi Biotec) មុនពេលចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាម (IV) (500 μl/សត្វ)។នៅក្នុងជុំទីមួយ 2 × 1012 phages ត្រូវបានណែនាំ។នៅក្នុងទីពីរ 2 × 1010 ហ្វា;នៅក្នុងជុំជ្រើសរើសទីបី និងទីបួន 2×109 phages ក្នុងមួយសត្វ។មាតិកា Phage នៅក្នុង CSF និងសំណាកឈាមដែលប្រមូលបានតាមពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញត្រូវបានកំណត់ដោយការរាប់បន្ទះយោងទៅតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត (សៀវភៅណែនាំប្រព័ន្ធ T7Select) ។ការជ្រើសរើស Phage ត្រូវបានអនុវត្តដោយការចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាមនៃបណ្ណាល័យដែលបានបន្សុតចូលទៅក្នុងសរសៃកន្ទុយ ឬដោយការចាក់ឡើងវិញនូវ phage ដែលស្រង់ចេញពី CSF ពីជុំជ្រើសរើសមុន ហើយការប្រមូលផលជាបន្តបន្ទាប់ត្រូវបានអនុវត្តនៅ 10 នាទី 30 នាទី 60 នាទី 90 នាទី 120 នាទី 180 នាទី និងឈាម 240 នាទីរៀងៗខ្លួន។សរុបចំនួនបួនជុំនៃការ panning នៅក្នុង vivo ត្រូវបានធ្វើឡើងដែលក្នុងនោះសាខាដែលបានជ្រើសរើសទាំងពីរត្រូវបានទុក និងវិភាគដាច់ដោយឡែកពីគ្នាក្នុងអំឡុងពេលបីជុំដំបូងនៃការជ្រើសរើស។ការបញ្ចូល phage ទាំងអស់ដែលបានស្រង់ចេញពី CSF ពីការជ្រើសរើសពីរជុំដំបូងត្រូវបានទទួលរងនូវ 454/Roche pyrosequencing ខណៈពេលដែលក្លូនទាំងអស់ដែលបានស្រង់ចេញពី CSF ពីជុំចុងក្រោយនៃការជ្រើសរើសត្រូវបានបន្តតាមលំដាប់ដោយដៃ។គ្រប់ឈាមទាំងអស់ពីជុំទី 1 នៃការជ្រើសរើសក៏ត្រូវទទួលរងនូវ 454/Roche pyrosequencing ផងដែរ។សម្រាប់ការចាក់ថ្នាំ phage ក្លូន phage ដែលបានជ្រើសរើសត្រូវបានពង្រីកនៅក្នុង E. coli (BL5615) នៅលើចាន 500 cm2 នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 4 ម៉ោង។ក្លូនដែលបានជ្រើសរើសជាលក្ខណៈបុគ្គល និងតាមលំដាប់លំដោយដោយដៃត្រូវបានផ្សព្វផ្សាយនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកជំងឺរបេង។បន្ទាប់ពីការស្រង់ចេញ phage ការបន្សុតនិងការយកចេញនៃ endotoxin (ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ) 2 × 1010 phages / សត្វក្នុង 300 μlត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមចូលទៅក្នុងសរសៃកន្ទុយមួយ។
ដំណើរការមុន និងតម្រងគុណភាពនៃទិន្នន័យលំដាប់។ទិន្នន័យ Raw 454/Roche ត្រូវបានបំប្លែងពីទម្រង់ផែនទីស្ទ្រីមស្តង់ដារគោលពីរ (sff) ទៅជាទម្រង់ដែលអាចអានបានរបស់មនុស្ស Pearson (fasta) ដោយប្រើកម្មវិធីអ្នកលក់។ដំណើរការបន្ថែមទៀតនៃលំដាប់នុយក្លេអូទីតត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី C និងស្គ្រីបដែលមានកម្មសិទ្ធិ (កញ្ចប់កម្មវិធីដែលមិនទាន់ចេញផ្សាយ) ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងក្រោម។ការវិភាគទិន្នន័យបឋមរួមមាននីតិវិធីត្រងពហុដំណាក់កាលដ៏តឹងរឹង។ដើម្បីត្រងការអានដែលមិនមាន 12mer បញ្ចូល DNA ត្រឹមត្រូវ ការអានត្រូវបានតម្រឹមជាបន្តបន្ទាប់ដើម្បីចាប់ផ្តើមស្លាក (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT) បញ្ឈប់ស្លាក (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) និងការបញ្ចូលផ្ទៃខាងក្រោយ (CCCTGCAGGATATCCCGGGAGAGCTCGTCGAC) ដោយប្រើសកលការតម្រឹមដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានភាពមិនស៊ីសង្វាក់គ្នារហូតដល់ 2 ក្នុងមួយការតម្រឹម 31.ដូច្នេះ អានដោយមិនចាប់ផ្តើម និងបញ្ឈប់ស្លាក និងការអានដែលមានការបញ្ចូលផ្ទៃខាងក្រោយ ពោលគឺការតម្រឹមដែលលើសពីចំនួនដែលអនុញ្ញាតត្រូវគ្នានោះ ត្រូវបានដកចេញពីបណ្ណាល័យ។ចំពោះការអានដែលនៅសេសសល់ លំដាប់ N-mer DNA ដែលលាតសន្ធឹងពីសញ្ញាចាប់ផ្តើម និងបញ្ចប់មុនពេលសញ្ញាឈប់ត្រូវបានដកចេញពីលំដាប់អានដើម និងដំណើរការបន្ថែម (តទៅនេះហៅថា "បញ្ចូល")។បន្ទាប់​ពី​ការ​បក​ប្រែ​នៃ​ការ​បញ្ចូល​នោះ ផ្នែក​បន្ទាប់​ពី stop codon ដំបូង​នៅ​ចុង 5′ នៃ primer ត្រូវ​បាន​យក​ចេញ​ពី​ការ​បញ្ចូល។លើសពីនេះទៀត nucleotides ដែលនាំទៅដល់ codons មិនពេញលេញនៅចុង 3′ នៃ primer ក៏ត្រូវបានដកចេញផងដែរ។ដើម្បី​មិន​រាប់បញ្ចូល​ការបញ្ចូល​ដែល​មាន​តែ​លំដាប់​ផ្ទៃខាងក្រោយ ការបញ្ចូល​ដែល​បាន​បកប្រែ​ដែល​ចាប់ផ្តើម​ដោយ​លំនាំ​អាស៊ីត​អាមីណូ “PAG” ក៏​ត្រូវ​បាន​ដកចេញ​ផងដែរ។Peptides ដែលមានប្រវែងក្រោយការបកប្រែនៃអាស៊ីតអាមីណូតិចជាង 3 ត្រូវបានដកចេញពីបណ្ណាល័យ។ជាចុងក្រោយ លុបភាពមិនដូចគ្នានៅក្នុងអាងបញ្ចូល ហើយកំណត់ប្រេកង់នៃការបញ្ចូលនីមួយៗ។លទ្ធផលនៃការវិភាគនេះរួមមានបញ្ជីនៃលំដាប់នុយក្លេអូទីត (បញ្ចូល) និងប្រេកង់ (អាន) របស់ពួកគេ (រូបភាពបន្ថែម 1c និង 2)។
ការបញ្ចូល DNA របស់ក្រុម N-mer ដោយភាពស្រដៀងគ្នានៃលំដាប់៖ ដើម្បីលុបបំបាត់កំហុសនៃលំដាប់ជាក់លាក់ 454/Roche (ដូចជាបញ្ហាជាមួយផ្នែកបន្ថែម homopolymer បន្តបន្ទាប់គ្នា) និងដកចេញនូវភាពខ្វះចន្លោះដែលមិនសូវសំខាន់ ការបញ្ចូលលំដាប់ N-mer DNA ដែលបានត្រងពីមុន (បញ្ចូល) ត្រូវបានតម្រៀបតាមភាពស្រដៀងគ្នា។សិលាចារឹក (រហូតដល់ 2 មូលដ្ឋានដែលមិនផ្គូផ្គងត្រូវបានអនុញ្ញាត) ដោយប្រើក្បួនដោះស្រាយដដែលៗដែលបានកំណត់ដូចខាងក្រោម៖ សិលាចារឹកត្រូវបានតម្រៀបដំបូងតាមប្រេកង់របស់វា (ខ្ពស់បំផុតទៅទាបបំផុត) ហើយប្រសិនបើពួកវាដូចគ្នា ដោយការតម្រៀបបន្ទាប់បន្សំដោយប្រវែង (វែងបំផុតទៅខ្លីបំផុត))។ដូច្នេះ ការបញ្ចូលញឹកញាប់ និងវែងបំផុតកំណត់ "ក្រុម" ដំបូង។ប្រេកង់ក្រុមត្រូវបានកំណត់ទៅប្រេកង់គន្លឹះ។បន្ទាប់មក សិលាចារឹកនីមួយៗដែលនៅសេសសល់ក្នុងបញ្ជីដែលបានតម្រៀបត្រូវបានព្យាយាមបញ្ចូលទៅក្នុងក្រុមដោយការតម្រឹមជាគូ Needleman-Wunsch ។ប្រសិនបើចំនួននៃការផ្គូផ្គង ការបញ្ចូល ឬការលុបនៅក្នុងការតម្រឹមមិនលើសពីកម្រិត 2 នោះសិលាចារឹកមួយត្រូវបានបន្ថែមទៅក្រុម ហើយប្រេកង់ក្រុមទាំងមូលត្រូវបានកើនឡើងដោយចំនួនញឹកញាប់នៃការបញ្ចូលត្រូវបានបន្ថែម។ការបញ្ចូលដែលបានបន្ថែមទៅក្រុមត្រូវបានសម្គាល់ថាបានប្រើ និងត្រូវបានដកចេញពីដំណើរការបន្ថែម។ប្រសិនបើ​លំដាប់​បញ្ចូល​មិន​អាច​បន្ថែម​ទៅ​ក្នុង​ក្រុម​ដែល​មាន​ស្រាប់​ទេ លំដាប់​បញ្ចូល​ត្រូវ​បាន​ប្រើ​ដើម្បី​បង្កើត​ក្រុម​ថ្មី​ដែល​មាន​ប្រេកង់​បញ្ចូល​សមស្រប ហើយ​សម្គាល់​ថា​បាន​ប្រើ។ការ​ធ្វើ​ឡើងវិញ​ត្រូវ​បញ្ចប់​នៅ​ពេល​លំដាប់​បញ្ចូល​គ្នា​ត្រូវ​បាន​ប្រើ​ដើម្បី​បង្កើត​ក្រុម​ថ្មី ឬ​អាច​បញ្ចូល​ក្នុង​ក្រុម​ដែល​មាន​ស្រាប់។យ៉ាងណាមិញ ការបញ្ចូលជាក្រុមដែលមាននុយក្លេអូទីត ត្រូវបានបកប្រែជាលំដាប់ peptide (បណ្ណាល័យ peptide)។លទ្ធផលនៃការវិភាគនេះគឺជាសំណុំនៃសិលាចារឹក និងប្រេកង់ដែលត្រូវគ្នារបស់ពួកគេ ដែលបង្កើតបានជាចំនួននៃការអានជាប់ៗគ្នា (រូបភាពបន្ថែម 2)។
Motif Generation៖ ដោយផ្អែកលើបញ្ជីនៃ peptides តែមួយគត់ បណ្ណាល័យមួយត្រូវបានបង្កើតឡើងដែលមានលំនាំអាស៊ីតអាមីណូដែលអាចធ្វើបានទាំងអស់ (aa) ដូចបានបង្ហាញខាងក្រោម។លំនាំនីមួយៗដែលអាចធ្វើទៅបាននៃប្រវែង 3 ត្រូវបានស្រង់ចេញពី peptide ហើយលំនាំបញ្ច្រាសរបស់វាត្រូវបានបន្ថែមជាមួយនឹងបណ្ណាល័យគំនូរទូទៅដែលមានលំនាំទាំងអស់ (tripeptides) ។បណ្ណាល័យ​នៃ​គំនូរ​ច្រំដែល​ខ្លាំង​ត្រូវ​បាន​រៀបចំ​តាម​លំដាប់​លំដោយ ហើយ​ការ​ប្រើ​ដដែលៗ​ត្រូវ​បាន​យក​ចេញ។បន្ទាប់មក សម្រាប់ tripeptide នីមួយៗនៅក្នុងបណ្ណាល័យគំនូរ យើងបានពិនិត្យរកមើលវត្តមានរបស់វានៅក្នុងបណ្ណាល័យដោយប្រើឧបករណ៍គណនា។ក្នុងករណីនេះ ភាពញឹកញាប់នៃ peptide ដែលមាន motif tripeptide ត្រូវបានបន្ថែម និងកំណត់ទៅគំនូរនៅក្នុងបណ្ណាល័យគំនូរ ("ចំនួនគំនូរ")។លទ្ធផលនៃការបង្កើតគំនូរគឺជាអារេពីរវិមាត្រដែលមានរាល់ការកើតឡើងនៃ tripeptides (motifs) និងតម្លៃរៀងៗខ្លួន ដែលជាចំនួននៃការអានតាមលំដាប់លំដោយ ដែលនាំឱ្យគំនូរដែលត្រូវគ្នានៅពេលដែលការអានត្រូវបានត្រង ដាក់ជាក្រុម និងបកប្រែ។មាត្រដ្ឋានដូចបានរៀបរាប់លម្អិតខាងលើ។
ការធ្វើធម្មតានៃចំនួនគំនូរ និងគ្រោងដែលត្រូវគ្នា៖ ចំនួននៃគំនូរសម្រាប់គំរូនីមួយៗត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដោយប្រើ
ដែល ni គឺជាចំនួននៃការអានដែលមានប្រធានបទ i ។ដូច្នេះ vi តំណាងឱ្យប្រេកង់ភាគរយនៃការអាន (ឬ peptides) ដែលមាន motif i នៅក្នុងគំរូ។តម្លៃ P សម្រាប់ចំនួនគំនូរដែលមិនមានលក្ខណៈធម្មតាត្រូវបានគណនាដោយប្រើការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ។ទាក់ទងនឹង correlograms នៃចំនួននៃការជម្រុញ ការជាប់ទាក់ទងរបស់ Spearman ត្រូវបានគណនាដោយប្រើចំនួនធម្មតានៃការជម្រុញជាមួយ R.
ដើម្បីស្រមៃមើលខ្លឹមសារនៃអាស៊ីតអាមីណូនៅទីតាំងនីមួយៗនៅក្នុងបណ្ណាល័យ peptide ឡូហ្គោក្រាមគេហទំព័រ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ត្រូវបានបង្កើតឡើង។ដំបូង ខ្លឹមសារនៃអាស៊ីតអាមីណូនៅទីតាំងនីមួយៗនៃ peptide 12-mer ត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងម៉ាទ្រីស 20×12 ។បន្ទាប់មក សំណុំនៃ 1000 peptides ដែលមានមាតិកាអាស៊ីតអាមីណូដែលទាក់ទងដូចគ្នានៅទីតាំងនីមួយៗត្រូវបានបង្កើតជាទម្រង់ fasta-sequence និងត្រូវបានផ្តល់ជាការបញ្ចូលទៅក្នុង web-logo 3 ដែលបង្កើតជាតំណាងក្រាហ្វិកនៃមាតិកាអាស៊ីតអាមីណូដែលទាក់ទងនៅទីតាំងនីមួយៗ។សម្រាប់បណ្ណាល័យ peptide ដែលបានផ្តល់ឱ្យ។ដើម្បីស្រមៃមើលសំណុំទិន្នន័យពហុវិមាត្រ ផែនទីកំដៅត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើឧបករណ៍ដែលបានអភិវឌ្ឍខាងក្នុងនៅក្នុង R (biosHeatmap ដែលជាកញ្ចប់ R ដែលមិនទាន់ត្រូវបានចេញផ្សាយ)។dendrograms ដែលបង្ហាញនៅក្នុងផែនទីកំដៅត្រូវបានគណនាដោយប្រើវិធីសាស្ត្រចង្កោមតាមឋានានុក្រមរបស់ Ward ជាមួយនឹងម៉ែត្រ Euclidean ។សម្រាប់ការវិភាគស្ថិតិនៃទិន្នន័យពិន្ទុ motif តម្លៃ P សម្រាប់ការដាក់ពិន្ទុមិនប្រក្រតីត្រូវបានគណនាដោយប្រើការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ។P-values ​​សម្រាប់សំណុំទិន្នន័យផ្សេងទៀតត្រូវបានគណនាជា R ដោយប្រើតេស្ត t-test ឬ ANOVA របស់សិស្ស។
ក្លូន phage និង phages ដែលបានជ្រើសរើសដោយគ្មានការបញ្ចូលត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមតាមសរសៃកន្ទុយ (2 × 1010 phages / សត្វក្នុង 300 μl PBS) ។10 នាទីមុនពេលចាក់បញ្ចូលទឹក និងការជួសជុលជាបន្តបន្ទាប់ សត្វដូចគ្នាត្រូវបានចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាមជាមួយនឹង 100 μl នៃ Lectin ដែលមានស្លាក DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177) ។60 នាទីបន្ទាប់ពីការចាក់ថ្នាំ phage សត្វកណ្ដុរត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងបេះដូងជាមួយនឹង 50 មីលីលីត្រ PBS អមដោយ 50 មីលីលីត្រ 4% PFA / PBS ។សំណាកខួរក្បាលត្រូវបានជួសជុលបន្ថែមមួយយប់ក្នុង 4% PFA/PBS និងត្រាំក្នុង 30% sucrose ពេញមួយយប់នៅ 4 °C។គំរូត្រូវបានកកក្នុងល្បាយ OCT ។ការវិភាគ Immunohistochemical នៃសំណាកដែលកកត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់នៅលើ 30 µm cryosections ដែលត្រូវបានរារាំងដោយ 1% BSA និង incubated ជាមួយ polyclonal FITC-labeled antibodies ប្រឆាំងនឹង T7 phage (Novus NB 600-376A) នៅ 4 ° C ។ភ្ញាស់ពេញមួយយប់។ទីបំផុតផ្នែកត្រូវបានលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយ PBS និងពិនិត្យដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ឡាស៊ែរ confocal (Leica TCS SP5) ។
peptides ទាំងអស់ដែលមានភាពបរិសុទ្ធអប្បបរមា 98% ត្រូវបានសំយោគដោយ GenScript USA, biotinylated និង lyophilized ។Biotin ត្រូវបានចងតាមរយៈ glycine spacer បីដងបន្ថែមទៀតនៅ N-terminus ។ពិនិត្យ peptides ទាំងអស់ដោយប្រើ spectrometry ។
Streptavidin (Sigma S0677) ត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាជាមួយនឹង equimolar លើសពី 5 ដងនៃ biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide ឬការរួមបញ្ចូលគ្នា (សមាមាត្រ 3: 1) នៃ biotinylated BACE1 inhibitory peptide និង BACE1 inhibitory peptide ក្នុង 5-10% Peptide DMSO/.BS1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់មុនពេលចាក់។ថ្នាំ Streptavidin-conjugated peptides ត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមក្នុងកម្រិត 10 mg/kg ចូលទៅក្នុងសរសៃកន្ទុយមួយរបស់សត្វកណ្តុរដែលមានប្រហោងខួរក្បាល។
ការផ្តោតអារម្មណ៍នៃស្មុគស្មាញ streptavidin-peptide ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយ ELISA ។Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) ត្រូវបានស្រោបពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ជាមួយនឹង 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011)។បន្ទាប់ពីការទប់ស្កាត់ (រារាំងសតិបណ្ដោះអាសន្ន៖ 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 2 ម៉ោង លាងចានជាមួយ 0.05% Tween-20/PBS (សតិបណ្ដោះអាសន្នលាងសម្អាត) សម្រាប់ 3 ទីពីរ ប្លាស្មាត្រូវបានបន្ថែមទៅអណ្តូង CSF sma 1:10,000, CSF 1:115) ។បន្ទាប់មកចានត្រូវបាន incubated មួយយប់នៅ 4 ° C ជាមួយនឹងអង្គបដិបក្ខរាវរក (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ។បន្ទាប់ពីការលាងបីជំហាន streptavidin ត្រូវបានរកឃើញដោយការភ្ញាស់នៅក្នុងដំណោះស្រាយស្រទាប់ខាងក្រោម TMB (Roche) រហូតដល់ 20 នាទី។បន្ទាប់ពីបញ្ឈប់ការអភិវឌ្ឍន៍ពណ៌ជាមួយ 1M H2SO4 វាស់ការស្រូបនៅ 450 nm ។
មុខងារនៃស្មុគស្មាញ streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយ Aβ(1-40) ELISA យោងទៅតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត (Wako, 294-64701) ។ដោយសង្ខេប គំរូ CSF ត្រូវបានពនឺក្នុងសារធាតុរំលាយតាមស្តង់ដារ (1:23) ហើយដាំពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ក្នុងចានអណ្តូង 96 ដែលស្រោបដោយអង្គបដិប្រាណចាប់យក BNT77 ។បន្ទាប់ពីការលាងសម្អាតចំនួនប្រាំជំហាន អង្គបដិប្រាណ BA27 ដែលផ្សំដោយ HRP ត្រូវបានបន្ថែម និងភ្ញាស់រយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 4 អង្សារសេ តាមពីក្រោយដោយការលាងប្រាំជំហាន។Aβ(1–40) ត្រូវបានរកឃើញដោយ incubation នៅក្នុងដំណោះស្រាយ TMB រយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់ពីការអភិវឌ្ឍពណ៌ត្រូវបានបញ្ឈប់ជាមួយនឹងដំណោះស្រាយបញ្ឈប់, វាស់ការស្រូបយកនៅ 450 nm ។សំណាកប្លាស្មាត្រូវបានទទួលរងនូវការស្រង់ចេញដំណាក់កាលរឹងមុនពេល Aβ(1-40) ELISA ។ប្លាស្មាត្រូវបានបន្ថែមទៅ 0.2% DEA (Sigma) ក្នុងចានអណ្តូង 96 និង incubated នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 30 នាទី។បន្ទាប់ពីលាងចាន SPE ជាបន្តបន្ទាប់ (Oasis, 186000679) ជាមួយទឹក និង 100% មេតាណុល គំរូប្លាស្មាត្រូវបានបន្ថែមទៅចាន SPE ហើយវត្ថុរាវទាំងអស់ត្រូវបានយកចេញ។គំរូត្រូវបានលាងសម្អាត (ដំបូងជាមួយ 5% មេតាណុល បន្ទាប់មក 30% មេតាណុល) និង eluted ជាមួយ 2% NH4OH / 90% មេតាណុល។បន្ទាប់ពីសម្ងួត eluate នៅសីតុណ្ហភាព 55°C រយៈពេល 99 នាទីនៅចរន្ត N2 ថេរ គំរូត្រូវបានកាត់បន្ថយក្នុងសារធាតុរំលាយស្តង់ដារ ហើយAβ(1-40) ត្រូវបានវាស់វែងដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។
តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីដកស្រង់អត្ថបទនេះ: Urich, E. et al ។ការដឹកជញ្ជូនទំនិញទៅកាន់ខួរក្បាលដោយប្រើ transit peptides កំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុង vivo ។វិទ្យាសាស្ត្រ។៥, ១៤១០៤;doi: 10.1038/srep14104 (2015) ។
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB និង Moos T. ការផ្តល់ថ្នាំម៉ាក្រូម៉ូលេគុលទៅកាន់ខួរក្បាលដោយប្រើការព្យាបាលតាមគោលដៅ។Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)។
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., និង Martinez-Martinez, P. ការចែកចាយថ្នាំ peptide និងប្រូតេអ៊ីនឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាល។Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009) ។
Pardridge, WM របាំងឈាម-ខួរក្បាល៖ ឧបសគ្គក្នុងការអភិវឌ្ឍន៍ថ្នាំខួរក្បាល។NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005) ។
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, និង Byrd, A. ការរំពឹងទុកសម្រាប់ការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវការផ្តល់ថ្នាំ និងការកំណត់គោលដៅទៅកាន់ខួរក្បាលតាមរយៈផ្លូវ choroid plexus-CSF ។ការស្រាវជ្រាវឱសថ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005) ។
Pardridge, WM ទំនើបកម្មនៃជីវឱសថជាមួយសេះ Trojan ម៉ូលេគុលសម្រាប់ការចែកចាយខួរក្បាល។Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008) ។
Pardridge, WM receptor-mediated peptide ដឹកជញ្ជូនឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាល។Endocr Rev. 7, 314–330 (1986)។
Niewoehner, J. et al ។បង្កើនការជ្រៀតចូលនៃខួរក្បាល និងប្រសិទ្ធភាពនៃអង្គបដិប្រាណព្យាបាលដោយប្រើឧបករណ៍បំប្លែងម៉ូលេគុល monovalent ។ណឺរ៉ុន 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014) ។
Bien-Lee, N. et al ។ការដឹកជញ្ជូន Transferrin receptor (TfR) កំណត់ការទទួលយកខួរក្បាលនៃភាពខុសគ្នានៃទំនាក់ទំនងនៃអង្គបដិប្រាណ TfR ។J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014) ។